A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Denne protokol har til formål at beskrive en ny metode til måling af iboende hjertefyringshastighed ved hjælp af mikroelektrode array registrering af hele sinoatrial node væv til at identificere pacemaking defekter i mus. Farmakologiske agenser kan også indføres i denne metode for at undersøge deres virkninger på iboende pacemaking.

Abstract

Den sinoatriale knude (SAN), der ligger i højre atrium, indeholder pacemakercellerne i hjertet, og dysfunktion i denne region kan forårsage takykardi eller bradykardi. Pålidelig identifikation af hjerte pacemaking defekter kræver måling af iboende hjertefrekvenser ved i vid udstrækning at forhindre indflydelsen af det autonome nervesystem, som kan maskere sats underskud. Traditionelle metoder til at analysere iboende hjerte pacemaker funktion omfatter narkotika-induceret autonom blokade til at måle in vivo hjertefrekvenser, isolerede hjerteoptagelser til at måle iboende hjertefrekvenser, og sinoatrial strimmel eller encellet patch-clamp optagelser af sinoatrial pacemaker celler til at måle spontan handling potentielle fyring satser. Men disse mere traditionelle teknikker kan være teknisk udfordrende og vanskelige at udføre. Her præsenterer vi en ny metode til måling af iboende hjertefyringshastighed ved at udføre mikroelektrode array (MEA) optagelser af hele mount sinoatrial node præparater fra mus. MeAs består af flere mikroelektroder arrangeret i et gitterlignende mønster til optagelse af in vitro ekstracellulære feltpotentialer. Den metode, der er beskrevet heri, har den kombinerede fordel, at den er relativt hurtigere, enklere og mere præcis end tidligere tilgange til registrering af iboende hjertefrekvenser, samtidig med at det giver mulighed for nem farmakologisk forhør.

Introduction

Hjertet er et komplekst organ styret af både hjerte-iboende og ydre påvirkninger som dem, der stammer fra hjernen. Den sinoatriale knude (SAN) er en defineret region i hjertet, der huser pacemakercellerne (også kaldet sinoatriale celler eller SA-celler), der er ansvarlige for indledningen og forevælelse af pattedyrets hjerteslag^1,2. Den iboende puls er den hastighed, der drives af pacemakercellerne uden indflydelse fra andre hjerte- eller neuro-humoristiske påvirkninger, men traditionelle mål for puls hos mennesker og levende dyr, såsom elektrokardiogrammer, afspejler både pacemakeren og neurale påvirkninger på hjertet. Den mest bemærkelsesværdige neurale indflydelse på SA-celler er fra det autonome nervesystem, som konstant modulerer fyringsmønstre for at opfylde kroppens fysiologiske krav³. Støtte denne idé, både sympatiske og parasympatiske fremskrivninger kan findes i nærheden af SAN⁴. Det iboende hjertenervesystem (ICNS) er en anden vigtig neural indflydelse, hvor ganglioneret plexi, specielt i højre forkamre, innerver og regulere aktiviteten af SAN^5,6.

Forståelse pacemaking underskud er klinisk vigtigt, som dysfunktion kan ligge til grund for mange hjertesygdomme, samt bidrage til risikoen for andre komplikationer. Syg sinus syndrom (SSS) er en kategori af sygdomme karakteriseret ved dysfunktion af den sinoatriale knude, som hindrer korrekt pacemaking^7,8. SSS kan præsentere med sinus bradycardia, sinus pauser, sinus anholdelse, sinoatrial exit blok, og vekslende bradyarrytmier og tachyarrhytmier⁹ og kan føre til komplikationer, herunder øget risiko for embolisk slagtilfælde og pludselig død^8,10. Personer med Brugada syndrom, en hjertesygdom præget af ventrikelflimmer med en øget risiko for pludselig hjertedød, har større risiko for arytmogenic hændelser, hvis de også har comorbid SAN dysfunktion^11,12. Sinoatrial dysfunktion kan også have fysiologiske konsekvenser ud over hjertet. For eksempel er SSS blevet observeret for at udløse anfald hos en patient på grund af cerebral hypoperfusion¹³.

For at identificere sinoatrial pacemaking underskud, iboende hjertefrekvenser skal bestemmes ved at måle aktiviteten af SAN uden indflydelse af det autonome nervesystem eller humoristiske faktorer. Klinisk kan dette tilnærmes ved farmakologisk autonom blokade¹⁴, men den samme teknik kan også anvendes i pattedyrsmodeller for at studere iboende hjertefunktion^15,16. Mens denne tilgang blokerer en stor del af bidragende neurale påvirkninger og giver mulighed for in vivo hjerteundersøgelse, det ikke helt fjerne alle ydre påvirkninger på hjertet. En anden forskningsteknik, der anvendes til at studere iboende hjertefunktion i dyremodeller er isolerede hjerte optagelser ved hjælp af Langendorff-perfused hjerter, som typisk involverer målinger ved hjælp af elektrogram, pacing, eller epicardial multielectrode arrays^17,18,19,20. Mens denne teknik er mere specifik for hjertefunktion, da det indebærer at fjerne hjertet fra kroppen, kan målingerne stadig påvirkes af mechano-elektriske autoreguleringsmekanismer, der kan påvirke iboende pulsmålinger²¹. De isolerede hjerteoptagelser kan også stadig påvirkes af autonom regulering gennem ICNS^5,6,22,23. Desuden kan det være svært at opretholde en fysiologisk relevant temperatur i hjertet, som er kritisk for hjertefunktionsmålinger, i isolerede hjertetilgange²⁰. En mere direkte metode til at studere SAN-funktionen er specifikt at isolere SAN-væv og måle dets aktivitet. Dette kan opnås gennem SAN strips (isoleret SAN væv) eller isolerede SAN pacemaker celler^24,25. Begge kræver en høj grad af teknisk uddannelse, da SAN er en meget lille og højt defineret region, og celleisolation udgør en endnu større udfordring, da afstand kan skade cellens generelle sundhed, hvis den ikke udføres korrekt. Desuden kræver disse teknikker ekspert elektrofysiologiske færdigheder for at kunne registrere fra væv eller celler ved hjælp af individuelle registrering mikroelektroder.

I denne protokol beskriver vi en teknik til at registrere SAN in vitro ved hjælp af et mikroelektrodesystem (MEA) for at opnå iboende pulsmålinger. Denne tilgang har den fordel, at meget specifikke elektrofysiologiske optagelser er tilgængelige for forskere, der mangler intensive elektrofysiologiske færdigheder. MeAs har tidligere været brugt til at studere kardiomyocyt funktion i primære kardiomyocyt kulturer^{26,27,28,29,30,31,32,}hjerteplader^{33,34,35,36,37,38,39}, og hele væv monterer^{40, 41,42,43,44,45,46,47}. Tidligere arbejde er også blevet gjort for at undersøge feltpotentialer i SAN væv^41,42. Her leverer vi en metode til at bruge MEA til at registrere og analysere murine iboende SAN fyring satser. Vi beskriver også, hvordan denne teknik kan bruges til at teste farmakologiske virkninger af lægemidler på SAN iboende fyring satser ved at give en prøve eksperiment, der viser virkningerne af 4-aminopyridin (4-AP), en spænding-gated K⁺ kanal blocker. Ved hjælp af definerede anatomiske landemærker kan vi nøjagtigt registrere SAN uden at skulle udføre de omfattende vævsdektioner eller celleisolationer, der kræves i andre metoder. Mens MEA kan være omkostningsoverkommelige, giver optagelserne meget specifikke og pålidelige målinger af pacemaking, der kan bruges i en lang række kliniske og fysiologiske forskningsapplikationer.

Protocol

Alle forsøgsprocedurer, der er beskrevet her, er blevet udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institutes of Health (NIH), som godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Southern Methodist University. 1. Belægning af multielektrodesystemet (MEA) til optagelse Lav 25 mM boratbuffer. 0,953 g af Na2B4O7,10H2O opløses i 80 mL destilleret vand. PH-pH-tallet justeres til 8,4 med HCl, og tilsæt derefter destilleret vand til et endeligt volumen på 100 mL. Lav en 0,1% lageropløsning af polyethylenimin (PEI). Der tilsættes 100 μL på 50% (w/v) PEI til 4,9 mL destilleret vand for at lave en 1% PEI-opløsning. Fortynd 1% PEI-opløsningen til 0,1% i boratbuffer ved at tilsætte 1 mL af 1% PEI-opløsningen til 9 mL af 25 mM boratbufferen. Pipette ~1 mL af 0,1% PEI-opløsningen i mea-fadet (microelectrode array), så elektroderne er helt dækket (Figur 1A og 1B).BEMÆRK: MEA’s mikroelektroder består typisk af platinsort eller carbon nanorør og isoleres med polyimid (eller akryl); begge materialer er hydrofobiske. Ved at overlægge MEA med en kationisk polymer som PEI, den hydrofobiske MEA overflade er gjort mere hydrofil, så vævsprøver til at gøre bedre kontakt med MEA overflade (Figur 1A1). Dæk MEA-fadet med termoplastisk film for at reducere fordampningen, og lad MEA natten over ved stuetemperatur (Figur 1C). Aspirere PEI opløsning fra MEA parabol ved hjælp af en pipette, være omhyggelig med ikke at røre elektrode gitter, som kan beskadige elektroderne, og derefter skylles ≥4 gange med destilleret vand (Figur 1D). Opbevar den PEI-coatede MEA under 1-2 mL ultrapurt vand og forsegles med termoplastisk film ved 4 °C, indtil det er nødvendigt. Alternativt kan du opbevare den coatede MEA ved at nedsænke den i et bæger fyldt med ultrapurt vand (Figur 1E).BEMÆRK: PEI-belægningsprocessen skal kun udføres én gang for MEA før dens første brug, og efter hver optagelsessession skal MEA opbevares nedsænket i ultrapurt vand. 2. Klargøring af komplet Tyroders opløsning til vævs dissektion Lav 1.000 mL komplet Tyrodes opløsning til dissektion; først tilsættes 8.1816 g NaCl til 800 mL ultrapure vand. Opløsningen tilføjes følgende mængde kemikalier: 0,4025 g KCl; 0,1633 g af KH2PO4; 1.1915 g HEPES; 0,9999 g glukose; 0,0952 g MgCl2; 0,2646 g ca.2,2H2O. Juster pH-skærmen til 7,4 med NaOH, og tilsæt derefter ultrapurt vand, indtil det samlede volumen er 1.000 mL.BEMÆRK: Den endelige sammensætning af Complete Tyrodes opløsning vil være følgende (i mM): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 KH2PO4, 5 HEPES, 5,55 glukose, 1 MgCl2, 1,8 CaCl2. 3. Forberedelse af iltet Tyroders opløsning til optagelse Lav 500 mL tyroders løsning; tilsæt 4,003 g NaCl til 400 mL ultrapure vand. Opløsningen: 0,651 g NaHCO3; 0,042 g af NaH2PO4; 0,132 g ca.2,2H2O; 0,149 g KCl; 0,0476 g MgCl2; 0,999 g glukose. Juster pH-skærmen til 7,4 med HCl, og tilsæt derefter ultrapurt vand, indtil det samlede volumen er 500 mL. Oxygener opløsningen med carbogen i mindst 30 min ved stuetemperatur, før optagelsen påbegyndes.BEMÆRK: Tyroderens endelige sammensætning vil være følgende (i mM): 137 NaCl, 15,5 NaHCO3, 0,7 NaH2PO4, 1,8 CaCl2, 4 KCl, 1 MgCl2, 11,1 glukose. Denne Tyroders løsning har en lidt anden sammensætning end Complete Tyrodes opløsning, der anvendes til dissektion. 4. Forberedelse af 4-aminopyridinopløsning (4-AP) til farmakologisk graduering Lav en 1 mM arbejdsløsning af 4-AP; 18,82 mg 4-AP til 200 mL af Tyroders opløsning fra trin 3. Ilt 4-AP-opløsningen i mindst 30 minutter før forsøget. 5. Forberedelse af petriskålen til dissektion Bland silikone elastomer komponenter i en 10:1 forhold (efter vægt) af basen til hærdningsmiddel. Hæld ~ 15 mL silikone elastomer blanding i en 60 mm diameter Petri fad. Lad elastomer hærde ved stuetemperatur i 48 timer før brug.BEMÆRK: Den silikone petriskål kan genbruges til fremtidige dissektioner. 6. Dissekere sinoatrial node (SAN) Forbered heparinized Complete Tyrode’s løsning til SAN dissektion. Der tilsættes 400 μL heparin (1.000 USP/mL) til 40 mL Complete Tyrodes opløsning og varm i et 37 °C vandbad. Indsprøjt musen intraperitonealt med 200-300 μL heparin (1000 USP/mL) og lad dyret sidde i 10 min. Aflive den hepariniserede mus ved isoflurane overdosis. Placer musen i et lille glaskammer, der indeholder isofluranedampe, der genereres ved at tilføje 200-300 μL flydende isoflurane til et filterpapir inde i et perforeret plastrør.BEMÆRK: Da isofluran kan forårsage hudirritation og også kan absorberes gennem huden, bør væsken ikke kontakte musen direkte. Derfor placeres den isoflurane-gennemblødte aftørring i et perforeret rør til administration. Kontroller døden ved ophør af bevægelse og vejrtrækning indsats og ved fraværet af en tå knivspids refleks. Døden tager normalt ca. 1-2 min efter placering i kammeret.BEMÆRK: Døden ledsages normalt af vandladning. Placer musen i en liggende position på en dissektion bord med poter udstrakte og fastsætte poter til brættet ved hjælp af 1 tommer lange, 23-gauge sprøjtenåle. Fjern derefter pelsen i nærheden af bunden af brystkassen ved hjælp af kirurgisk saks og skære pelsen ved rødderne.BEMÆRK: Til et dissektionsbræt kan der anvendes polystyrenkølerllåg. Mens du holder huden med en hæmostat, skal du bruge kirurgisk saks til at lave et tværgående snit i huden lige under bunden af brystkassen fra omkring venstre costalbue til højre costalbue (Figur 3A). Skær bughinden op med kirurgisk saks, og adskil forsigtigt leveren fra mellemgulvet, idet du passer på ikke at hakke leveren, hvilket vil forårsage overdreven blødning (Figur 3B). Opbragt mellemgulvet langs brystkassen for at eksponere brysthulen (Figur 3C-D). Ved hjælp af kirurgisk saks skæres de laterale vægge i brystkassen fra kanterne af costal buerne op til kraveben for at udsætte hjertet, idet du er omhyggelig med at undgå at beskadige hjertet (Figur 3D). Brug derefter en 23-gauge sprøjtenål til at fastgøre brystkassen over skulderen og holde den på plads og ud af vejen for det kirurgiske felt. Brug en overførselspipette til at dryppe varm (37 °C) hepariniseret Complete Tyroders opløsning på hjertet for at holde den fugtig.BEMÆRK: Lad ikke hjertet tørre ud. Fjern lungerne ved at holde dem med ekstra fine Graefe-sammentrækninger og afskære luftrøret med kirurgisk saks (Figur 3E). Hold toppen af hjertet med ekstra fine Graefe-sammenkrøpper og fjern det ved at skære aorta og venae cavae med kirurgisk saks. Overfør hjertet til en petriskål, der indeholder hærdet silikoneelastomer (Figur 4A), og brug en overførselspipette til at bade hjertet med 2-3 mL varm (37 °C) hepariniseret Complete Tyroders opløsning.BEMÆRK: Pas på ikke at beskadige den sarte bageste væg i højre forkamre, som indeholder SAN, og de tilsluttede højre atrieårer. Badning af hjertet med Complete Tyroders opløsning forhindrer hjertet i at tørre ud, men nedsænker ikke hjertet helt i opløsning, da det vil forringe synligheden under dissektion. Orient hjertet med højre atrium til højre og venstre atrium til venstre.BEMÆRK: Dissektion af SAN-vævet skal ske hurtigt for at forhindre iskæmirelateret skade. Fastgør hjertets spids til fadet med en dissektionsstift. Derefter, mens du holder ringere vena cava med Dumont #2 laminectomy sammenklapper, indsætte en 22 G sprøjte nål gennem ringere og overlegen vena cava at finde deres position i højre atrium, som også identificerer den omtrentlige position af SAN (placeret i plasteret af væv mellem ringere og overlegen vena cava (Figur 4B). Ved hjælp af små dissektionsnåle fastgøres venstre og højre atrie vedhæng til skålen. Mens du holder venstre atrie vedhæng med Dumont #2 laminectomy pinps, sætte en dissektion pin gennem venstre atrie vedhæng til at holde det på plads. Mens du holder den rigtige atrie vedhæng med Dumont #55 pinps, sætte en dissektion pin gennem højre atrie vedhæng til at holde det på plads.BEMÆRK: Den samme type sammentak kan bruges til at holde venstre og højre atrie vedhæng, hvis det ønskes. Fjern sprøjtenålen, der spænder over venae cavae. For at frigøre blod fra hjertet skal du bruge Castroviejo saks til at fjerne toppen af hjertet (dvs. den nederste halvdel) ved at lave et tværgående snit over hjertekamrene (Figur 4C). Vask derefter hjertet ved at tilføje varm (37 °C) hepariniseret Complete Tyrodes opløsning med en overførselspipette. Brug Castroviejo saks til at skære langs atrioventrikulær septum holde snit tættere på ventrikel end forkamrene. Fortsæt med at skære langs atrioventrikulær septum, indtil forkamrene er adskilt fra hjertekamrene. Skær langs den interatriale septum for at fjerne venstre atrium. Placer dissektionsnåle i periferien af det højre atrium for at få det til at lægge sig fladt ned (Figur 4D). Fjern eventuelt resterende fedt, fartøjer eller væv fra atriummet ved hjælp af Castroviejo-saksen. Find SAN i højre atrium, som i denne orientering er omtrent omgivet af den overlegne vena cava (på toppen), ringere vena cava (på bunden) og cristae terminalis (til venstre) (Figur 4D).BEMÆRK: Crista terminalis fremstår som en mørk muskuløs højderyg mellem højre atrie vedhæng og SAN. Ofte san arterie kan også ses løbe gennem SAN (Figur 4D). 7. Forberedelse af MEA-systemet til optagelse Tyroders opløsning (fra trin 3) til inputopløsningsflasken (Figur 5C) og ilt den ved at tænde for strømmen af carbogengas (Figur 5A) til systemet.BEMÆRK: Tyroderens opløsning, der anvendes til optagelsen, er lidt anderledes i sammensætning end Complete Tyrodes opløsning, der anvendes til dissektionen. Kontroller carbogens strøm ved at observere bobler i den koniske kolbe, som bruges til at befugte gassen (Figur 5B) og inputopløsningsflasken (Figur 5C) . Sæt den peristaltiske pumpeindløbsslange (Figur 5D) i Tyroders optagelsesopløsning (Figur 5C). Sæt derefter den peristaltiske pumpeudløbsslange i opsamlingsflasken (Figur 5I). Indstil den peristaltiske pumpe til 25 rpm, hvilket giver en strømningshastighed på 2 mL/min og start pumpen. Kontroller, om der er bufferlækage eller overløb i systemet. Indstil temperaturregulatoren til 37 °C, musenes fysiologiske temperatur (Figur 5E). 8. Placering af hjertevævet på MEA-gitteret Overfør det dissekerede SAN-væv ved hjælp af en pensel (figur 6A) fra dissekeringsgælden til MEA-gitteret (figur 1A1). Mens du ser under et omvendt mikroskop, skal du forsigtigt placere vævet med en blød pensel, så SAN-regionen overlejrer elektrodegitteret. Re-position vævet efter behov for at sikre, at det lægger fladt på elektrodegitteret, hvilket gør god kontakt med elektroderne.BEMÆRK: Der kræves en blød pensel til at flytte vævet for at undgå at beskadige elektrodegitteret. Når vævet er korrekt placeret, skal du bruge knogletrakkerne (eller eventuelle buede sammentvingere) til at placere masken over vævet (figur 6A) . Brug derefter knogletr frem til at placere harpeankeret (figur 6A) på masken for at holde alt på plads (Figur 6B). Tag et billede af placeringen af vævet på MEA, så aktiviteten af de enkelte elektroder kan korreleres med deres anatomiske placering under optagelsen. Dette kan gøres ved at holde en smartphone op til det omvendte mikroskopmål eller ved hjælp af et vedhæftet mikroskopkamera.BEMÆRK: Hvis mea’ens retning ikke ændres efter at have taget billedet, vises den øverste venstre elektrode som den første kanal (Ch1) under optagelsen. Anbring MEA-fadet på stikpladen (Figur 5F og 6C), og placer forsigtigt perfusionshætten (Figur 6C) på MEA-fadet uden at forstyrre harpeskivens anker. Perfusionshætten kan sikres yderligere ved hjælp af et stykke laboratorietape (Figur 6C).BEMÆRK: Ud over at have justerbare opløsningsrør og udstrømningsrør har hætten også en port til levering af gas (Figur 6C). Derudover løber referenceelektroderingen gennem hætten (Figur 6C). Lad vævet komme sig efter håndtering og akklimatificere sig til kammeret i 15-20 minutter før optagelsen. 9. Angivelse af dataindsamlingsprotokollen til registrering BEMÆRK: Følgende trin beskriver åbning af softwareprotokollen for spontan beatoptagelse og definition af optagelsesbetingelserne. Detaljerne i disse trin kan variere afhængigt af den specifikke software, der bruges, men den generelle disposition bør forblive den samme. Tænd for forstærkeren (Figur 5G), og konfigurer en arbejdsgang for optagelsen i softwaren på computeren (Figur 5H). Åbn softwaren , og klik på arbejdsgangen. Vælg Åbn ny mappe. Åbn mappen Fra skabeloner. Vælg 64MD1-1920X1080 (afhængigt af skrivebordets opløsning). Åbn mappen QT. Åbn mappen Spontan optagelse. Vælg Beat_recording.moflo-skabelonen, og åbn den (Figur 7A). Indstil registreringsparametrene for at angive antallet af spor, sporvarighed, sporinterval, indgangsspænding,prøveudtagningshastighed osv.BEMÆRK: For beat frekvens og interspike dataindsamling, typisk bruge en indgangsområde spænding på 2,9 mV, en 1-Hz high pass filter, en 1000-Hz low pass filter, og en prøveudtagning sats på 20 kHz. Hvis du vil markere forskellige faser eller betingelser for eksperimentet, f.eks. før og efter administration af lægemidler, skal du klikke på fanen Anmærkninger for at tilføje de ønskede notationer (Figur 7C). Hvis du vil angive fildestinationen for de data, der skal indsamles, skal du markere feltet Aktiver lagring og angive det ønskede filnavn i feltet Ændring af filnavn. 10. Udførelse af registrering og indsamling af data Klik på knappen Indspil og afspil på øverste menulinje i anskaffelsessoftwaren for at starte optagelsen. Indhent data for 10 spor af 1 min varighed med intervaller på 2 min mellem spor. Fra disse indledende spor skal du kontrollere, at de registrerede bølgeformer er i overensstemmelse med et sundt vævspræparat af høj kvalitet ved at bekræfte, at de fleste optagelseskanaler udviser signal amplituder på ≥ 0,5 mV og identiske inter-spike intervaller (Figur 8).BEMÆRK: En indledende vurdering af de enkelte mikroelektroders aktivitet og bølgeforme svarende til deres anatomiske placeringer kan udføres ved at henvise til det billede, der er erhvervet efter positionering af vævet på MEA. Hvis du vil måle virkningerne af lægemidler på vævet, skal du sætte optagelsen på pause efter at have indsamlet de første oprindelige data ved at klikke på pauseknappen på menulinjen øverst.BEMÆRK: Eksperimentets lægemiddelresponsfase kan noteres i optagelsen ved at klikke på fanen Anmærkninger og tilføje den ønskede notation som beskrevet ovenfor (Figur 7C). Sæt pumpen på pause, og skift pumpeindløbsslangen fra den normale optagelsesløsning til Tyroders opløsning, der indeholder det ønskede foretrukne lægemiddel.BEMÆRK: I eksempelforsøget blev Tyroders opløsning brugt med 1 mM 4-aminopyridin (4-AP). Genstart pumpen, og afbryd optagelsen midlertidigt for at begynde at indsamle data igen. Når den lægemiddelinfunderede Tyrodes opløsning har nået vævet, optager 10 spor på samme måde som tidligere for baselineoptagelserne.BEMÆRK: Sporene vil tage lidt tid at stabilisere som stoffet infunderes i optagekammeret. Virkningsmekanismen af lægemidlet kan også påvirke registrering stabilitet. For lægemidler, der har reversible virkningsmekanismer, bør der også registreres en udvaskningsperiode for at bekræfte genoprettelsen af aktivitet til baselineniveauer, som er en indikator for sundt væv. Klik på Stop for at afslutte optagelserne. Tag et endeligt billede af placeringen af vævet på MEA under mikroskopet, hvis vævet har ændret sig efter den indledende optagelse setup procedure. 11. Rengøring af opsætningen efter optagelsen Rengør MEA. Når optagelsen er afsluttet, skal du forsigtigt fjerne optageopløsningen fra MEA-fadet ved hjælp af en 1 mL mikropipette.BEMÆRK: Pas på ikke at kontakte MEA-elektroderne, som kan beskadige dem. Fjern masken og harpe anker med knogle tang (eller nogen buede tang). Brug derefter en pensel til at fjerne vævet fra MEA-overfladen, idet du altid er omhyggelig med ikke at røre ved de enkelte mikroelektroder. Brug en vaskeflaske, skyl forsigtigt MEA skålen med ultrapurt vand ca. 3 til 4 gange. Opbevar den rensede MEA nedsænket i ultrapurt vand ved 4 °C. Skyl systemet slange ved at køre ultrapure vand gennem det i mindst 5 min ved hjælp af den maksimale hastighed indstilling på peristaltic pumpen.BEMÆRK: For at forhindre svampevækst må der ikke efterlades vand- eller bufferopløsning inde i slangen efter rengøring. 12. Analyse af MEA optagelser til måling SAN beat frekvens Åbn den gemte registrerede datafil i skabelonen “Beat_frequency_analysis” i analysesoftwaren (Figur 9) . Klik på knappen Afspil og lad hele optagelsen køre for at visualisere datasættet og tildele passende analyseparametre. Vælg placeringsvinduet for det ønskede visningsformat for dataene, uanset om det vises som et gennemsnit pr. sporing eller gennemsnit pr. gang (Figur 10A). Vælg de kanaler, der skal medtages i analysen, og angiv de ønskede amplitudmaksima- eller amplititude minimatærskelværdier for automatisk bølgeform peakidentifikation (Figur 10B).BEMÆRK: En individuel kanal, en kombination af kanaler eller alle 64 kanaler kan vælges til analyse på dette trin (Figur 9). Hvis de valgte tærskelværdier er for tæt på bølgeformens maxima- og minimaværdier, identificeres nogle bølgeformtoppe muligvis ikke af analysesoftwaren. Angiv mængden af tid før spike og post-spike, der skal medtages i analysen.BEMÆRK: Indstillinger på 50 ms pre-spike og 100 ms post-spike fungerer normalt godt (Figur 10B). Når du har angivet analysebetingelserne, skal du klikke på knappen Afspil igen for at køre datasættet igen og bekræfte, at analyseparametrene er egnede til spikeudtræk. Til analyse identificeres de tre mest stabile på hinanden følgende spor, der udviser stabil slåhastighed for hvert spor på tværs af de fleste kanaler både i eksperimentets basisperiode og yderligere tre på hinanden følgende stabile spor i stofeksponeringsperioden (Figur 10A). Angiv start- og slutsporene til analyse, og angiv tidsvarigheden for hvert spor, der skal analyseres (Figur 9). Før analysen startes, skal du vælge aktiveringsboksene for både Gem gennemslag pr. minut og Gem interspikeinterval (Figur 10B). Angiv det ønskede filnavn i feltet Ændringsmodifikator filnavn (Figur 10B). De analyserede data for beatfrekvens og interspikeinterval gemmes i form af ASCII-format (tekst).BEMÆRK: For at analysere forskellige tilstande (f.eks. baseline og lægemiddelrespons) skal analysen køres separat for hver tilstand. Klik på knappen Afspil og optag på den øverste fanelinje for at starte analysen. Hvis du vil eksportere dataene til andre programmer, skal du markere felterne for Gem gennemslag pr. minut og Gem interspikeinterval (Figur 10B). Skriv det ønskede filnavn i feltet Ændring af filnavn ( Figur10B), og klik på Gem for at gemme de analyserede data i ASCII-tekstformat i den valgte mappe.

Representative Results

Efter at have tilladt vævet at akklimatificer sig i fadet i 15 min, registreres 10 et-min spor. Vores nuværende protokol registrerer aktivitet i over en time, men vi har registreret stabile fyringsmønstre for ≥4 timer i ikke-offentliggjorte data, der ikke er vist her. Hvis et eksperimentelt præparat er godt til dataindsamling, skal hver optagelseskanal udvise ensartede og jævnt fordelte tilbagevendende bølgeformer (dvs. pigge) af ensartet form for en given kanal (Figur 11D). Disse b?…

Discussion

Det er bydende nødvendigt at øve og mestre SAN dissektionsprocessen, da vævet er skrøbeligt, og sundt væv er nødvendigt for en vellykket optagelse. Under SAN dissektionen er korrekt orientering afgørende for at opnå den rette vævsregion. Men den oprindelige orientering af hjertet kan let gå tabt under dissektionsprocessen, hvilket komplicerer denne bestræbelse. For at sikre den korrekte venstre-højre orientering skal forkamrene derfor inspiceres visuelt. Typisk har højre atrium tendens til at være mere genn…

Materials

4-Aminopyridine	Sigma	A78403-25G
22 gauge syringe needle	Fisher Scientific	14-826-5A	Used for dissection
23 gauge syringe needle	Fisher Scientific	14-826-6C	Used for dissection
60mm Petri Dishes	Genesee Scientific	32-105G
500mL Pyrex Bottle	Fisher Scientific	06-414-1C	Used to store solutions
1000 mL Pyrex Bottle	Fisher Scientific	06-414-1D	Used to store solutions
Bone Forceps	Fine Science Tools	16060-11
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080-500G
Carbogen (95% O2, 5% CO2)
Castroviejo Scissors, 4"	Fine Science Tools	15024-10
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
Data Acquisition PC			CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080
Dissection Microscope	Jenco
Dissecting Pins	Fine Science Tools	26002-20
Dumont #2 Laminectomy Forceps	Fine Science Tools	11223-20
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
Extra Fine Graefe Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Glass Chamber	Grainger	49WF30	Used for mouse euthanization
Harp Anchor Kit	Warner Instruments	SHD-22CL/15 WI 64-0247
HCl	Fisher Chemicals	SA48-4	Used for pH balancing
Hemostat	Fine Science Tools	13013-14
Heparin	Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram	NDC 63739-953-25
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-250G
Inverted Microscope	Motic	AE2000
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Lab Tape	Fisher Scientific	15-950
Light for Dissection Microscope	Dolan-Jenner	MI150DG 660000391014
Magesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	208337-100G
MED64 Head Amplifier	MED64	MED-A64HE1S
MED64 Main Amplifier	MED64	MED-A64MD1A
MED64 Perfusion Cap	MED64	MED-KCAP01
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit	MED64	MED-KPK02
MED64 ThermoConnector	MED64	MED-CP04
Mesh	Warner Instruments	640246
Microelectrode array (MEA)	Alpha Med Scientific	MED-R515A
Mobius Software	WitWerx Inc.		Specific software for the MED64
NaOH	Fisher Chemicals	S320-500	Used for pH balancing
Normal Saline	Ultigiene	NDC 50989-885-17
Paint Brush	Fisher Scientific	NC1751733
Parafilm	Genesee Scientific	PM-996
Peristaltic Pump	Gilson	F155009
Peristaltic Pump Tubing	Fisher Scientific	14-171-298	1/8'' Interior Diameter
Polyethyleneimine	Sigma	P3143
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655-500G
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6297
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S671-3
Sylgruard Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S6566
Sodium tetraborate	Sigma	S9640
Surgical Scissors	Fine Science Tools	14074-09
Transfer Pipets (3mL graduated)	Samco Scientific	225