Microelectrode Array Registrering af sinoatrial Node Fyring Sats for at identificere iboende hjerte pacemaking defekter i mus
Summary
Denne protokol har til formål at beskrive en ny metode til måling af iboende hjertefyringshastighed ved hjælp af mikroelektrode array registrering af hele sinoatrial node væv til at identificere pacemaking defekter i mus. Farmakologiske agenser kan også indføres i denne metode for at undersøge deres virkninger på iboende pacemaking.
Abstract
Den sinoatriale knude (SAN), der ligger i højre atrium, indeholder pacemakercellerne i hjertet, og dysfunktion i denne region kan forårsage takykardi eller bradykardi. Pålidelig identifikation af hjerte pacemaking defekter kræver måling af iboende hjertefrekvenser ved i vid udstrækning at forhindre indflydelsen af det autonome nervesystem, som kan maskere sats underskud. Traditionelle metoder til at analysere iboende hjerte pacemaker funktion omfatter narkotika-induceret autonom blokade til at måle in vivo hjertefrekvenser, isolerede hjerteoptagelser til at måle iboende hjertefrekvenser, og sinoatrial strimmel eller encellet patch-clamp optagelser af sinoatrial pacemaker celler til at måle spontan handling potentielle fyring satser. Men disse mere traditionelle teknikker kan være teknisk udfordrende og vanskelige at udføre. Her præsenterer vi en ny metode til måling af iboende hjertefyringshastighed ved at udføre mikroelektrode array (MEA) optagelser af hele mount sinoatrial node præparater fra mus. MeAs består af flere mikroelektroder arrangeret i et gitterlignende mønster til optagelse af in vitro ekstracellulære feltpotentialer. Den metode, der er beskrevet heri, har den kombinerede fordel, at den er relativt hurtigere, enklere og mere præcis end tidligere tilgange til registrering af iboende hjertefrekvenser, samtidig med at det giver mulighed for nem farmakologisk forhør.
Introduction
Hjertet er et komplekst organ styret af både hjerte-iboende og ydre påvirkninger som dem, der stammer fra hjernen. Den sinoatriale knude (SAN) er en defineret region i hjertet, der huser pacemakercellerne (også kaldet sinoatriale celler eller SA-celler), der er ansvarlige for indledningen og forevælelse af pattedyrets hjerteslag1,2. Den iboende puls er den hastighed, der drives af pacemakercellerne uden indflydelse fra andre hjerte- eller neuro-humoristiske påvirkninger, men traditionelle mål for puls hos mennesker og levende dyr, såsom elektrokardiogrammer, afspejler både pacemakeren og neurale påvirkninger på hjertet. Den mest bemærkelsesværdige neurale indflydelse på SA-celler er fra det autonome nervesystem, som konstant modulerer fyringsmønstre for at opfylde kroppens fysiologiske krav3. Støtte denne idé, både sympatiske og parasympatiske fremskrivninger kan findes i nærheden af SAN4. Det iboende hjertenervesystem (ICNS) er en anden vigtig neural indflydelse, hvor ganglioneret plexi, specielt i højre forkamre, innerver og regulere aktiviteten af SAN5,6.
Forståelse pacemaking underskud er klinisk vigtigt, som dysfunktion kan ligge til grund for mange hjertesygdomme, samt bidrage til risikoen for andre komplikationer. Syg sinus syndrom (SSS) er en kategori af sygdomme karakteriseret ved dysfunktion af den sinoatriale knude, som hindrer korrekt pacemaking7,8. SSS kan præsentere med sinus bradycardia, sinus pauser, sinus anholdelse, sinoatrial exit blok, og vekslende bradyarrytmier og tachyarrhytmier9 og kan føre til komplikationer, herunder øget risiko for embolisk slagtilfælde og pludselig død8,10. Personer med Brugada syndrom, en hjertesygdom præget af ventrikelflimmer med en øget risiko for pludselig hjertedød, har større risiko for arytmogenic hændelser, hvis de også har comorbid SAN dysfunktion11,12. Sinoatrial dysfunktion kan også have fysiologiske konsekvenser ud over hjertet. For eksempel er SSS blevet observeret for at udløse anfald hos en patient på grund af cerebral hypoperfusion13.
For at identificere sinoatrial pacemaking underskud, iboende hjertefrekvenser skal bestemmes ved at måle aktiviteten af SAN uden indflydelse af det autonome nervesystem eller humoristiske faktorer. Klinisk kan dette tilnærmes ved farmakologisk autonom blokade14, men den samme teknik kan også anvendes i pattedyrsmodeller for at studere iboende hjertefunktion15,16. Mens denne tilgang blokerer en stor del af bidragende neurale påvirkninger og giver mulighed for in vivo hjerteundersøgelse, det ikke helt fjerne alle ydre påvirkninger på hjertet. En anden forskningsteknik, der anvendes til at studere iboende hjertefunktion i dyremodeller er isolerede hjerte optagelser ved hjælp af Langendorff-perfused hjerter, som typisk involverer målinger ved hjælp af elektrogram, pacing, eller epicardial multielectrode arrays17,18,19,20. Mens denne teknik er mere specifik for hjertefunktion, da det indebærer at fjerne hjertet fra kroppen, kan målingerne stadig påvirkes af mechano-elektriske autoreguleringsmekanismer, der kan påvirke iboende pulsmålinger21. De isolerede hjerteoptagelser kan også stadig påvirkes af autonom regulering gennem ICNS5,6,22,23. Desuden kan det være svært at opretholde en fysiologisk relevant temperatur i hjertet, som er kritisk for hjertefunktionsmålinger, i isolerede hjertetilgange20. En mere direkte metode til at studere SAN-funktionen er specifikt at isolere SAN-væv og måle dets aktivitet. Dette kan opnås gennem SAN strips (isoleret SAN væv) eller isolerede SAN pacemaker celler24,25. Begge kræver en høj grad af teknisk uddannelse, da SAN er en meget lille og højt defineret region, og celleisolation udgør en endnu større udfordring, da afstand kan skade cellens generelle sundhed, hvis den ikke udføres korrekt. Desuden kræver disse teknikker ekspert elektrofysiologiske færdigheder for at kunne registrere fra væv eller celler ved hjælp af individuelle registrering mikroelektroder.
I denne protokol beskriver vi en teknik til at registrere SAN in vitro ved hjælp af et mikroelektrodesystem (MEA) for at opnå iboende pulsmålinger. Denne tilgang har den fordel, at meget specifikke elektrofysiologiske optagelser er tilgængelige for forskere, der mangler intensive elektrofysiologiske færdigheder. MeAs har tidligere været brugt til at studere kardiomyocyt funktion i primære kardiomyocyt kulturer26,27,28,29,30,31,32,hjerteplader33,34,35,36,37,38,39, og hele væv monterer40, 41,42,43,44,45,46,47. Tidligere arbejde er også blevet gjort for at undersøge feltpotentialer i SAN væv41,42. Her leverer vi en metode til at bruge MEA til at registrere og analysere murine iboende SAN fyring satser. Vi beskriver også, hvordan denne teknik kan bruges til at teste farmakologiske virkninger af lægemidler på SAN iboende fyring satser ved at give en prøve eksperiment, der viser virkningerne af 4-aminopyridin (4-AP), en spænding-gated K+ kanal blocker. Ved hjælp af definerede anatomiske landemærker kan vi nøjagtigt registrere SAN uden at skulle udføre de omfattende vævsdektioner eller celleisolationer, der kræves i andre metoder. Mens MEA kan være omkostningsoverkommelige, giver optagelserne meget specifikke og pålidelige målinger af pacemaking, der kan bruges i en lang række kliniske og fysiologiske forskningsapplikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er bydende nødvendigt at øve og mestre SAN dissektionsprocessen, da vævet er skrøbeligt, og sundt væv er nødvendigt for en vellykket optagelse. Under SAN dissektionen er korrekt orientering afgørende for at opnå den rette vævsregion. Men den oprindelige orientering af hjertet kan let gå tabt under dissektionsprocessen, hvilket komplicerer denne bestræbelse. For at sikre den korrekte venstre-højre orientering skal forkamrene derfor inspiceres visuelt. Typisk har højre atrium tendens til at være mere genn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health, tilskud numre R01NS100954 og R01NS099188.
Materials
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
References
- Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
- Josea, A. D., Collison, D. The normal range and determinants of the intrinsic heart rate in man. Cardiovascular Research. (4), 160-167 (1970).
- Peters, C. H., Sharpe, E. J., Proenza, C. Annual Review of Physiology Cardiac Pacemaker Activity and Aging. Annual Review of Physiology. 82, 21-43 (2019).
- Keith, A., Flack, M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. Journal of Anatomy and Physiology. 41 (3), 172-189 (1907).
- Wake, E., Brack, K. Characterization of the intrinsic cardiac nervous system. Autonomic Neuroscience. 199, (2016).
- Fedele, L., Brand, T. The intrinsic cardiac nervous system and its role in cardiac pacemaking and conduction. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 7 (4), 1-33 (2020).
- Mangrum, J. M., DiMarco, J. P. The evaluation and management of bradycardia. New England Journal of Medicine. 342 (10), 703-709 (2000).
- Adan, V., Crown, L. A. Diagnosis and treatment of Sick Sinus Syndrome. American Family Physician. 67 (8), 1725-1732 (2003).
- Semelka, M., Gera, J., Usman, S. Sick Sinus Syndrome: A Review. American Family Physician. 87 (10), 691-696 (2013).
- Zaragoza, M. V., et al. Exome sequencing identifies a novel LMNA splice-site mutation and multigenic heterozygosity of potential modifiers in a family with Sick Sinus Syndrome, dilated cardiomyopathy, and sudden cardiac death. PLoS ONE. 11 (5), 0155421 (2016).
- Brugada, J., Campuzano, O., Arbelo, E., Sarquella-Brugada, G., Brugada, R. Present status of Brugada Syndrome: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (9), 1046-1059 (2018).
- Rollin, A., et al. Prevalence, characteristics, and prognosis role of type 1 ST elevation in the peripheral ECG leads in patients with Brugada syndrome. Heart Rhythm. 10 (7), 1012-1018 (2013).
- Patel, N., Majeed, F., Sule, A. A. Seizure triggered by Sick Sinus Syndrome. BMJ case reports. 4, 2017222011 (2017).
- Knecht, S., et al. Impact of pharmacological autonomic blockade on complex fractionated atrial electrograms. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (7), 766-772 (2010).
- Saba, S., London, B., Ganz, L. Autonomic blockade unmasks maturational differences in rate-dependent atrioventricular nodal conduction and facilitation in the mouse. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 14 (2), 191-195 (2003).
- Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 51-56 (2002).
- Tse, G., Tse, V., Yeo, J. M., Sun, B. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts. PLoS ONE. 11 (2), 0148858 (2016).
- Tse, G., et al. Quantification of beat-to-beat variability of action potential durations in Langendorff-perfused mouse hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1578), 01578 (2018).
- Avula, U. M. R., et al. Heterogeneity of the action potential duration is required for sustained atrial fibrillation. JCI Insight. 5 (11), 128765 (2019).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. (135), e57617 (2018).
- Quinn, A. T., Kohl, P. Cardiac mechano-electric coupling: Acute effects of mechanical stimulation on heart rate and rhythm. Physiological Reviews. 101 (1), 37-92 (2021).
- Ripplinger, C. M., Noujaim, S. F., Linz, D. The nervous heart. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 199-209 (2016).
- Pauza, D. H., Pauziene, N., Pakeltyte, G., Stropus, R. Comparative quantitative study of the intrinsic cardiac ganglia and neurons in the rat, guinea pig, dog and human as revealed by histochemical staining for acetylcholinesterase. Annals of Anatomy. 184, 125-136 (2002).
- Golovko, V., Gonotkov, M., Lebedeva, E. Effects of 4-aminopyridine on action potentials generation in mouse sinoauricular node strips. Physiological Reports. 3 (7), 12447 (2015).
- Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), e54555 (2016).
- Doi, M., Ogawa, E., Arai, T. Effect of a photosensitization reaction performed during the first 3 min after exposure of rat myocardial cells to talaporfin sodium in vitro. Lasers in Medical Science. 32 (8), 1873-1878 (2017).
- Takanari, H., et al. A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology. Journal of Cellular Physiology. 231 (10), 2249-2256 (2016).
- Nakashima, T., et al. Rapid electrical stimulation causes alterations in cardiac intercellular junction proteins of cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1324-1333 (2014).
- Suzuki, S., et al. Effects of aldosterone on Cx43 gap junction expression in neonatal rat cultured cardiomyocytes. Circulation Journal. 73 (8), (2009).
- Horiba, M., et al. T-type Ca2+ channel blockers prevent cardiac cell hypertrophy through an inhibition of calcineurin-NFAT3 activation as well as L-type Ca2+ channel blockers. Life Sciences. 82 (11-12), 554-560 (2008).
- Inoue, N., et al. Rapid electrical stimulation of contraction modulates gap junction protein in neonatal rat cultured cardiomyocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases and effects of angiotensin II receptor agonist. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 914-922 (2004).
- Aalders, J., et al. Effects of fibrillin mutations on the behavior of heart muscle cells in Marfan syndrome. Scientific Reports. 10 (16756), (2020).
- Matsuura, K., et al. Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets. Biomaterials. 32 (30), 7355-7362 (2011).
- Fujita, H., Shimizu, K., Nagamori, E. Application of a cell sheet-polymer film complex with temperature sensitivity for increased mechanical strength and cell alignment capability. Biotechnology and Bioengineering. 103 (2), 370-377 (2009).
- Baba, S., et al. Generation of cardiac and endothelial cells from neonatal mouse testis-derived multipotent germline stem cells. Stem Cells. 25 (6), 1375-1383 (2007).
- Baba, S., et al. Flk1+ cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model. Cardiovascular Research. 76 (1), 119-131 (2007).
- Shimizu, K., et al. Construction of multi-layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 803-809 (2007).
- Haraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. Electrical coupling of cardiomyocyte sheets occurs rapidly via functional gap junction formation. Biomaterials. 27 (27), 4765-4774 (2006).
- Miyagawa, S., et al. Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: Their integration with recipient myocardium. Transplantation. 80 (11), 1586-1595 (2005).
- Watts, M., et al. Decreased bioavailability of hydrogen sulfide links vascular endothelium and atrial remodeling in atrial fibrillation. Redox Biology. 38, 101817 (2021).
- Feng, Y., Cao, H., Zhang, Y. Prediction model of sinoatrial node field potential using high order partial least squares. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 1805-1811 (2015).
- Feng, Y., Cao, H., Wang, Y., Zhang, Y. Fuzzy linguistic prediction model for sinoatrial node field potential analysis in acute hyperglycemia environment. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 881-887 (2015).
- Suzuki, K., Matsumoto, A., Nishida, H., Reien, Y., Maruyama, H., Nakaya, H. Termination of aconitine-induced atrial fibrillation by the KACh-channel blocker tertiapin: underlying electrophysiological mechanism. Journal of Pharmacological Sciences. 125 (4), 406-414 (2014).
- Chang, S. -. L., et al. Heart failure enhances arrhythmogenesis in pulmonary veins. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 38 (10), 666-674 (2011).
- Wang, Y. -. J., et al. Time-dependent block of ultrarapid-delayed rectifier K+ currents by aconitine, a potent cardiotoxin, in heart-derived H9c2 myoblasts and in neonatal rat ventricular myocytes. Toxicological Sciences. 106 (2), 454-463 (2008).
- Lai, Y. -. J., Huang, E. Y. -. K., Yeh, H. -. I., Chen, Y. -. L., Lin, J. J. -. C., Lin, C. -. I. On the mechanisms of arrhythmias in the myocardium of mXinα-deficient murine left atrial-pulmonary veins. Life Sciences. 83 (7-8), 272-283 (2008).
- Gustafson-Wagner, E. A., et al. Loss of mXinα, an intercalated disk protein, results in cardiac hypertrophy and cardiomyopathy with conduction defects. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (5), 2680-2692 (2007).
- Clark, R. B., et al. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, 1757-1766 (2004).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Nikmaram, M. R., et al. Characterization of the effects of Ryanodine, TTX, E-4031 and 4-AP on the sinoatrial and atrioventricular nodes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 96 (1-3), 452-464 (2008).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
- Masé, M., Glass, L., Ravelli, F. A model for mechano-electrical feedback effects on atrial flutter interval variability. Bulletin of Mathematical Biology. 70 (5), 1326-1347 (2008).
- Franz, M. R., Bode, F. Mechano-electrical feedback underlying arrhythmias: The atrial fibrillation case. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 82 (1-3), 163-174 (2003).
- Bucchi, A., Tognati, A., Milanesi, R., Baruscotti, M., DiFrancesco, D. Properties of ivabradine-induced block of HCN1 and HCN4 pacemaker channels. Journal of Physiology. 572 (2), 335-346 (2006).
