Summary

Microelectrode Array Recording av sinoatrial node avfyringshastighet for å identifisere iboende hjerte pacemaking defekter hos mus

Published: July 05, 2021
doi:

Summary

Denne protokollen tar sikte på å beskrive en ny metodikk for å måle iboende hjerteavfyringshastighet ved hjelp av mikroelektrode array-opptak av hele sinoatrial nodevevet for å identifisere pacemaking-defekter hos mus. Farmakologiske midler kan også innføres i denne metoden for å studere deres effekter på iboende pacemaking.

Abstract

Den sinoatriale noden (SAN), som ligger i høyre atrium, inneholder pacemakercellene i hjertet, og dysfunksjon i denne regionen kan forårsake takykardi eller bradykardi. Pålitelig identifisering av hjerte-pacemaking-defekter krever måling av iboende hjertefrekvenser ved i stor grad å forhindre påvirkning av det autonome nervesystemet, noe som kan maskere hastighetsunderskudd. Tradisjonelle metoder for å analysere iboende hjerte pacemaker funksjon inkluderer narkotika-indusert autonom blokade for å måle in vivo hjertefrekvens, isolerte hjerteopptak for å måle iboende hjertefrekvenser, og sinoatrial stripe eller encellet patch-clamp opptak av sinoatrial pacemaker celler for å måle spontan handling potensielle avfyringshastigheter. Imidlertid kan disse mer tradisjonelle teknikkene være teknisk utfordrende og vanskelige å utføre. Her presenterer vi en ny metodikk for å måle egen hjerteavfyringshastighet ved å utføre mikroelektrode array (MEA) opptak av helmonterte sinoatriale nodepreparater fra mus. MEAer består av flere mikroelektroder arrangert i et rutenettlignende mønster for registrering av in vitro ekstracellulære feltpotensialer. Metoden som er beskrevet her, har den kombinerte fordelen av å være relativt raskere, enklere og mer presis enn tidligere tilnærminger for registrering av iboende hjertefrekvenser, samtidig som det tillater lett farmakologisk forhør.

Introduction

Hjertet er et komplekst organ styrt av både hjerte-iboende og ekstrinsiske påvirkninger som de som stammer fra hjernen. Den sinoatriale noden (SAN) er en definert region i hjertet som huser pacemakercellene (også referert til som sinoatriale celler eller SA-celler) som er ansvarlige for initiering og videreføring av pattedyrets hjerteslag1,2. Den iboende hjertefrekvensen er frekvensen drevet av pacemakercellene uten påvirkning av andre hjerte- eller nevro-humorale påvirkninger, men tradisjonelle mål på hjertefrekvens hos mennesker og levende dyr, som elektrokardiogrammer, gjenspeiler både pacemakeren og nevrale påvirkninger på hjertet. Den mest bemerkelsesverdige nevrale påvirkningen på SA-celler er fra det autonome nervesystemet, som hele tiden modulerer avfyringsmønstre for å møte kroppens fysiologiske krav3. Støtte denne ideen, både sympatiske og parasympatiske projeksjoner finnes i nærheten av SAN4. Det iboende hjertenervesystemet (ICNS) er en annen viktig nevral påvirkning der ganglionated plexi, spesielt i høyre atria, innervate og regulerer aktiviteten til SAN5,6.

Å forstå tempomaking underskudd er klinisk viktig, da dysfunksjon kan underbe tro mange hjertesykdommer, samt bidra til risikoen for andre komplikasjoner. Syk sinus syndrom (SSS) er en kategori av sykdommer preget av dysfunksjon av sinoatrial noden som hindrer riktig pacemaking7,8. SSS kan presentere med sinus bradykardi, sinus pauser, sinus arrestasjon, sinoatrial exit blokk, og vekslende bradyarrythmias og tachyarrhythmias9 og kan føre til komplikasjoner inkludert økt risiko for embolisk slag og plutselig død8,10. De med Brugada syndrom, en hjertesykdom preget av ventrikulær fibrillasjon med økt risiko for plutselig hjertedød, har større risiko for arytmogene hendelser hvis de også har komorbid SAN dysfunksjon11,12. Sinoatrial dysfunksjon kan også ha fysiologiske konsekvenser utover hjertet. For eksempel har SSS blitt observert for å utløse anfall hos en pasient på grunn av cerebral hypoperfusjon13.

