Pattedyr celledeling i 3D matriser via kvantitative AC Confocal refleksjon mikroskopi

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokollen effektivt studier pattedyr celledeling i 3D kollagen matriser ved å integrere synkronisering av cellen divisjon, overvåking av løpene i 3D matriser med live-celle tenkelig teknikk, tid-løst AC confocal refleksjon mikroskopi og kvantitativ tenkelig analyse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

He, L., Sneider, A., Chen, W., Karl, M., Prasath, V., Wu, P. H., Mattson, G., Wirtz, D. Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy. J. Vis. Exp. (129), e56364, doi:10.3791/56364 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Studiet av hvordan pattedyr celledeling er regulert i en 3D miljø forblir stort sett uutforsket tross sin fysiologiske relevans og terapeutiske betydning. Mulige årsaker til mangel på leting er eksperimentell begrensninger og tekniske utfordringer som gjengir studiet av cellen divisjon i 3D kultur ineffektiv. Her beskriver vi en imaging-basert metode for å effektivt studere pattedyr celledeling og celle-matrix samhandlinger i 3D kollagen matriser. Celler merket med fluorescerende H2B synkroniseres med kombinasjonen av thymidine blokkerer og nocodazole behandling, etterfulgt av en mekanisk riste av teknikk. Synkroniserte celler er innebygd i en 3D kollagen matrise. Celledeling overvåkes ved hjelp av live-celle mikroskopi. Deformasjon av kollagen fibrene under og etter celledeling, som er en indikator på cellen matrise samhandling, kan overvåkes og kvantifisert ved hjelp av kvantitative AC confocal refleksjon mikroskopi. Metoden gir en effektiv og generell tilnærming for å studere pattedyr celledeling og celle-matrix interaksjoner i en fysiologisk relevante 3D-miljø. Denne tilnærmingen ikke bare gir ny innsikt i molekylær grunnlaget for utviklingen av normalt vev og sykdommer, men gir også mulighet for utformingen av romanen diagnostiske og terapeutiske tilnærminger.

Introduction

Cellen mitose er en kritisk hendelse i mobilnettet liv, regulering av som spiller avgjørende roller i vev og organ utvikling. Unormal mitose er innblandet i naturlig genetisk variasjoner, menneskelige aldring prosesser og progresjon av kreft,1,,2,,3,,4,,5. Økt er spredning av kreftceller sammenlignet med normale celler ett av kjennetegnene av kreft, tross at cellen atferd er ganske heterogene blant annet typer av svulst og selv blant pasienter. Til tross for lovende prekliniske resultater vist noen nyutviklet antimitotic stoffer ikke seg for å være effektive i kliniske studier6,7,8,9,10 ,11. Relevansen av eksperimentelle og prekliniske modeller har vurderes. Mange typer normale pattedyr og kreft celler dele i tredimensjonale (3D) matriser, som fibroblaster og fibrosarcoma celler i kollagen-rike 3D bindevev og metastatisk kreftceller i 3D stromal ekstracellulær matrix (EFM). Imidlertid er det store flertallet av pattedyr celledeling eksperimenter og analyser utført på celler kultivert på todimensjonale (2D) underlag. En konstruert 3D matrise kan bedre recapitulate mikrostruktur, mekaniske egenskaper og biokjemiske signaler av 3D ECM både normal og patologisk vev12,13,14, 15,16,17.

Studiet av hvordan pattedyr celledeling er regulert i 3D miljøer forblir stort sett uutforsket til tross for både fysiologiske relevansen og terapeutiske betydning18,19. Mulige årsaker inkluderer tekniske problemer og eksperimentelle utfordringer knyttet studere celledeling i 3D matriser. Cellen mitose utgjør en timelig brøkdel i hele cellen syklus20. Tidligere arbeid har vist at spredning frekvensen av mange pattedyrceller, som menneskelig bryst adenocarcinoma MCF-7, menneskelige osteosarcoma U2OS og menneskelige lever HepG2, er mye lavere i 3D matriser sammenlignet med sine kolleger på 2D underlag21, 22. Videre flytte celler i 3D matriser av fokus under live-celle bildebehandling. Alle disse faktorene bidra til ekstremt lav effektivitet av fange celledeling hendelser i 3D kultur med imaging teknikker.

Interaksjoner mellom de ECM og spille viktige roller i å regulere celledelinger. Her beskriver vi tilnærming for å effektivt studere pattedyr celledeling i 3D kollagen matriser. Metoden inneholder inkorporering av mitotisk indikatorer som cellene, synkronisering av cellen divisjon, samt overvåking av løpene i 3D matriser med live-celle tenkelig teknikk, tid-løst AC confocal refleksjon mikroskopi, og kvantitativ tenkelig analyse. Fluorescens-merket histone protein H2B er først introdusert i cellene som en markør å skille mitotisk og interphase celler. Deretter synkroniseres cellene med kombinasjonen av thymidine blokkerer og nocodazole behandling, etterfulgt av en mekanisk riste av teknikk. Synkroniserte celler er deretter direkte innkapslet i 3D kollagen matriser. Celledeling hendelsene i flere celler, overvåkes effektivt med lav forstørrelse time-lapse live-celle imaging. Deformasjon av kollagen fibrene, som er en indikator på cellen matrise samhandling, overvåkes med AC confocal refleksjon mikroskopi på høy forstørrelse.

