Memeli hücre bölünmesi yılında niceliksel Confocal yansıma mikroskobu ile 3D matrisler

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Bu iletişim kuralı verimli çalışmalar 3D kollajen matrisler memeli hücre bölünmesi hücre bölünmesi, eşitlenmesi entegre ederek 3B matrisleri canlı hücre görüntüleme tekniği, confocal yansıması zaman çözüldü mikroskobu kullanarak bölümü olayların izlenmesi ve nicel analiz görüntüleme.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

He, L., Sneider, A., Chen, W., Karl, M., Prasath, V., Wu, P. H., Mattson, G., Wirtz, D. Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy. J. Vis. Exp. (129), e56364, doi:10.3791/56364 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nasıl memeli hücre bölünmesi çalışmanın düzenlenmiş bir 3D çevre onun fizyolojik alaka ve tedavi edici öneme rağmen büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır. Keşif eksikliği için olası nedenler deneysel sınırlamalar ve hücre bölünmesi çalışma 3D kültüründe verimsiz hale teknik zorluklar nelerdir. Burada, verimli bir şekilde çalışma memeli hücre bölünmesi ve 3D kollajen matrisler etkileşimlerde hücre-matris bir görüntüleme tabanlı yöntemi açıklanmaktadır. Floresan H2B ile etiketli hücreleri timidin engelleme ve nocodazole tedavi, bir mekanik sallamak-off tekniği ile takip birleşimini kullanarak eşitlenir. Eşitlenmiş hücreleri sonra 3D kollajen matris gömülür. Hücre bölünmesi yaşamak-cep mikroskobu kullanılarak izlenir. Deformasyon sırasında ve sonra hücre bölünmesi, hücre-matris etkileşim bir göstergesidir, kollajen liflerinin izlenebilir ve nicel confocal yansıma mikroskobu kullanılarak sayılabilir. Memeli hücre bölünmesi ve hücre-matris etkileşimleri fizyolojik ilgili 3D ortamında çalışmaya verimli ve genel bir yaklaşım yöntemdir. Bu yaklaşım sadece gelişimi normal doku ve hastalıkların moleküler temeli roman ilgili bilgiler sağlar, ama aynı zamanda yeni tanı ve tedavi yaklaşımları tasarımı için sağlar.

Introduction

Hücre mitoz hangi tür ile doku ve organ gelişiminde çok önemli rol oynar hücresel hayatında önemli bir olay var. Anormal mitoz doğal genetik varyasyonları, insan yaşlanma süreçlerini ve kanser1,2,3,4,5ilerlemesini karıştığı. Normal hücreleri ile karşılaştırıldığında tümör hücrelerinin çoğalması artış oranı kanser hücre davranışları oldukça heterojen değişik tümörler arasında ve hastalar arasında bile aslında rağmen işaretlerinden biridir. Preklinik umut verici sonuçlar rağmen klinik6,7,8,9,10 ' etkili olabilmesi için bazı yeni geliştirilen antimitotic ilaçlar gösterememiştir ,11. Deneysel ve Preklinik modellerin ilgisi dikkate alınması gereken vardır. Üç boyutlu (3D) matrisler, fibroblastlar ve kollajen bakımından zengin 3D bağ doku hücrelerinde Fibrosarkom ve 3D stromal hücre dışı Matriks (ECM) metastatik kanser hücreleri gibi içinde adl tip-in normal memeli ve kanser hücreleri bölün. Ancak, memeli hücre bölünmesi deneyleri ve deneyleri büyük çoğunluğu iki boyutlu (2D) yüzeyler üzerinde kültürlü hücreleri üzerinde gerçekleştirilmiş. Bir mühendislik 3D matris daha iyi Mikroyapı, mekanik özellikleri ve her iki normal ve patolojik doku12,13,14, 3D ECM biyokimyasal sinyalleri özetlemek 15,16,17.

Nasıl memeli hücre bölünmesi çalışmanın düzenlenmiştir 3D ortamlar fizyolojik alaka ve terapötik önemi18,19rağmen büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır. Teknik sorunlar ve deneysel zorluklar 3D matris hücre bölünmesi eğitimi ile ilişkili olası nedenler. Hücre mitoz bütün hücre döngüsü20küçük bir zamansal bölümü kabul ettiğiniz anlamına gelir. Önceki çalışma olduğunu göstermiştir bu insan meme adenokarsinom MCF-7, insan osteosarkom U2OS ve insan karaciğer gibi birçok memeli hücrelerinin proliferasyonu oranı HepG2, çok daha düşük 2D yüzeylerde21, onların meslektaşları ile karşılaştırıldığında 3D matris içinde 22. Ayrıca, 3D matris içinde gömülü hücreler odak içinde ve dışında canlı hücre görüntüleme sırasında geçiş yapar. Tüm bu faktörlerin hücre bölünmesi olayları görüntüleme teknikleri kullanarak 3D kültüründe yakalama son derece düşük verimlilik katkıda bulunur.

ECM ve hücreler arasındaki etkileşimler hücre bölünmeler düzenlenmesinde önemli rol oynarlar. Burada, verimli bir şekilde 3D kollajen matrisler memeli hücre bölünmesi çalışmaya bir yaklaşımı açıklamak. Hücreleri, hücre bölünmesi eşitlenmesi yanı sıra 3B matrisleri kullanarak canlı hücre görüntüleme tekniği, confocal yansıması zaman çözüldü mikroskobu, bölünme olayları izleme Mitotik işaretleri birleşme yöntemi içerir ve nicel analiz görüntüleme. Floresans etiketli Histon protein H2B ilk hücrelere Mitotik ayırt etmek ve hücreleri Interphase bir işareti olarak tanıtıldı. Sonra hücreleri timidin engelleme ve nocodazole tedavi, bir mekanik sallamak-off tekniği ile takip birleşimini kullanarak eşitlenir. Eşitlenmiş hücreleri sonra doğrudan 3D kollajen matrisler kapsüllü. Birden çok hücre hücre bölünmesi olaylar verimli bir şekilde düşük-büyütme hızlandırılmış canlı hücre Imaging'i kullanma izlenir. Hangi hücre-matris etkileşim bir göstergesidir, deformasyon kollajen liflerinin confocal yansıma mikroskobu yüksek-büyütme oranında kullanarak izlenir.

