Summary
Detta protokoll syftar till att beskriva en ny metod för att mäta inneboende hjärtbränningshastighet med hjälp av mikroelektrod array registrering av hela sinoatrial nodvävnad för att identifiera pacemaking defekter hos möss. Farmakologiska medel kan också införas i denna metod för att studera deras effekter på inneboende pacemaking.
Abstract
Den sinoatrial noden (SAN), som ligger i rätt atrium, innehåller pacemaker celler i hjärtat, och dysfunktion i denna region kan orsaka takykardi eller bradykardi. Tillförlitlig identifiering av hjärt pacemaking defekter kräver mätning av inneboende hjärtfrekvenser genom att till stor del förhindra påverkan av det autonoma nervsystemet, som kan maskera hastighet underskott. Traditionella metoder för att analysera inneboende hjärt pacemaker funktion inkluderar droginducerad autonoma blockad för att mäta in vivo hjärtfrekvenser, isolerade hjärtinspelningar för att mäta inneboende hjärtfrekvenser och sinoatrial remsa eller encelliga patch-clamp inspelningar av sinoatrial pacemaker celler för att mäta spontana åtgärder potentiella avfyrning priser. Dessa mer traditionella tekniker kan dock vara tekniskt utmanande och svåra att utföra. Här presenterar vi en ny metod för att mäta inneboende hjärtbränningshastighet genom att utföra mikroelektrodmatrisinspelningar (MEA) av hela berget sinoatrienodpreparat från möss. MeAs består av flera mikroelektroder ordnade i ett rutnätsliknande mönster för registrering av in vitro extracellulära fältpotentialer. Metoden som beskrivs häri har den kombinerade fördelen att vara relativt snabbare, enklare och mer exakt än tidigare metoder för att registrera inneboende hjärtfrekvenser, samtidigt som det möjliggör enkla farmakologiska förhör.
Introduction
Hjärtat är ett komplext organ som styrs av både hjärt-inneboende och extrinsiska influenser som de som har sitt ursprung i hjärnan. Den sinoatrial noden (SAN) är en definierad region i hjärtat som rymmer pacemakercellerna (även kallade sinoatrial celler, eller SA-celler) som ansvarar för initiering och fortlevnad av däggdjurs hjärtslag1,2. Den inneboende hjärtfrekvensen är den hastighet som drivs av pacemakercellerna utan påverkan av andra hjärt- eller neurohumorala influenser, men traditionella mått på hjärtfrekvens hos människor och levande djur, såsom elektrokardiogram, återspeglar både pacemaker och neurala influenser på hjärtat. Det mest anmärkningsvärda neurala inflytandet på SA-celler är från det autonoma nervsystemet, som ständigt modulerar bränningsmönster för att uppfylla kroppens fysiologiska krav3. Stödja denna idé, både sympatiska och parasympatiska projektioner kan hittas nära SAN4. Det inneboende hjärtnervsystemet (ICNS) är en annan viktig neural påverkan där ganglionated plexi, särskilt i rätt atria, innervate och reglera aktiviteten hos SAN5,6.
Att förstå pacemaking underskott är kliniskt viktigt, eftersom dysfunktion kan lindra många hjärtsjukdomar, samt bidra till risken för andra komplikationer. Sjuk sinus syndrom (SSS) är en kategori av sjukdomar som kännetecknas av dysfunktion i sinoatrial noden som hindrar korrekt pacemaking7,8. SSS kan presentera med sinus bradykardi, sinus pauser, sinus gripande, sinoatrial exit block och alternerande bradyarrythmias och takyarrhythmias9 och kan leda till komplikationer inklusive ökad risk för embolisk stroke och plötslig död8,10. De med Brugada syndrom, en hjärtsjukdom som kännetecknas av ventrikulär förmaksflimmer med en ökad risk för plötslig hjärtdöd, har större risk för arytmogena händelser om de också har komorbid SAN dysfunktion11,12. Sinoatrie dysfunktion kan också ha fysiologiska konsekvenser bortom hjärtat. Till exempel har SSS observerats för att utlösa anfall hos en patient på grund av cerebral hypoperfusion13.
För att identifiera sinoatrial pacemaking underskott, inneboende hjärtfrekvenser måste bestämmas genom att mäta san verksamhet utan påverkan av autonoma nervsystemet eller humorala faktorer. Kliniskt kan detta approximeras av farmakologisk autonom blockad14, men samma teknik kan också tillämpas i däggdjursmodeller för att studera inneboende hjärtfunktion15,16. Medan detta tillvägagångssätt blockerar en stor del av bidragande neurala influenser och möjliggör hjärtundersökning in vivo, eliminerar det inte helt alla extrinsiska influenser på hjärtat. En annan forskningsteknik som används för att studera inneboende hjärtfunktion i djurmodeller är isolerade hjärtinspelningar med Langendorff-perfused hjärtan, som vanligtvis involverar mätningar med hjälp av elektrogram, pacing eller epicardial multielektrod arrayer17,18,19,20. Medan denna teknik är mer specifik för hjärtfunktion eftersom det innebär att ta bort hjärtat från kroppen, kan mätningarna fortfarande påverkas av mekano-elektriska autoregulatoriska mekanismer som kan påverka inneboende pulsmätningar21. De isolerade hjärtinspelningarna kan också fortfarande påverkas av autonom reglering genom ICNS5,6,22,23. Dessutom kan det vara svårt att upprätthålla en fysiologiskt relevant temperatur i hjärtat, vilket är avgörande för hjärtfunktionsmätningar, i isolerade hjärtmetoder20. En mer direkt metod för att studera SAN-funktion är att specifikt isolera SAN-vävnad och mäta dess aktivitet. Detta kan åstadkommas genom SAN-remsor (isolerad SAN-vävnad) eller isolerade SAN pacemakerceller24,25. Båda kräver en hög grad av teknisk utbildning, eftersom SAN är en mycket liten och mycket definierad region, och cellisolering utgör en ännu större utmaning eftersom dissociation kan skada cellens allmänna hälsa om den inte utförs korrekt. Dessutom kräver dessa tekniker expertelektrofiologiska färdigheter för att framgångsrikt registrera från vävnaden eller cellerna med hjälp av enskilda registrering av mikroelektroder.
I det här protokollet beskriver vi en teknik för att spela in SAN in vitro med hjälp av en mikroelektrod array (MEA) för att erhålla inneboende pulsmätningar. Detta tillvägagångssätt har fördelen att göra mycket specifika elektrofysiologiska inspelningar tillgängliga för forskare som saknar intensiva elektrofysiologiska färdigheter. MEAs har tidigare använts för att studera kardiomyocyt funktion i primära kardiomyocyt kulturer26,27,28,29,30,31,32,hjärt täcker33,34,35,36,37, 38,39,och vävnad hela fästen40, 41,42,43,44,45,46,47. Tidigare arbete har också gjorts för att undersöka fältpotentialer iSAN-vävnad 41,42. Här tillhandahåller vi en metodik för att använda MEA för att registrera och analysera murin inneboende SAN-avfyrningshastigheter. Vi beskriver också hur denna teknik kan användas för att testa farmakologiska effekter av läkemedel på SAN inneboende avfyrningshastigheter genom att tillhandahålla ett provexperiment som visar effekterna av 4-aminopyridin (4-AP), en spänning-gated K+ kanalblockerare. Med hjälp av definierade anatomiska landmärken kan vi noggrant registrera SAN utan att behöva utföra de omfattande vävnadsdesektioner eller cellisoleringar som krävs i andra metoder. Även om mea kan vara kostnadsöverkomliga, ger inspelningarna mycket specifika och tillförlitliga mått på pacemaking som kan användas i ett stort antal kliniska och fysiologiska forskningsapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella förfaranden som beskrivs här har utförts i enlighet med riktlinjerna från National Institutes of Health (NIH), som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Southern Methodist University.
1. Beläggning av multielektrodmatrisen (MEA) för inspelning
- Gör 25 mM boratbuffert.
- Lös upp 0,953 g Na2B4O7·10 H2O i 80 ml destillerat vatten.
- Justera pH-talet till 8,4 med HCl och tillsätt sedan destillerat vatten till en slutlig volym på 100 ml.
- Gör en 0,1% stamlösning av polyetylenimin (PEI).
- Tillsätt 100 μL 50 % (w/v) PEI till 4,9 ml destillerat vatten för att göra en 1% PEI-lösning.
- Späd ut 1% PEI-lösningen till 0,1% i boratbuffert genom att tillsätta 1 ml av 1% PEI-lösningen till 9 ml av 25 mM boratbufferten.
- Pipett ~1 ml av 0,1 % PEI-lösning i mea-skålen (microelectrode array) så att elektroderna är helt täckta (figur 1A och 1B).
OBS: Mikroelektroderna i MEA består vanligtvis av platinasvart eller kolnanorör och isoleras med polyimid (eller akryl); båda materialen är hydrofobiska. Genom att täcka MEA med en katjonpolymer som PEI blir den hydrofobiska MEA-ytan mer hydrofil, vilket gör att vävnadsprover kan få bättre kontakt med MEA-ytan (figur 1A1). - Täck MEA-skålen med termoplastisk film för att minska avdunstningen och lämna MEA över natten vid rumstemperatur (figur 1C).
- Aspirera PEI-lösningen från MEA-skålen med en pipett, var försiktig så att du inte rör elektrodnätet som kan skada elektroderna och skölj sedan ≥4 gånger med destillerat vatten (Figur 1D).
- Förvara den PEI-belagda MEA under 1-2 ml ultrapurevatten och förseglad med termoplastisk film vid 4 °C tills det behövs. Alternativt förvara den belagda MEA genom att dränka den i en bägare fylld med ultrapurevatten (Figur 1E).
OBS: PEI-beläggningsprocessen behöver endast utföras en gång för MEA före dess första användning, och efter varje inspelningssession bör MEA lagras nedsänkt i ultrapurevatten.
2. Förbereda fullständig Tyrodes lösning för vävnadsdesektion
- Gör 1 000 ml komplett Tyrodes lösning för dissekering; tillsätt först 8,1816 g NaCl till 800 ml ultrapurevatten.
- Tillsätt följande mängd kemikalier till lösningen: 0,4025 g KCl; 0.1633 g KH2PO4; 1.1915 g HEPES, 0,9999 g glukos; 0,0952 g MgCl2, 0.2646 g cacl2·2H2O.
- Justera pH-talet till 7,4 med NaOH och tillsätt sedan ultrapurevatten tills den totala volymen är 1 000 ml.
OBS: Den slutliga sammansättningen av Complete Tyrodes lösning kommer att vara följande (i mM): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 KH2PO4, 5 HEPES, 5,55 glukos, 1 MgCl2, 1,8 CaCl2.
3. Förbereda syresatt tyrods lösning för inspelning
- Gör 500 ml av Tyrodes lösning; tillsätt 4,003 g NaCl till 400 ml ultrapurevatten.
- Tillsätt följande mängder kemikalier till lösningen: 0,651 g NaHCO3; 0,042 g NaH2PO4; 0.132 g cacl2·2H2O; 0,149 g KCl; 0,0476 g MgCl2, 0,999 g glukos.
- Justera pH-talet till 7,4 med HCl och tillsätt sedan ultrapurevatten tills den totala volymen är 500 ml.
- Syresätta lösningen med karbon i minst 30 minuter vid rumstemperatur innan du startar inspelningen.
OBS: Den slutliga sammansättningen av Tyrodens lösning kommer att vara följande (i mM): 137 NaCl, 15,5 NaHCO3, 0,7 NaH2PO4, 1,8 CaCl2, 4 KCl, 1 MgCl2, 11,1 glukos. Denna tyrods lösning har en något annorlunda sammansättning än Complete Tyrodes lösning som används för dissekering.
4. Beredning av 4-aminopyridinlösning (4-AP) för farmakologisk modulering
- Gör en 1 mM arbetslösning på 4-AP; tillsätt 18,82 mg 4-AP till 200 ml av Tyrodens lösning från steg 3.
- Syresätta 4-AP-lösningen i minst 30 minuter före experimentet.
5. Förbereda Petri skål för dissekering
- Blanda silikon elastomerkomponenter i ett 10:1-förhållande (i vikt) av basen till härdningsmedel.
- Häll ~15 ml silikon elastomerblandning i en petriskål med diametern 60 mm.
- Låt elastomer härda i rumstemperatur i 48 timmar före användning.
OBS: Den silikoniserade Petri-skålen kan återanvändas för framtida dissekeringar.
6. Dissekera den sinoatrial noden (SAN)
- Förbered hepariniserad Complete Tyrodes lösning för SAN-dissekering.
- Tillsätt 400 μL heparin (1 000 USP/ml) till 40 ml Complete Tyrodes lösning och värm i ett vattenbad på 37 °C.
- Injicera musen intraperitoneally med 200-300 μL heparin (1000 USP/ml) och låt djuret sitta i 10 min.
- Avliva den hepariniserade musen genom isofluranöverdos.
- Placera musen i en liten glaskammare som innehåller isofluranångor som genereras genom att tillsätta 200-300 μL flytande isofluran till ett filterpapper inuti ett perforerat plaströr.
OBS: Eftersom isofluran kan orsaka hudirritation och även kan absorberas genom huden, bör vätskan inte kontakta musen direkt. Därför placeras den isoflurandränkta våtservetten i ett perforerat rör för administrering. - Verifiera döden genom att upphöra med rörelse och andningsansträngning och genom avsaknad av en tå nyp reflex. Döden tar vanligtvis ca 1-2 min efter placering i kammaren.
OBS: Döden åtföljs vanligtvis av urinering.
- Placera musen i en liten glaskammare som innehåller isofluranångor som genereras genom att tillsätta 200-300 μL flytande isofluran till ett filterpapper inuti ett perforerat plaströr.
- Placera musen i ett supin läge på en dissektionsbräda med tassar utsträckta och fixera tassarna på brädan med 1 tum långa, 23-gauge sprutnålar. Ta sedan bort pälsen i närheten av botten av revbensburen genom att använda kirurgisk sax och skära pälsen vid rötterna.
OBS: För en dissekeringsbräda kan polystyrenkylarlock användas. - Medan du håller huden med en hemostat, använd kirurgisk sax för att göra ett tvärgående snitt i huden precis under botten av revbensburen från ungefär den vänstra kostnadsbågen till rätt kostnadsbåge (Figur 3A).
- Skär upp bukhinnan med kirurgisk sax och separera försiktigt levern från membranet, var försiktig så att du inte hackar levern, vilket kommer att orsaka överdriven blödning (Figur 3B). Inkapsla membranet längs bröstkorgen för att exponera brösthålan (figur 3C-D).
- Använd kirurgisk sax, skär revbensburens sidoväggar från kanterna på kostnadsbågarna upp till nyckelbenen för att exponera hjärtat, var noga med att undvika att skada hjärtat (Figur 3D). Använd sedan en 23-gauge sprutnål för att fästa revbensburen över axeln, hålla den på plats och ur vägen för operationsfältet.
- Använd en överföringspipett för att droppa varmt (37 °C) hepariniserad Complete Tyrodes lösning på hjärtat för att hålla den fuktig.
OBS: Låt inte hjärtat torka ut. - Ta bort lungorna genom att hålla dem med extra fina Graefe-tångar och skära luftstrupen med kirurgisk sax (Figur 3E).
- Håll hjärtats spets med extra fina Graefe-tångar och ta bort det genom att skära aortan och venae cavae med kirurgisk sax. Överför hjärtat till en petriskål som innehåller härdad silikon elastomer (Figur 4A) och använd en överföringspipett för att bada hjärtat med 2-3 ml varm (37 °C) hepariniserad Complete Tyrodes lösning.
OBS: Var försiktig så att du inte skadar den känsliga bakre väggen i höger atria, som innehåller SAN, och de anslutna högra förmaksvenerna. Bada hjärtat med Complete Tyrodes lösning hindrar hjärtat från att torka ut men inte helt nedsänkt hjärtat i lösning eftersom det kommer att försämra sikten under dissekering. - Orientera hjärtat med höger atrium till experimentörens högra och vänstra atrium till vänster.
OBS: Dissekering av SAN-vävnaden bör ske snabbt för att förhindra ischemirelaterad skada. - Fäst hjärtats spets på skålen med en dissekeringsstift. Sedan, medan du håller den sämre vena cava med Dumont #2 laminectomy tång, sätt in en 22 G spruta nål genom den sämre och överlägsna vena cava för att hitta sin position i rätt atrium, som också identifierar den ungefärliga positionen för SAN (ligger i vävnadslappen mellan den sämre och överlägsna vena cava (Figur 4B).
- Fäst vänster och höger förmaksbihang på skålen med hjälp av små dissektionsstift.
- Medan du håller det vänstra förmaksbihanget med Dumont #2 laminectomy tång, sätt en dissekering stift genom vänster förmaksflimmer bihang för att hålla den på plats.
- Medan du håller rätt förmaksbihang med Dumont #55 tång, sätt en dissekeringsstift genom rätt förmaksbihang för att hålla det på plats.
OBS: Samma typ av tång kan användas för att hålla vänster och höger förmaksbihang om så önskas.
- Ta bort sprutnålen som sträcker sig över venae cavae.
- För att frigöra blod från hjärtat, använd Castroviejo sax för att ta bort hjärtats spets (dvs. den nedre halvan) genom att göra ett tvärgående snitt över ventriklarna (Figur 4C). Tvätta sedan hjärtat genom att tillsätta varm (37 °C) hepariniserad Complete Tyrodes lösning med en överföringspipett.
- Använd Castroviejo sax för att skära längs atrioventricular septum hålla snittet närmare ventrikeln än atria. Fortsätt att skära längs atrioventricular septum tills atria separeras från ventriklarna.
- Skär längs interatrial septum för att ta bort det vänstra atriumet.
- Placera dissekeringsstiften i periferin på rätt atrium för att få det att ligga platt (Figur 4D). Ta bort eventuellt återstående fett, kärl eller vävnad från atriumet med castroviejo-saxen.
- Placera SAN i det högra atriumet, som i denna orientering är ungefär kantad av överlägsen vena cava (på toppen), sämre vena cava (längst ner) och cristae terminalis (till vänster) (Figur 4D).
OBS: Crista terminalis visas som en mörk muskulös ås mellan rätt förmaksbihang och SAN. Ofta kan SAN-artären också ses genom SAN(Figur 4D).
7. Förbereda systemet för mea för registrering
- Tillsätt Tyrodes lösning (från steg 3) till ingångslösningsflaskan (figur 5C) och syresätta den genom att slå på flödet av karbongas (figur 5A) till systemet.
OBS: Tyrodens lösning som används för inspelningen skiljer sig något i sammansättning från Complete Tyrodes lösning som används för dissekeringen. - Kontrollera kolhydratogenflödet genom att observera bubblor i den koniska kolven, som används för att fukta gasen (figur 5B) och ingångslösningsflaskan (figur 5C).
- För in den peristaltiska pumpens inflödesrör (figur 5D) i Tyrodens inspelningslösning (figur 5C). Sätt sedan in peristaltiska pumputflödesrör i uppsamlingsflaskan (Bild 5I).
- Ställ in peristaltic pumpen på 25 varv/min, vilket ger ett flöde på 2 ml/min och starta pumpen. Kontrollera systemet för eventuella buffertläckage eller spill.
- Ställ in temperaturregulatorn på 37 °C, mössens fysiologiska temperatur (figur 5E).
8. Placera hjärtvävnaden på MEA-nätet
- Överför den dissekerade SAN-vävnaden med hjälp av en pensel (figur 6A) från den dissekerande Petri-skålen till MEA-nätet (figur 1A1).
- Medan du tittar under ett inverterat mikroskop, placera försiktigt vävnaden med en mjuk pensel så att SAN-regionen täcker elektrodnätet.
- Sätt tillbaka vävnaden vid behov för att säkerställa att den ligger platt på elektrodnätet och gör god kontakt med elektroderna.
OBS: En mjuk pensel krävs för att flytta vävnaden för att undvika att skada elektrodnätet.
- När vävnaden är korrekt placerad, använd bentång (eller några böjda tångar) för att placera nätet över vävnaden (figur 6A). Använd sedan bentångarna för att placera harpankaret (figur 6A) på nätet för att hålla allt på plats (Figur 6B).
- Ta en bild av vävnadens placering på MEA så att aktiviteten hos enskilda elektroder kan korreleras med deras anatomiska plats under inspelningen. Detta kan göras genom att hålla en smartphone upp till det inverterade mikroskopmålet eller genom att använda en ansluten mikroskopkamera.
OBS: Om orienteringen för MEA inte ändras efter att bilden har tagits, visas den övre vänstra elektroden som den första kanalen (Ch1) under inspelningen. - Placera MEA-skålen på kopplingsplattan(figur 5F och 6C)och placera försiktigt perfusionslocket(figur 6C)på MEA-skålen utan att störa harpaskivan. Perfusionslocket kan säkras ytterligare med hjälp av en labbtejp (Figur 6C).
OBS: Förutom att ha justerbara inflödes- och utflödesrör för lösningar har locket också en port för leverans av gas(figur 6C). Dessutom löper referenselektrodringen genom locket (figur 6C). - Låt vävnaden återhämta sig från hanteringen och acklimatisera sig till kammaren i 15-20 minuter före registrering.
9. Ställa in protokollet för datainsamling för registrering
FÖLJANDE steg beskriver hur du öppnar programvaruprotokollet för spontan beatinspelning och definierar inspelningsförhållandena. Detaljerna i dessa steg kan variera beroende på vilken programvara som används, men den allmänna dispositionen bör förbli densamma.
- Slå på förstärkaren (Bild 5G) och ställ in ett arbetsflöde för inspelningen i programvaran på datorn (Bild 5H).
- Öppna programvaran och klicka på Arbetsflödet.
- Välj Öppna ny mapp.
- Öppna mappen Från mallar.
- Välj 64MD1-1920X1080 (beroende på skrivbordets upplösning).
- Öppna QT-mappen.
- Öppna mappen Spontan inspelning.
- Välj Beat_recording.moflo-mallen och öppna den (bild 7A).
- Ställ in registreringsparametrarna för att ange antalet spår, spårlängd, spårintervall, ingångsspänning, provtagningshastighet etc., enligt önskade inspelningsförhållanden (figur 7B).
OBS: För slagfrekvens och datainsamling mellanpiker, använd vanligtvis en ingångsintervallspänning på 2,9 mV, ett 1 Hz högt passfilter, ett 1000-Hz lågpassfilter och en samplingshastighet på 20 kHz. - Om du vill markera olika faser eller villkor i experimentet, till exempel före och efter administrering av läkemedel, klickar du på fliken Anteckningar för att lägga till önskade noteringar ( figur7C).
- Om du vill ange filmålet för de data som ska samlas in markerar du rutan Aktivera lagring och anger önskat filnamn i rutan Filnamnmodifierare.
10. Utföra inspelning och insamling av data
- Klicka på knappen Spela in och spela upp längst upp på menyraden i förvärvsprogrammet för att starta inspelningen. Hämta data för 10 spår med en minsta varaktighet med intervaller på 2 minuter mellan spåren.
- Från dessa första spår, kontrollera att de inspelade vågformerna överensstämmer med ett hälsosamt och högkvalitativt vävnadspreparat genom att bekräfta att majoriteten av inspelningskanalerna uppvisar signalamlituder på ≥ 0,5 mV och identiska mellanrum mellan spikarna (figur 8).
OBS: En första bedömning av aktiviteten och vågformerna hos de enskilda mikroelektroderna som motsvarar deras anatomiska platser kan utföras genom att referera till den bild som förvärvats efter placering av vävnaden på MEA. - Om du vill mäta effekterna av läkemedel på vävnaden pausar du inspelningen efter att ha fått initiala baslinjedata genom att klicka på pausknappen längst upp på menyraden.
OBS: Experimentet kan noteras i inspelningen genom att klicka på fliken Anteckningar och lägga till önskad notation enligt beskrivningen ovan ( figur7C). - Pausa pumpen och byt pumpens inflödesrör från den normala inspelningslösningen till Tyrodes lösning som innehåller önskat läkemedel.
OBS: I exempelexperimentet användes Tyrodes lösning med 1 mM 4-aminopyridin (4-AP). - Starta om pumpen och pausa inspelningen för att börja samla in data igen.
- När den läkemedelsinfuserade Tyrodes lösning har nått vävnaden, registrera 10 spår på samma sätt som tidigare för baslinjeinspelningarna.
OBS: Spåren kommer att ta lite tid att stabilisera när läkemedlet ingjuter i inspelningskammaren. Läkemedlets verkningsmekanism kan också påverka inspelningsstabiliteten. För läkemedel som har reversibla verkningsmekanismer bör en washout-period också registreras för att bekräfta återställandet av aktiviteten till utgångsnivåerna, vilket är en indikator på frisk vävnad. - Klicka på Stoppa för att avsluta inspelningarna.
- Ta en slutlig bild av vävnadens placering på MEA under mikroskopet om vävnaden har förskjutits efter det första inspelningsförfarandet.
11. Rengöring av installationen efter inspelningen
- Rengör MEA.
- Ta försiktigt bort inspelningslösningen från MEA-skålen med en 1 ml mikropipett efter avslutad inspelning.
OBS: Var försiktig så att du inte kontaktar MEA-elektroderna som kan skada dem. - Ta bort nät- och harpankaret med bentång (eller några böjda tångar). Använd sedan en pensel för att lossa vävnaden från MEA-ytan och var alltid noga med att inte röra de enskilda mikroelektroderna.
- Använd en tvättflaska och skölj försiktigt MEA-skålen med ultrapurevatten ca 3 till 4 gånger.
- Förvara den rengjorda MEA nedsänkt i ultrapurevatten vid 4 °C.
- Ta försiktigt bort inspelningslösningen från MEA-skålen med en 1 ml mikropipett efter avslutad inspelning.
- Skölj systemslangen genom att köra ultrapurvatten genom den i minst 5 minuter med maximal hastighetsinställning på peristaltisk pump.
OBS: För att förhindra svamptillväxt bör inget vatten eller buffertlösning lämnas inuti slangen efter rengöring.
12. Analysera MEA-inspelningarna för att mäta SAN-slagfrekvensen
- Öppna den sparade inspelade datafilen i Beat_frequency_analysis mallen för analysprogramvaran (figur 9).
- Klicka på knappen Spela upp och låt hela inspelningen köras för att visualisera datauppsättningen och tilldela lämpliga analysparametrar.
- Välj fönstret lagerplats för önskat visningsformat för data, oavsett om det visas som ett genomsnitt per spårning eller medelvärde per gång (bild 10A).
- Välj de kanaler som ska ingå i analysen och ställ in önskade amplitud maxima eller amplitud minima tröskelvärden för automatiserad vågform toppidentifiering (Figur 10B).
OBS: En enskild kanal, en kombination av kanaler eller alla 64 kanaler kan väljas för analys i detta steg (figur 9). Om de valda tröskelvärdena ligger för nära vågformens maxima- och minima-värden kanske vissa vågformstoppar inte identifieras av analysprogramvaran. - Ange hur mycket tid före och efter insamling som ska inkluderas i analysen.
OBS: Inställningar på 50 ms pre-spike och 100 ms post-spike fungerar vanligtvis bra (Bild 10B).
- När du har ställt in analysvillkoren klickar du på knappen Spela upp igen för att köra datauppsättningen igen och bekräfta att analysparametrarna är lämpliga för extraktion av toppar.
- För analys, identifiera de tre mest stabila på varandra följande spåren som uppvisar stabil slagfrekvens för varje spår i de flesta kanaler både under experimentets baslinjeperiod och ytterligare tre stabila spår i följd under läkemedelsexponeringsperioden (figur 10A).
- Ange start- och slutspåren för analys och ange tidslängden för varje spårning som ska analyseras (figur 9).
- Innan du startar analysen väljer du aktiveringsrutorna för både Spara slag per minut och Spara interspike-intervall (Bild 10B).
- Ange önskat filnamn i rutan Filnamnsmodifierare (Bild 10B). Analyserade data för slagfrekvens och interspike-intervall sparas i form av ASCII-format (text).
OBS: För att analysera olika tillstånd (t.ex. baslinje och läkemedelsrespons) måste analysen köras separat för varje tillstånd. - Klicka på knappen Spela upp och spela in i det övre flikfältet för att starta analysen.
- Om du vill exportera data för andra program markerar du rutorna för Spara takt per minut och Spara interspike-intervall (Bild 10B). Ange önskat filnamn i rutan Filnamnsmodifierare (Bild 10B) och klicka på Spara för att spara analyserade data i ASCII-textformat i den markerade mappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter att ha tillåtit vävnaden att acklimatisera sig i skålen i 15 min registreras 10 enminspår. Vårt nuvarande protokoll registrerar aktivitet i över en timme, men vi har registrerat stabila avfyrningsmönster för ≥4 h i opublicerade data som inte visas här. Om en experimentell förberedelse är bra för datainsamling bör varje inspelningskanal uppvisa konsekventa och jämnt försedda återkommande vågformer (dvs. spikar) av enhetlig form för en viss kanal (figur 11D). Dessa vågformer motsvarar individuella hjärtslag som återspeglar inneboende hjärt pacemaking aktivitet. Mellanrumen mellanpikerna bör vara desamma för varje kanal även om de kanske inte är perfekt anpassade mellan kanalerna på grund av små skillnader i deras placering i förhållande till initieringsplatsen för depolarisering (figur 8). Även om vågformernas form för en viss kanal bör vara konsekvent, varierar vågformernas form mellan kanalerna beroende på elektrodens placering i vävnaden (figur 8). Graden av kontakt med vävnaden med elektroden kan också påverka vågformsegenskaper, såsom amplituden. Amplitud maxima bör dock vara minst 0,5 mV för de flesta kanaler om preparatet är tillfredsställande. Av de tio registrerade spåren valdes de tre på varandra följande kanalerna som bäst uppfyller de kvalitetskriterier som beskrivs ovan för ytterligare analys som beskrivs nedan. Figur 10A visar ett prov av stabil slagfrekvens (övre panelen) och interspikeintervall (mittpanelen) för tre på varandra följande spår. Vävnad som inte uppfyller dessa kriterier bör inte registreras eftersom det sannolikt finns vävnadsskador som kommer att hindra korrekt datainsamling. Figur 11 visar exempel på dåliga extraherade spikmönster som antingen är frånvarande (A), påverkade av buller (B) eller instabila (C).
Provdata som visas i siffrorna samlades in från en 45-dagars gammal manlig vildtyp Svart schweizisk (Tac:N:NIHS-BC) mus. Analysförfarandet i figur 9 och figur 10 användes för att extrahera den inneboende avfyrningshastigheten och visa baslinjespikar som kan ses i figur 12A. Avfyrningshastigheten är den genomsnittliga hastigheten över 60 000 ms från vart och ett av de tre spåren, men spikmönstret i figur 12A visar 5 s representativ spikning från ett enda spår. Med hjälp av automatiserad analysprogramvara konstaterades den inneboende avfyrningshastigheten (dvs. slagfrekvensen) för de valda tre spåren i alla 64 kanalerna vara cirka 320 slag/min i våra exempeldata (figur 12A). I allmänhet observerar vi en rad värden på ca 290-340 per minut i våra inspelningar för vilda möss. Avfyrningshastigheten kan också användas som sekundär metod för att bedöma preparatet. Priser som antingen är instabila eller betydligt lägre än 300 bpm är mindre benägna att vara bra för analys. Dessa värden är jämförbara med både isolerade hjärt- och encellsinspelningar som rapporterar inneboende hjärtfrekvenser i intervallet cirka 300-500 bpm25,48,49. Därför kan MEA-inspelningstekniken generera tillförlitliga och exakta mått på inneboende hjärtfrekvens.
En fördel med MEA-systemet är att det gör det enkelt att använda läkemedelsmedel för att testa farmakologiska effekter. I provexperimentet testade vi effekterna av 1 mM 4-AP på avfyrningshastigheten, vilket bör bromsa SAN-aktiviteten eftersom blockad av spänningsgrindade K+ kanaler är kända för att försämra potentiell repolarisering i SA-celler24,50. Figur 12B visar att införandet av 4-AP ökade interspike-intervallen som förväntat. Detta långvariga spikintervall motsvarade en minskning av slagfrekvensen från 320 slag/min till 210 slag/min. Denna avfyrningshastighet efter 4-AP-administrering liknar en tidigare studie som undersökte effekterna av 4-AP på SAN-avfyrningshastigheten med hjälp av enstaka elektrodinspelningar av isolerad vävnad. Den studien mätte en avfyrningshastighet på cirka 190 bpm i närvaro av 4-AP50. Mea-systemet kan därför användas som ett bekvämt och värdefullt verktyg för att testa farmakologiska effekter av läkemedelsinterventioner på inneboende hjärtfunktion.
Figur 1:Beläggning av mikroelektrodmatrisen (MEA) före användning. (A) MEA består av en liten plastform med en rutnätsmatris på 64 mikroelektroder i mitten (som visas i panelen A1) och fyra referenselektroder runt periferin i ett kvadratiskt mönster. B)Tillsats av 1 ml PEI-buffert för att täcka mea. C)Täcker MEA-skålen med termoplastisk film för inkubation över natten vid rumstemperatur. D)Aspirera pei-bufferten från MEA-skålen, som följs av minst fyra sköljningar med destillerat vatten. e)Förvaring av den belagda MEA-sonden under ultrapurvatten för att förhindra att den torkar ut. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Verktyg som används för dissekering av sinoatrienod (SAN). Följande verktyg används under dissekeringsdelen av protokollet: (i) Petri-skål med silikon elastomer och små dissekeringsstift; ii) Pipett för plastöverföring. iii) Castroviejo sax, storlek 4". iv) Kirurgisk sax (rak) för skärprocedurer. v) Dumont #2 Laminectomy tång. vi) Dumont #55 tång. vii) Extra fina Graefe tång; viii) Hemostats (krökt). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3:Avlägsnande av hjärtat. (A) Tvärsnitt i huden precis under botten av revbenskorgen från ungefär den vänstra kostnadsbågen till höger kostnadsbåge. (B) Peritoneal snitt. C,D) Snitt av membranet längs bröstkorgen för att exponera brösthålan. e)Avlägsnande av hjärtat efter excision av lungorna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Dissekering av den sinoatrial (SAN) noden. (A) Hjärtats utseende i Petri-skålen efter avlägsnande från kroppen. B)Införande av sprutnålen genom den sämre vena cava (IVC) och överlägsen vena cava (SVC) i höger atrium. Stiftet i hjärtats topp visas också. C)Excision av toppen (dvs. den nedre halvan) av hjärtat för att frigöra blodet. Stiften i de förmaksbihang visas också. D)Det slutliga framträdandet av SAN-regionen i det högra atriumet i slutet av dissekeringen. Den boxade regionen motsvarar san:s ungefärliga placering. SAN-artären kan också ses svagt genom SAN i vertikal orientering. Förkortningarna: AO, aorta; CT, crista terminalis; IVC, sämre vena cava; LA, vänster atrium; RA, höger atrium; RAA, rätt förmaksbihang; SAN, sinoatrienod; SVC, överlägsen vena cava. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 5:Schematiskt för mea-systemet (microelectrode array). Följande komponenter består av systemet: (A) gascylinder (karbin: 95% O2/ 5% CO2); b)Konisk kolv med destillerat vatten för att fukta gasen. c)Registrering av Tyrodes lösningsflaska som ger inflöde till mea-skålen. D)Peristaltisk pump för pumplösning till och från MEA-skålen. e)Temperaturregulator. F)Kontaktplatta för mea som tar emot signaler från MEA-skålen. G)Förstärkare. H)Dator. (I) insamlingsflaska för använd avfallslösning från MEA-skålen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Placering av SA-nodalvävnaden på mea. a)Verktyg som används för att placera vävnaden: i) Nät med 1,5 mm rutnätsstorlek, ii) harpaankare, iii) bentång, iv) pensel. b)Placering av vävnaden på mea. Den gula rutan anger det ungefärliga området i den sinoatrial nodregionen under nätet och ankaret i MEA-skålen. c)Arrangemang av MEA-skålen med sluten vävnad på anslutningsplattan för fältpotentialregistrering: i) inlopp för inspelningslösningen. ii) Inlopp för gas (karbin; iii) Utlopp för lösningen. iv) Anslutningsplatta för mikroelektrod. v) Perfusionslock. vi) Referenselektrodring fäst vid locket. vii) tejp för att hålla locket. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 7: Ställa in datainsamlingsprotokollet i programvaran. (A) Ett exempel på inspelningsmall som visar arrangemang för alla 64 kanaler. (B) Ett exempel på programvaruinmatningsegenskaperna för inspelningsförhållandena. (C) Ett exempel på anteckningsmenyn som visar hur man lägger till ny fas under inspelningen, till exempel för att mäta läkemedelseffekter. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 8: Olika områden i vävnaderna som visar olika aktivitetsvågformer. Exempel på skärmbild som visar vågformer med olika former och amplituder i olika kanaler. Alla kanaler visar dock identiska interspike-intervall och avfyrningsfrekvenser. Kanalerna i den röda lådan motsvarar ungefär de elektroder som placeras inom SAN-regionen i vävnaden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 9:Mall för analys av slagfrekvens. Exempelmall som visar ordningen för alla 64 kanaler i mallen för analys av slagfrekvens. Insetet Replay Raw Data File visar ett exempel på analysfönstrets indataegenskaper. I det här exemplet har spår 5 till 7 valts för analys och analystiden för varje spårning har angetts som 60 000 ms. Klicka här för att se en större version av den här siffran.
Figur 10: Definiera analysparametrar för spikextraktion. (A) Representativa analysmallresultat för 3 utvalda spår av en enda kanal. Den övre panelen visar slagfrekvens för de tre valda spåren (tre definierade grupperingar av datapunkter), och varje punkt representerar ett 10-talsmedelvärde för slagfrekvens under den specifika spårningen. På mittenpanelen visas intervall mellan toppar för de tre markerade spåren (tre definierade grupper av datapunkter) och varje datapunkt representerar intervallet mellan två på varandra följande toppar. Den nedre vänstra panelen visar valda representativa extraherade toppar för de sista 5 s av den tredje spårningen, medan den nedre högra panelen visar en extraherad vågform som härletts från 5-s-gruppen av extraherade toppar i den nedre vänstra panelen. B)Utökad vy över analysfönstret som visar parametrar som används vid analysen av slagfrekvensen för de tre spåren. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 11: Representativ siffra som visar bra kontra dålig datautvinning för en viss kanal. Dålig datautvinning: (A) Frånvaro av extraherade spikar; B)Extraherade spikar med bullersignaler. (C) Instabila extraherade spikar. (D) Bra data som visar stabila extraherade spikar utan ljudsignaler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 12:Inspelningar vid baslinjen ochefter administrering av 1mM 4-aminopyridin (4-AP). (A) Baslinjeinspelning från en enda mikroelektrod visar vågformer med en stabil avfyrningsfrekvens på 320 bpm i ett WT-hjärta. B)Efter administrering av 4-AP saktar avfyrningsfrekvensen till en stabil hastighet av 210 varv/min. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att öva och behärska SAN-dissekeringsprocessen är absolut nödvändigt eftersom vävnaden är bräcklig och frisk vävnad är nödvändig för en framgångsrik inspelning. Under SAN dissekering är korrekt orientering avgörande för att få rätt region av vävnad. Hjärtats ursprungliga orientering kan dock lätt gå förlorad under dissekeringsprocessen, vilket komplicerar denna strävan. För att säkerställa rätt vänster-högerorientering bör atria därför inspekteras visuellt. Vanligtvis tenderar det högra atriumet att vara mer transparent, medan det vänstra atriumet vanligtvis är mörkare och mer rött i färg25,48. Dessutom är det viktigt att inte sträcka SAN-vävnaden medan du arbetar med den eller monterar den på elektrodnätet, eftersom vävnaden lätt skadas mekaniskt51. Ett tips för att verifiera frisk och korrekt dissekerad SAN-vävnad är att undersöka den i Complete Tyrodes lösning under mikroskopet för att verifiera att vävnaden slår. När tekniken har behärskats bör minst 90% av vävnadspreparaten vara bra för inspelning.
Flera överväganden kan förbättra sannolikheten för framgångsrika inspelningar och efterföljande dataanalys. För att säkerställa bästa möjliga inspelningar bör lösningarna noggrant förberedas och testas på övningsmusprover före experimentella inspelningar. Vi arbetade mycket med att anpassa och modifiera inspelningslösningen för att optimera SAN-vävnadens hälsa. Se dessutom till att gasen som används för registreringen är karbagen (dvs. 95% O2/5% CO2). Encelliga inspelningar använder ofta rent syre på grund av den specifika kemiska sammansättningen av Tyrodens lösning som används för den applikationen, men den lösning som används för registrering på MEA kräver karbagen för att upprätthålla ett stabilt pH. Användning av rent syre med Tyrodens lösning för MEA-inspelningarna kommer att orsaka fluktuationer i pH som kan leda till snabb försämring av vävnaden. Att bedöma amplitud maxima i kanalerna som tidigare beskrivits kommer att hjälpa till att avgöra om vävnaden är av god inspelningskvalitet. Slutligen, för att hjälpa analys efter inspelningen, är det till stor hjälp att ta en bild av den monterade SAN-vävnaden på MEA-elektrodmatrisen efter att inspelningen är klar. Vävnaden kan skifta något under den första uppsättningen av MEA, och detta ger den mest exakta bedömningen av elektrodplacering för analys.
Vi föreslår MEA-inspelningar som ett grundligt och exakt sätt att karakterisera SAN-avfyrningshastighet. En fördel med MEA-tekniken är att den gör det möjligt för experimenteraren att fånga avfyrningshastigheter i nivå med encelliga inspelningar utan att behöva ha omfattande elektrofysiologisk expertis. MEA-tekniken har också fördelen att eliminera de potentiella förvirrande influenserna av neurohumorala och mekano-elektriska mekanismer, som är inneboende i isolerade hjärtinspelningar och in vivo autonoma blockadmätningar21. Ventrikulär sammandragning och andning är de viktigaste mekano-elektriska influenserna som kan förändra SAN-bränning, men de elimineras i vår vävnadsberedning 52,53. Medan vår teknik eliminerar de flesta autonoma influenserna på SAN, kan ett begränsat antal återstående ICNS-prognoser i höger atria potentiellt påverka SAN-avfyrning, en teoretisk begränsning som bör hållas i åtanke under tolkningen av resultaten5,6,22,23. En annan fördel med MEA-tekniken som beskrivs här är att den kan anpassas för många andra typer av hjärtstudier. Till exempel, även om detta protokoll visade effekterna av 4-AP på SAN-aktivitet, kan framtida studier titta på ett nästan gränslöst antal farmakologiska medel, liksom effekterna av genmutationer på SAN inneboende avfyrning. Till exempel kan ivabradin, en specifik blockerare av den SAN-specifika Hcn4-kanalen, användas för att studera roliga aktuella bidrag till avfyrningshastigheten54. MEA-systemet kan också användas för att mäta hjärtfunktion i andra delar av hjärtat, vilket möjliggör detaljerad, regionspecifik karakterisering. Inspelning från andra hjärtregioner skulle dock kräva olika dissekeringsmetoder och möjlighet till tunnvävnadssektionering före inspelning. En potentiellt betydande begränsning av denna teknik är de höga kostnaderna för att köpa ett mea-system som kan vara oöverkomlig. Flera mea-system finns på marknaden med liknande egenskaper och funktionalitet, men den höga kostnaden är densamma. Men när den ursprungliga utrustningen och programvaran har förvärvats är kostnaden för att underhålla och använda MEA-systemet ganska låg. En annan begränsning är att systemet med mea endast tillåter registrering av extracellulära fältpotentialer som inte bidrar till exakta jämförelser av potentiella åtgärdsegenskaper (t.ex. amplitud och form) mellan preparat som kan uppnås med intracellulära encelliga registreringar. Sammanfattningsvis ger detta protokoll ett effektivt arbetsflöde för att mäta och analysera inneboende hjärtbränningshastigheter i mus SAN-vävnad med förmågan att studera effekterna av farmakologiska ingrepp på avfyrningshastigheten på ett mycket specifikt sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Institutes of Health, bidragsnumren R01NS100954 och R01NS099188.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920x1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
References
- Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
- Josea, A. D., Collison, D. The normal range and determinants of the intrinsic heart rate in man. Cardiovascular Research. (4), 160-167 (1970).
- Peters, C. H., Sharpe, E. J., Proenza, C. Annual Review of Physiology Cardiac Pacemaker Activity and Aging. Annual Review of Physiology. 82, 21-43 (2019).
- Keith, A., Flack, M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. Journal of Anatomy and Physiology. 41 (3), 172-189 (1907).
- Wake, E., Brack, K. Characterization of the intrinsic cardiac nervous system. Autonomic Neuroscience. 199, (2016).
- Fedele, L., Brand, T. The intrinsic cardiac nervous system and its role in cardiac pacemaking and conduction. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 7 (4), 1-33 (2020).
- Mangrum, J. M., DiMarco, J. P. The evaluation and management of bradycardia. New England Journal of Medicine. 342 (10), 703-709 (2000).
- Adan, V., Crown, L. A. Diagnosis and treatment of Sick Sinus Syndrome. American Family Physician. 67 (8), 1725-1732 (2003).
- Semelka, M., Gera, J., Usman, S. Sick Sinus Syndrome: A Review. American Family Physician. 87 (10), 691-696 (2013).
- Zaragoza, M. V., et al. Exome sequencing identifies a novel LMNA splice-site mutation and multigenic heterozygosity of potential modifiers in a family with Sick Sinus Syndrome, dilated cardiomyopathy, and sudden cardiac death. PLoS ONE. 11 (5), 0155421 (2016).
- Brugada, J., Campuzano, O., Arbelo, E., Sarquella-Brugada, G., Brugada, R. Present status of Brugada Syndrome: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (9), 1046-1059 (2018).
- Rollin, A., et al. Prevalence, characteristics, and prognosis role of type 1 ST elevation in the peripheral ECG leads in patients with Brugada syndrome. Heart Rhythm. 10 (7), 1012-1018 (2013).
- Patel, N., Majeed, F., Sule, A. A. Seizure triggered by Sick Sinus Syndrome. BMJ case reports. 4, 2017222011 (2017).
- Knecht, S., et al. Impact of pharmacological autonomic blockade on complex fractionated atrial electrograms. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (7), 766-772 (2010).
- Saba, S., London, B., Ganz, L. Autonomic blockade unmasks maturational differences in rate-dependent atrioventricular nodal conduction and facilitation in the mouse. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 14 (2), 191-195 (2003).
- Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 51-56 (2002).
- Tse, G., Tse, V., Yeo, J. M., Sun, B. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts. PLoS ONE. 11 (2), 0148858 (2016).
- Tse, G., et al. Quantification of beat-to-beat variability of action potential durations in Langendorff-perfused mouse hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1578), 01578 (2018).
- Avula, U. M. R., et al. Heterogeneity of the action potential duration is required for sustained atrial fibrillation. JCI Insight. 5 (11), 128765 (2019).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. (135), e57617 (2018).
- Quinn, A. T., Kohl, P. Cardiac mechano-electric coupling: Acute effects of mechanical stimulation on heart rate and rhythm. Physiological Reviews. 101 (1), 37-92 (2021).
- Ripplinger, C. M., Noujaim, S. F., Linz, D. The nervous heart. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 199-209 (2016).
- Pauza, D. H., Pauziene, N., Pakeltyte, G., Stropus, R. Comparative quantitative study of the intrinsic cardiac ganglia and neurons in the rat, guinea pig, dog and human as revealed by histochemical staining for acetylcholinesterase. Annals of Anatomy. 184, 125-136 (2002).
- Golovko, V., Gonotkov, M., Lebedeva, E. Effects of 4-aminopyridine on action potentials generation in mouse sinoauricular node strips. Physiological Reports. 3 (7), 12447 (2015).
- Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), e54555 (2016).
- Doi, M., Ogawa, E., Arai, T. Effect of a photosensitization reaction performed during the first 3 min after exposure of rat myocardial cells to talaporfin sodium in vitro. Lasers in Medical Science. 32 (8), 1873-1878 (2017).
- Takanari, H., et al. A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology. Journal of Cellular Physiology. 231 (10), 2249-2256 (2016).
- Nakashima, T., et al. Rapid electrical stimulation causes alterations in cardiac intercellular junction proteins of cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1324-1333 (2014).
- Suzuki, S., et al. Effects of aldosterone on Cx43 gap junction expression in neonatal rat cultured cardiomyocytes. Circulation Journal. 73 (8), (2009).
- Horiba, M., et al. T-type Ca2+ channel blockers prevent cardiac cell hypertrophy through an inhibition of calcineurin-NFAT3 activation as well as L-type Ca2+ channel blockers. Life Sciences. 82 (11-12), 554-560 (2008).
- Inoue, N., et al. Rapid electrical stimulation of contraction modulates gap junction protein in neonatal rat cultured cardiomyocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases and effects of angiotensin II receptor agonist. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 914-922 (2004).
- Aalders, J., et al. Effects of fibrillin mutations on the behavior of heart muscle cells in Marfan syndrome. Scientific Reports. 10 (16756), (2020).
- Matsuura, K., et al. Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets. Biomaterials. 32 (30), 7355-7362 (2011).
- Fujita, H., Shimizu, K., Nagamori, E. Application of a cell sheet-polymer film complex with temperature sensitivity for increased mechanical strength and cell alignment capability. Biotechnology and Bioengineering. 103 (2), 370-377 (2009).
- Baba, S., et al. Generation of cardiac and endothelial cells from neonatal mouse testis-derived multipotent germline stem cells. Stem Cells. 25 (6), 1375-1383 (2007).
- Baba, S., et al. Flk1+ cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model. Cardiovascular Research. 76 (1), 119-131 (2007).
- Shimizu, K., et al. Construction of multi-layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 803-809 (2007).
- Haraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. Electrical coupling of cardiomyocyte sheets occurs rapidly via functional gap junction formation. Biomaterials. 27 (27), 4765-4774 (2006).
- Miyagawa, S., et al. Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: Their integration with recipient myocardium. Transplantation. 80 (11), 1586-1595 (2005).
- Watts, M., et al. Decreased bioavailability of hydrogen sulfide links vascular endothelium and atrial remodeling in atrial fibrillation. Redox Biology. 38, 101817 (2021).
- Feng, Y., Cao, H., Zhang, Y. Prediction model of sinoatrial node field potential using high order partial least squares. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 1805-1811 (2015).
- Feng, Y., Cao, H., Wang, Y., Zhang, Y. Fuzzy linguistic prediction model for sinoatrial node field potential analysis in acute hyperglycemia environment. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, Suppl 1 881-887 (2015).
- Suzuki, K., Matsumoto, A., Nishida, H., Reien, Y., Maruyama, H., Nakaya, H. Termination of aconitine-induced atrial fibrillation by the KACh-channel blocker tertiapin: underlying electrophysiological mechanism. Journal of Pharmacological Sciences. 125 (4), 406-414 (2014).
- Chang, S. -L., et al. Heart failure enhances arrhythmogenesis in pulmonary veins. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 38 (10), 666-674 (2011).
- Wang, Y. -J., et al. Time-dependent block of ultrarapid-delayed rectifier K+ currents by aconitine, a potent cardiotoxin, in heart-derived H9c2 myoblasts and in neonatal rat ventricular myocytes. Toxicological Sciences. 106 (2), 454-463 (2008).
- Lai, Y. -J., Huang, E. Y. -K., Yeh, H. -I., Chen, Y. -L., Lin, J. J. -C., Lin, C. -I. On the mechanisms of arrhythmias in the myocardium of mXinα-deficient murine left atrial-pulmonary veins. Life Sciences. 83 (7-8), 272-283 (2008).
- Gustafson-Wagner, E. A., et al. Loss of mXinα, an intercalated disk protein, results in cardiac hypertrophy and cardiomyopathy with conduction defects. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (5), 2680-2692 (2007).
- Clark, R. B., et al. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, 1757-1766 (2004).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Nikmaram, M. R., et al. Characterization of the effects of Ryanodine, TTX, E-4031 and 4-AP on the sinoatrial and atrioventricular nodes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 96 (1-3), 452-464 (2008).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
- Masé, M., Glass, L., Ravelli, F. A model for mechano-electrical feedback effects on atrial flutter interval variability. Bulletin of Mathematical Biology. 70 (5), 1326-1347 (2008).
- Franz, M. R., Bode, F. Mechano-electrical feedback underlying arrhythmias: The atrial fibrillation case. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 82 (1-3), 163-174 (2003).
- Bucchi, A., Tognati, A., Milanesi, R., Baruscotti, M., DiFrancesco, D. Properties of ivabradine-induced block of HCN1 and HCN4 pacemaker channels. Journal of Physiology. 572 (2), 335-346 (2006).