Vi har brukt denne teknikken til å overvåke og kvantifisere celle matrise samhandling før, under og etter mitose to metastatisk kreftcelle linjer, menneskelige invasiv ductal karsinom MDA-MB-231 og menneskelig fibrosarcoma HT1080 celler, i 3D kollagen matriser19. Metodene presenteres her gi en effektiv og generell tilnærming for å studere både pattedyr celledeling i et 3D-miljø og celle-matrise interaksjoner. MDA-MB-231 celle linjen brukes som et eksempel gjennom papiret. Denne protokollen gir ny innsikt i molekylær grunnlaget for utviklingen av normalt vev og sykdommer, og kan også tillate for design av romanen diagnostiske og terapeutiske tilnærminger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen gitt følger retningslinjene av The Homewood institusjonelle Review Board (HIRB).

1. stabil uttrykk for H2B-mCherry som en markør for cellen mitose

  1. Generasjon av lentiviral partikler fra menneskelige embryonale nyre 293T (HEK 293T) celler
    1. Plate HEK 293T cellene i en 10 cm celle kultur parabol på tettheten av 5 x 106 celler/parabolen i celle kultur medium (Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) inneholder høy glukose (4.5 g/L), natrium pyruvate, 10% fosterets Bovine Serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (penn/Strep)). Inkuber 24 h på 37 ° C og 5% karbondioksid (CO2). Den ønskede confluency cellene i dag hva er ca 70-80%.
      Merk: HEK 293T celler brukes her til å produsere virus partikler, som skal brukes senere til transduce MDA-MB-231 celler for å generere en celle linje stabilt uttrykke H2B-mCherry. Kontroller at cellene er jevnt fordelt i hele platen. Tillegg av cellene slippe klok til platen, og forsiktig bevegelige plate og tilbake kan hjelpe i jevn fordeling. Cellene kan også bli sådd i plater eller flasker av andre størrelser, som vil resultere i samlingen av ulike mengder virus partikler.
    2. Transfect HEK 293T cellene med en transfection reagens med tre plasmider (lentiviral vektor CMV ΔR 8.91 og pMDG-VSVG). Plasmider koding H2B-mCherry er klonet i en lentiviral vektor med phosphoglycerate kinase promoter (PGK). CMV ΔR 8.91 inneholder tre nødvendige HIV gener, kneble, polog rev. pMDG-VSVG inneholder VSV-G konvolutt genet.
      Merk: Det er flere transfection agenter å velge mellom.
      1. Tillate ampullen av transfection reagensen til romtemperatur (RT) før bruk. Inverter eller vortex ampullen kort.
      2. Mix 16 µg av DNA, som består av 6 µg av H2B-mCherry plasmider, 8 µg av CMV ΔR 8.91 og 2 µg av pMDG-VSVG, i 1 mL av redusert serum media. Ruge på RT i 5 min.
        Merk: Mengden og forholdet mellom tre vektorer er variert og optimalisert for lentiviral overføre vektorer.
      3. Legge til 48 µL (bruk 1:3 forholdet mellom DNA: hva reagens) av hva reagensen i ovenstående DNA løsning, og deretter ruge på RT i minst 15 min.
        Merk: Forholdet mellom DNA vs transfection reagens er variert og optimalisert for lentiviral overføre vektorer. Kontroller at transfection reagensen ikke får kontakt siden av 1,5 mL sentrifuge røret.
      4. Legge til DNA-lipid kompleks løsning laget i trinn 1.1.2.3 drop-wise til cellene. Forsiktig snurr den for å sikre jevn fordeling av komplekset i platen.
    3. Ca 6 timer etter transfection, Sug opp mediet og legge frisk celle kultur medium (DMEM med høy glukose (4.5 g/L), natrium pyruvate, 10% FBS og 1% penn/Strep).
    4. Høste supernatant 24, 48 og 72 h etter hva. Erstatt medium etter hver innhøsting (DMEM, 4,5 finans glukose, natrium pyruvate, med 10% FBS, og 1% penn/Strep).
    5. Filtrere lentiviral partikler gjennom et 0,45 µm filter fjerne mobilnettet rusk. Alternativt Nedspinning nedbryting skille ut celle rusk. Nedbryting kan brukes for signaltransduksjon umiddelbart, eller kan lagres på-80 ° C.
  2. Generering av linjer stabilt uttrykke H2B-mCherry
    Merk: Denne protokollen er beskrevet i detalj for MDA-MB-231 celler. Før bruk i eksperimentet, menneskelig bryst karsinom celler MDA-MB-231 (Physical Sciences onkologi Center, NIH) er kultivert i DMEM som inneholder høy glukose (4.5 g/L), natrium pyruvate, 10% FBS og 1% penn/Strep.
    1. Plate MDA-MB-231 cellene på tettheten av 1 x 105 celler i en 35 mm kultur parabol.
      Merk: Tettheten av plating for forskjellige linjer skal være optimalisert, og derfor kan være forskjellig fra den optimale tettheten for MDA-MB-231 cellene.
    2. 24 timer etter plating cellene, legge til 1 mL av virus og 1 mL av fersk medium (DMEM, høy glukose (4.5 g/L), natrium pyruvate, 10% FBS og 1% penn/Strep).
    3. Inkuber cellene for en tidsperiode 6 h overnight.
      Merk: Begge volumet viruset og inkubasjon må optimaliseres for forskjellige linjer. For eksempel hvis cellene ikke se sunn noen timer etter at viruset, bruke 1 mL av virus og 2 mL av fersk medium (DMEM, høy glukose (4.5 g/L), natrium pyruvate, 10% FBS og 1% penn/Strep) for trinn 1.2.2. Den inkubasjon tiden i trinn 1.2.3 kan også reduseres.
    4. Sug opp mediet og tilsett 10 mL av fersk medium (DMEM, høy glukose (4.5 g/L), natrium pyruvate, 10% FBS og 1% penn/Strep). Inkuber mellom 24 til 72 h 37 ° C og 5% CO2.
    5. Sjekk uttrykk for H2B-mCherry i celler ved hjelp av en epifluorescence mikroskop.
      Merk: Hvis signaltransduksjon effektivitet er lav i cellene, volumet virus i trinn 2.2 og inkubasjon i trinn 2.3 kan øke.

2. synkronisering av cellene stabilt uttrykke H2B-mCherry

  1. Plate cellene på 50 til 60% confluency, dvs plate 2 x 104 MDA-MB-231 celler i hver brønn av en 24-vel plate.
  2. Inkuber kulturen på 37 ° C og 5% CO2 24 h.
  3. Erstatte vekstmediet med 0,5 mL av medium (DMEM, høy glukose (4.5 g/L), natrium pyruvate, 10% FBS og 1% penn/Strep) som inneholder 2 mM thymidine og la i inkubator for 24 timer.
    Merk: Celler utsatt for thymidine er arrestert i fasen av cellevekst (G1) / DNA syntese (S) transition og gjennom S-fase på grunn av hemming av DNA-syntese. Inkubasjon tiden bør variert og optimalisert for ulike linjer.
  4. Frigi cellene fra thymidine eksponering ved å vaske dem med fosfat bufret saltvann (PBS) tre ganger. Deretter ruge celler i normal celle kultur medium (DMEM, høy glukose (4.5 g/L), natrium pyruvate, 10% FBS og 1% penn/Strep) for 5 h.
    Merk: Utgivelsen av cellene fra thymidine eksponering lar cellene fremgang til cellevekst (G2) / mitotisk (M) for cellene tidligere arrestert på G1/S fasen og til G1 fase for cellene tidligere arrestert på S fase. Utgivelsen tiden skal være varierte og optimalisert for ulike linjer.
  5. Blokkere cellene med 250 ng/mL nocodazole 12 h.
    Merk: Alle utsatt for nocodazole er arrestert på G2/M fasen. Nocodazole er cytotoksisk. Langvarig eksponering for nocodazole kan forårsake apoptose. Justere periode eller konsentrasjon av eksponering for ulike linjer hvis cellen dødsfall er observert. Celler som er synkronisert har en sfærisk morfologi.
  6. Riste celler for 45 s til 1 min med en orbital shaker på 150 til 200 rpm.
    Merk: Mitotisk celler, som har lite tilslutning til underlaget, skal skjelve under prosessen.
  7. Fjerne mediet for å pakke ut celler, av pipettering mediet i en sentrifuge tube, og legg deretter til 0,5 mL av fersk medium (DMEM, høy glukose (4.5 g/L), natrium pyruvate, 10% FBS og 1% penn/Strep) til hver brønn av platen.
  8. Gjenta 2.6 og 2,7 tre ganger.
  9. Sentrifuge samlet inn mediet som inneholder mitotisk cellene på 800 x g i 3 minutter.
    Merk: Dette trinnet brukes til å fjerne nocodazole fra cellen medium.

3. innlemmelse av den synkroniserte celler i kollagen jeg matriser

Merk: Type I kollagen er det mest rikelig proteinet i kroppen og ECM bindevev, og derfor er mye brukt til å undersøke hvordan eukaryote celle funksjoner er modulert av en 3D-miljø17,23,24 . Kollagen er løselig i eddiksyre. Etter nøytralisere og oppvarming kollagen løsningen på 20-37 ° C, danner kollagen monomerer i en meshwork av kollagen fibrils.

  1. Klargjør 10 x DMEM løsningen ved oppløsende en pakke av DMEM pulver, 3,7 g natriumbikarbonat (NaHCO3) og 1 g 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) i 50 mL destillert vann. Filtrere løsningen og deretter forberede 1 M av natriumhydroksid (NaOH) ved å løse opp 2 g av NaOH pellets i 50 mL destillert vann. Filter og aliquot løsningen i 1,5 mL sentrifuge rør.
    Merk: Normal DMEM løsning bør ikke brukes i dette trinnet. Tillegg av betydelige volumet av kollagen løsningen vil utvanne medium. Derfor er konsentrert DMEM løsningen forberedt på å sikre at den endelige konsentrasjonen av DMEM i kollagen matrisen vil være den samme som den vanlige DMEM.
  2. Fortsette å arbeide med celler fra trinn 2.9. Sug opp medium, og å suspendere celler i ca 0,25 - 0,5 mL frisk celle kultur medium (DMEM, høy glukose (4.5 g/L), natrium pyruvate, 10% FBS og 1% penn/Strep).
    NOTE For å nå en bestemt celle tetthet i kollagen matrix, første tettheten av cellene i suspensjon kan ikke være for lavt. Dermed avhenger volumet av mediet som brukes til å suspendere cellene av antall tilgjengelige celler.
  3. Sted 10 µL av nytt suspendert celle løsningen fra trinn 3.2 hemocytometer og antall tettheten av cellene i løsningen.
  4. Bestemme volumene som trengs for alle komponenter gjøre 3D kollagen matrix. 500 µL av 2 µg/µL kollagen gel brukes her som eksempel.
    1. Beregne volumet av cellen løsningen måtte få 40.000 celler/mL (eller 20.000 celler for de 500 µL av kollagen gel). Dette nummeret i µL er X. 50 µL av 10 x DMEM vil være nødvendig. 50 µL av FBS vil være nødvendig.
    2. Beregne volumet av kollagen jeg lager nødvendig. Konsentrasjonen av kollagen er rundt 4 µg/µL. Mengden av kollagen som trengs i µL er Y.
    3. Beregne volumet av natriumhydroksid trenger å nøytralisere eddiksyre i kollagen løsningen: Y µL kollagen * 0.023 * 1000 = Z µL NaOH nødvendig.
    4. Finne volumet av filler løsningen: (500 µL totale gel - X µL celler - 50 µL 10 X DMEM - 50 µL av FBS - Y µL kollagen - Z µL NaOH) = R µL
      Merk: Filler løsningen er destillert vann. Hvis den beregnede mengden filler løsningen er et negativt tall, er opprinnelige cellen tettheten i cellen suspensjon for lavt. Cellene må være spunnet ned igjen og igjen suspendert i et mindre volum av medium (DMEM, høy glukose (4.5 g/L), natrium pyruvate, 10% FBS og 1% penn/Strep).
  5. Legger du til komponentene i følgende rekkefølge til en ren 1,5 mL sentrifuge tube: celler i medium, 10 x DMEM, FBS, deionisert (DI) vann, kollagen, NaOH. Plassere alle komponentene på isen tregere gelation kollagen løsningen. Bruk riktig pipettering teknikker for å hindre dannelsen av bobler.
  6. Etter tilføyer NaOH, bland løsningen nøye med en 1 mL pipetter.
    Merk: Gelation av kollagen starter rett umiddelbart etter tilsetning av NaOH. Blande bør gjøres nøye og raskt.
  7. Når løsningen er godt blandet, tilsett 500 µL av løsningen hver brønn av 24-vel plate. Sted 24-vel platen i 37 ° C inkubator. Plass frisk celle kultur medium i vannbad 37 ° C.
    Merk: Plast bunnplater brukes for lav-forstørrelse live-celle microcopy der arbeidsavstand av linsen er over 1 mm. Glass bunn plater brukes for høy forstørrelse live-celle mikroskopi på grunn av den korte arbeidsavstand av høy forstørrelse linse.
  8. Legge til 500 µL av forvarmes medium (DMEM, høy glukose (4.5 g/L), natrium pyruvate, 10% FBS og 1% penn/Strep) til toppen av gel 30 min etter fullført trinn 3.7.

4. levende celle Imaging cellene dele i 3D kollagen matriser (lav forstørrelse)

Merk: Bilder av celler er samlet i 2 min intervaller bruker et charge koplede enhet (CCD) kamera montert på en fase kontrast mikroskop som er utstyrt med en 10 X målsetting og kontrollert av bildebehandlingsprogrammer.

  1. Slå på levende celle enhet montert på toppen av linsen. Vent til temperaturen stabiliserer seg på 37 ° C, konsentrasjonen av CO2 er på 5% og fuktighet til 75%.
  2. La 24-vel platen gelé i levende celle enheten på mikroskopet. Finn bunnen av platen, og flytt deretter linsen til mikroskopet fokuserer på rundt 500 µm fra bunnen av platen.
    Merk: Celler i kollagen matrisen som er for nær bunnen av platen ikke er fullstendig innebygd i 3D matrix. Imaging celler som er 500 µm fra bunnen av platen sikrer at cellene ikke påvirkes av kanteffekter16,17,25.
  3. Flytte scenen rundt for å finne cellene og velger flere stillinger for bildebehandling.
  4. Definere time-lapse eksperimentet med 2 minutters intervaller.
    Merk: Maksimalt antall stillinger som kan tas under 2 min intervall er begrenset av bevegelige hastigheten på motorisert scenen, og lengden på eksponeringstid for å ta bilder.