Biz daha önce önce sırasında ve sonrasında iki metastatik kanser hücre hatları, insan invaziv duktal Karsinom MDA-MB-231 ve 3D kollajen insan Fibrosarkom HT1080 hücrelerinde mitoz hücre-matris etkileşim ölçmek ve izlemek için bu teknik kullandık matrisler19. Burada sunulan yöntemleri her iki memeli hücre bölünmesi 3D çevre ve hücre-matris etkileşimleri çalışmaya verimli ve genel bir yaklaşım sağlar. MDA-MB-231 hücre satırı kağıt boyunca bir örnek olarak kullanılır. Bu iletişim kuralı gelişimi normal doku ve hastalıkların moleküler temeli yeni anlayışlar sağlar ve ayrıca yeni tanı ve tedavi yaklaşımları tasarımı için izin verebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Gelen doğrulama kuralları, Homewood kurumsal inceleme Kurulu (HIRB) izler.

1. H2B-mCherry hücre mitoz için sabit ifadesi bir Marker olarak

  1. İnsan embriyonik böbrek 293T lentiviral parçacıkları (HEK 293T) nesil hücreleri
    1. Bir 10 cm hücre kültür yemek 5 x 106 hücreler/çanak hücre kültür orta (Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) içeren yüksek glikoz (4,5 g/M), sodyum pyruvate, %10 Fetal sığır Serum (FBS) ve % 1 yoğunluğu, HEK 293T hücrelerdeyse plaka penisilin-streptomisin (kalem/Strep)). 37 ° C ve %5 karbondioksit (CO2), 24 h için kuluçkaya. İstenen confluency hücre transfection gününde yaklaşık 70-%80 olduğunu.
      Not: HEK 293T hücreler burada daha sonra MDA-MB-231 hücre transduce stabil H2B-mCherry ifade bir hücre satırı oluşturmak için kullanılacak viral parçacıkların üretmek için kullanılır. Hücreleri plaka eşit olarak dağıtılır emin olun. Ek hücre plaka bilge bırak ve yavaşça hareket ileri geri plaka bile dağıtım yardımcı olabilir. Hücreleri de tabak veya viral parçacıkların farklı birimler koleksiyonda neden olur diğer boyutlarda şişeler numaralı seribaşı.
    2. Transfection reaktifi (lentiviral vektör, CMV ΔR 8.91 ve pMDG-VSVG) üç Plasmid'ler ile kullanarak HEK 293T hücre transfect. H2B-mCherry kodlama plazmid phosphoglycerate kinaz organizatörü (PGK) ile lentiviral bir vektör klonlanmış. CMV ΔR 8.91 üç gerekli HIV genleri, gag, polve reviçerir. pMDG-VSVG VSV-G zarf gen içerir.
      Not: Ajanlar seçim için birden fazla transfection.
      1. Oda sıcaklığında (RT) ulaşmak için transfection reaktif şişe önce kullanılsın. Ters Çevir'i veya girdap şişeyi kısaca.
      2. Mix 16 µg H2B-mCherry plazmid 6 µg, CMV ΔR 8.91 8 µg ve pMDG-VSVG, düşük serum medya 1 ml 2 µg oluşan DNA. RT 5 min için kuluçkaya.
        Not: Miktar ve oran üç vektörlerin çeşitli ve farklı lentiviral transfer vektörel çizimler için en iyi duruma getirilmiş.
      3. 48 µL ekleyin (DNA oranı 1:3 kullanın: transfection reaktif) Yukarıdaki DNA çözüm içine transfection reaktif ve en az 15 dakikadır RT kuluçkaya.
        Not: DNA transfection reaktif vs oranını çeşitli ve farklı lentiviral transfer vektörel çizimler için en iyi duruma getirilmiş. Transfection reaktif 1,5 mL santrifüj tüpü tarafında ile değil emin olun.
      4. 1.1.2.3. adımda drop-wise hücrelere yapılan DNA-lipid karmaşık çözüm ekleyin. Yavaşça plaka da komplekse eşit dağılımı sağlamak için plaka girdap.
    3. Yaklaşık 6 h transfection sonra orta Aspire edin ve taze hücre kültür orta ekleyin (DMEM yüksek glikoz (4,5 g/M), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep).
    4. Hasat süpernatant 24, 48 ve 72 h sonrası transfection. Her hasat sonrası orta yerine (DMEM, 4,5 g/M glikoz, %10 FBS ve % 1 ile sodyum pyruvate kalem/Strep).
    5. Lentiviral parçacıklar hücresel enkaz kaldırmak için 0,45 µm filtre ile filtre. Alternatif olarak, hücre artıkları ayırmak için süpernatant aşağı spin. Süpernatant iletim için hemen kullanılabilir veya-80 ° C'de depolanan
  2. Hücre nesil stabil ifade H2B-mCherry hatları
    Not: Bu protokol MDA-MB-231 hücreler için ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Deneyinde kullanmadan önce insan meme Karsinomu hücre MDA-MB-231 (fiziksel bilimler Onkoloji Merkezi, NIH) yüksek glikoz (4,5 g/M), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1'i içeren DMEM kültürlü kalem/Strep.
    1. MDA-MB-231 hücre yoğunluğu 1 x 105 hücre bir 35 mm kültür tabak, plaka.
      Not: Farklı hücre hatları için kaplama yoğunluğu optimize edilmelidir ve bu nedenle MDA-MB-231 hücre için en uygun yoğunluğu farklı olabilir.
    2. hücreleri, kaplama sonra 24 h eklemek virüs ve taze orta 1 mL 1 mL (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/L), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep).
    3. Hücreleri bir gecede 6 h dönem için kuluçkaya.
      Not: Her iki virüs ve hacmi kuluçka süresi farklı hücre hatları için optimize edilmiş olması gerekir. Hücreleri bir kaç saat sonra virüs ilavesi sağlıklı görünmüyor, örneğin, 1 mL virüs ve 2 mL taze orta kullanın (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/L), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep) için adım 1.2.2. 1.2.3. adımda kuluçka süresini de azalır.
    4. Orta Aspire edin ve taze orta 10 mL ekleyin (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/M), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep). CO237 ° C ve %5 24-72 saat arasında için kuluçkaya.
    5. H2B-mCherry bir epifluorescence mikroskop kullanarak hücrelerdeki ifade denetleyin.
      Not: iletim verimliliği hücrelerde düşükse, virüs adım 2.2 ve adım 2.3 kuluçka zamanında hacmi artmış.

2. stabil H2B-mCherry ifade hücreleri eşitlenmesi

  1. 50-%60 confluency, Yani plaka 2 x 104 MDA-MB-231 hücre hücreleri 24-şey plaka her kuyuya plaka.
  2. Kültür 37 ° C ve % 5 CO2 24 h için kuluçkaya.
  3. Büyüme orta orta 0.5 mL ile değiştirin (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/L), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep) 2 mM timidin içeren ve 24 saat için kuluçka bırakın.
    Not: timidin için maruz hücreleri hücre büyümesini (G1) aşamasında tutuklandı / DNA sentezi (S) geçiş ve S-faz DNA sentezi inhibisyonu nedeniyle boyunca. Kuluçka süresini çeşitli ve farklı hücre hatları için optimize edilmiştir.
  4. Timidin pozlama hücrelerden fosfat tamponlu tuz (PBS) ile üç kez yıkayarak serbest bırakın. O zaman, normal hücre kültür orta hücrelerde kuluçkaya (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/M), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep) 5 h için.
    Not: Sağlar hücreleri serbest timidin maruz kalma hücrelere hücre büyümesini (G2) ilerleme / Mitotik (M) faz hücreler için daha önce G1/S aşamasında tutuklandı ve daha önce tutuklandı S hücreler için G1 aşama aşama. Yayın süreyi çeşitli ve farklı hücre hatları için optimize edilmiştir.
  5. Nocodazole 12 h için 250 ng/mL hücrelerle engelleyin.
    Not: Nocodazole için maruz hücrelerin tümünü G2/M aşamasında tutuklandı. Nocodazole sitotoksik. Uzun süre maruz kalmak nocodazole apoptosis neden olabilir. Hücre ölüm gözlenen nokta veya pozlama farklı hücre hatları için konsantrasyon ayarlayın. Başarılı bir şekilde eşitlenir hücreleri küresel bir Morfoloji sergileyecek.
  6. 45 için hücreleri sallamayın s 1 dk 150 ila 200 devir / dakikada bir orbital Çalkalayıcı kullanarak.
    Not: küçük substrat bağlılığı var, Mitotik hücre işlemi sırasında sarsılmış.
  7. Hücreleri, bir santrifüj tüpüne orta pipetting tarafından ayıklamak için orta kaldırın ve sonra 0.5 mL taze orta ekleyin (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/L), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep) plaka için her şey.
  8. 2.6 ve 2.7 üç kez arasındaki adımları yineleyin.
  9. 800 x g 3 dk de Mitotik hücre içeren toplanan orta santrifüj kapasitesi.
    Not: Bu adımı nocodazole hücre ortamından kaldırmak için kullanılır.

3. birleşme eşitlenmiş hücreleri kollajen ben matrisler

Not: Tip ı kollajen insan vücudu ve bağ dokusu ECM en bol protein ve bu nedenle yaygın olarak nasıl ökaryotik hücre fonksiyonları bir 3D çevre17,23tarafından,24 modülasyonlu araştırmak için kullanılır . Kollajen Asetik asit çözünür. Nötralize ve kollajen çözüm 20-37 ° c ısınma sonra kollajen monomerleri kollajen liflerinde meshwork polimerize.

  1. 10 x DMEM çözüm DMEM toz, sodyum bikarbonat (NaHCO3) 3.7 g ve 1 g 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) 50 mL distile su içinde bir paket çözülerek hazırlayın. Çözüm filtre uygulamak ve sonra sodyum hidroksit (NaOH) 1 M 2 g NaOH Pelet 50 ml distile su ile çözülerek hazırlamak. Filtre ve aliquot çözüm 1.5 mL santrifüj tüpleri içine.
    Not: Bu adımda Normal DMEM çözüm kullanılmamalıdır. Kollajen çözümün önemli toplu ilavesi orta seyreltik. Bu nedenle konsantre DMEM çözüm DMEM kollajen matris son konsantrasyonu normal DMEM aynı olmasını sağlamak amacıyla hazırlanmıştır.
  2. Adım 2,9 toplanan hücre ile çalışmaya devam. Orta ve yeniden askıya alma hücrelerinin yaklaşık 0,25 - 0,5 mL taze hücre kültür ortamının Aspire edin (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/L), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep).
    Not: belirli hücre yoğunluğu kollajen matris ulaşmaya, süspansiyon hücrelerde ilk yoğunluğu çok düşük olamaz. Böylece, hücreleri yeniden askıya alma için kullanılan orta hacmi toplam kullanılabilir hücre sayısına bağlı olacaktır.
  3. Bir hemasitometre ve sayısı çözüm hücrelerde yoğunluğu 3.2. adımdaki yeniden askıya alınan hücre çözümü yer 10 µL.
  4. 3D kollajen matris yapmak tüm bileşenler için gerekli birimleri belirleyin. 2 µg/µL kollajen jel 500 µL kullanılır burada örnek olarak.
    1. 40.000 hücre/mL (veya kollajen jel 500 µL için 20.000 hücreleri) elde etmek için gereken hücre çözümü hacmi hesaplamak. X. 50 µL 10 x DMEM gerekli µL bu sayısıdır. FBS 50 µL gerekli olacaktır.
    2. Ben stok kollajen hacmi hesaplamak. Kollajen konsantrasyonu ben 4 µg/µL olduğunu. Kollajen µL içinde Y miktarıdır.
    3. Sodyum hidroksit hacmi gereksinimini kollajen çözümde Asetik asit nötralize etmek hesaplamak: Y µL kollajen * 0.023 * 1000 = Z µL NaOH gerekli.
    4. Dolgu çözüm hacmi belirlemek: (500 µL toplam jel - X µL hücreleri - 50 µL 10 X DMEM - FBS 50 µL - Y µL kollajen - Z µL NaOH) R µL =
      Not: Dolgu çözüm distile su. Dolgu çözüm hesaplanan birim negatif bir sayı ise, özgün hücre yoğunluğu hücre süspansiyon çok düşüktür. Hücreleri aşağı tekrar döndü ve orta küçük bir hacim içinde yeniden askıya gerekir (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/L), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep).
  5. Bileşenleri aşağıdaki sırayla temiz 1.5 mL santrifüj tüpü ekleyin: Orta, 10 x DMEM, FBS, deiyonize su (DI), kollajen, NaOH hücrelerde. Tüm bileşenleri kollajen çözüm jelleşme yavaş Buza koyun. Kabarcıklar oluşumunu önlemek için uygun pipetting tekniklerini kullanın.
  6. NaOH ekledikten sonra çözüm ile 1 mL damlalıklı dikkatlice karıştırın.
    Not: Kollajen jelleşme hemen NaOH eklenmesinden sonra doğru başlar. Karıştırma dikkatli ve hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
  7. Çözüm de karışınca çözümün 500 µL 24-şey plaka her şey için ekleyin. 24-şey plaka 37 ° C kuluçka makinesine koyun. Taze hücre kültür ortamın 37 ° C su banyosu içinde.
    Not: Plastik alt plaka düşük-büyütme canlı hücre microcopy çalışma mesafesi lensin cam plakalar yüksek büyütme yaşamak-cep mikroskobu yüksek kısa çalışma mesafesi nedeniyle kullanılan 1 mm. alt yukarıda olduğu için kullanılır büyütme objektif.
  8. Önceden ısıtılmış orta 500 µL ekleyin (DMEM, yüksek glikoz (4,5 g/M), sodyum pyruvate, %10 FBS ve % 1 kalem/Strep) jel adım 3.7 tamamladıktan sonra 30 dk dön.

4. canlı hücre görüntüleme 3D kollajen matrisler (düşük büyütme) bölünmesi hücre

Not: Görüntü hücre 2 dk aralıklarla 10 X amacı ile donatılmış ve görüntüleme yazılımı tarafından kontrollü faz kontrast mikroskop monte bir ücret eşleşmiş cihaz (CCD) kamera ile toplanır.

  1. Üstünde tepe-in objektif lens monte canlı hücre birimi açın. Sıcaklığı 37 ° C'de stabilize, CO2 konsantrasyonu % 5 ve nem % 75 kadar bekleyin.
  2. Mikroskop canlı hücre biriminde jelleri 24-şey tabak koyun. Alt plaka ve plaka derinliklerinden gelen yaklaşık 500 µm, mikroskop odaklanır kadar objektif lens hareket ettirin.
    Not: yakın alt plaka değil tamamen gömülü 3D Matris hücreleri kollajen matris. Alt plaka uzak 500 µm olan hücreler Imaging hücrelerin kenar efektleri16tarafından,17,25etkilenmez sağlayacaktır.
  3. Civarında hücreleri bulmak için sahne taşımak ve görüntüleme için çoklu konumlarını seçin.
  4. 2-dk aralıklarla hızlandırılmış deneme ayarlayın.
    Not: En fazla 2 dk aralığında alınabilir konum sayısı motorlu sahne hareket hızını ve esir alma imge için pozlama süresi uzunluğu ile sınırlıdır.

5. kollajen ağ deformasyon hücre bölünmesi (yüksek büyütme mikroskobu) sırasında

  1. Üstünde tepe-in objektif lens monte canlı hücre birimi açın. Sıcaklığı 37 ° C'de stabilize, CO2 konsantrasyonu % 5 ve nem % 75 kadar bekleyin.
  2. Günahı 3D kollajen matrisler kollajen lifler görselleştirmek için yalnızca yansıyan ışık (488-nm) örnek aydınlatmak için kullanılan 488-nm lazer yakalamak için confocal mikroskop yapılandırın. Lazer bir 60 X su-daldırma amaç, NA kullanır = 1.2, WD = 200 µm ve görüntüleme yazılımı tarafından kontrol edilir.
  3. Örnek (kollajen Matris hücrelerinde) canlı hücre birim içine koymak. Alt plaka ve plaka derinliklerinden gelen yaklaşık 100 µm, mikroskop odaklanır kadar objektif lens hareket ettirin. Alt plaka uzak 100 µm olan hücreler Imaging hücrelerin kenar efektleri tarafından etkilenmez sağlayacaktır.
    Not: su-daldırma amaç burada bir petrol-daldırma lens yerine çalışma mesafesi petrol-daldırma lens sadece yaklaşık 100 µm olduğu için kullanılır. Cam alt plaka kalınlığı normalde yaklaşık 100 µm olarak petrol-daldırma lens kullanımı bir sorun teşkil etmektedir.
  4. Civarında hücreleri bulmak için sahne taşımak ve görüntüleme için çoklu konumlarını seçin.
    Not: Confocal mikroskobu optik örnek kesitler ve sadece odak düzlemi sinyallerini yakalar. Canlı hücreleri hızlandırılmış deneme sırasında odak içinde ve dışında hareketli olabilir. Hücre görüntülerini uzun bir süre içinde yakalama etkinleştirmek için Z-yığın görüntüleri izleyen dilimleri 5 µm aralıklarla toplamak için kullanılır. Toplam 25 µm kapsayan 5 dilim görüntüsü.
  5. 5 dk aralıklarla hızlandırılmış deneme ayarlayın.
    Not: 5 dakika kullanılır burada 2 dk Floresans H2B-mCherry, yansıma kollajen için tarama ve Z-yığın tarama, için tarama dahil olmak üzere birden fazla tarama modu her konuma uygulandığından 4 bölümde kullanılan yerine aralığı olarak. Birden fazla tarama modu kullanımı düşük büyütme Imaging'e karşılaştırıldığında bir pozisyon tarama hızını azaltır.
  6. Kollajen matris bir hücre parçacık velosimetri (PIV) alt piksel çözünürlük20Imaging kullanarak bu hücre tarafından sarf güçleri nedeniyle civarında deformasyon ölçmek. 2D görüntülerde bu çözümlemesini H2B mCherry ve kollajen lifler her iki sinyali Açık görselleştirme için sağlar. Kollajen ağ20sinyal artırmak için filtreleme anisotropic düşük geçiş uygulayın.
  7. İlgi (x,y) yer alan bir görüntü alt bölgesinin yerel deplasman çerçeve k k+ 1 çerçeve, 15 × 15 bölgesel bir pencere ayıklamak için ölçmek için piksel kare k(x,y) merkezli. En iyi Mekanlar (x,y) eşleşen belirlemek * maksimum normalleştirilmiş çapraz korelasyon katsayısı çerçeve k+ 1 elde edilen görüntü özelliği mekanlar arasında. Deformasyon vektör (x,y) hesaplanır *-(x,y).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu makalenin amacı 3D matris işlemlerinde memeli hücre bölünmesi çalışmaya ve sırasında ve sonra hücre bölünmesi hücre ve 3D hücre dışı matriks arasındaki etkileşimler ölçmek için görüntüleme tabanlı yöntem sunmaktır. Hücre mitoz görüntüleme kolaylaştırmak için biz lentiviral iletim kullanarak MDA-MB-231 hücrelere H2B-mCherry dahil. Floresan proteinler ile Birleşik H2B Mitotik bir işareti olarak Mitotik hücre Interphase hücrelerden ayırt etmek ve farklı aşamaları sırasında hücre mitoz19,20,26tanımlamak için kullanılır. Bu yöntemi kullanarak, biz stabil H2B-mCherry 3D kollajen matrisler (şekil 1A) içinde ifade MDA-MB-231 hücre vaziyettesıkışıp işlemi izlemek başardık. Mitotik aşamaları nükleer membran (profaz; 1, çerçeve şekil 1A); mahkemelerine başladı Kromozom yeniden yapılanma (prometafaz: çerçeve 2); Kromozom (metafaz; çerçeve 3); hücre vücut ortasında hizalama ayrılık kromozom (anafaz; çerçeve 4); yeniden yapılanma kromozomlar ve nükleer membran ve iki kızı hücreleri (telofaz/sitokinez, çerçeve 5) organlarının ayrılması.

Nükleer silahların yayılmasına karşı bir 3D Matris hücrelerinde genellikle çok kendi muadilleri hücre bölünmesi 3D daha az verimli19izleme işler 2D bir yüzey üzerinde daha düşük oranıdır. 3D hücre bölünmesi eğitim verimliliğini artırmak için timidin, nocodazole ve senkronize ve Mitotik aşamasında olan MDA-MB-231 hücreleri seçmek için bir shake-off tekniği birleştiren bir yöntem çalıştırmaya başladık. Eşitlenmiş hücreleri sonra kollajen matrisler gömülü. Birden çok hücre bölünme sürecinin gerçek zamanlı kullanma sınıf başkanı canlı hücre düşsel vasıl 10 X büyütme. Böylece mitoz 3D (Şekil 2) verimli izlenmesi için izin ilk 2 h kollajen matris (Resim 2), kuruluşundan sonra içinde hücrelerin % 70'i ayrılır.

Hücreleri ve onların çevresindeki kollajen matrisler arasındaki etkileşimi izlemek için görüntü kollajen lifleri için confocal yansıma mikroskobu ve hücreleri görüntüye Floresans mikroskobu kombine. 60 X objektif yüksek-nitelik imge kollajen liflerinin yakalama için sağlar. Her görüş alanı daha az hücreleri yakalar, bir yüksek büyütme objektif kullanarak Imaging fazla alt işlem hacmi düşük-büyütme 10 X veya 20 X kullanımı karşılaştırılır. Eşitlenmiş hücrelerin çoğu içinde ilk 2 h kollajen matris oluşumu sonra bölmek beri başarılı eşitleme hücrelerin verimliliğini ve böyle bir deneme-den geçerek büyük ölçüde artırır. Matris deformasyon sırasında ve sonra hücre bölünmesi (görüntülenmeyecektir temsilcisi anlık görüntüleri şekil 1Badımında gösterilir) olduğunu ve bir özel PIV yazılım kullanarak sayılabilir. Sayısal ve matris deformasyon interfaz ve Mitotik aşamasında içine senkronize hücreler için Mitotik faz sırasında karşılaştırılır. Biz matris deformasyon çok az değişim gözlenen Mitotik sırasında (şekil 3A) aşama ve deformasyon daha az sonrası Mitotik aşamalarında (şekil 3B) görülmektedir. Bu sonuç Mitotik aşamasında oldukları sırada memeli hücreleri en az ek ve çevresindeki matris ile etkileşimleri olduğunu gösterir.

Figure 1
Şekil 1: temsilcisi filmler yüksek büyütme canlı hücre görüntüleme videodan MDA-MB-231 hücre elde stabil H2B-mCherry ifade eden kollajen dizey içinde gömülü. (A) MDA-MB-231 hücre Mitotik ilerlemesini, farklı aşamalarını H2B-mCherry tarafından kırmızı etiketli olarak tanımlanır. (B) Mitotik işlemi sırasında (beyaz) kolajen lifleri zamana bağımlı confocal yansıma mikroskobu tarafından görüntülenmiştir. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: 3D kollajen matrisler eşitlenmiş hücrelerde bölünmesi. Hücreleri G2/M aşamaya eşzamanlı ve kollajen dizey içinde gömülü. Eşitleme bölmek rasgele kontrol hücreleri, ancak eşitlenmiş hücrelerinin % 70'i ilk 2 saat içinde bölün. Hata çubuğu SEM (ortalama, standart hata) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: matris deformasyon MDA-MB-231 için miktar hücreleri interfaz ve mitoz sırasında. (A) matris deformasyon matris gömülü MDA-MB-231 hücrelerin büyüklüğü değişikliği. Yeşil ok profaz gösterir ve kırmızı ok telofaz gösterir. MDA-MB-231 hücreler için matris deformasyon interfaz ve Mitotik faz sırasında (B) matris deformasyon hücre bölünmesi sırasında çok az olduğunu belirten miktar. Hata çubuğu SEM (ortalama, standart hata) =. * p < 0,05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hücre bölünmesi 3D önceki çalışmada deneysel sınırlamalar ve teknik sorunlar18,19nedeniyle verimli değildi. Memeli hücre bölünmesi 3D kollajen matrisler içinde verimli çalışması için kritik adımlar şunlardır: (1) birleşme Floresans etiketli Mitotik işaretleri hücrelere; (2 eşitlenmesi hücre bölünmesi; ve (3) 3D matrisler canlı hücre görüntüleme tekniği, confocal yansıması zaman çözüldü mikroskobu ve nicel görüntüleme analizi kullanarak bölümü olayları izleme.

2D yüzeylerde Mitotik hücre onların morfolojisi dayalı Interphase hücrelerden ayırt edilebilir, yani Mitotik hücre yuvarlak ve Interphase hücreleri dağılın ve sıkıca bağlamak belgili tanımlık substrate ise zar zor için belgili tanımlık substrate ekleyebilirsiniz. 3D matrisler, ancak, hücre morfolojisi Mitotik hücre için güvenilir bir işaretleyici beri bazı hücreler zar zor yayılmış değildir ve matris27,28yuvarlak kalır. Böylece, Mitotik bir işaretçi 3D matris hücre bölünmesi incelenmesi için hücreleri takdim etmek esastır. Stabil H2B-mCherry profaz, prometafaz, metafaz, anafaz ve telofaz/sitokinez dahil olmak üzere farklı Mitotik aşamaları için güvenilir bir işareti olarak hizmet MDA-MB-231 hücrelerdeki dile getirdi. Daha önce 3D Matris hücrelerinde Interphase Mitotik hücrelerden ayırt etmek için bu yaklaşım kullanılan. Bu işaretleyici yardımıyla, ayrıca 2D yüzeylerde ve 3B matrisleri19bölen HT1080 hücreleri, Mitotik aşama için başka bir hücreyi satır uzunluğunu ölçmek başardık.

Serum açlık29, Mitotik sallamak-off30,31,32ve nocodazole32engelleme Çift Kişilik timidin dahil olmak üzere hücreleri eşitlemek için birden çok yolu vardır. Timidin tedavi ve verimli bir şekilde MDA-MB-231 hücre G2/M faz eşitlemek için nocodazole tedavi kombine. Timidin için maruz hücreleri G1/S geçiş ve DNA sentezi inhibisyonu nedeniyle S faz boyunca timidin tarafından tutuklandı. Hücreleri serbest timidin maruz hücreleri ilerleme G2/M aşamasında G1/S aşamasında tutuklanan hücrelerin ve G1 S aşamasında tutuklanan hücreler için izin. Nocodazole için maruz tüm hücreleri G2/M aşamasında tutuklandı. Mitotik faz girerek yuvarlanmış hücreleri sonra sarsıldı-plaka off ve doğrudan kollajen matrisler kapsüllenir. Kollajen matrisler (Şekil 2) dahil edilmiştir sonra hücrelerin % 70'i içinde 2 h bölmek gösterdi. Alternatif olarak, hücreleri kollajen matrisler eşitleme önce içinde katıştırılmış, ancak, kollajen matris çapraz bağlı ağ fiziksel bir engel sunar ve biyomoleküler Difüzyon ve konveksiyon33, oranını azaltır 34. Nitekim, biz hücreleri kollajen matrisler timidin ve nocodazole kullanarak eşitlemek çalıştı, ama verimli eşitleme elde edilemedi. Bu verimsiz Difüzyon ve konveksiyon yoluyla kollajen matris ilaçların nedeniyle olabilir.

Yansıma optik içsel bir kollajen dahil olmak üzere birçok biyopolimer özelliğidir. Confocal yansıması mikroskobu tekniği görüntüler ve gözenekli Biyomalzeme hazırlanan sentetik Polimerler ve 3D kollajen matrisler23,24,35,36 microtopography quantitates ,37. Bizim laboratuvar teknikleri38kollajen konsantrasyonu değişir gibi kollajen lif polarite içinde değişiklikleri izlemek için kurduk. Burada, cep-matris etkileşimi göstermek için yansıtıcı confocal görüntüler time-lapse video dayalı kollajen liflerinin deformasyon izlenecek yöntem açıklanmaktadır. Matris deformasyon Mitotik MDA-MB-231 hücreler için önemli ölçüde daha küçük memeli hücreleri en az ek ve etkileşim var öneriyor Interphase bu hücrelere daha burada sunulan temsilcisi sonuçları göster Mitotik faz19girdiğinizde matris çevreleyen.

Daha önce confocal yansıma mikroskobu öncesinde, sırasında ve sonra HT1080 hücreler mitoz hücre-matris etkileşim ölçmek ve izlemek için kullanılır. Β1 integrin knock-down HT1080 hücreleri tarafından matris deformasyon interfaz ve Mitotik faz sırasında da sınıf başkanı. Β1 integrin önemli ölçüde tüketen hücre matris deformasyon Interphase sırasında azaltır. Ancak, matris deformasyon Mitotik aşamasında yuvarlak β1-integrin nakavt (KD) hücreleri ve HT1080 vahşi türü hücre19hiçbir fark yoktur.

Kollajen lifleri görselleştirmek için alternatif bir yaklaşım Floresans Birleşik istihdam etmektir tip ı kollajen. Biz daha önce hücreleri19tarafından oluşturulan kollajen matrisler görüntü parça bu yaklaşım kullanılır. Bu yaklaşım, ancak, kollajen floresan boya gibi floresein isothiocyanate (FITC), hem zaman alıcı ve daha az verimli etiketleme gerektirir. Öte yandan, confocal yansıma mikroskobu zaman ve kaynak tasarrufu veya floresan photobleaching ile ilgili sorunları çıkartmak için değiştirilmemiş kollajen doğrudan uygulanabilir. Ayrıca, bu yöntem tek bir floresan kanal gerektirmez ve bu nedenle tüm floresan boyalar ile uyumludur.

Bu raporda sunulan yöntem potansiyel olarak 3D kollajen dizey içinde bölmek memeli hücreleri her türlü uygulanabilir. Her ne kadar farklı hücre türleri tarafından lentivirus verimliliği iletim için çeşitli H2B-mCherry işaretçisi birleşme diğer memeli hücreleri lentiviral iletim tarafından içine tam olarak aynı yordamları gazetede, açıklandığı gibi takip edecek 39. her iki hücreleri iletim sırasında yoğunluğunu ve virüs titresi verimlilik için optimize. Eğer yüksek iletim verimliliği elde hücreleri floresan yardımlı hücre (FACS) sıralama tarafından seçilmiş olabilir. Timidin engelleme ve nocodazole memeli hücreleri, HeLa40gibi bazı başka tür başarıyla eşitlemeye uygulanır. Mekanik shake kapalı o kadar yuvarlak ve zar zor için belgili tanımlık substrate sırasında Mitotik faz30,31eklemek herhangi bir hücre tipleri için uygulanabilir. Ayrıca, kolajen liflerinin confocal yansıma mikroskobu ve matris deformasyon miktar kullanarak görüntüleme memeli hücre bölünmesi tüm diğer türleri için doğrudan uygulanabilir.

Burada sunulan memeli hücre bölünmesi ve hücre-matris etkileşimleri 3D ortamında çalışmaya verimli ve genel bir yaklaşım yöntemidir. Yaklaşım gelişimi normal doku ve hastalıkların moleküler temeli bizim soruşturma kolaylaştırır ve roman tanılama tasarımını potentiates ve tedavi edici yaklaşımlar gelecekte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

Bu eser NIH tarafından desteklenen R01CA174388 ve U54CA143868 verir. Yazarlar Wei-tong Chen desteği için Johns Hopkins Üniversitesi'nden PURA ödülü kabul etmek istiyorum. Bu malzeme Ulusal Bilim Vakfı yüksek lisans araştırma bursu Grant No 1232825 altında tarafından desteklenen çalışma üzerine kuruludur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human embryonic kidney 293T ATCC
MDA-MB-231 Physical Sciences Oncology Center, NIH
DMEM Corning 10-013-CV
DMEM powder ThermoFisher Scientific 12100-046
Fetal bovine serum Hyclone SH30910.03
Penicillin-Streptomycin 100X Sigma-Aldrich P0781
Fugene HD Promega E2311
Lipofectamine 2000 Life technologies 11668-07
Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector Addgene plasmid 21217
Thymidine Sigma-Aldrich T1895
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
Opti-MEM Life Technologies 31985-070
Sodium bicarbonate GibcoBRL 11810-025
HEPES Sigma-Aldrich 113375-100
Collagen Corning 354236
NaOH J.T. Bake 3722-01
Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm Millipore SLHVM33RS
Nikon TE2000E epifluorescence microscope Nikon TE2000E
Cascade 1K CCD camera Roper Scientific
NIS-Elements AR imaging software Nikon
Nikon A1 confocal microscope Nikon A1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. Mitotic misregulation and human aging. Science. 287, (5462), 2486-2492 (2000).
  2. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122, (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  3. Brinkley, B. R. Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division. Trends Cell Biol. 11, (1), 18-21 (2001).
  4. Phillip, J. M., Aifuwa, I., Walston, J., Wirtz, D. The Mechanobiology of Aging. Annu Rev Biomed Eng. 17, 113-141 (2015).
  5. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, (5), 646-674 (2011).
  6. Martin, M. D., et al. Effect of ablation or inhibition of stromal matrix metalloproteinase-9 on lung metastasis in a breast cancer model is dependent on genetic background. Cancer Res. 68, (15), 6251-6259 (2008).
  7. Knox, J. J., Hotte, S. J., Kollmannsberger, C., Winquist, E., Fisher, B., Eisenhauer, E. A. Phase II study of Triapine in patients with metastatic renal cell carcinoma: a trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (NCIC IND.161). Invest New Drugs. 25, (5), 471-477 (2007).
  8. Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D. L., Fojo, A. T. Inhibitors targeting mitosis: tales of how great drugs against a promising target were brought down by a flawed rationale. Clin Cancer Res. 18, (1), 51-63 (2012).
  9. Tong, W. G., et al. Phase I and pharmacologic study of SNS-032, a potent and selective Cdk2, 7, and 9 inhibitor, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma. J Clin Oncol. 28, (18), 3015-3022 (2010).
  10. Matulonis, U. A., et al. Phase II study of MLN8237 (alisertib), an investigational Aurora A kinase inhibitor, in patients with platinum-resistant or -refractory epithelial ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal carcinoma. Gynecol Oncol. 127, (1), 63-69 (2012).
  11. Boss, D. S., et al. Clinical evaluation of AZD1152, an i.v. inhibitor of Aurora B kinase, in patients with solid malignant tumors. Ann Oncol. 22, (2), 431-437 (2011).
  12. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, (3), 211-224 (2006).
  13. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, (5547), 1708-1712 (2001).
  14. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196, (4), 395-406 (2012).
  15. Giri, A., et al. The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration. FASEB J. 27, (10), 4089-4099 (2013).
  16. Fraley, S. I., Feng, Y., Giri, A., Longmore, G. D., Wirtz, D. Dimensional and temporal controls of three-dimensional cell migration by zyxin and binding partners. Nat Commun. 3, 719 (2012).
  17. Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12, (6), 598-604 (2010).
  18. Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. J Cell Biol. 205, (2), 155-162 (2014).
  19. He, L., et al. Local 3D matrix confinement determines division axis through cell shape. Oncotarget. 7, (6), 6994-7011 (2016).
  20. Held, M., et al. CellCognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, (9), 747-754 (2010).
  21. Fallica, B., Maffei, J. S., Makin, G., Zaman, M. Alteration of cellular behavior and response to PI3K pathway inhibition by culture in 3D collagen gels. PLoS One. 7, (10), e48024 (2012).
  22. Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33, (35), 9087-9096 (2012).
  23. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-20 (2010).
  24. Gunzer, M., Kampgen, E., Brocker, E. B., Zanker, K. S., Friedl, P. Migration of dendritic cells in 3D-collagen lattices. Visualisation of dynamic interactions with the substratum and the distribution of surface structures via a novel confocal reflection imaging technique. Adv Exp Med Biol. 417, 97-103 (1997).
  25. Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. J Vis Exp. (80), e50763 (2013).
  26. Lleres, D., James, J., Swift, S., Norman, D. G., Lamond, A. I. Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET. J Cell Biol. 187, (4), 481-496 (2009).
  27. Poincloux, R., et al. Contractility of the cell rear drives invasion of breast tumor cells in 3D Matrigel. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (5), 1943-1948 (2011).
  28. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33, (16), 4157-4165 (2012).
  29. Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods Mol Biol. 761, 75-83 (2011).
  30. Jackman, J., O'Connor, P. M. Methods for synchronizing cells at specific stages of the cell cycle. Curr Protoc Cell Biol. 8, (2001).
  31. Zwanenburg, T. S. Standardized shake-off to synchronize cultured CHO cells. Mutat Res. 120, (2-3), 151-159 (1983).
  32. Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol Biol. 296, 157-166 (2005).
  33. Kihara, T., Ito, J., Miyake, J. Measurement of biomolecular diffusion in extracellular matrix condensed by fibroblasts using fluorescence correlation spectroscopy. PLoS One. 8, (11), e82382 (2013).
  34. Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys J. 83, (3), 1650-1660 (2002).
  35. Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling. PLoS One. 6, (9), e24891 (2011).
  36. Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20, (8), 931-941 (2009).
  37. Petroll, W. M. Differential interference contrast and confocal reflectance imaging of collagen organization in three-dimensional matrices. Scanning. 28, (6), 305-310 (2006).
  38. Fraley, S. I., et al. Three-dimensional matrix fiber alignment modulates cell migration and MT1-MMP utility by spatially and temporally directing protrusions. Sci Rep. 5, 14580 (2015).
  39. Ikeda, Y., Collins, M. K., Radcliffe, P. A., Mitrophanous, K. A., Takeuchi, Y. Gene transduction efficiency in cells of different species by HIV and EIAV vectors. Gene Ther. 9, (14), 932-938 (2002).
  40. Ma, H. T., Poon, R. Y. Synchronization of HeLa cells. Methods Mol Biol. 761, 151-161 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics