Preparazione di ovociti di Drosophila fissi per l'immunostaining: un metodo ad alta produttività per fissare e rimuovere la membrana esterna

- Iniziare pulsando la Drosophila anestetizzata insieme al tampone in un frullatore per rompere le mosche in piccoli pezzi. Filtrare la miscela attraverso una rete per rimuovere le parti del corpo di grandi dimensioni. Quindi, lasciare che le uova affondino mentre i frammenti più grandi rimangono sulla superficie e possono essere rimossi.

Ripetere questo processo utilizzando una rete più piccola per rimuovere detriti aggiuntivi. Raccogliere le uova in una fiala e, se le uova devono essere trattate con un farmaco, a questo punto, rimuovere il liquido e sostituirlo con fissatore. Aggiungere l'eptano per aiutare il fissatore a penetrare nella membrana che circonda l'uovo.

Quindi, lavare via il fissatore con PBS. Per macchiare gli ovociti, rimuovere le membrane esterne protettive per consentire la penetrazione degli anticorpi. Pipettare gli ovociti sulla parte smerigliata di uno scivolo di vetro. Posizionare una coverlip sulle uova e arrotolare delicatamente il coverslip in un movimento avanti e indietro per separare meccanicamente il coro e la membrana vitellina dall'uovo. Gli ovociti sono ora pronti per essere macchiati.

Nel protocollo di esempio, prepareremo gli ovociti nella meiosi I a macchiare e visualizzare l'apparato del mandrino.

- Per iniziare, pretagliare l'interno di un tubo da 5 millilitri e pipetta Pasteur con PTB per evitare che gli ovociti si attacchino alle superfici. Aggiungere 100 millilitri del tampone di Rob a un frullatore e quindi aggiungere da 100 a 300 mosche anestetizzate e pulsare tre volte per un secondo.

Filtrare il liquame risultante in un becher da 250 millilitri attraverso una grande rete con pori di circa 1500 micrometri. Lasciare depositare il filtrato per circa due minuti e quindi aspirare lo strato superiore, rimuovendo il maggior numero possibile di parti del corpo di grandi dimensioni. Filtrare nuovamente il liquame in un becher da 250 millilitri attraverso una rete più piccola con la dimensione dei pori di 300 micrometri.

Risciacquare il primo becher utilizzando un tampone aggiuntivo nella pipetta rivestita per raccogliere gli ovociti rimanenti. Lasciare che il liquame si accontenti di tre minuti e quindi aspirare tutti tranne i 10 millilitri inferiori. Versare il maggior numero possibile di 10 millilitri nel tubo rivestito da 5 millilitri. Lasciare depositare il liquame per circa due minuti e quindi rimuovere con cura il liquido.

Aggiungete il resto dei 10 millilitri di liquami e lasciate che la miscela si stabilizza nuovamente prima di rimuovere il liquido. Risciacquare gli ovociti rimanenti dal becher utilizzando un tampone aggiuntivo nella pipetta rivestita. Lasciare depositare il risciacquo nel tubo da 5 millilitri per tre o cinque minuti.

Per fissare le ovaie, prima aspirare tutto il liquido dai tessuti e aggiungere immediatamente 1 millilitro di miscela fissa. Posizionare i tessuti su un nutator per due minuti e mezzo. Successivamente, aggiungere 1 millilitro di eptano, vortice il tubo per un minuto, quindi lasciare che gli ovociti si sistemino per un altro minuto.

Rimuovere tutto il liquido dal tessuto stabilizzato, quindi aggiungere 1 millilitro di 1x PBS. Vortice il tubo per 30 secondi, quindi lasciare che gli ovociti si stabiliscino per un minuto. Successivamente, rimuovere tutto il liquido dal tubo e riempirlo con cinque millilitri di 1x PBS.

Utilizzando la pipetta rivestita, aggiungere da 500 a 1.000 ovociti a uno scivolo di vetro smerigliato. Rimuovere eventuali parti estranee del corpo o materiale utilizzando le forcep. Posizionare un copriletto sopra il tessuto e arrotolare delicatamente gli ovociti fino a rimuovere tutte le membrane. Trascinare il bordo del coperchio attraverso gli ovociti funziona bene. Controllare periodicamente l'avanzamento della rimozione della membrana al microscopio. Troppa pressione distruggerà gli ovociti.