5. kollagen nettverk deformasjon under celledeling (forstørring mikroskopi)

  1. Slå på levende celle enhet montert på toppen av linsen. Vent til temperaturen stabiliserer seg på 37 ° C, konsentrasjonen av CO2 er på 5% og fuktighet til 75%.
  2. For å visualisere kollagen fibrene i unstained kvinne 3D kollagen matriser, konfigurere AC confocal mikroskop for å fange kun reflektert lys (488-nm) fra 488-nm laser brukes til å belyse prøven. Laseren bruker en 60 X vann nedsenking mål, NA = 1.2, WD = 200 µm og styres av bildebehandlingsprogrammer.
  3. Prøven (celler i kollagen matriser) inn levende celle enheten. Finn bunnen av platen, og flytt deretter linsen til mikroskopet fokuserer på ca 100 µm fra bunnen av platen. Imaging celler som er 100 µm fra bunnen av platen sikrer at cellene ikke påvirkes av kanteffekter.
    Merk: Her et vann nedsenking mål brukes i stedet for en oljeneddyp linse arbeidsavstand av oljeneddyp objektivet er bare ca 100 µm. Bruk av oljeneddyp linsen utgjør et problem som tykkelsen på glass på bunnen av platen er vanligvis 100 µm.
  4. Flytte scenen rundt for å finne cellene og velger flere stillinger for bildebehandling.
    Merk: AC Confocal mikroskopi seksjoner optisk prøven og bare fanger opp signaler fra fokalplanet. Levende celler kan være bevegelse av fokus under time-lapse eksperimentet. For å aktivere fange av cellen bilder over lengre tid, brukes Z-stakken å samle bilder fra påfølgende sektorene i 5 µm intervaller. Totalt 5 skiver som spenner over 25 µm er fotografert.
  5. Definere time-lapse eksperimentet i 5 min intervaller.
    Merk: 5 minutter brukes her som intervallet i stedet for 2 minutter brukt i Seksjon 4 fordi flere skanning moduser, inkludert fluorescens skanning for H2B-mCherry, refleksjon skanning for kollagen og Z-stack skanning, brukes på hver posisjon. Bruk av flere skanning modi reduserer hastigheten på skanning en posisjon i forhold til lav forstørrelse avbilding.
  6. Kvantifisere deformasjon av kollagen matrise i en celle på grunn av styrkene utøves av cellen med partikkel imaging velocimetry (PIV) med underpiksel oppløsning20. Utføre denne analysen på 2D-bilder gir tydelig visualisering av både signalene H2B-mCherry og kollagen fibrene. Bruke det Anisotrop lav passet filtrering for å styrke signalet av kollagen nettverk20.
  7. For å måle lokale forskyvning av et sub bilde område av interesse på (x,y) fra rammen k ramme k+ 1, trekke ut en regional vindu av 15 × 15 piksler sentrert ved (x,y) på rammen k. Deretter finne best matchende steder (x,y) * gjennom hvilke lokasjoner som har en maksimal normalisert kryss-korrelasjonskoeffisient i bildet på rammen k+ 1. Deformasjon vektoren er beregnet som (x,y) *-(x,y).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med denne artikkelen er å presentere en imaging-basert metode å studere pattedyr celledeling prosesser i 3D matriser og kvantifisere samspillet mellom cellen og 3D ekstracellulær matrix under og etter celledeling. For å lette avbilding av cellen mitose, innlemmet vi H2B-mCherry i MDA-MB-231 celler med lentiviral signaltransduksjon. H2B konjugert med fluorescerende proteiner er brukt som en mitotisk markør skille mitotisk celler fra interphase celler og definere ulike faser i cellen mitose19,20,26. Bruker denne metoden, kunne vi overvåker hele prosessen med MDA-MB-231 celler uttrykke stabilt H2B-mCherry i 3D kollagen matriser (figur 1A). Mitotisk faser startet med oppløsningen av de kjernefysiske membranen (prophase, ramme 1, figur 1A); reorganisering av kromosomene (prometaphase: ramme 2); justeringen av kromosomene i celle kroppen (metaphase, bilde 3); separasjon av kromosomene (anaphase, ramme 4); omorganisering av kromosomene og kjernefysiske membranen og separasjon av likene av to datter cellene (telophase/cytokinesis, bilde 5).

Spredning frekvensen av celler i en 3D matrise er vanligvis mye lavere enn sine kolleger på et 2D substrat, som gjengir overvåking av cellen divisjon i 3D mindre effektiv19. For å effektivisere studere 3D celledeling, ansatt vi metode kombinerer thymidine, nocodazole og en riste-off-teknikk for å synkronisere og velg MDA-MB-231 celler på mitotisk fasen. Synkroniserte celler var innebygd i kollagen matriser. Divisjon prosessen med flere celler var overvåket i sanntid ved hjelp av live-celle bildebehandling på 10 X forstørrelse. Omtrent 70% av cellene delt i første 2 h etter dannelsen av kollagen matrix (figur 2), dermed gir for effektiv overvåking av mitose i 3D (figur 2).

For å overvåke samspillet mellom celler og deres omkringliggende kollagen matriser, kombinert vi AC confocal refleksjon mikroskopi til bildet kollagen fibrene og fluorescens mikroskopi å image cellene. En 60 X linsen tillater for fangst av høy kvalitet bilder av kollagen fibrene. Imaging bruker en høy forstørrelse linse, som fanger færre celler i hver synsfelt, er mye lavere gjennomstrømming forhold til bruk av lav forstørrelse på 10 X eller 20 X. Vellykket synkronisering av cellene forbedrer effektiviteten og produksjon av slikt eksperiment, siden de fleste synkronisert cellene deler i første 2 h etter dannelsen av kollagen matrix. Matrix deformasjon under og etter celledeling er visualisert (representant øyeblikksbilder vises i figur 1B) og kvantifisert med en tilpasset PIV-programvare. Vi kvantifisert og sammenlignet matrix deformasjon interphase og mitotisk fase for cellene synkroniseres til mitotisk fasen. Vi observerte at matrix deformasjon endret seg lite i løpet av mitotisk fase (figur 3A), og er mindre enn deformasjon observert etter mitotisk faser (figur 3B). Dette resultatet viser at pattedyrceller har minimal vedlegg og interaksjon med de omkringliggende matrisen mens de er i mitotisk fase.

Figure 1
Figur 1: Representative micrographs fra en høy forstørrelse live-celle tenkelig video av en MDA-MB-231 celle innebygd i en kollagen matrise som uttrykker stabilt H2B-mCherry. (A) ulike faser av mitotisk progresjon av MDA-MB-231 cellen er definert av H2B-mCherry som merket i rødt. (B) kollagen fibrene (hvit) under mitotisk prosessen er visualisert ved tidsavhengige AC confocal refleksjon mikroskopi. Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: divisjon synkronisert cellene i 3D kollagen matriser. Cellene ble synkronisert til G2/M fase og innebygd i en kollagen matrise. Omtrent 70% av synkronisert celler dele innen de første 2 h, mens kontroll celler uten synkronisering deler tilfeldig. Feilfelt = SEM (standard feil av gjsnitt). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: kvantifisering av matrix deformasjon for MDA-MB-231 celler under interphase og mitose. (A) endringen i omfanget av matrix deformasjon for matrix-embedded MDA-MB-231 celler. Den grønne pilen indikerer prophase og røde pilen viser telophase. (B) kvantifisering av matrix deformasjon for MDA-MB-231 celler under interphase og mitotisk fase, som angir at matrix deformasjon er minimal under celledeling. Feilfelt = SEM (standard feil av gjsnitt). * p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den tidligere studien av cellen divisjon i 3D var ikke effektiv eksperimentelle begrensninger og tekniske utfordringer18,19. Kritisk trinnene for effektiv av pattedyr celledeling i 3D kollagen matriser er: (1) inkorporering av fluorescens-merket mitotisk indikatorer som cellene, (2) synkroniseringen av cellen divisjon; og (3) overvåking av løpene i 3D matriser med live-celle tenkelig teknikk, tid-løst AC confocal refleksjon mikroskopi og kvantitative tenkelig analyse.

Mitotisk celler i 2D underlag kan skilles fra interphase cellene basert på deres morfologi, dvs mitotisk celler er runde og knapt knytte til underlaget mens interphase celler spredt og sy fast underlaget. I 3D matriser, men cellen morfologi er ikke en pålitelig indikator for mitotisk celler siden noen celler knapt spredt og forbli runde i matrix27,28. Derfor er det viktig å introdusere merketråd mitotisk celler for studiet av cellen divisjon i 3D matriser. Vi uttrykte stabilt H2B-mCherry i MDA-MB-231 celler, som fungerte som en pålitelig indikator for ulike mitotisk faser inkludert prophase, prometaphase, metaphase, anaphase og telophase/cytokinesis. Vi har tidligere brukt denne tilnærmingen for å skille mitotisk celler fra interphase celler i 3D matriser. Med hjelp av denne indikatoren var vi også kunne måle lengden av mitotisk fasen for en annen celle linje, HT1080 celler, dele 2D underlag og i 3D matriser19.

Det er flere måter å synkronisere cellene, inkludert serum sult29, mitotisk riste av30,31, dobbel thymidine blokkerer32og nocodazole32. Vi kombinerte thymidine behandling og nocodazole behandling effektivt synkronisere MDA-MB-231 celler til G2/M fase. Celler som er utsatt for thymidine er arrestert på G1/S overgangen og hele S fase på grunn av hemming av DNA-syntese av thymidine. Utgivelsen av cellene fra thymidine eksponering la celler fremdriften G2/M fase for cellene arrestert på G1/S fase og G1 for cellene arrestert på S fase. Alle celler som er utsatt for nocodazole er arrestert den G2/M-fasen. Avrundet cellene inn mitotisk fase var deretter rystet av fra platen og direkte innkapslet i kollagen matriser. Vi viste at omtrent 70% av cellene deler innen 2 timer etter at de er lagt inn kollagen matriser (figur 2). Eventuelt cellene kan være innebygd i kollagen matriser før synkroniseringen, men kollagen matrise krysskoblet nettverket presenterer en fysisk barriere og reduserer den biomolecular diffusjon og konveksjon33, 34. faktisk vi forsøkte å synkronisere celler i kollagen matriser ved hjelp av thymidine og nocodazole, men kan ikke hente effektiv synkronisering. Dette resultatet kan være ineffektiv diffusjon og konveksjon av narkotika gjennom kollagen matrix.

Refleksjon er en innebygd optisk eiendom av mange biopolymers, inkludert kollagen. AC confocal refleksjon mikroskopi teknikken visualiserer og quantitates microtopography av porøse biologisk materiale syntetiske polymerer og 3D kollagen matriser23,24,35,36 ,37. I vår lab, har vi etablert teknikker for å overvåke endringer i kollagen fiber polaritet som konsentrasjonen av kollagen varierer38. Her beskriver vi metoden for å overvåke deformasjon av kollagen fibrene basert på time-lapse video av reflekterende AC confocal bildene å betegne celle matrise samhandlingen. Representant resultatene presenteres her viser at matrix deformasjon for mitotisk MDA-MB-231 cellene er betydelig mindre enn disse cellene i interphase, noe som antyder at pattedyrceller har minimal vedlegg og interaksjon med den rundt matrix når de angir mitotisk fase19.

Tidligere pleide vi AC confocal refleksjon mikroskopi å overvåke og kvantifisere celle matrise samhandling før, under og etter mitose HT1080 celler. Vi har også overvåket matrix deformasjon av β1-integrin sammenleggbare HT1080 celler under både interphase og mitotisk fase. Tappe β1-integrin betydelig reduserer matrix deformasjon av cellen under interphase. Men er det ingen forskjell i matrix deformasjon i mitotisk fasen av runde β1-integrin knockdown (KD) cellene og HT1080 vill type celler19.

En alternativ tilnærming til å visualisere kollagen fibrene er å ansette fluorescens-konjugerte skriver jeg kollagen. Vi har tidligere brukt denne tilnærmingen til bildet spor i kollagen matriser generert av celler19. Denne metoden, men krever merkingen av kollagen med fluorescerende farge som fluorescein isothiocyanate (FITC), som er både tidkrevende og mindre effektiv. På den annen side, kan AC confocal refleksjon mikroskopi direkte brukes uforandret kollagen å spare tid og ressurser, og utelate problemstillinger knyttet til fluorescens photobleaching. Videre denne metoden krever ikke en individuell fluorescerende kanal, og er dermed kompatibel med alle fluorescerende fargestoffer.

Metoden som presenteres i dette dokumentet kan potensielt brukes til alle typer pattedyrceller som deler i en 3D kollagen matrise. Inkorporering av H2B-mCherry merket andre pattedyrceller av lentiviral signaltransduksjon vil følge nøyaktig de samme fremgangsmåtene som beskrevet i den, selv om ulike typer celler kan ha varierte effektivitet for signaltransduksjon av lentivirus 39. både tettheten av cellene på signaltransduksjon og titer av viruset kan være optimalisert for bedre effektivitet. Hvis høy signaltransduksjon effektivitet ikke kan oppnås, kan cellene velges fluorescens assistert celle sortering (FACS). Thymidine blokkerer og nocodazole brukes for å kunne synkronisere flere andre typer pattedyrceller, som HeLa40. Mekanisk riste-off kan brukes til alle celletyper som runde opp og knapt knytte til underlaget under mitotisk fase30,31. Videre kan avbilding av kollagen fibrene refleksjon AC confocal mikroskopi og kvantifisering av matrix deformasjon være direkte brukes for alle andre typer dele pattedyrceller.

