Summary
Denne protokollen tar sikte på å beskrive en ny metodikk for å måle iboende hjerteavfyringshastighet ved hjelp av mikroelektrode array-opptak av hele sinoatrial nodevevet for å identifisere pacemaking-defekter hos mus. Farmakologiske midler kan også innføres i denne metoden for å studere deres effekter på iboende pacemaking.
Abstract
Den sinoatriale noden (SAN), som ligger i høyre atrium, inneholder pacemakercellene i hjertet, og dysfunksjon i denne regionen kan forårsake takykardi eller bradykardi. Pålitelig identifisering av hjerte-pacemaking-defekter krever måling av iboende hjertefrekvenser ved i stor grad å forhindre påvirkning av det autonome nervesystemet, noe som kan maskere hastighetsunderskudd. Tradisjonelle metoder for å analysere iboende hjerte pacemaker funksjon inkluderer narkotika-indusert autonom blokade for å måle in vivo hjertefrekvens, isolerte hjerteopptak for å måle iboende hjertefrekvenser, og sinoatrial stripe eller encellet patch-clamp opptak av sinoatrial pacemaker celler for å måle spontan handling potensielle avfyringshastigheter. Imidlertid kan disse mer tradisjonelle teknikkene være teknisk utfordrende og vanskelige å utføre. Her presenterer vi en ny metodikk for å måle egen hjerteavfyringshastighet ved å utføre mikroelektrode array (MEA) opptak av helmonterte sinoatriale nodepreparater fra mus. MEAer består av flere mikroelektroder arrangert i et rutenettlignende mønster for registrering av in vitro ekstracellulære feltpotensialer. Metoden som er beskrevet her, har den kombinerte fordelen av å være relativt raskere, enklere og mer presis enn tidligere tilnærminger for registrering av iboende hjertefrekvenser, samtidig som det tillater lett farmakologisk forhør.
Introduction
Hjertet er et komplekst organ styrt av både hjerte-iboende og ekstrinsiske påvirkninger som de som stammer fra hjernen. Den sinoatriale noden (SAN) er en definert region i hjertet som huser pacemakercellene (også referert til som sinoatriale celler eller SA-celler) som er ansvarlige for initiering og videreføring av pattedyrets hjerteslag1,2. Den iboende hjertefrekvensen er frekvensen drevet av pacemakercellene uten påvirkning av andre hjerte- eller nevro-humorale påvirkninger, men tradisjonelle mål på hjertefrekvens hos mennesker og levende dyr, som elektrokardiogrammer, gjenspeiler både pacemakeren og nevrale påvirkninger på hjertet. Den mest bemerkelsesverdige nevrale påvirkningen på SA-celler er fra det autonome nervesystemet, som hele tiden modulerer avfyringsmønstre for å møte kroppens fysiologiske krav3. Støtte denne ideen, både sympatiske og parasympatiske projeksjoner finnes i nærheten av SAN4. Det iboende hjertenervesystemet (ICNS) er en annen viktig nevral påvirkning der ganglionated plexi, spesielt i høyre atria, innervate og regulerer aktiviteten til SAN5,6.
Å forstå tempomaking underskudd er klinisk viktig, da dysfunksjon kan underbe tro mange hjertesykdommer, samt bidra til risikoen for andre komplikasjoner. Syk sinus syndrom (SSS) er en kategori av sykdommer preget av dysfunksjon av sinoatrial noden som hindrer riktig pacemaking7,8. SSS kan presentere med sinus bradykardi, sinus pauser, sinus arrestasjon, sinoatrial exit blokk, og vekslende bradyarrythmias og tachyarrhythmias9 og kan føre til komplikasjoner inkludert økt risiko for embolisk slag og plutselig død8,10. De med Brugada syndrom, en hjertesykdom preget av ventrikulær fibrillasjon med økt risiko for plutselig hjertedød, har større risiko for arytmogene hendelser hvis de også har komorbid SAN dysfunksjon11,12. Sinoatrial dysfunksjon kan også ha fysiologiske konsekvenser utover hjertet. For eksempel har SSS blitt observert for å utløse anfall hos en pasient på grunn av cerebral hypoperfusjon13.
For å identifisere sinoatrial pacemaking underskudd, iboende hjertefrekvenser må bestemmes ved å måle aktiviteten til SAN uten påvirkning av autonome nervesystemet eller humorale faktorer. Klinisk kan dette tilnærmes av farmakologisk autonom blokade14, men den samme teknikken kan også brukes i pattedyrmodeller for å studere iboende hjertefunksjon15,16. Selv om denne tilnærmingen blokkerer en stor del av å bidra med nevrale påvirkninger og tillater in vivo hjerteundersøkelse, eliminerer den ikke helt alle ekstrinsiske påvirkninger på hjertet. En annen forskningsteknikk som brukes til å studere iboende hjertefunksjon i dyremodeller, er isolerte hjerteopptak ved hjelp av Langendorff-perfused hjerter, som vanligvis innebærer målinger ved hjelp av elektrogrammer, pacing eller epikardiale multielektrode matriser17,18,19,20. Selv om denne teknikken er mer spesifikk for hjertefunksjon siden den innebærer å fjerne hjertet fra kroppen, kan målingene fortsatt påvirkes av mekano-elektriske autoregulatoriske mekanismer som kan påvirke iboende hjertefrekvensmålinger21. De isolerte hjerteopptakene kan også fortsatt påvirkes av autonom regulering gjennom ICNS5,6,22,23. Videre kan det være vanskelig å opprettholde en fysiologisk relevant temperatur i hjertet, som er kritisk for hjertefunksjonsmålinger, i isolerte hjertetilnærminger20. En mer direkte metode for å studere SAN-funksjonen er å isolere SAN-vev spesifikt og måle aktiviteten. Dette kan oppnås gjennom SAN-strimler (isolert SAN-vev) eller isolerte SAN pacemaker-celler24,25. Begge krever en høy grad av teknisk opplæring, da SAN er en svært liten og svært definert region, og celleisolasjon utgjør en enda større utfordring, da dissosiasjon kan skade cellens generelle helse hvis den ikke utføres riktig. Videre krever disse teknikkene ekspert elektrofysiologiske ferdigheter for å kunne registrere fra vevet eller cellene ved hjelp av individuelle opptaksmikroelektroder.
I denne protokollen beskriver vi en teknikk for å registrere SAN in vitro ved hjelp av en mikroelektrode array (MEA) for å oppnå iboende pulsmålinger. Denne tilnærmingen har fordelen av å gjøre svært spesifikke elektrofysiologiske opptak tilgjengelige for forskere som mangler intensive elektrofysiologiske ferdigheter. MEAer har tidligere blitt brukt til å studere kardiomyocyttfunksjon i primære kardiomyocyttkulturer26,27,28,29,30,31,32, hjerteark33,34,35,36,37,38,39og vev hele monteres40, 41,42,43,44,45,46,47. Tidligere arbeid er også gjort for å undersøke feltpotensialer i SAN vev41,42. Her tilbyr vi en metodikk for å bruke MEA til å registrere og analysere murine iboende SAN-avfyringshastigheter. Vi beskriver også hvordan denne teknikken kan brukes til å teste farmakologiske effekter av legemidler på SAN iboende avfyringshastigheter ved å gi et prøveeksperiment som viser effekten av 4-aminopyridin (4-AP), en spenningsportert K+ kanalblokker. Ved hjelp av definerte anatomiske landemerker kan vi registrere SAN nøyaktig uten å måtte utføre de omfattende vevspredningene eller celleisolasjonene som kreves i andre metoder. Selv om MEA kan være kostnadsforbudende, gir opptakene svært spesifikke og pålitelige mål på pacemaking som kan brukes i et stort utvalg av kliniske og fysiologiske forskningsapplikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer beskrevet her er utført i samsvar med retningslinjene fra National Institutes of Health (NIH), som godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Southern Methodist University.
1. Belegg multielektrode array (MEA) for opptak
- Lag 25 mM boratbuffer.
- Løs opp 0,953 g Na2B4O7·10 H2O i 80 ml destillert vann.
- Juster pH til 8,4 med HCl og tilsett deretter destillert vann til et endelig volum på 100 ml.
- Lag en 0,1% lagerløsning av polyetylenimin (PEI).
- Tilsett 100 μL 50 % (w/v) PEI til 4,9 ml destillert vann for å lage en 1 % PEI-løsning.
- Fortynn 1% PEI-løsningen til 0,1% i boratbuffer ved å tilsette 1 ml av 1% PEI-løsningen til 9 ml av 25 mM boratbufferen.
- Pipette ~1 ml av 0,1 % PEI-oppløsningen i mikroelektrode array (MEA)-parabolen slik at elektrodene er helt dekket (Figur 1A og 1B).
MERK: MEAs mikroelektroder består vanligvis av platina svart eller karbonnanorør og isolert med polyimid (eller akryl); Begge materialene er hydrofobe. Ved å belegge MEA med en kationisk polymer som PEI, blir den hydrofobe MEA-overflaten mer hydrofil, slik at vevsprøver kan få bedre kontakt med MEA-overflaten (Figur 1A1). - Dekk MEA-retten med termoplastfilm for å redusere fordampning og la MEA stå over natten ved romtemperatur (Figur 1C).
- Aspirer PEI-løsningen fra MEA-retten ved hjelp av en pipette, vær forsiktig så du ikke berører elektrodegitteret som kan skade elektrodene, og skyll deretter ≥4 ganger med destillert vann (Figur 1D).
- Oppbevar den PEI-belagte MEA under 1-2 ml ultrarent vann og forseglet med termoplastfilm ved 4 °C til det er nødvendig. Du kan også oppbevare den belagte MEA-en ved å senke den ned i et beger fylt med ultrarent vann (figur 1E).
MERK: PEI-beleggprosessen trenger bare å utføres én gang for MEA før første gangs bruk, og etter hver opptaksøkt skal MEA oppbevares nedsenket i ultrarent vann.
2. Klargjøring av fullstendig Tyrodes oppløsning for vevs disseksjon
- Lag 1000 ml komplett Tyrodes løsning for disseksjon; Tilsett først 8.1816 g NaCl til 800 ml ultrapure vann.
- Tilsett følgende mengde kjemikalier til løsningen: 0,4025 g KCl; 0.1633 g KH2PO4; 1.1915 g HEPES; 0,9999 g glukose; 0,0952 g MgCl2; 0,2646 g CaCl2·2H2O.
- Juster pH til 7,4 med NaOH og tilsett deretter ultrarent vann til det totale volumet er 1000 ml.
MERK: Den endelige sammensetningen av Komplett Tyrodes løsning vil være følgende (i mM): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 KH2PO4, 5 HEPES, 5,55 glukose, 1 MgCl2, 1,8 CaCl2.
3. Forbereder oksygenert Tyrodes løsning for opptak
- Lag 500 ml tyrodes løsning; tilsett 4,003 g NaCl til 400 ml ultrarent vann.
- Tilsett følgende mengder kjemikalier til løsningen: 0,651 g NaHCO3; 0.042 g NaH2PO4; 0.132 g CaCl2·2H2O; 0,149 g KCl; 0,0476 g MgCl2; 0,999 g glukose.
- Juster pH til 7.4 med HCl og tilsett deretter ultrapure vann til det totale volumet er 500 ml.
- Oksygener oppløsningen med carbogen i minst 30 minutter ved romtemperatur før du starter opptaket.
MERK: Den endelige sammensetningen av Tyrodes løsning vil være følgende (i mM): 137 NaCl, 15,5 NaHCO3, 0,7 NaH2PO4, 1,8 CaCl2, 4 KCl, 1 MgCl2, 11,1 glukose. Denne Tyrodes løsning har en litt annen sammensetning enn Complete Tyrodes løsning som brukes til disseksjon.
4. Klargjøring av 4-aminopyridin (4-AP) oppløsning for farmakologisk modulasjon
- Lag en 1 mM arbeidsløsning på 4-AP; tilsett 18,82 mg 4-AP til 200 ml av Tyrodes løsning fra trinn 3.
- Oksygener 4-AP-løsningen i minst 30 minutter før eksperimentet.
5. Klargjøring av Petri-retten for disseksjon
- Bland silikonelastomerkomponenter i et 10:1-forhold (etter vekt) av basen til herdemiddel.
- Hell ~15 ml silikonelastomerblanding i en Petri-tallerken med en diameter på 60 mm.
- La elastomeren herde ved romtemperatur i 48 timer før bruk.
MERK: Den silikoniserte Petri-retten kan gjenbrukes til fremtidige disseksjoner.
6. Dissekere sinoatrialnoden (SAN)
- Forbered heparinisert Complete Tyrodes løsning for SAN-disseksjon.
- Tilsett 400 μL heparin (1000 USP/ml) til 40 ml Komplett Tyrodes oppløsning og varm i et 37 °C vannbad.
- Injiser musen intraperitonealt med 200-300 μL heparin (1000 USP / ml) og la dyret sitte i 10 minutter.
- Euthanize den hepariniserte musen ved isofluran overdose.
- Plasser musen i et lite glasskammer som inneholder isoflurandamp generert ved å tilsette 200-300 μL flytende isofluran til et filterpapir inne i et perforert plastrør.
MERK: Fordi isofluran kan forårsake hudirritasjon og også kan absorberes gjennom huden, bør væsken ikke kontakte musen direkte. Derfor er den isofluran-gjennomvåte kluten plassert i et perforert rør for administrering. - Bekreft døden ved opphør av bevegelse og pusteinnsats og ved fravær av tåklemme refleks. Døden tar vanligvis ca 1-2 min etter plassering i kammeret.
MERK: Døden er vanligvis ledsaget av vannlating.
- Plasser musen i et lite glasskammer som inneholder isoflurandamp generert ved å tilsette 200-300 μL flytende isofluran til et filterpapir inne i et perforert plastrør.
- Plasser musen i en liggende stilling på et disseksjonsbrett med poter utstrakt og fest potene til brettet ved hjelp av 1 tomme lange, 23-gauge sprøytenåler. Fjern deretter pelsen i nærheten av bunnen av ribbeburet ved å bruke kirurgisk saks og kutte pelsen ved røttene.
MERK: For et disseksjonskort kan polystyrenkjølelokk brukes. - Mens du holder huden med en hemostat, bruk kirurgisk saks for å lage et tverrgående snitt i huden like under bunnen av ribbeburet fra omtrent venstre kostnadsbue til høyre kostbar bue (Figur 3A).
- Klipp åpne bukhinnen med kirurgisk saks og separer leveren forsiktig fra membranen, vær forsiktig så du ikke stjeler leveren, noe som vil forårsake overdreven blødning (Figur 3B). Øk membranen langs thoraxen for å eksponere thoraxhulen (Figur 3C-D).
- Bruk kirurgisk saks, kutt sideveggene på ribbeburet fra kantene på kostbuene opp til kragebenene for å eksponere hjertet, vær forsiktig så du unngår å skade hjertet (Figur 3D). Bruk deretter en 23-gauge sprøytenål til å feste ribbeburet over skulderen, hold det på plass og ut av veien for det kirurgiske feltet.
- Bruk en overføringspipette til å dryppe varm (37 °C) heparinisert Komplett Tyrodes oppløsning på hjertet for å holde den fuktig.
MERK: Ikke la hjertet tørke ut. - Fjern lungene ved å holde dem med ekstra fine Graefe tang og kutte luftrøret med kirurgisk saks (Figur 3E).
- Hold toppen av hjertet med ekstra fine Graefe tang og fjern den ved å kutte aorta og venae cavae med kirurgisk saks. Overfør hjertet til en Petri-tallerken som inneholder herdet silikonelastomer (figur 4A) og bruk en overføringspipette til å bade hjertet med 2-3 ml varm (37 °C) heparinisert Komplett Tyrodes oppløsning.
MERK: Vær forsiktig så du ikke skader den delikate bakre veggen på høyre atria, som inneholder SAN, og de tilkoblede høyre atrieårene. Å bade hjertet med Complete Tyrodes løsning holder hjertet fra å tørke ut, men ikke helt nedsenke hjertet i løsningen, da det vil svekke synligheten under disseksjonen. - Orienter hjertet med høyre atrium på eksperimentets høyre og venstre atrium til venstre for eksperimentet.
MERK: Disseksjon av SAN-vevet bør gjøres raskt for å forhindre iskemirelatert skade. - Fest toppen av hjertet til parabolen med en disseksjonspinne. Deretter, mens du holder den dårligere vena cava med Dumont #2 laminectomy tang, sett inn en 22 G sprøytenål gjennom den dårligere og overlegne vena cava for å finne sin posisjon i riktig atrium, som også identifiserer den omtrentlige posisjonen til SAN (plassert i vevslappen mellom den dårligere og overlegne vena cava (Figur 4B).
- Bruk små disseksjonspinner, fest venstre og høyre atrievedlegg til parabolen.
- Mens du holder venstre atrievedheng med Dumont #2 laminectomy tang, legg en formidlingspinne gjennom venstre atrievedheng for å holde den på plass.
- Mens du holder riktig atrievedheng med Dumont #55 tang, legg en disseksjonspinne gjennom høyre atrievedlegg for å holde den på plass.
MERK: Samme type tang kan brukes til å holde venstre og høyre atrievedlegg om ønskelig.
- Fjern sprøytenålen som spenner over fin cavae.
- For å frigjøre blod fra hjertet, bruk Castroviejo saks for å fjerne toppen av hjertet (dvs. den nederste halvdelen) ved å lage et tverrsnitt over ventriklene (Figur 4C). Vask deretter hjertet ved å tilsette varm (37 °C) heparinisert Komplett Tyrodes oppløsning med en overføringspipette.
- Bruk Castroviejo saks til å kutte langs atrioventrikulær septum holde snittet nærmere ventrikelen enn atria. Fortsett å skjære langs atrioventrikulær septum til atriene er skilt fra ventriklene.
- Klipp langs interatrial septum for å fjerne venstre atrium.
- Plasser disseksjonspinnene i periferien av høyre atrium for å få det til å ligge flatt (Figur 4D). Fjern eventuelt gjenværende fett, kar eller vev fra atriet ved hjelp av Castroviejo-saksen.
- Finn SAN i høyre atrium, som i denne retningen er omtrent grenser til den overlegne vena cava (på toppen), dårligere vena cava (nederst) og cristae terminalis (til venstre) (Figur 4D).
MERK: Crista terminalis fremstår som en mørk muskuløs ås mellom høyre atrievedheng og SAN. Ofte kan SAN-arterien også sees gjennom SAN (Figur 4D).
7. Klargjøring av MEA-systemet for opptak
- Tilsett Tyrodes oppløsning (fra trinn 3) i inngangsløsningsflasken (Figur 5C) og oksygener den ved å slå på strømmen av karbogengass (figur 5A) i systemet.
MERK: Tyrodes løsning som brukes til innspillingen er litt forskjellig i komposisjon fra Complete Tyrodes løsning som brukes til disseksjonen. - Kontroller strømmen av karbogen ved å observere bobler i den koniske kolben, som brukes til å fukte gassen (Figur 5B), og inngangsoppløsningsflasken (Figur 5C) .
- Sett den peristaltiske pumpeinnstrømningsslangen (figur 5D) inn i Tyrodes opptaksløsning (Figur 5C). Sett deretter den peristaltiske pumpeutløpsslangen inn i oppsamlingsflasken (Figur 5I).
- Sett den peristaltiske pumpen til 25 rpm, noe som gir en strømningshastighet på 2 ml / min og start pumpen. Kontroller systemet for bufferlekkasje eller overflyt.
- Sett temperaturregulatoren til 37 °C, den fysiologiske temperaturen på mus (Figur 5E).
8. Plassere hjertevevet på MEA-nettet
- Overfør det dissekerte SAN-vevet ved hjelp av en pensel (Figur 6A) fra dissekering petriskålen til MEA-rutenettet (Figur 1A1).
- Mens du ser under et invertert mikroskop, plasserer du vevet forsiktig med en myk pensel slik at SAN-regionen overlapper elektrodegitteret.
- Sett vevet på nytt etter behov for å sikre at det ligger flatt på elektrodegitteret, noe som gir god kontakt med elektrodene.
MERK: En myk malingsbørste er nødvendig for å flytte vevet for å unngå å skade elektrodegitteret.
- Når vevet er riktig plassert, bruk ben tang (eller buede tang) for å plassere nettet over vevet (Figur 6A) . Bruk deretter benstøttene til å plassere harpeankeret (Figur 6A) på nettet for å holde alt på plass (Figur 6B).
- Ta et bilde av vevets posisjonering på MEA slik at aktiviteten til individuelle elektroder kan korreleres med deres anatomiske plassering under opptaket. Dette kan gjøres ved å holde en smarttelefon opp til det inverterte mikroskopmålet eller ved å bruke et tilkoblet mikroskopkamera.
MERK: Hvis retningen på MEA ikke endres etter at du har tatt bildet, vises den øverste venstre elektroden som den første kanalen (Ch1) under opptak. - Plasser MEA-retten på kontaktplaten (Figur 5F og 6C) og plasser forsiktig perfusjonshetten (figur 6C) på MEA-parabolen uten å forstyrre harpeskiveankeret. Perfusjonshetten kan sikres ytterligere ved hjelp av et stykke labtape (Figur 6C).
MERK: I tillegg til å ha justerbare oppløsningsinnløps- og utløpsrør, har hetten også en port for levering av gass (Figur 6C). I tillegg går referanseelektroderingen gjennom hetten (Figur 6C). - La vevet komme seg etter håndtering og akklimatisere seg til kammeret i 15-20 minutter før opptak.
9. Stille inn datainnsamlingsprotokollen for opptak
MERK: Følgende trinn beskriver åpning av programvareprotokollen for spontan beatopptak og definering av opptaksforholdene. Spesifikasjonene for disse trinnene kan variere avhengig av hvilken programvare som brukes, men den generelle disposisjonen bør forbli den samme.
- Slå på forsterkeren (Figur 5G), og konfigurer en arbeidsflyt for innspillingen i programvaren på datamaskinen (Figur 5H).
- Åpne programvaren, og klikk Arbeidsflyt.
- Velg Åpne ny mappe.
- Åpne Mappen Fra maler.
- Velg 64MD1-1920X1080 (avhengig av oppløsningen på skrivebordet).
- Åpne QT-mappen.
- Åpne spontan innspillingsmappen.
- Velg malen Beat_recording.moflo , og åpne den (Figur 7A).
- Angi registreringsparameterne for å angi antall spor, sporvarighet, sporintervall, inngangsspenning, samplingsfrekvens, etc., i henhold til de ønskede opptaksbetingelsene (Figur 7B).
MERK: For innsamling av beatfrekvens og interspike-data bruker du vanligvis en inngangsverdi på 2,9 mV, et 1-Hz høypassfilter, et 1000-Hz low pass-filter og en samplingsfrekvens på 20 kHz. - Hvis du vil markere ulike faser eller betingelser for eksperimentet, for eksempel før og etter legemiddeladministrasjon, klikker du kategorien Merknader for å legge til de ønskede notasjonene (Figur 7C).
- Hvis du vil angi filmålet for dataene som skal samles inn, merker du av for Aktiver lagring og skriver inn ønsket filnavn i boksen Endring av filnavn .
10. Utføre opptak og innsamling av data
- Klikk spill inn og spill av-knappen på den øverste menylinjen i anskaffelsesprogramvaren for å starte innspillingen. Innhente data for 10 spor av 1 min varighet med intervaller på 2 min mellom spor.
- Fra disse første sporene må du kontrollere at de registrerte bølgeformene er i samsvar med et sunt vevspreparat av høy kvalitet ved å bekrefte at de fleste opptakskanalene viser signalamplituder på ≥ 0,5 mV og identiske intervaller mellom piggene (figur 8).
MERK: En innledende vurdering av aktiviteten og bølgeformene til de enkelte mikroelektrodene som tilsvarer deres anatomiske steder, kan utføres ved å referere til bildet som er anskaffet etter å ha plassert vevet på MEA. - For å måle effekten av narkotika på vevet, pause opptaket etter å ha anskaffet innledende grunnlinjedata ved å klikke pauseknappen på den øverste menylinjen.
MERK: Legemiddelresponsfasen av eksperimentet kan noteres i opptaket ved å klikke på Merknader-fanen og legge til ønsket notasjon som beskrevet ovenfor (Figur 7C). - Sett pumpen på pause og sett pumpeinnstrømningsslangen på pause fra den vanlige opptaksløsningen til Tyrodes løsning som inneholder ønsket valgte legemiddel.
MERK: I eksempeleksperimentet ble Tyrodes løsning brukt med 1 mM 4-aminopyridin (4-AP). - Start pumpen på nytt, og sett registreringen på pause for å begynne å samle inn data på nytt.
- Når den legemiddelinfunderte Tyrodes løsning har nådd vevet, registrerer du 10 spor på samme måte som tidligere for basisopptakene.
MERK: Sporene vil ta litt tid å stabilisere seg når stoffet infuses inn i opptakskammeret. Virkningsmekanismen til stoffet kan også påvirke opptaksstabiliteten. For legemidler som har reversible virkningsmekanismer, bør det også registreres en utvaskingsperiode for å bekrefte restaurering av aktivitet til baseline nivåer, som er en indikator på sunt vev. - Klikk Stopp for å avslutte innspillingene.
- Ta et siste bilde av plasseringen av vevet på MEA under mikroskopet i tilfelle vevet har skiftet etter den første opptaksprosedyren.
11. Rengjøring av oppsettet etter opptaket
- Rengjør MEA.
- Når du er ferdig med innspillingen, fjerner du opptaksløsningen forsiktig fra MEA-parabolen ved hjelp av en 1 ml mikropipette.
MERK: Pass på at du ikke kontakter MEA-elektrodene som kan skade dem. - Fjern maske- og harpeankeret med ben tang (eller buede tang). Bruk deretter en pensel til å løsne vevet fra MEA-overflaten, og vær alltid forsiktig så du ikke berører de enkelte mikroelektrodene.
- Bruk en vaskeflaske og skyll MEA-retten forsiktig med ultrarent vann ca. 3 til 4 ganger.
- Oppbevar den rensede MEA nedsenket i ultrarent vann ved 4 °C.
- Når du er ferdig med innspillingen, fjerner du opptaksløsningen forsiktig fra MEA-parabolen ved hjelp av en 1 ml mikropipette.
- Skyll systemslangen ved å kjøre ultrarent vann gjennom den i minst 5 minutter ved hjelp av maksimal hastighetsinnstilling på den peristaltiske pumpen.
MERK: For å unngå soppvekst, bør det ikke etterlates vann eller bufferoppløsning inne i slangen etter rengjøring.
12. Analysere MEA-opptakene for å måle SAN-beatfrekvens
- Åpne den lagrede innspilte datafilen i malen "Beat_frequency_analysis" i analyseprogramvaren (figur 9) .
- Klikk på Spill av-knappen og la hele innspillingen kjøre for å visualisere datasettet og tilordne passende analyseparametere.
- Velg binning -vinduet for ønsket visningsformat for dataene, uansett om det vises som et gjennomsnitt per sporing eller gjennomsnitt per gang (figur 10A).
- Velg kanalene som skal inkluderes i analysen, og angi de ønskede amplitude maxima- eller amplitude minima-terskelverdiene for automatisert toppidentifikasjon for bølgeform (Figur 10B).
MERK: En individuell kanal, en kombinasjon av kanaler eller alle de 64 kanalene kan velges for analyse på dette trinnet (Figur 9). Hvis de valgte terskelverdiene er for nær bølgeformens maksimerings- og minimaverdier, kan det hende at noen bølgeformtopper ikke identifiseres av analyseprogramvaren. - Angi hvor mye pre-spike og post-spike tid som skal inkluderes i analysen.
MERK: Innstillinger på 50 ms pre-spike og 100 ms post-spike fungerer vanligvis bra (Figur 10B).
- Etter å ha angitt analysebetingelsene, klikker du på Spill av-knappen igjen for å kjøre datasettet på nytt og bekrefte at analyseparametrene passer for topputtrekking.
- For analyse, identifiser de tre mest stabile påfølgende sporene som viser stabil slagrate for hvert spor over de fleste kanaler både i løpet av eksperimentets basisperiode og ytterligere tre påfølgende stabile spor i løpet av narkotikaeksponeringsperioden (figur 10A).
- Angi start- og sluttsporene for analyse, og angi tidsvarigheten for hver sporing som skal analyseres (Figur 9).
- Før du starter analysen, merker du av for aktiver for både Lagre slag per minutt og Lagre interspikeintervall (Figur 10B).
- Skriv inn ønsket filnavn i boksen Endring av filnavn ( Figur10B). De analyserte dataene for beatfrekvens og interspike intervall vil bli lagret i form av ASCII (tekst) format.
MERK: For å analysere ulike tilstander (for eksempel baseline og legemiddelrespons), må analysen kjøres separat for hver tilstand. - Klikk Spill av og spill inn på den øverste fanelinjen for å starte analysen.
- Hvis du vil eksportere dataene for andre programmer, merker du av for Lagre slag per minutt og Lagre interspikeintervall (Figur 10B). Skriv inn ønsket filnavn i boksen Endring av filnavn ( Figur10B), og klikk Lagre for å lagre de analyserte dataene i ASCII-tekstformat i den valgte mappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter å ha tillatt vevet å akklimatisere seg i parabolen i 15 min, registreres 10 en-min spor. Vår nåværende protokoll registrerer aktivitet i over en time, men vi har registrert stabile avfyringsmønstre for ≥4 t i upubliserte data som ikke vises her. Hvis et eksperimentelt preparat er bra for datainnsamling, bør hver innspillingskanal vise konsekvente og jevnt fordelte tilbakevendende bølgeformer (dvs. pigger) av ensartet form for en gitt kanal (Figur 11D). Disse bølgeformene tilsvarer individuelle hjerteslag som gjenspeiler egen hjerte-pacemaking aktivitet. Interspike-intervallene bør være de samme for hver kanal, selv om de kanskje ikke er perfekt justert på tvers av kanaler på grunn av små forskjeller i deres plassering i forhold til initieringsstedet for depolarisering (figur 8). Selv om formen på bølgeformene for en gitt kanal skal være konsistent, vil formen på bølgeformene variere på tvers av kanaler avhengig av plasseringen av elektroden i vevet (Figur 8). Graden av kontakt av vevet med elektroden kan også påvirke bølgeformegenskaper, for eksempel amplituden. Amplitude maxima bør imidlertid være minst 0,5 mV for de fleste kanaler hvis preparatet er tilfredsstillende. Fra de 10 registrerte sporene ble de tre påfølgende kanalene som best oppfyller kvalitetskriteriene beskrevet ovenfor valgt for videre analyse beskrevet nedenfor. Figur 10A viser en prøve av stabil beatfrekvens (topppanel) og interspikeintervall (midtpanel) for tre påfølgende spor. Vev som ikke oppfyller disse kriteriene, bør ikke registreres, da det er sannsynlig vevsskade som vil hindre nøyaktig datainnsamling. Figur 11 viser eksempler på dårlige ekstraherte spissmønstre som enten er fraværende (A), påvirket av støy (B) eller ustabile (C).
Eksempeldataene som vises i figurene ble samlet inn fra en 45-dagers gammel mannlig wildtype svart sveitsisk (Tac:N:NIHS-BC) mus. Analyseprosedyren som er avbildet i figur 9 og figur 10, ble brukt til å trekke ut den innebygde avfyringshastigheten og vise grunnlinjespisser som kan ses i figur 12A. Avfyringshastigheten er gjennomsnittshastigheten på 60 000 ms fra hver av de tre sporene, men piggmønsteret i figur 12A viser 5 s representativ spiking fra et enkelt spor. Ved hjelp av automatisert analyseprogramvare ble den iboende avfyringshastigheten (dvs. beatfrekvens) til de valgte tre sporene på tvers av alle de 64 kanalene funnet å være omtrent 320 bpm i våre eksempeldata (Figur 12A). Generelt observerer vi en rekke verdier på ca 290-340 bpm i våre opptak for wildtype mus. Avfyringshastigheten kan også brukes som en sekundær metode for å vurdere forberedelseskvalitet. Priser som enten er ustabile eller betydelig lavere enn 300 bpm, er mindre sannsynlig å være gode for analyse. Disse verdiene kan sammenlignes med både isolerte hjerte- og enkeltcelleopptak som rapporterer egen hjertefrekvens i området ca. 300-500 bpm25,48,49. Derfor er MEA-opptaksteknikken i stand til å generere pålitelige og nøyaktige mål på egen hjertefrekvens.
En fordel med MEA-systemet er at det gjør det enkelt å bruke legemiddelmidler for å teste farmakologiske effekter. I prøveeksperimentet testet vi effekten av 1 mM 4-AP på avfyringshastighet, noe som bør bremse SAN-aktiviteten siden blokade av spenningsportede K+ kanaler er kjent for å svekke virkningen potensiell repolering i SA-cellene24,50. Figur 12B viser at innføringen av 4-AP økte interspikeintervallene som forventet. Dette langvarige piggintervallet tilsvarte en reduksjon i slagfrekvensen fra 320 bpm til 210 bpm. Denne avfyringsraten etter 4-AP-administrasjon ligner på en tidligere studie som undersøkte effekten av 4-AP på SAN-avfyringshastighet ved hjelp av enkeltelektrodeopptak av isolert vev. Denne studien målte en avfyringshastighet på omtrent 190 bpm i nærvær av 4-AP50. Dermed kan MEA-systemet brukes som et praktisk og verdifullt verktøy for å teste farmakologiske effekter av legemiddelintervensjoner på iboende hjertefunksjon.
Figur 1: Belegg mikroelektrode array (MEA) før bruk. (A) MEA består av en liten plastfat med et rutenett på 64 mikroelektroder i midten (som vist i panelet A1) og fire referanseelektroder rundt periferien i et firkantet mønster. (B) Tilsetning av 1 ml PEI-buffer for å belegge MEA. (C) Dekker MEA-retten med termoplastisk film for inkubasjon over natten ved romtemperatur. (D) Aspirering av PEI-bufferen fra MEA-parabolen, som etterfølges av minst fire skyllinger med destillert vann. (E) Lagring av den belagte MEA-sonden under ultrarent vann for å hindre at den tørker ut. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Verktøy som brukes til sinoatrial node (SAN) disseksjon. Følgende verktøy brukes under disseksjonsdelen av protokollen: (i) Petri-tallerken med silikonelastomer og små disseksjonspinner; (ii) Plastoverføring pipette; (iii) Castroviejo saks, størrelse 4"; (iv) Kirurgisk saks (rett) for skjæreprosedyrer; (v) Dumont #2 Laminectomy tang; (vi) Dumont #55 tang; (vii) Ekstra fine Graefe tang; (viii) Hemostater (buet). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fjerning av hjertet. (A) Tverrsnitt i huden like under bunnen av ribbeinburet fra omtrent venstre kostbue til høyre kostbar bue. (B) Peritoneal snitt. (C,D) Snitt av membranen langs thoraxen for å eksponere thoraxhulen. (E) Fjerning av hjertet etter eksisjon av lungene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Disseksjon av sinoatrial (SAN) node. (A) Utseendet til hjertet i Petri parabolen etter fjerning fra kroppen. (B) Innsetting av sprøytenålen gjennom den dårligere vena cava (IVC) og overlegen vena cava (SVC) av høyre atrium. Pinnen i toppen av hjertet vises også. (C) Eksisjon av apex (dvs. den nederste halvdelen) av hjertet for å frigjøre blodet. Pinnene i atrievedleggene vises også. (D) Det endelige utseendet til SAN-regionen til høyre atrium på slutten av disseksjonen. Det innrammede området tilsvarer den omtrentlige plasseringen av SAN. SAN-arterien kan også ses svakt gjennom SAN i vertikal retning. Forkortelsene: AO, aorta; CT, crista terminalis; IVC, dårligere vena cava; LA, venstre atrium; RA, høyre atrium; RAA, høyre atrievedlegg; SAN, sinoatrial node; SVC, overlegne vena cava. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Skjematisk for systemoppsettet for microelectrode array (MEA). Følgende komponenter består av systemet: (A) gassflaske (karbogen: 95% O2/ 5% CO2); (B) konisk kolbe med destillert vann for å fukte gassen; (C) opptak Tyrodes løsningsflaske som gir tilsig til MEA-parabolen; (D) peristaltisk pumpe til pumpeløsning til og fra MEA-parabolen; (E) temperaturregulator; (F) MEA-kontaktplate som mottar signaler fra MEA-parabolen; (G) forsterker; (H) datamaskin; (I) oppsamlingsflaske til brukt avfallsløsning fra MEA-retten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Plassering av SA-nodalvevet på MEA. (A) Verktøy som brukes til å plassere vevet: (i) Netting med 1,5 mm rutenettstørrelse, (ii) harpeanker, (iii) ben tang, (iv) pensel. (B) Plassering av vevet på MEA. Den gule boksen indikerer det omtrentlige området av den sinoatriale nodeområdet under nettet og ankeret i MEA-parabolen. (C) Arrangement av MEA-retten med vedlagt vev på kontaktplaten for feltpotensialopptak: (i) innløp for opptaksløsningen; (ii) innløp for gass (karbogen); (iii) utløp for løsningen; (iv) mikroelektrode kontaktplate; (v) perfusjonshette; (vi) referanseelektrodering festet til hetten; (vii)-tape for å holde hetten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Angi datainnsamlingsprotokollen i programvaren. (A) Et eksempel på innspillingsmal som viser plassering av alle de 64 kanalene. (B) Et eksempel på programvareinngangsegenskapene for innspillingsbetingelsene. (C) Et eksempel på Merknader-menyen som viser hvordan du legger til ny fase under innspillingen, for eksempel for måling av legemiddeleffekter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Ulike områder av vevet som viser forskjellige aktivitetsbølgeformer. Eksempelskjermbilde som viser bølgeformer med forskjellige former og amplituder i forskjellige kanaler. Imidlertid viser alle kanaler identiske interspike intervaller og avfyring frekvenser. Kanalene i den røde boksen tilsvarer omtrent elektrodene som er plassert i SAN-området i vevet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Mal for beatfrekvensanalyse. Eksempelmal som viser plassering av alle de 64 kanalene i malen for beatfrekvensanalyse. Inset for Replay Raw Data File viser et eksempel på inndataegenskapene til analysevinduet. I dette eksemplet er spor 5 til 7 valgt for analyse, og analysevarigheten for hver sporing er angitt som 60 000 ms. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 10: Definere analyseparametere for topputtrekking. (A) Representative analysemalresultater for 3 valgte spor av en enkelt kanal. Det øverste panelet viser beatfrekvens for de tre valgte sporene (tre definerte grupperinger av datapunkter), og hvert punkt representerer et gjennomsnitt på 10 for slagfrekvens under den spesifikke sporingen. Det midterste panelet viser intervall mellom topper for de tre valgte sporene (tre definerte grupperinger av datapunkt), og hvert datapunkt representerer intervallet mellom topper mellom to påfølgende topper. Panelet nederst til venstre viser utvalgte representative utpakkede pigger for de siste 5 s av den tredje sporingen, mens det nedre høyre panelet viser en ekstrahert bølgeform avledet fra 5-s-gruppen med ekstraherte pigger i nedre venstre panel. (B) Utvidet visning av analysevinduet som viser parametere som brukes i analysen av slagfrekvens for de 3 sporene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Representativ figur som viser god kontra dårlig datautvinning for en bestemt kanal. Ugyldig datauttrekking: (A) Fravær av utpakkede pigger. (B) Ekstraherte pigger med støysignaler; (C) Ustabile utpakkede pigger. (D) Gode data som viser stabile ekstraherte pigger uten støysignaler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 12: Opptak ved baseline og etter administrering av 1mM 4-Aminopyridine (4-AP). (A) Baseline opptak fra en enkelt mikroelektrod viser bølgeformer med en stabil avfyringsfrekvens på 320 bpm i et WT-hjerte. (B) Etter administrering av 4-AP, reduseres avfyringsfrekvensen til en stabil hastighet på 210 bpm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Å praktisere og mestre SAN-disseksjonsprosessen er viktig siden vevet er skjøre og sunt vev er nødvendig for en vellykket registrering. Under SAN-disseksjonen er riktig orientering viktig for å oppnå riktig vevsområde. Imidlertid kan hjertets opprinnelige orientering lett gå tapt under disseksjonsprosessen, noe som kompliserer denne bestrebelsen. Derfor, for å sikre riktig venstre-høyre orientering, bør atriene inspiseres visuelt. Vanligvis har høyre atrium en tendens til å være mer gjennomsiktig, mens venstre atrium vanligvis er mørkere og mer rødt i farge25,48. Videre er det viktig å ikke strekke SAN-vevet mens du arbeider med det eller montere det på elektrodegitteret, da vevet lett er mekanisk skadet51. Et tips for å verifisere sunt og riktig dissekert SAN-vev er å undersøke det i Complete Tyrodes løsning under mikroskopet for å bekrefte at vevet slår. Når teknikken er mestret, bør minst 90% av vevspreparatene være gode for opptak.
Flere hensyn kan forbedre sannsynligheten for vellykkede opptak og påfølgende dataanalyse. For å sikre de beste opptakene, bør løsningene være nøye forberedt og testet på praksis museprøver før eksperimentelle opptak. Vi jobbet mye for å tilpasse og modifisere opptaksløsningen for å optimalisere helsen til SAN-vevet. I tillegg må du sørge for at gassen som brukes til opptaket er karbogen (dvs. 95% O2/ 5% CO2). Enkeltcelleopptak bruker ofte rent oksygen på grunn av den spesifikke kjemiske sammensetningen av Tyrodes løsning som brukes til den applikasjonen, men løsningen som brukes til opptak på MEA krever karbogen for å opprettholde en stabil pH. Bruk av rent oksygen med Tyrodes løsning for MEA-opptakene vil føre til svingninger i pH som kan føre til rask forverring av vevet. Vurdering av amplitude maxima i kanalene som tidligere beskrevet, vil bidra til å avgjøre om vevet er av god opptakskvalitet. Til slutt, for å hjelpe analyse etter innspillingen, er det veldig nyttig å ta et bilde av det monterte SAN-vevet på MEA-elektrodematrisen etter at opptaket er ferdig. Vevet kan skifte litt under det første oppsettet av MEA, og dette gir den mest nøyaktige vurderingen av elektrodeplassering for analyse.
Vi foreslår MEA-opptak som en grundig og nøyaktig måte å karakterisere SAN-avfyringshastigheten på. En fordel med MEA-teknikken er at den gjør det mulig for eksperimentet å fange avfyringshastigheter på linje med enkeltcelleopptak uten å måtte ha omfattende elektrofysiologisk kompetanse. MEA-teknikken har også fordelen av å eliminere de potensielle forvirrende påvirkningene av nevrohumorale og mekano-elektriske mekanismer, som er iboende i isolerte hjerteopptak og in vivo autonome blokademålinger21. Ventrikulær sammentrekning og åndedrett er de viktigste mekano-elektriske påvirkningene som kan endre SAN-avfyring, men de elimineres i vevspreparatet vårt 52,53. Selv om teknikken vår eliminerer de fleste autonome påvirkningene på SAN, kan et begrenset antall gjenværende ICNS-projeksjoner i høyre atria potensielt påvirke SAN-avfyring, en teoretisk begrensning som bør huskes under tolkningen av resultatene5,6,22,23. En annen fordel med MEA-teknikken som er beskrevet her, er at den kan tilpasses mange andre typer hjertestudier. For eksempel, selv om denne protokollen demonstrerte effekten av 4-AP på SAN-aktivitet, kunne fremtidige studier se på et nesten ubegrenset antall farmakologiske midler, samt effekten av genmutasjoner på SAN iboende avfyring. For eksempel kan ivabradin, en bestemt blokkering av den SAN-spesifikke Hcn4-kanalen, brukes til å studere morsomme nåværende bidrag til avfyringsraten54. MEA-systemet kan også brukes til å måle hjertefunksjon i andre områder av hjertet, noe som gir detaljert, regionspesifikk karakterisering. Imidlertid vil opptak fra andre hjerteregioner kreve forskjellige disseksjonsmetoder og muligheten for tynn vevsseksjon før opptak. En potensielt betydelig begrensning av denne teknikken er de høye kostnadene ved å kjøpe et MEA-system som kan være forbudt. Flere MEA-systemer er tilgjengelige på markedet med lignende egenskaper og funksjonalitet, men den høye prisen forblir den samme. Men når det første utstyret og programvaren er anskaffet, er kostnadene for å vedlikeholde og bruke MEA-systemet ganske lave. En annen begrensning er at MEA-systemet bare tillater registrering av ekstracellulære feltpotensialer som ikke bidrar til presise sammenligninger av handlingspotensiale egenskaper (f.eks. amplitude og form) mellom preparater som kan oppnås med enkeltcellede intracellulære opptak. Oppsummert gir denne protokollen en effektiv arbeidsflyt for å måle og analysere iboende hjerteavfyringshastigheter i musen SAN-vev med evnen til å studere effekten av farmakologisk intervensjon på avfyringshastighet på en svært spesifikk måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health, tilskuddsnummer R01NS100954 og R01NS099188.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920x1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
References
- Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
- Josea, A. D., Collison, D. The normal range and determinants of the intrinsic heart rate in man. Cardiovascular Research. (4), 160-167 (1970).
- Peters, C. H., Sharpe, E. J., Proenza, C. Annual Review of Physiology Cardiac Pacemaker Activity and Aging. Annual Review of Physiology. 82, 21-43 (2019).
- Keith, A., Flack, M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. Journal of Anatomy and Physiology. 41 (3), 172-189 (1907).
- Wake, E., Brack, K. Characterization of the intrinsic cardiac nervous system. Autonomic Neuroscience. 199, (2016).
- Fedele, L., Brand, T. The intrinsic cardiac nervous system and its role in cardiac pacemaking and conduction. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 7 (4), 1-33 (2020).
- Mangrum, J. M., DiMarco, J. P. The evaluation and management of bradycardia. New England Journal of Medicine. 342 (10), 703-709 (2000).
- Adan, V., Crown, L. A. Diagnosis and treatment of Sick Sinus Syndrome. American Family Physician. 67 (8), 1725-1732 (2003).
- Semelka, M., Gera, J., Usman, S. Sick Sinus Syndrome: A Review. American Family Physician. 87 (10), 691-696 (2013).
- Zaragoza, M. V., et al. Exome sequencing identifies a novel LMNA splice-site mutation and multigenic heterozygosity of potential modifiers in a family with Sick Sinus Syndrome, dilated cardiomyopathy, and sudden cardiac death. PLoS ONE. 11 (5), 0155421 (2016).
- Brugada, J., Campuzano, O., Arbelo, E., Sarquella-Brugada, G., Brugada, R. Present status of Brugada Syndrome: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (9), 1046-1059 (2018).
- Rollin, A., et al. Prevalence, characteristics, and prognosis role of type 1 ST elevation in the peripheral ECG leads in patients with Brugada syndrome. Heart Rhythm. 10 (7), 1012-1018 (2013).
- Patel, N., Majeed, F., Sule, A. A. Seizure triggered by Sick Sinus Syndrome. BMJ case reports. 4, 2017222011 (2017).
- Knecht, S., et al. Impact of pharmacological autonomic blockade on complex fractionated atrial electrograms. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (7), 766-772 (2010).
- Saba, S., London, B., Ganz, L. Autonomic blockade unmasks maturational differences in rate-dependent atrioventricular nodal conduction and facilitation in the mouse. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 14 (2), 191-195 (2003).
- Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 51-56 (2002).
- Tse, G., Tse, V., Yeo, J. M., Sun, B. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts. PLoS ONE. 11 (2), 0148858 (2016).
- Tse, G., et al. Quantification of beat-to-beat variability of action potential durations in Langendorff-perfused mouse hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1578), 01578 (2018).
- Avula, U. M. R., et al. Heterogeneity of the action potential duration is required for sustained atrial fibrillation. JCI Insight. 5 (11), 128765 (2019).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. (135), e57617 (2018).
- Quinn, A. T., Kohl, P. Cardiac mechano-electric coupling: Acute effects of mechanical stimulation on heart rate and rhythm. Physiological Reviews. 101 (1), 37-92 (2021).
- Ripplinger, C. M., Noujaim, S. F., Linz, D.
- Pauza, D. H., Pauziene, N., Pakeltyte, G., Stropus, R. Comparative quantitative study of the intrinsic cardiac ganglia and neurons in the rat, guinea pig, dog and human as revealed by histochemical staining for acetylcholinesterase. Annals of Anatomy. 184, 125-136 (2002).
- Golovko, V., Gonotkov, M., Lebedeva, E. Effects of 4-aminopyridine on action potentials generation in mouse sinoauricular node strips. Physiological Reports. 3 (7), 12447 (2015).
- Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), e54555 (2016).
- Doi, M., Ogawa, E., Arai, T. Effect of a photosensitization reaction performed during the first 3 min after exposure of rat myocardial cells to talaporfin sodium in vitro. Lasers in Medical Science. 32 (8), 1873-1878 (2017).
- Takanari, H., et al. A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology. Journal of Cellular Physiology. 231 (10), 2249-2256 (2016).
- Nakashima, T., et al. Rapid electrical stimulation causes alterations in cardiac intercellular junction proteins of cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1324-1333 (2014).
- Suzuki, S., et al. Effects of aldosterone on Cx43 gap junction expression in neonatal rat cultured cardiomyocytes. Circulation Journal. 73 (8), (2009).
- Horiba, M., et al. T-type Ca2+ channel blockers prevent cardiac cell hypertrophy through an inhibition of calcineurin-NFAT3 activation as well as L-type Ca2+ channel blockers. Life Sciences. 82 (11-12), 554-560 (2008).
- Inoue, N., et al. Rapid electrical stimulation of contraction modulates gap junction protein in neonatal rat cultured cardiomyocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases and effects of angiotensin II receptor agonist. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 914-922 (2004).
- Aalders, J., et al. Effects of fibrillin mutations on the behavior of heart muscle cells in Marfan syndrome. Scientific Reports. 10 (16756), (2020).
- Matsuura, K., et al. Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets. Biomaterials. 32 (30), 7355-7362 (2011).
- Fujita, H., Shimizu, K., Nagamori, E. Application of a cell sheet-polymer film complex with temperature sensitivity for increased mechanical strength and cell alignment capability. Biotechnology and Bioengineering. 103 (2), 370-377 (2009).
- Baba, S., et al. Generation of cardiac and endothelial cells from neonatal mouse testis-derived multipotent germline stem cells. Stem Cells. 25 (6), 1375-1383 (2007).
- Baba, S., et al. Flk1+ cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model. Cardiovascular Research. 76 (1), 119-131 (2007).
- Shimizu, K., et al. Construction of multi-layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 803-809 (2007).
- Haraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. Electrical coupling of cardiomyocyte sheets occurs rapidly via functional gap junction formation. Biomaterials. 27 (27), 4765-4774 (2006).
- Miyagawa, S., et al. Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: Their integration with recipient myocardium. Transplantation. 80 (11), 1586-1595 (2005).
- Watts, M., et al. Decreased bioavailability of hydrogen sulfide links vascular endothelium and atrial remodeling in atrial fibrillation. Redox Biology. 38, 101817 (2021).
- Feng, Y., Cao, H., Zhang, Y. Prediction model of sinoatrial node field potential using high order partial least squares. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 1805-1811 (2015).
- Feng, Y., Cao, H., Wang, Y., Zhang, Y. Fuzzy linguistic prediction model for sinoatrial node field potential analysis in acute hyperglycemia environment. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, Suppl 1 881-887 (2015).
- Suzuki, K., Matsumoto, A., Nishida, H., Reien, Y., Maruyama, H., Nakaya, H. Termination of aconitine-induced atrial fibrillation by the KACh-channel blocker tertiapin: underlying electrophysiological mechanism. Journal of Pharmacological Sciences. 125 (4), 406-414 (2014).
- Chang, S. -L., et al. Heart failure enhances arrhythmogenesis in pulmonary veins. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 38 (10), 666-674 (2011).
- Wang, Y. -J., et al. Time-dependent block of ultrarapid-delayed rectifier K+ currents by aconitine, a potent cardiotoxin, in heart-derived H9c2 myoblasts and in neonatal rat ventricular myocytes. Toxicological Sciences. 106 (2), 454-463 (2008).
- Lai, Y. -J., Huang, E. Y. -K., Yeh, H. -I., Chen, Y. -L., Lin, J. J. -C., Lin, C. -I. On the mechanisms of arrhythmias in the myocardium of mXinα-deficient murine left atrial-pulmonary veins. Life Sciences. 83 (7-8), 272-283 (2008).
- Gustafson-Wagner, E. A., et al. Loss of mXinα, an intercalated disk protein, results in cardiac hypertrophy and cardiomyopathy with conduction defects. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (5), 2680-2692 (2007).
- Clark, R. B., et al. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, 1757-1766 (2004).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Nikmaram, M. R., et al. Characterization of the effects of Ryanodine, TTX, E-4031 and 4-AP on the sinoatrial and atrioventricular nodes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 96 (1-3), 452-464 (2008).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
- Masé, M., Glass, L., Ravelli, F. A model for mechano-electrical feedback effects on atrial flutter interval variability. Bulletin of Mathematical Biology. 70 (5), 1326-1347 (2008).
- Franz, M. R., Bode, F. Mechano-electrical feedback underlying arrhythmias: The atrial fibrillation case. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 82 (1-3), 163-174 (2003).
- Bucchi, A., Tognati, A., Milanesi, R., Baruscotti, M., DiFrancesco, D. Properties of ivabradine-induced block of HCN1 and HCN4 pacemaker channels. Journal of Physiology. 572 (2), 335-346 (2006).
