Denne protokol har til formål at beskrive en ny metode til måling af iboende hjertefyringshastighed ved hjælp af mikroelektrode array registrering af hele sinoatrial node væv til at identificere pacemaking defekter i mus. Farmakologiske agenser kan også indføres i denne metode for at undersøge deres virkninger på iboende pacemaking.
Den sinoatriale knude (SAN), der ligger i højre atrium, indeholder pacemakercellerne i hjertet, og dysfunktion i denne region kan forårsage takykardi eller bradykardi. Pålidelig identifikation af hjerte pacemaking defekter kræver måling af iboende hjertefrekvenser ved i vid udstrækning at forhindre indflydelsen af det autonome nervesystem, som kan maskere sats underskud. Traditionelle metoder til at analysere iboende hjerte pacemaker funktion omfatter narkotika-induceret autonom blokade til at måle in vivo hjertefrekvenser, isolerede hjerteoptagelser til at måle iboende hjertefrekvenser, og sinoatrial strimmel eller encellet patch-clamp optagelser af sinoatrial pacemaker celler til at måle spontan handling potentielle fyring satser. Men disse mere traditionelle teknikker kan være teknisk udfordrende og vanskelige at udføre. Her præsenterer vi en ny metode til måling af iboende hjertefyringshastighed ved at udføre mikroelektrode array (MEA) optagelser af hele mount sinoatrial node præparater fra mus. MeAs består af flere mikroelektroder arrangeret i et gitterlignende mønster til optagelse af in vitro ekstracellulære feltpotentialer. Den metode, der er beskrevet heri, har den kombinerede fordel, at den er relativt hurtigere, enklere og mere præcis end tidligere tilgange til registrering af iboende hjertefrekvenser, samtidig med at det giver mulighed for nem farmakologisk forhør.
Hjertet er et komplekst organ styret af både hjerte-iboende og ydre påvirkninger som dem, der stammer fra hjernen. Den sinoatriale knude (SAN) er en defineret region i hjertet, der huser pacemakercellerne (også kaldet sinoatriale celler eller SA-celler), der er ansvarlige for indledningen og forevælelse af pattedyrets hjerteslag1,2. Den iboende puls er den hastighed, der drives af pacemakercellerne uden indflydelse fra andre hjerte- eller neuro-humoristiske påvirkninger, men traditionelle mål for puls hos mennesker og levende dyr, såsom elektrokardiogrammer, afspejler både pacemakeren og neurale påvirkninger på hjertet. Den mest bemærkelsesværdige neurale indflydelse på SA-celler er fra det autonome nervesystem, som konstant modulerer fyringsmønstre for at opfylde kroppens fysiologiske krav3. Støtte denne idé, både sympatiske og parasympatiske fremskrivninger kan findes i nærheden af SAN4. Det iboende hjertenervesystem (ICNS) er en anden vigtig neural indflydelse, hvor ganglioneret plexi, specielt i højre forkamre, innerver og regulere aktiviteten af SAN5,6.
Forståelse pacemaking underskud er klinisk vigtigt, som dysfunktion kan ligge til grund for mange hjertesygdomme, samt bidrage til risikoen for andre komplikationer. Syg sinus syndrom (SSS) er en kategori af sygdomme karakteriseret ved dysfunktion af den sinoatriale knude, som hindrer korrekt pacemaking7,8. SSS kan præsentere med sinus bradycardia, sinus pauser, sinus anholdelse, sinoatrial exit blok, og vekslende bradyarrytmier og tachyarrhytmier9 og kan føre til komplikationer, herunder øget risiko for embolisk slagtilfælde og pludselig død8,10. Personer med Brugada syndrom, en hjertesygdom præget af ventrikelflimmer med en øget risiko for pludselig hjertedød, har større risiko for arytmogenic hændelser, hvis de også har comorbid SAN dysfunktion11,12. Sinoatrial dysfunktion kan også have fysiologiske konsekvenser ud over hjertet. For eksempel er SSS blevet observeret for at udløse anfald hos en patient på grund af cerebral hypoperfusion13.
