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Medicine

マウスにおける心内ペース作りの欠損を同定するための、中房ノードの発火率のマイクロ電極アレイ記録

Published: July 05, 2021
doi:
10.3791/62735
, , ,
1Department of Biological Sciences,Southern Methodist University

Summary

このプロトコルは、マウスのペースメイキング欠陥を同定するために、サイノアノード組織全体のマイクロ電極アレイ記録を用いて、固有の心焼成率を測定する新しい方法論を記述することを目的とする。薬理学的薬剤は、本質的なペースメイキングに及ぼす影響を研究するために、この方法で導入することもできる。

Abstract

右心房に位置する心房ノード(SAN)は、心臓のペースメーカー細胞を含み、この領域の機能不全は頻脈または徐脈を引き起こす可能性がある。心臓ペースメイキング欠陥の確実な同定は、主に率の欠陥を隠すことができる自律神経系の影響を防ぐことによって、本質的な心拍数の測定を必要とする。心臓ペースメーカーの固有の機能を分析する従来の方法には、 インビボ 心拍数を測定するための薬物誘発自律神経遮断、内因性心拍数を測定するための孤立した心臓記録、およびシナウアーストリップまたは単細胞パッチクランプ記録が含まれ、自発的作用電位発射率を測定する。しかし、これらの従来の手法は、技術的に困難で実行が困難な場合があります。ここでは、マウスからの全実装サイノアオアノード製剤の微小電極アレイ(MEA)記録を行うことにより、固有の心焼成率を測定する新しい方法論を提示する。MEAは、 体外 細胞外電位を記録するためのグリッド状のパターンに配置された複数の微小電極で構成されています。本明細書に記載されている方法は、本質的な心拍数を記録するための以前のアプローチよりも比較的速く、より簡単で、より正確であるという組み合わせの利点を有する一方で、容易な薬理学的尋問を可能にする。

Introduction

心臓は、脳に由来するもののような心臓固有および外因性の両方の影響によって支配される複雑な器官である。この正気ノード(SAN)は、哺乳類の心拍の開始および永続化を担うペースメーカー細胞(シナウ細胞、またはSA細胞とも呼ばれる)を収容する心臓の定義領域である。固有の心拍数は、他の心臓や神経体液の影響を受けずにペースメーカー細胞によって駆動される速度ですが、心電図などの人間と生きている動物の心拍数の伝統的な尺度は、ペースメーカーと神経の両方の心臓への影響を反映しています。SA細胞に対する最も顕著な神経影響は自律神経系からであり、それは常に身体の生理学的要件を満たすために発火パターンを調節する3.この考えを支持して、交感神経と副交感神経の両方の投影は、SAN4の近くで見つけることができます。心内神経系(ICNS)は、神経節化された神経神経の影響、特に右心房、インナーベート、SAN5、6の活性を調節するもう一つの重要な神経影響である。

機能不全は多くの心臓疾患の根源となり、他の合併症のリスクに寄与する可能性があるため、ペースメイキングの赤字を理解することは臨床的に重要です。病気の正座症候群(SSS)は、適切なペースメイキング7、8を妨げる正属ノードの機能不全を特徴とする疾患のカテゴリーである。SSSは、正気性徐脈、正弦波休止、正弦波停止、正気出口ブロック、および交互のブラダリトミアおよび頻脈性不整脈9を呈し、塞栓症および突然死のリスクの増加を含む合併症を引き起こす可能性がある8,10。ブルガダ症候群を有する者は、突然の心臓死のリスクが高い心室細動によって特徴付けられた心疾患であり、併存SAN機能不全11、12を有する場合、不整脈性事象のリスクが高い。中房機能不全はまた、心臓を超えて生理学的な結果をもたらす可能性があります。例えば、SSSは、脳低灌流13による患者の発作を引き起こすことが観察されている。

心房ペース作りの欠損を特定するには、自律神経系や体液性因子の影響を受けずにSANの活動を測定することによって、本質的な心拍数を決定する必要があります。臨床的には、これは薬理学的自律神経遮断14によって近似することができるが、この同じ技術は、哺乳類モデルにおいても、固有の心機能15、16を研究するために適用することができる。このアプローチは、寄与する神経影響の大部分をブロックし、生体内心臓検査を可能にするが、それは完全に心臓に対するすべての外因性の影響を排除しない。動物モデルにおける固有の心臓機能を研究するために使用される別の研究技術は、ランゲンドルフ透過心臓を用いた孤立した心臓記録であり、これは典型的には、エレクトログラム、ペーシング、または外膜多電極アレイ17、18、19、20を用いた測定を含む。この技術は、心筋から心臓を除去することを含むので心機能に特異的であるが、測定値は依然として、本質的な心拍数測定21に影響を与える可能性のあるメカノ電気自動調節機構の影響を受ける可能性がある。孤立した心臓の記録は、ICNS5、6、22、23を通じた自律的な規制の影響を受ける可能性もあります。さらに、心機能測定に重要な心臓の生理学的に関連する温度を維持することは、単離された心臓アプローチ20において困難であり得る。SAN機能を研究する直接的な方法は、SAN組織を特異的に隔離し、その活性を測定することです。これは、SANストリップ(孤立したSAN組織)または孤立したSANペースメーカーセル24、25を介して達成できます。SANは非常に小さく高度に定義された領域であるため、どちらも高度な技術トレーニングが必要であり、解離が正しく実行されない場合、細胞の全体的な健康状態に損傷を与える可能性があるため、細胞分離はさらに大きな課題となります。さらに、これらの技術は、個々の記録マイクロ電極を使用して組織または細胞から正常に記録するために、専門的な電気生理学的スキルを必要とします。

本プロトコルでは、マイクロ電極アレイ(MEA)を用いて固有の心拍数測定を得ることによって、SAN in vitroを記録する技術について述べています。このアプローチは、集中的な電気生理学的スキルセットを欠いている研究者が非常に特異的な電気生理学的記録を利用できるようにするという利点を有する。MEAは、原発性心筋細胞培養26、27、28、29、30、31、32、心臓シート33、34、35、36、37、38、39、および組織全体マウント40、および組織全体のマウントで心筋細胞機能を研究するために以前に使用されています。 41,42,43,44,45,46,47.SAN組織41,42の分野ポテンシャルを調べる前の作業も行われてきました。ここでは、MEAを使用してマウス固有SAN発火率を記録および分析する方法を提供します。また、この技術を用いて、電圧ゲートK+チャネルブロッカーである4-アミノピリジン(4-AP)の効果を示すサンプル実験を提供することにより、SAN固有の発火率に対する薬物の薬理学的効果をテストする方法についても説明します。定義された解剖学的ランドマークを使用して、我々は他の方法で必要とされる広範な組織解剖または細胞分離を行うことなく正確にSANを記録することができる。MEAはコストが非常に高い場合がありますが、記録は、臨床および生理学的研究アプリケーションの広大な配列で使用することができるペースメイキングの非常に具体的で信頼性の高い尺度を提供します。

Protocol

ここで説明するすべての実験手順は、国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従って行われており、サザンメソジスト大学の制度動物ケア・使用委員会(IACUC)の承認を受けています。 1. 多電極アレイ(MEA)を被覆して記録する 25 mMのホレートバッファーを作成します。 80 mLの蒸留水にNa2B4O 7・10H2Oの0.953gを溶解します。 HClで…

Representative Results

15分間皿の中で組織を順応させ、10の1分間の痕跡を記録する。現在のプロトコルは1時間以上の活動を記録していますが、ここには示されていない未公開データに≥4 hの安定した発射パターンを記録しています。実験準備がデータ収集に適している場合、各記録チャンネルは、所定のチャンネルに対して一定の均一な形状の一定の間隔の繰り返し波形(すなわちスパイク)を示すべきである(<strong…

Discussion

SAN解剖プロセスの練習と習得は、組織が壊れやすく、健全な組織が正常な記録のために必要であるため、不可欠です。SAN解剖の間、組織の適切な領域を得るために正しい方向が不可欠である。しかし、心臓の本来の向きは解剖プロセス中に容易に失われ、この努力を複雑にする。したがって、適切な左右方向を確保するために、アトリアを視覚的に検査する必要があります。典型的には、右?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、国立衛生研究所、助成金番号R01NS100954とR01NS099188によって資金提供されました。

Materials

4-Aminopyridine Sigma A78403-25G
22 gauge syringe needle Fisher Scientific 14-826-5A Used for dissection
23 gauge syringe needle Fisher Scientific 14-826-6C Used for dissection
60mm Petri Dishes Genesee Scientific 32-105G
500mL Pyrex Bottle Fisher Scientific 06-414-1C Used to store solutions
1000 mL Pyrex Bottle Fisher Scientific 06-414-1D Used to store solutions
Bone Forceps Fine Science Tools 16060-11
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C5080-500G
Carbogen (95% O2, 5% CO2)
Castroviejo Scissors, 4" Fine Science Tools 15024-10
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021-1KG
Data Acquisition PC CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080
Dissection Microscope Jenco
Dissecting Pins Fine Science Tools 26002-20
Dumont #2 Laminectomy Forceps Fine Science Tools 11223-20
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11295-51
 Extra Fine Graefe Forceps Fine Science Tools 11152-10
Glass Chamber Grainger 49WF30 Used for mouse euthanization
Harp Anchor Kit Warner Instruments  SHD-22CL/15 WI 64-0247
HCl Fisher Chemicals SA48-4 Used for pH balancing
Hemostat Fine Science Tools 13013-14
Heparin Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram NDC 63739-953-25
HEPES Sigma-Aldrich H3375-250G
Inverted Microscope Motic AE2000
Isoflurane Patterson Veterinary 07-893-1389
Lab Tape Fisher Scientific 15-950
Light for Dissection Microscope Dolan-Jenner MI150DG 660000391014
Magesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 208337-100G
MED64 Head Amplifier MED64 MED-A64HE1S
MED64 Main Amplifier MED64 MED-A64MD1A
MED64 Perfusion Cap MED64 MED-KCAP01
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit MED64 MED-KPK02
MED64 ThermoConnector MED64 MED-CP04
Mesh  Warner Instruments 640246
Microelectrode array (MEA) Alpha Med Scientific MED-R515A
Mobius Software WitWerx Inc. Specific software for the MED64
NaOH Fisher Chemicals S320-500 Used for pH balancing
Normal Saline Ultigiene NDC 50989-885-17
Paint Brush Fisher Scientific NC1751733
Parafilm Genesee Scientific PM-996
Peristaltic Pump Gilson F155009
Peristaltic Pump Tubing Fisher Scientific 14-171-298 1/8'' Interior Diameter
Polyethyleneimine Sigma P3143
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333-500G
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655-500G
Sodium Bicarbonate Sigma S6297
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-3
Sylgruard Elastomer Kit Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S6566
Sodium tetraborate Sigma S9640
Surgical Scissors Fine Science Tools 14074-09
Transfer Pipets (3mL graduated) Samco Scientific 225
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Kumar, P., Si, M., Paulhus, K., Glasscock, E. Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice. J. Vis. Exp. (173), e62735, doi:10.3791/62735 (2021).
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