Metoden som presenteres her er en effektiv og generell tilnærming pattedyr celledeling og celle-matrix interaksjoner i et 3D-miljø. Tilnærmingen gjør våre sonde i molekylær grunnlaget for utviklingen av normalt vev og sykdommer og potentiates utformingen av romanen diagnostiske og terapeutiske tilnærminger i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH gir R01CA174388 og U54CA143868. Forfatterne ønsker å erkjenne PURA prisen fra Johns Hopkins University for støtte av Wei-tong Chen. Dette materialet er basert på arbeid støttes av National Science Foundation Graduate forskning fellesskap under Grant nr. 1232825.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human embryonic kidney 293T ATCC
MDA-MB-231 Physical Sciences Oncology Center, NIH
DMEM Corning 10-013-CV
DMEM powder ThermoFisher Scientific 12100-046
Fetal bovine serum Hyclone SH30910.03
Penicillin-Streptomycin 100X Sigma-Aldrich P0781
Fugene HD Promega E2311
Lipofectamine 2000 Life technologies 11668-07
Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vector Addgene plasmid 21217
Thymidine Sigma-Aldrich T1895
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
Opti-MEM Life Technologies 31985-070
Sodium bicarbonate GibcoBRL 11810-025
HEPES Sigma-Aldrich 113375-100
Collagen Corning 354236
NaOH J.T. Bake 3722-01
Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mm Millipore SLHVM33RS
Nikon TE2000E epifluorescence microscope Nikon TE2000E
Cascade 1K CCD camera Roper Scientific
NIS-Elements AR imaging software Nikon
Nikon A1 confocal microscope Nikon A1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. Mitotic misregulation and human aging. Science. 287, (5462), 2486-2492 (2000).
  2. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122, (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  3. Brinkley, B. R. Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division. Trends Cell Biol. 11, (1), 18-21 (2001).
  4. Phillip, J. M., Aifuwa, I., Walston, J., Wirtz, D. The Mechanobiology of Aging. Annu Rev Biomed Eng. 17, 113-141 (2015).
  5. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, (5), 646-674 (2011).
  6. Martin, M. D., et al. Effect of ablation or inhibition of stromal matrix metalloproteinase-9 on lung metastasis in a breast cancer model is dependent on genetic background. Cancer Res. 68, (15), 6251-6259 (2008).
  7. Knox, J. J., Hotte, S. J., Kollmannsberger, C., Winquist, E., Fisher, B., Eisenhauer, E. A. Phase II study of Triapine in patients with metastatic renal cell carcinoma: a trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (NCIC IND.161). Invest New Drugs. 25, (5), 471-477 (2007).
  8. Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D. L., Fojo, A. T. Inhibitors targeting mitosis: tales of how great drugs against a promising target were brought down by a flawed rationale. Clin Cancer Res. 18, (1), 51-63 (2012).
  9. Tong, W. G., et al. Phase I and pharmacologic study of SNS-032, a potent and selective Cdk2, 7, and 9 inhibitor, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma. J Clin Oncol. 28, (18), 3015-3022 (2010).
  10. Matulonis, U. A., et al. Phase II study of MLN8237 (alisertib), an investigational Aurora A kinase inhibitor, in patients with platinum-resistant or -refractory epithelial ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal carcinoma. Gynecol Oncol. 127, (1), 63-69 (2012).
  11. Boss, D. S., et al. Clinical evaluation of AZD1152, an i.v. inhibitor of Aurora B kinase, in patients with solid malignant tumors. Ann Oncol. 22, (2), 431-437 (2011).
  12. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, (3), 211-224 (2006).
  13. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, (5547), 1708-1712 (2001).
  14. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196, (4), 395-406 (2012).
  15. Giri, A., et al. The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration. FASEB J. 27, (10), 4089-4099 (2013).
  16. Fraley, S. I., Feng, Y., Giri, A., Longmore, G. D., Wirtz, D. Dimensional and temporal controls of three-dimensional cell migration by zyxin and binding partners. Nat Commun. 3, 719 (2012).
  17. Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12, (6), 598-604 (2010).
  18. Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. J Cell Biol. 205, (2), 155-162 (2014).
  19. He, L., et al. Local 3D matrix confinement determines division axis through cell shape. Oncotarget. 7, (6), 6994-7011 (2016).
  20. Held, M., et al. CellCognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, (9), 747-754 (2010).
  21. Fallica, B., Maffei, J. S., Makin, G., Zaman, M. Alteration of cellular behavior and response to PI3K pathway inhibition by culture in 3D collagen gels. PLoS One. 7, (10), e48024 (2012).
  22. Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33, (35), 9087-9096 (2012).
  23. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-20 (2010).
  24. Gunzer, M., Kampgen, E., Brocker, E. B., Zanker, K. S., Friedl, P. Migration of dendritic cells in 3D-collagen lattices. Visualisation of dynamic interactions with the substratum and the distribution of surface structures via a novel confocal reflection imaging technique. Adv Exp Med Biol. 417, 97-103 (1997).
  25. Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. J Vis Exp. (80), e50763 (2013).
  26. Lleres, D., James, J., Swift, S., Norman, D. G., Lamond, A. I. Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET. J Cell Biol. 187, (4), 481-496 (2009).
  27. Poincloux, R., et al. Contractility of the cell rear drives invasion of breast tumor cells in 3D Matrigel. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (5), 1943-1948 (2011).
  28. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33, (16), 4157-4165 (2012).
  29. Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods Mol Biol. 761, 75-83 (2011).
  30. Jackman, J., O'Connor, P. M. Methods for synchronizing cells at specific stages of the cell cycle. Curr Protoc Cell Biol. 8, (2001).
  31. Zwanenburg, T. S. Standardized shake-off to synchronize cultured CHO cells. Mutat Res. 120, (2-3), 151-159 (1983).
  32. Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol Biol. 296, 157-166 (2005).
  33. Kihara, T., Ito, J., Miyake, J. Measurement of biomolecular diffusion in extracellular matrix condensed by fibroblasts using fluorescence correlation spectroscopy. PLoS One. 8, (11), e82382 (2013).
  34. Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys J. 83, (3), 1650-1660 (2002).
  35. Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling. PLoS One. 6, (9), e24891 (2011).
  36. Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20, (8), 931-941 (2009).
  37. Petroll, W. M. Differential interference contrast and confocal reflectance imaging of collagen organization in three-dimensional matrices. Scanning. 28, (6), 305-310 (2006).
  38. Fraley, S. I., et al. Three-dimensional matrix fiber alignment modulates cell migration and MT1-MMP utility by spatially and temporally directing protrusions. Sci Rep. 5, 14580 (2015).
  39. Ikeda, Y., Collins, M. K., Radcliffe, P. A., Mitrophanous, K. A., Takeuchi, Y. Gene transduction efficiency in cells of different species by HIV and EIAV vectors. Gene Ther. 9, (14), 932-938 (2002).
  40. Ma, H. T., Poon, R. Y. Synchronization of HeLa cells. Methods Mol Biol. 761, 151-161 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics