Mikroelektrod arrayinspelning av sinoatrie nodavfyrningshastighet för att identifiera inneboende hjärt pacemaking defekter hos möss
Summary
Detta protokoll syftar till att beskriva en ny metod för att mäta inneboende hjärtbränningshastighet med hjälp av mikroelektrod array registrering av hela sinoatrial nodvävnad för att identifiera pacemaking defekter hos möss. Farmakologiska medel kan också införas i denna metod för att studera deras effekter på inneboende pacemaking.
Abstract
Den sinoatrial noden (SAN), som ligger i rätt atrium, innehåller pacemaker celler i hjärtat, och dysfunktion i denna region kan orsaka takykardi eller bradykardi. Tillförlitlig identifiering av hjärt pacemaking defekter kräver mätning av inneboende hjärtfrekvenser genom att till stor del förhindra påverkan av det autonoma nervsystemet, som kan maskera hastighet underskott. Traditionella metoder för att analysera inneboende hjärt pacemaker funktion inkluderar droginducerad autonoma blockad för att mäta in vivo hjärtfrekvenser, isolerade hjärtinspelningar för att mäta inneboende hjärtfrekvenser och sinoatrial remsa eller encelliga patch-clamp inspelningar av sinoatrial pacemaker celler för att mäta spontana åtgärder potentiella avfyrning priser. Dessa mer traditionella tekniker kan dock vara tekniskt utmanande och svåra att utföra. Här presenterar vi en ny metod för att mäta inneboende hjärtbränningshastighet genom att utföra mikroelektrodmatrisinspelningar (MEA) av hela berget sinoatrienodpreparat från möss. MeAs består av flera mikroelektroder ordnade i ett rutnätsliknande mönster för registrering av in vitro extracellulära fältpotentialer. Metoden som beskrivs häri har den kombinerade fördelen att vara relativt snabbare, enklare och mer exakt än tidigare metoder för att registrera inneboende hjärtfrekvenser, samtidigt som det möjliggör enkla farmakologiska förhör.
Introduction
Hjärtat är ett komplext organ som styrs av både hjärt-inneboende och extrinsiska influenser som de som har sitt ursprung i hjärnan. Den sinoatrial noden (SAN) är en definierad region i hjärtat som rymmer pacemakercellerna (även kallade sinoatrial celler, eller SA-celler) som ansvarar för initiering och fortlevnad av däggdjurs hjärtslag1,2. Den inneboende hjärtfrekvensen är den hastighet som drivs av pacemakercellerna utan påverkan av andra hjärt- eller neurohumorala influenser, men traditionella mått på hjärtfrekvens hos människor och levande djur, såsom elektrokardiogram, återspeglar både pacemaker och neurala influenser på hjärtat. Det mest anmärkningsvärda neurala inflytandet på SA-celler är från det autonoma nervsystemet, som ständigt modulerar bränningsmönster för att uppfylla kroppens fysiologiska krav3. Stödja denna idé, både sympatiska och parasympatiska projektioner kan hittas nära SAN4. Det inneboende hjärtnervsystemet (ICNS) är en annan viktig neural påverkan där ganglionated plexi, särskilt i rätt atria, innervate och reglera aktiviteten hos SAN5,6.
Att förstå pacemaking underskott är kliniskt viktigt, eftersom dysfunktion kan lindra många hjärtsjukdomar, samt bidra till risken för andra komplikationer. Sjuk sinus syndrom (SSS) är en kategori av sjukdomar som kännetecknas av dysfunktion i sinoatrial noden som hindrar korrekt pacemaking7,8. SSS kan presentera med sinus bradykardi, sinus pauser, sinus gripande, sinoatrial exit block och alternerande bradyarrythmias och takyarrhythmias9 och kan leda till komplikationer inklusive ökad risk för embolisk stroke och plötslig död8,10. De med Brugada syndrom, en hjärtsjukdom som kännetecknas av ventrikulär förmaksflimmer med en ökad risk för plötslig hjärtdöd, har större risk för arytmogena händelser om de också har komorbid SAN dysfunktion11,12. Sinoatrie dysfunktion kan också ha fysiologiska konsekvenser bortom hjärtat. Till exempel har SSS observerats för att utlösa anfall hos en patient på grund av cerebral hypoperfusion13.
För att identifiera sinoatrial pacemaking underskott, inneboende hjärtfrekvenser måste bestämmas genom att mäta san verksamhet utan påverkan av autonoma nervsystemet eller humorala faktorer. Kliniskt kan detta approximeras av farmakologisk autonom blockad14, men samma teknik kan också tillämpas i däggdjursmodeller för att studera inneboende hjärtfunktion15,16. Medan detta tillvägagångssätt blockerar en stor del av bidragande neurala influenser och möjliggör hjärtundersökning in vivo, eliminerar det inte helt alla extrinsiska influenser på hjärtat. En annan forskningsteknik som används för att studera inneboende hjärtfunktion i djurmodeller är isolerade hjärtinspelningar med Langendorff-perfused hjärtan, som vanligtvis involverar mätningar med hjälp av elektrogram, pacing eller epicardial multielektrod arrayer17,18,19,20. Medan denna teknik är mer specifik för hjärtfunktion eftersom det innebär att ta bort hjärtat från kroppen, kan mätningarna fortfarande påverkas av mekano-elektriska autoregulatoriska mekanismer som kan påverka inneboende pulsmätningar21. De isolerade hjärtinspelningarna kan också fortfarande påverkas av autonom reglering genom ICNS5,6,22,23. Dessutom kan det vara svårt att upprätthålla en fysiologiskt relevant temperatur i hjärtat, vilket är avgörande för hjärtfunktionsmätningar, i isolerade hjärtmetoder20. En mer direkt metod för att studera SAN-funktion är att specifikt isolera SAN-vävnad och mäta dess aktivitet. Detta kan åstadkommas genom SAN-remsor (isolerad SAN-vävnad) eller isolerade SAN pacemakerceller24,25. Båda kräver en hög grad av teknisk utbildning, eftersom SAN är en mycket liten och mycket definierad region, och cellisolering utgör en ännu större utmaning eftersom dissociation kan skada cellens allmänna hälsa om den inte utförs korrekt. Dessutom kräver dessa tekniker expertelektrofiologiska färdigheter för att framgångsrikt registrera från vävnaden eller cellerna med hjälp av enskilda registrering av mikroelektroder.
I det här protokollet beskriver vi en teknik för att spela in SAN in vitro med hjälp av en mikroelektrod array (MEA) för att erhålla inneboende pulsmätningar. Detta tillvägagångssätt har fördelen att göra mycket specifika elektrofysiologiska inspelningar tillgängliga för forskare som saknar intensiva elektrofysiologiska färdigheter. MEAs har tidigare använts för att studera kardiomyocyt funktion i primära kardiomyocyt kulturer26,27,28,29,30,31,32,hjärt täcker33,34,35,36,37, 38,39,och vävnad hela fästen40, 41,42,43,44,45,46,47. Tidigare arbete har också gjorts för att undersöka fältpotentialer iSAN-vävnad 41,42. Här tillhandahåller vi en metodik för att använda MEA för att registrera och analysera murin inneboende SAN-avfyrningshastigheter. Vi beskriver också hur denna teknik kan användas för att testa farmakologiska effekter av läkemedel på SAN inneboende avfyrningshastigheter genom att tillhandahålla ett provexperiment som visar effekterna av 4-aminopyridin (4-AP), en spänning-gated K+ kanalblockerare. Med hjälp av definierade anatomiska landmärken kan vi noggrant registrera SAN utan att behöva utföra de omfattande vävnadsdesektioner eller cellisoleringar som krävs i andra metoder. Även om mea kan vara kostnadsöverkomliga, ger inspelningarna mycket specifika och tillförlitliga mått på pacemaking som kan användas i ett stort antal kliniska och fysiologiska forskningsapplikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Att öva och behärska SAN-dissekeringsprocessen är absolut nödvändigt eftersom vävnaden är bräcklig och frisk vävnad är nödvändig för en framgångsrik inspelning. Under SAN dissekering är korrekt orientering avgörande för att få rätt region av vävnad. Hjärtats ursprungliga orientering kan dock lätt gå förlorad under dissekeringsprocessen, vilket komplicerar denna strävan. För att säkerställa rätt vänster-högerorientering bör atria därför inspekteras visuellt. Vanligtvis tenderar det högra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av National Institutes of Health, bidragsnumren R01NS100954 och R01NS099188.
Materials
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
References
- Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
- Josea, A. D., Collison, D. The normal range and determinants of the intrinsic heart rate in man. Cardiovascular Research. (4), 160-167 (1970).
- Peters, C. H., Sharpe, E. J., Proenza, C. Annual Review of Physiology Cardiac Pacemaker Activity and Aging. Annual Review of Physiology. 82, 21-43 (2019).
- Keith, A., Flack, M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. Journal of Anatomy and Physiology. 41 (3), 172-189 (1907).
- Wake, E., Brack, K. Characterization of the intrinsic cardiac nervous system. Autonomic Neuroscience. 199, (2016).
- Fedele, L., Brand, T. The intrinsic cardiac nervous system and its role in cardiac pacemaking and conduction. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 7 (4), 1-33 (2020).
- Mangrum, J. M., DiMarco, J. P. The evaluation and management of bradycardia. New England Journal of Medicine. 342 (10), 703-709 (2000).
- Adan, V., Crown, L. A. Diagnosis and treatment of Sick Sinus Syndrome. American Family Physician. 67 (8), 1725-1732 (2003).
- Semelka, M., Gera, J., Usman, S. Sick Sinus Syndrome: A Review. American Family Physician. 87 (10), 691-696 (2013).
- Zaragoza, M. V., et al. Exome sequencing identifies a novel LMNA splice-site mutation and multigenic heterozygosity of potential modifiers in a family with Sick Sinus Syndrome, dilated cardiomyopathy, and sudden cardiac death. PLoS ONE. 11 (5), 0155421 (2016).
- Brugada, J., Campuzano, O., Arbelo, E., Sarquella-Brugada, G., Brugada, R. Present status of Brugada Syndrome: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (9), 1046-1059 (2018).
- Rollin, A., et al. Prevalence, characteristics, and prognosis role of type 1 ST elevation in the peripheral ECG leads in patients with Brugada syndrome. Heart Rhythm. 10 (7), 1012-1018 (2013).
- Patel, N., Majeed, F., Sule, A. A. Seizure triggered by Sick Sinus Syndrome. BMJ case reports. 4, 2017222011 (2017).
- Knecht, S., et al. Impact of pharmacological autonomic blockade on complex fractionated atrial electrograms. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (7), 766-772 (2010).
- Saba, S., London, B., Ganz, L. Autonomic blockade unmasks maturational differences in rate-dependent atrioventricular nodal conduction and facilitation in the mouse. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 14 (2), 191-195 (2003).
- Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 51-56 (2002).
- Tse, G., Tse, V., Yeo, J. M., Sun, B. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts. PLoS ONE. 11 (2), 0148858 (2016).
- Tse, G., et al. Quantification of beat-to-beat variability of action potential durations in Langendorff-perfused mouse hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1578), 01578 (2018).
- Avula, U. M. R., et al. Heterogeneity of the action potential duration is required for sustained atrial fibrillation. JCI Insight. 5 (11), 128765 (2019).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. (135), e57617 (2018).
- Quinn, A. T., Kohl, P. Cardiac mechano-electric coupling: Acute effects of mechanical stimulation on heart rate and rhythm. Physiological Reviews. 101 (1), 37-92 (2021).
- Ripplinger, C. M., Noujaim, S. F., Linz, D. The nervous heart. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 199-209 (2016).
- Pauza, D. H., Pauziene, N., Pakeltyte, G., Stropus, R. Comparative quantitative study of the intrinsic cardiac ganglia and neurons in the rat, guinea pig, dog and human as revealed by histochemical staining for acetylcholinesterase. Annals of Anatomy. 184, 125-136 (2002).
- Golovko, V., Gonotkov, M., Lebedeva, E. Effects of 4-aminopyridine on action potentials generation in mouse sinoauricular node strips. Physiological Reports. 3 (7), 12447 (2015).
- Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), e54555 (2016).
- Doi, M., Ogawa, E., Arai, T. Effect of a photosensitization reaction performed during the first 3 min after exposure of rat myocardial cells to talaporfin sodium in vitro. Lasers in Medical Science. 32 (8), 1873-1878 (2017).
- Takanari, H., et al. A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology. Journal of Cellular Physiology. 231 (10), 2249-2256 (2016).
- Nakashima, T., et al. Rapid electrical stimulation causes alterations in cardiac intercellular junction proteins of cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1324-1333 (2014).
- Suzuki, S., et al. Effects of aldosterone on Cx43 gap junction expression in neonatal rat cultured cardiomyocytes. Circulation Journal. 73 (8), (2009).
- Horiba, M., et al. T-type Ca2+ channel blockers prevent cardiac cell hypertrophy through an inhibition of calcineurin-NFAT3 activation as well as L-type Ca2+ channel blockers. Life Sciences. 82 (11-12), 554-560 (2008).
- Inoue, N., et al. Rapid electrical stimulation of contraction modulates gap junction protein in neonatal rat cultured cardiomyocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases and effects of angiotensin II receptor agonist. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 914-922 (2004).
- Aalders, J., et al. Effects of fibrillin mutations on the behavior of heart muscle cells in Marfan syndrome. Scientific Reports. 10 (16756), (2020).
- Matsuura, K., et al. Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets. Biomaterials. 32 (30), 7355-7362 (2011).
- Fujita, H., Shimizu, K., Nagamori, E. Application of a cell sheet-polymer film complex with temperature sensitivity for increased mechanical strength and cell alignment capability. Biotechnology and Bioengineering. 103 (2), 370-377 (2009).
- Baba, S., et al. Generation of cardiac and endothelial cells from neonatal mouse testis-derived multipotent germline stem cells. Stem Cells. 25 (6), 1375-1383 (2007).
- Baba, S., et al. Flk1+ cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model. Cardiovascular Research. 76 (1), 119-131 (2007).
- Shimizu, K., et al. Construction of multi-layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 803-809 (2007).
- Haraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. Electrical coupling of cardiomyocyte sheets occurs rapidly via functional gap junction formation. Biomaterials. 27 (27), 4765-4774 (2006).
- Miyagawa, S., et al. Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: Their integration with recipient myocardium. Transplantation. 80 (11), 1586-1595 (2005).
- Watts, M., et al. Decreased bioavailability of hydrogen sulfide links vascular endothelium and atrial remodeling in atrial fibrillation. Redox Biology. 38, 101817 (2021).
- Feng, Y., Cao, H., Zhang, Y. Prediction model of sinoatrial node field potential using high order partial least squares. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 1805-1811 (2015).
- Feng, Y., Cao, H., Wang, Y., Zhang, Y. Fuzzy linguistic prediction model for sinoatrial node field potential analysis in acute hyperglycemia environment. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 881-887 (2015).
- Suzuki, K., Matsumoto, A., Nishida, H., Reien, Y., Maruyama, H., Nakaya, H. Termination of aconitine-induced atrial fibrillation by the KACh-channel blocker tertiapin: underlying electrophysiological mechanism. Journal of Pharmacological Sciences. 125 (4), 406-414 (2014).
- Chang, S. -. L., et al. Heart failure enhances arrhythmogenesis in pulmonary veins. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 38 (10), 666-674 (2011).
- Wang, Y. -. J., et al. Time-dependent block of ultrarapid-delayed rectifier K+ currents by aconitine, a potent cardiotoxin, in heart-derived H9c2 myoblasts and in neonatal rat ventricular myocytes. Toxicological Sciences. 106 (2), 454-463 (2008).
- Lai, Y. -. J., Huang, E. Y. -. K., Yeh, H. -. I., Chen, Y. -. L., Lin, J. J. -. C., Lin, C. -. I. On the mechanisms of arrhythmias in the myocardium of mXinα-deficient murine left atrial-pulmonary veins. Life Sciences. 83 (7-8), 272-283 (2008).
- Gustafson-Wagner, E. A., et al. Loss of mXinα, an intercalated disk protein, results in cardiac hypertrophy and cardiomyopathy with conduction defects. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (5), 2680-2692 (2007).
- Clark, R. B., et al. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, 1757-1766 (2004).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Nikmaram, M. R., et al. Characterization of the effects of Ryanodine, TTX, E-4031 and 4-AP on the sinoatrial and atrioventricular nodes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 96 (1-3), 452-464 (2008).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
- Masé, M., Glass, L., Ravelli, F. A model for mechano-electrical feedback effects on atrial flutter interval variability. Bulletin of Mathematical Biology. 70 (5), 1326-1347 (2008).
- Franz, M. R., Bode, F. Mechano-electrical feedback underlying arrhythmias: The atrial fibrillation case. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 82 (1-3), 163-174 (2003).
- Bucchi, A., Tognati, A., Milanesi, R., Baruscotti, M., DiFrancesco, D. Properties of ivabradine-induced block of HCN1 and HCN4 pacemaker channels. Journal of Physiology. 572 (2), 335-346 (2006).