For at identificere sinoatrial pacemaking underskud, iboende hjertefrekvenser skal bestemmes ved at måle aktiviteten af SAN uden indflydelse af det autonome nervesystem eller humoristiske faktorer. Klinisk kan dette tilnærmes ved farmakologisk autonom blokade14, men den samme teknik kan også anvendes i pattedyrsmodeller for at studere iboende hjertefunktion15,16. Mens denne tilgang blokerer en stor del af bidragende neurale påvirkninger og giver mulighed for in vivo hjerteundersøgelse, det ikke helt fjerne alle ydre påvirkninger på hjertet. En anden forskningsteknik, der anvendes til at studere iboende hjertefunktion i dyremodeller er isolerede hjerte optagelser ved hjælp af Langendorff-perfused hjerter, som typisk involverer målinger ved hjælp af elektrogram, pacing, eller epicardial multielectrode arrays17,18,19,20. Mens denne teknik er mere specifik for hjertefunktion, da det indebærer at fjerne hjertet fra kroppen, kan målingerne stadig påvirkes af mechano-elektriske autoreguleringsmekanismer, der kan påvirke iboende pulsmålinger21. De isolerede hjerteoptagelser kan også stadig påvirkes af autonom regulering gennem ICNS5,6,22,23. Desuden kan det være svært at opretholde en fysiologisk relevant temperatur i hjertet, som er kritisk for hjertefunktionsmålinger, i isolerede hjertetilgange20. En mere direkte metode til at studere SAN-funktionen er specifikt at isolere SAN-væv og måle dets aktivitet. Dette kan opnås gennem SAN strips (isoleret SAN væv) eller isolerede SAN pacemaker celler24,25. Begge kræver en høj grad af teknisk uddannelse, da SAN er en meget lille og højt defineret region, og celleisolation udgør en endnu større udfordring, da afstand kan skade cellens generelle sundhed, hvis den ikke udføres korrekt. Desuden kræver disse teknikker ekspert elektrofysiologiske færdigheder for at kunne registrere fra væv eller celler ved hjælp af individuelle registrering mikroelektroder.
I denne protokol beskriver vi en teknik til at registrere SAN in vitro ved hjælp af et mikroelektrodesystem (MEA) for at opnå iboende pulsmålinger. Denne tilgang har den fordel, at meget specifikke elektrofysiologiske optagelser er tilgængelige for forskere, der mangler intensive elektrofysiologiske færdigheder. MeAs har tidligere været brugt til at studere kardiomyocyt funktion i primære kardiomyocyt kulturer26,27,28,29,30,31,32,hjerteplader33,34,35,36,37,38,39, og hele væv monterer40, 41,42,43,44,45,46,47. Tidligere arbejde er også blevet gjort for at undersøge feltpotentialer i SAN væv41,42. Her leverer vi en metode til at bruge MEA til at registrere og analysere murine iboende SAN fyring satser. Vi beskriver også, hvordan denne teknik kan bruges til at teste farmakologiske virkninger af lægemidler på SAN iboende fyring satser ved at give en prøve eksperiment, der viser virkningerne af 4-aminopyridin (4-AP), en spænding-gated K+ kanal blocker. Ved hjælp af definerede anatomiske landemærker kan vi nøjagtigt registrere SAN uden at skulle udføre de omfattende vævsdektioner eller celleisolationer, der kræves i andre metoder. Mens MEA kan være omkostningsoverkommelige, giver optagelserne meget specifikke og pålidelige målinger af pacemaking, der kan bruges i en lang række kliniske og fysiologiske forskningsapplikationer.
Det er bydende nødvendigt at øve og mestre SAN dissektionsprocessen, da vævet er skrøbeligt, og sundt væv er nødvendigt for en vellykket optagelse. Under SAN dissektionen er korrekt orientering afgørende for at opnå den rette vævsregion. Men den oprindelige orientering af hjertet kan let gå tabt under dissektionsprocessen, hvilket komplicerer denne bestræbelse. For at sikre den korrekte venstre-højre orientering skal forkamrene derfor inspiceres visuelt. Typisk har højre atrium tendens til at være mere genn…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health, tilskud numre R01NS100954 og R01NS099188.
4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
Dissection Microscope | Jenco | ||
Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |