免疫染色のための固定 ショウジョウバエ の調製:外膜を固定・除去する高スループット法

- 麻酔付きショウジョウバエをブレンダーのバッファと一緒に脈動させてハエを小片に分解し始める。メッシュを通して混合物をフィルターして大きな体の部分を取り除く。その後、大きな断片が表面に残っている間に卵が沈み、取り除くことができる。

より小さなメッシュを使って追加の破片を取り除くこのプロセスを繰り返します。バイアルに卵を集め、卵を薬物で処理する場合は、この時点で処理します。

その後、PBSで固定剤を洗い流し、卵母細胞を汚すために保護外膜を取り除き、ガラススライドの曇った部分に卵母細胞をピペットします。

プロトコル例では、紡錘装置を染色し、視覚化するために、meiosis Iで卵母細胞を準備する。

- まず、5ミリリットルチューブとパスツールピペットの内側をPTBでプレカットして、卵母細胞が表面に付着するのを防ぎます。

得られたスラリーを約1500マイクロメートルの細孔を持つ大きなメッシュを通して250ミリリットルのビーカーにフィルターします。濾液を約2分間落ち着かせ、最上層を吸引し、できるだけ多くの大きな体の部分を取り除きます。

コーティングされたピペットに追加のバッファを使用して最初のビーカーをすすいでください。スラリーを3分間落ち着かせ、下の10ミリリットルを除くすべてを吸引します。

スラリーの残りの10ミリリットルを追加し、液体を取り除く前にミックスを再び落ち着かせる。コーティングされたピペットの追加のバッファを使用してビーカーから残りの卵母細胞をすすいでください。

卵巣を固定するには、まず、組織からすべての液体を吸引し、すぐに1ミリリットルの固定ミックスを加え、2分半、ヌテレーターに組織を置き、ヘプタンを1ミリリットル、チューブを1分間渦液に加え、さらに1分間落ち着かせる。

落ち着いた組織からすべての液体を取り出し、1x PBSの1ミリリットルを加え、チューブを30秒間ボルテックスし、卵母細胞が1分間沈着するようにします。

コーティングされたピペットを使用して、曇ったガラススライドに約500から1,000の卵母細胞を加えます。鉗子を使用して余分な身体部分または材料を取り除き、組織の上にカバースリップを置き、すべての膜が取り除かれるまで卵母細胞をそっと転がします。