For å identifisere sinoatrial pacemaking underskudd, iboende hjertefrekvenser må bestemmes ved å måle aktiviteten til SAN uten påvirkning av autonome nervesystemet eller humorale faktorer. Klinisk kan dette tilnærmes av farmakologisk autonom blokade14, men den samme teknikken kan også brukes i pattedyrmodeller for å studere iboende hjertefunksjon15,16. Selv om denne tilnærmingen blokkerer en stor del av å bidra med nevrale påvirkninger og tillater in vivo hjerteundersøkelse, eliminerer den ikke helt alle ekstrinsiske påvirkninger på hjertet. En annen forskningsteknikk som brukes til å studere iboende hjertefunksjon i dyremodeller, er isolerte hjerteopptak ved hjelp av Langendorff-perfused hjerter, som vanligvis innebærer målinger ved hjelp av elektrogrammer, pacing eller epikardiale multielektrode matriser17,18,19,20. Selv om denne teknikken er mer spesifikk for hjertefunksjon siden den innebærer å fjerne hjertet fra kroppen, kan målingene fortsatt påvirkes av mekano-elektriske autoregulatoriske mekanismer som kan påvirke iboende hjertefrekvensmålinger21. De isolerte hjerteopptakene kan også fortsatt påvirkes av autonom regulering gjennom ICNS5,6,22,23. Videre kan det være vanskelig å opprettholde en fysiologisk relevant temperatur i hjertet, som er kritisk for hjertefunksjonsmålinger, i isolerte hjertetilnærminger20. En mer direkte metode for å studere SAN-funksjonen er å isolere SAN-vev spesifikt og måle aktiviteten. Dette kan oppnås gjennom SAN-strimler (isolert SAN-vev) eller isolerte SAN pacemaker-celler24,25. Begge krever en høy grad av teknisk opplæring, da SAN er en svært liten og svært definert region, og celleisolasjon utgjør en enda større utfordring, da dissosiasjon kan skade cellens generelle helse hvis den ikke utføres riktig. Videre krever disse teknikkene ekspert elektrofysiologiske ferdigheter for å kunne registrere fra vevet eller cellene ved hjelp av individuelle opptaksmikroelektroder.

I denne protokollen beskriver vi en teknikk for å registrere SAN in vitro ved hjelp av en mikroelektrode array (MEA) for å oppnå iboende pulsmålinger. Denne tilnærmingen har fordelen av å gjøre svært spesifikke elektrofysiologiske opptak tilgjengelige for forskere som mangler intensive elektrofysiologiske ferdigheter. MEAer har tidligere blitt brukt til å studere kardiomyocyttfunksjon i primære kardiomyocyttkulturer26,27,28,29,30,31,32, hjerteark33,34,35,36,37,38,39og vev hele monteres40, 41,42,43,44,45,46,47. Tidligere arbeid er også gjort for å undersøke feltpotensialer i SAN vev41,42. Her tilbyr vi en metodikk for å bruke MEA til å registrere og analysere murine iboende SAN-avfyringshastigheter. Vi beskriver også hvordan denne teknikken kan brukes til å teste farmakologiske effekter av legemidler på SAN iboende avfyringshastigheter ved å gi et prøveeksperiment som viser effekten av 4-aminopyridin (4-AP), en spenningsportert K+ kanalblokker. Ved hjelp av definerte anatomiske landemerker kan vi registrere SAN nøyaktig uten å måtte utføre de omfattende vevspredningene eller celleisolasjonene som kreves i andre metoder. Selv om MEA kan være kostnadsforbudende, gir opptakene svært spesifikke og pålitelige mål på pacemaking som kan brukes i et stort utvalg av kliniske og fysiologiske forskningsapplikasjoner.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer beskrevet her er utført i samsvar med retningslinjene fra National Institutes of Health (NIH), som godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Southern Methodist University. 1. Belegg multielektrode array (MEA) for opptak Lag 25 mM boratbuffer. Løs opp 0,953 g Na2B4O7·10 H2O i 80 ml destillert vann. Juster pH til 8,4 med HCl og tilsett deretter destillert vann til et endelig volum på 100 ml. Lag en 0,1% lagerløsning av polyetylenimin (PEI). Tilsett 100 μL 50 % (w/v) PEI til 4,9 ml destillert vann for å lage en 1 % PEI-løsning. Fortynn 1% PEI-løsningen til 0,1% i boratbuffer ved å tilsette 1 ml av 1% PEI-løsningen til 9 ml av 25 mM boratbufferen. Pipette ~1 ml av 0,1 % PEI-oppløsningen i mikroelektrode array (MEA)-parabolen slik at elektrodene er helt dekket (Figur 1A og 1B).MERK: MEAs mikroelektroder består vanligvis av platina svart eller karbonnanorør og isolert med polyimid (eller akryl); Begge materialene er hydrofobe. Ved å belegge MEA med en kationisk polymer som PEI, blir den hydrofobe MEA-overflaten mer hydrofil, slik at vevsprøver kan få bedre kontakt med MEA-overflaten (Figur 1A1). Dekk MEA-retten med termoplastfilm for å redusere fordampning og la MEA stå over natten ved romtemperatur (Figur 1C). Aspirer PEI-løsningen fra MEA-retten ved hjelp av en pipette, vær forsiktig så du ikke berører elektrodegitteret som kan skade elektrodene, og skyll deretter ≥4 ganger med destillert vann (Figur 1D). Oppbevar den PEI-belagte MEA under 1-2 ml ultrarent vann og forseglet med termoplastfilm ved 4 °C til det er nødvendig. Du kan også oppbevare den belagte MEA-en ved å senke den ned i et beger fylt med ultrarent vann (figur 1E).MERK: PEI-beleggprosessen trenger bare å utføres én gang for MEA før første gangs bruk, og etter hver opptaksøkt skal MEA oppbevares nedsenket i ultrarent vann. 2. Klargjøring av fullstendig Tyrodes oppløsning for vevs disseksjon Lag 1000 ml komplett Tyrodes løsning for disseksjon; Tilsett først 8.1816 g NaCl til 800 ml ultrapure vann. Tilsett følgende mengde kjemikalier til løsningen: 0,4025 g KCl; 0.1633 g KH2PO4; 1.1915 g HEPES; 0,9999 g glukose; 0,0952 g MgCl2; 0,2646 g CaCl2·2H2O. Juster pH til 7,4 med NaOH og tilsett deretter ultrarent vann til det totale volumet er 1000 ml.MERK: Den endelige sammensetningen av Komplett Tyrodes løsning vil være følgende (i mM): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 KH2PO4, 5 HEPES, 5,55 glukose, 1 MgCl2, 1,8 CaCl2. 3. Forbereder oksygenert Tyrodes løsning for opptak Lag 500 ml tyrodes løsning; tilsett 4,003 g NaCl til 400 ml ultrarent vann. Tilsett følgende mengder kjemikalier til løsningen: 0,651 g NaHCO3; 0.042 g NaH2PO4; 0.132 g CaCl2·2H2O; 0,149 g KCl; 0,0476 g MgCl2; 0,999 g glukose. Juster pH til 7.4 med HCl og tilsett deretter ultrapure vann til det totale volumet er 500 ml. Oksygener oppløsningen med carbogen i minst 30 minutter ved romtemperatur før du starter opptaket.MERK: Den endelige sammensetningen av Tyrodes løsning vil være følgende (i mM): 137 NaCl, 15,5 NaHCO3, 0,7 NaH2PO4, 1,8 CaCl2, 4 KCl, 1 MgCl2, 11,1 glukose. Denne Tyrodes løsning har en litt annen sammensetning enn Complete Tyrodes løsning som brukes til disseksjon. 4. Klargjøring av 4-aminopyridin (4-AP) oppløsning for farmakologisk modulasjon Lag en 1 mM arbeidsløsning på 4-AP; tilsett 18,82 mg 4-AP til 200 ml av Tyrodes løsning fra trinn 3. Oksygener 4-AP-løsningen i minst 30 minutter før eksperimentet. 5. Klargjøring av Petri-retten for disseksjon Bland silikonelastomerkomponenter i et 10:1-forhold (etter vekt) av basen til herdemiddel. Hell ~15 ml silikonelastomerblanding i en Petri-tallerken med en diameter på 60 mm. La elastomeren herde ved romtemperatur i 48 timer før bruk.MERK: Den silikoniserte Petri-retten kan gjenbrukes til fremtidige disseksjoner. 6. Dissekere sinoatrialnoden (SAN) Forbered heparinisert Complete Tyrodes løsning for SAN-disseksjon. Tilsett 400 μL heparin (1000 USP/ml) til 40 ml Komplett Tyrodes oppløsning og varm i et 37 °C vannbad. Injiser musen intraperitonealt med 200-300 μL heparin (1000 USP / ml) og la dyret sitte i 10 minutter. Euthanize den hepariniserte musen ved isofluran overdose. Plasser musen i et lite glasskammer som inneholder isoflurandamp generert ved å tilsette 200-300 μL flytende isofluran til et filterpapir inne i et perforert plastrør.MERK: Fordi isofluran kan forårsake hudirritasjon og også kan absorberes gjennom huden, bør væsken ikke kontakte musen direkte. Derfor er den isofluran-gjennomvåte kluten plassert i et perforert rør for administrering. Bekreft døden ved opphør av bevegelse og pusteinnsats og ved fravær av tåklemme refleks. Døden tar vanligvis ca 1-2 min etter plassering i kammeret.MERK: Døden er vanligvis ledsaget av vannlating. Plasser musen i en liggende stilling på et disseksjonsbrett med poter utstrakt og fest potene til brettet ved hjelp av 1 tomme lange, 23-gauge sprøytenåler. Fjern deretter pelsen i nærheten av bunnen av ribbeburet ved å bruke kirurgisk saks og kutte pelsen ved røttene.MERK: For et disseksjonskort kan polystyrenkjølelokk brukes. Mens du holder huden med en hemostat, bruk kirurgisk saks for å lage et tverrgående snitt i huden like under bunnen av ribbeburet fra omtrent venstre kostnadsbue til høyre kostbar bue (Figur 3A). Klipp åpne bukhinnen med kirurgisk saks og separer leveren forsiktig fra membranen, vær forsiktig så du ikke stjeler leveren, noe som vil forårsake overdreven blødning (Figur 3B). Øk membranen langs thoraxen for å eksponere thoraxhulen (Figur 3C-D). Bruk kirurgisk saks, kutt sideveggene på ribbeburet fra kantene på kostbuene opp til kragebenene for å eksponere hjertet, vær forsiktig så du unngår å skade hjertet (Figur 3D). Bruk deretter en 23-gauge sprøytenål til å feste ribbeburet over skulderen, hold det på plass og ut av veien for det kirurgiske feltet. Bruk en overføringspipette til å dryppe varm (37 °C) heparinisert Komplett Tyrodes oppløsning på hjertet for å holde den fuktig.MERK: Ikke la hjertet tørke ut. Fjern lungene ved å holde dem med ekstra fine Graefe tang og kutte luftrøret med kirurgisk saks (Figur 3E). Hold toppen av hjertet med ekstra fine Graefe tang og fjern den ved å kutte aorta og venae cavae med kirurgisk saks. Overfør hjertet til en Petri-tallerken som inneholder herdet silikonelastomer (figur 4A) og bruk en overføringspipette til å bade hjertet med 2-3 ml varm (37 °C) heparinisert Komplett Tyrodes oppløsning.MERK: Vær forsiktig så du ikke skader den delikate bakre veggen på høyre atria, som inneholder SAN, og de tilkoblede høyre atrieårene. Å bade hjertet med Complete Tyrodes løsning holder hjertet fra å tørke ut, men ikke helt nedsenke hjertet i løsningen, da det vil svekke synligheten under disseksjonen. Orienter hjertet med høyre atrium på eksperimentets høyre og venstre atrium til venstre for eksperimentet.MERK: Disseksjon av SAN-vevet bør gjøres raskt for å forhindre iskemirelatert skade. Fest toppen av hjertet til parabolen med en disseksjonspinne. Deretter, mens du holder den dårligere vena cava med Dumont #2 laminectomy tang, sett inn en 22 G sprøytenål gjennom den dårligere og overlegne vena cava for å finne sin posisjon i riktig atrium, som også identifiserer den omtrentlige posisjonen til SAN (plassert i vevslappen mellom den dårligere og overlegne vena cava (Figur 4B). Bruk små disseksjonspinner, fest venstre og høyre atrievedlegg til parabolen. Mens du holder venstre atrievedheng med Dumont #2 laminectomy tang, legg en formidlingspinne gjennom venstre atrievedheng for å holde den på plass. Mens du holder riktig atrievedheng med Dumont #55 tang, legg en disseksjonspinne gjennom høyre atrievedlegg for å holde den på plass.MERK: Samme type tang kan brukes til å holde venstre og høyre atrievedlegg om ønskelig. Fjern sprøytenålen som spenner over fin cavae. For å frigjøre blod fra hjertet, bruk Castroviejo saks for å fjerne toppen av hjertet (dvs. den nederste halvdelen) ved å lage et tverrsnitt over ventriklene (Figur 4C). Vask deretter hjertet ved å tilsette varm (37 °C) heparinisert Komplett Tyrodes oppløsning med en overføringspipette. Bruk Castroviejo saks til å kutte langs atrioventrikulær septum holde snittet nærmere ventrikelen enn atria. Fortsett å skjære langs atrioventrikulær septum til atriene er skilt fra ventriklene. Klipp langs interatrial septum for å fjerne venstre atrium. Plasser disseksjonspinnene i periferien av høyre atrium for å få det til å ligge flatt (Figur 4D). Fjern eventuelt gjenværende fett, kar eller vev fra atriet ved hjelp av Castroviejo-saksen. Finn SAN i høyre atrium, som i denne retningen er omtrent grenser til den overlegne vena cava (på toppen), dårligere vena cava (nederst) og cristae terminalis (til venstre) (Figur 4D).MERK: Crista terminalis fremstår som en mørk muskuløs ås mellom høyre atrievedheng og SAN. Ofte kan SAN-arterien også sees gjennom SAN (Figur 4D). 7. Klargjøring av MEA-systemet for opptak Tilsett Tyrodes oppløsning (fra trinn 3) i inngangsløsningsflasken (Figur 5C) og oksygener den ved å slå på strømmen av karbogengass (figur 5A) i systemet.MERK: Tyrodes løsning som brukes til innspillingen er litt forskjellig i komposisjon fra Complete Tyrodes løsning som brukes til disseksjonen. Kontroller strømmen av karbogen ved å observere bobler i den koniske kolben, som brukes til å fukte gassen (Figur 5B), og inngangsoppløsningsflasken (Figur 5C) . Sett den peristaltiske pumpeinnstrømningsslangen (figur 5D) inn i Tyrodes opptaksløsning (Figur 5C). Sett deretter den peristaltiske pumpeutløpsslangen inn i oppsamlingsflasken (Figur 5I). Sett den peristaltiske pumpen til 25 rpm, noe som gir en strømningshastighet på 2 ml / min og start pumpen. Kontroller systemet for bufferlekkasje eller overflyt. Sett temperaturregulatoren til 37 °C, den fysiologiske temperaturen på mus (Figur 5E). 8. Plassere hjertevevet på MEA-nettet Overfør det dissekerte SAN-vevet ved hjelp av en pensel (Figur 6A) fra dissekering petriskålen til MEA-rutenettet (Figur 1A1). Mens du ser under et invertert mikroskop, plasserer du vevet forsiktig med en myk pensel slik at SAN-regionen overlapper elektrodegitteret. Sett vevet på nytt etter behov for å sikre at det ligger flatt på elektrodegitteret, noe som gir god kontakt med elektrodene.MERK: En myk malingsbørste er nødvendig for å flytte vevet for å unngå å skade elektrodegitteret. Når vevet er riktig plassert, bruk ben tang (eller buede tang) for å plassere nettet over vevet (Figur 6A) . Bruk deretter benstøttene til å plassere harpeankeret (Figur 6A) på nettet for å holde alt på plass (Figur 6B). Ta et bilde av vevets posisjonering på MEA slik at aktiviteten til individuelle elektroder kan korreleres med deres anatomiske plassering under opptaket. Dette kan gjøres ved å holde en smarttelefon opp til det inverterte mikroskopmålet eller ved å bruke et tilkoblet mikroskopkamera.MERK: Hvis retningen på MEA ikke endres etter at du har tatt bildet, vises den øverste venstre elektroden som den første kanalen (Ch1) under opptak. Plasser MEA-retten på kontaktplaten (Figur 5F og 6C) og plasser forsiktig perfusjonshetten (figur 6C) på MEA-parabolen uten å forstyrre harpeskiveankeret. Perfusjonshetten kan sikres ytterligere ved hjelp av et stykke labtape (Figur 6C).MERK: I tillegg til å ha justerbare oppløsningsinnløps- og utløpsrør, har hetten også en port for levering av gass (Figur 6C). I tillegg går referanseelektroderingen gjennom hetten (Figur 6C). La vevet komme seg etter håndtering og akklimatisere seg til kammeret i 15-20 minutter før opptak. 9. Stille inn datainnsamlingsprotokollen for opptak MERK: Følgende trinn beskriver åpning av programvareprotokollen for spontan beatopptak og definering av opptaksforholdene. Spesifikasjonene for disse trinnene kan variere avhengig av hvilken programvare som brukes, men den generelle disposisjonen bør forbli den samme. Slå på forsterkeren (Figur 5G), og konfigurer en arbeidsflyt for innspillingen i programvaren på datamaskinen (Figur 5H). Åpne programvaren, og klikk Arbeidsflyt. Velg Åpne ny mappe. Åpne Mappen Fra maler. Velg 64MD1-1920X1080 (avhengig av oppløsningen på skrivebordet). Åpne QT-mappen. Åpne spontan innspillingsmappen. Velg malen Beat_recording.moflo , og åpne den (Figur 7A). Angi registreringsparameterne for å angi antall spor, sporvarighet, sporintervall, inngangsspenning, samplingsfrekvens, etc., i henhold til de ønskede opptaksbetingelsene (Figur 7B).MERK: For innsamling av beatfrekvens og interspike-data bruker du vanligvis en inngangsverdi på 2,9 mV, et 1-Hz høypassfilter, et 1000-Hz low pass-filter og en samplingsfrekvens på 20 kHz. Hvis du vil markere ulike faser eller betingelser for eksperimentet, for eksempel før og etter legemiddeladministrasjon, klikker du kategorien Merknader for å legge til de ønskede notasjonene (Figur 7C). Hvis du vil angi filmålet for dataene som skal samles inn, merker du av for Aktiver lagring og skriver inn ønsket filnavn i boksen Endring av filnavn . 10. Utføre opptak og innsamling av data Klikk spill inn og spill av-knappen på den øverste menylinjen i anskaffelsesprogramvaren for å starte innspillingen. Innhente data for 10 spor av 1 min varighet med intervaller på 2 min mellom spor. Fra disse første sporene må du kontrollere at de registrerte bølgeformene er i samsvar med et sunt vevspreparat av høy kvalitet ved å bekrefte at de fleste opptakskanalene viser signalamplituder på ≥ 0,5 mV og identiske intervaller mellom piggene (figur 8).MERK: En innledende vurdering av aktiviteten og bølgeformene til de enkelte mikroelektrodene som tilsvarer deres anatomiske steder, kan utføres ved å referere til bildet som er anskaffet etter å ha plassert vevet på MEA. For å måle effekten av narkotika på vevet, pause opptaket etter å ha anskaffet innledende grunnlinjedata ved å klikke pauseknappen på den øverste menylinjen.MERK: Legemiddelresponsfasen av eksperimentet kan noteres i opptaket ved å klikke på Merknader-fanen og legge til ønsket notasjon som beskrevet ovenfor (Figur 7C). Sett pumpen på pause og sett pumpeinnstrømningsslangen på pause fra den vanlige opptaksløsningen til Tyrodes løsning som inneholder ønsket valgte legemiddel.MERK: I eksempeleksperimentet ble Tyrodes løsning brukt med 1 mM 4-aminopyridin (4-AP). Start pumpen på nytt, og sett registreringen på pause for å begynne å samle inn data på nytt. Når den legemiddelinfunderte Tyrodes løsning har nådd vevet, registrerer du 10 spor på samme måte som tidligere for basisopptakene.MERK: Sporene vil ta litt tid å stabilisere seg når stoffet infuses inn i opptakskammeret. Virkningsmekanismen til stoffet kan også påvirke opptaksstabiliteten. For legemidler som har reversible virkningsmekanismer, bør det også registreres en utvaskingsperiode for å bekrefte restaurering av aktivitet til baseline nivåer, som er en indikator på sunt vev. Klikk Stopp for å avslutte innspillingene. Ta et siste bilde av plasseringen av vevet på MEA under mikroskopet i tilfelle vevet har skiftet etter den første opptaksprosedyren. 11. Rengjøring av oppsettet etter opptaket Rengjør MEA. Når du er ferdig med innspillingen, fjerner du opptaksløsningen forsiktig fra MEA-parabolen ved hjelp av en 1 ml mikropipette.MERK: Pass på at du ikke kontakter MEA-elektrodene som kan skade dem. Fjern maske- og harpeankeret med ben tang (eller buede tang). Bruk deretter en pensel til å løsne vevet fra MEA-overflaten, og vær alltid forsiktig så du ikke berører de enkelte mikroelektrodene. Bruk en vaskeflaske og skyll MEA-retten forsiktig med ultrarent vann ca. 3 til 4 ganger. Oppbevar den rensede MEA nedsenket i ultrarent vann ved 4 °C. Skyll systemslangen ved å kjøre ultrarent vann gjennom den i minst 5 minutter ved hjelp av maksimal hastighetsinnstilling på den peristaltiske pumpen.MERK: For å unngå soppvekst, bør det ikke etterlates vann eller bufferoppløsning inne i slangen etter rengjøring. 12. Analysere MEA-opptakene for å måle SAN-beatfrekvens Åpne den lagrede innspilte datafilen i malen “Beat_frequency_analysis” i analyseprogramvaren (figur 9) . Klikk på Spill av-knappen og la hele innspillingen kjøre for å visualisere datasettet og tilordne passende analyseparametere. Velg binning -vinduet for ønsket visningsformat for dataene, uansett om det vises som et gjennomsnitt per sporing eller gjennomsnitt per gang (figur 10A). Velg kanalene som skal inkluderes i analysen, og angi de ønskede amplitude maxima- eller amplitude minima-terskelverdiene for automatisert toppidentifikasjon for bølgeform (Figur 10B).MERK: En individuell kanal, en kombinasjon av kanaler eller alle de 64 kanalene kan velges for analyse på dette trinnet (Figur 9). Hvis de valgte terskelverdiene er for nær bølgeformens maksimerings- og minimaverdier, kan det hende at noen bølgeformtopper ikke identifiseres av analyseprogramvaren. Angi hvor mye pre-spike og post-spike tid som skal inkluderes i analysen.MERK: Innstillinger på 50 ms pre-spike og 100 ms post-spike fungerer vanligvis bra (Figur 10B). Etter å ha angitt analysebetingelsene, klikker du på Spill av-knappen igjen for å kjøre datasettet på nytt og bekrefte at analyseparametrene passer for topputtrekking. For analyse, identifiser de tre mest stabile påfølgende sporene som viser stabil slagrate for hvert spor over de fleste kanaler både i løpet av eksperimentets basisperiode og ytterligere tre påfølgende stabile spor i løpet av narkotikaeksponeringsperioden (figur 10A). Angi start- og sluttsporene for analyse, og angi tidsvarigheten for hver sporing som skal analyseres (Figur 9). Før du starter analysen, merker du av for aktiver for både Lagre slag per minutt og Lagre interspikeintervall (Figur 10B). Skriv inn ønsket filnavn i boksen Endring av filnavn ( Figur10B). De analyserte dataene for beatfrekvens og interspike intervall vil bli lagret i form av ASCII (tekst) format.MERK: For å analysere ulike tilstander (for eksempel baseline og legemiddelrespons), må analysen kjøres separat for hver tilstand. Klikk Spill av og spill inn på den øverste fanelinjen for å starte analysen. Hvis du vil eksportere dataene for andre programmer, merker du av for Lagre slag per minutt og Lagre interspikeintervall (Figur 10B). Skriv inn ønsket filnavn i boksen Endring av filnavn ( Figur10B), og klikk Lagre for å lagre de analyserte dataene i ASCII-tekstformat i den valgte mappen.

Representative Results

Etter å ha tillatt vevet å akklimatisere seg i parabolen i 15 min, registreres 10 en-min spor. Vår nåværende protokoll registrerer aktivitet i over en time, men vi har registrert stabile avfyringsmønstre for ≥4 t i upubliserte data som ikke vises her. Hvis et eksperimentelt preparat er bra for datainnsamling, bør hver innspillingskanal vise konsekvente og jevnt fordelte tilbakevendende bølgeformer (dvs. pigger) av ensartet form for en gitt kanal (Figur 11D). Disse bølgeformene til…

Discussion

Å praktisere og mestre SAN-disseksjonsprosessen er viktig siden vevet er skjøre og sunt vev er nødvendig for en vellykket registrering. Under SAN-disseksjonen er riktig orientering viktig for å oppnå riktig vevsområde. Imidlertid kan hjertets opprinnelige orientering lett gå tapt under disseksjonsprosessen, noe som kompliserer denne bestrebelsen. Derfor, for å sikre riktig venstre-høyre orientering, bør atriene inspiseres visuelt. Vanligvis har høyre atrium en tendens til å være mer gjennomsiktig, mens venst…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health, tilskuddsnummer R01NS100954 og R01NS099188.

Materials

4-Aminopyridine Sigma A78403-25G
22 gauge syringe needle Fisher Scientific 14-826-5A Used for dissection
23 gauge syringe needle Fisher Scientific 14-826-6C Used for dissection
60mm Petri Dishes Genesee Scientific 32-105G
500mL Pyrex Bottle Fisher Scientific 06-414-1C Used to store solutions
1000 mL Pyrex Bottle Fisher Scientific 06-414-1D Used to store solutions
Bone Forceps Fine Science Tools 16060-11
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C5080-500G
Carbogen (95% O2, 5% CO2)
Castroviejo Scissors, 4" Fine Science Tools 15024-10
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021-1KG
Data Acquisition PC CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080
Dissection Microscope Jenco
Dissecting Pins Fine Science Tools 26002-20
Dumont #2 Laminectomy Forceps Fine Science Tools 11223-20
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11295-51
 Extra Fine Graefe Forceps Fine Science Tools 11152-10
Glass Chamber Grainger 49WF30 Used for mouse euthanization
Harp Anchor Kit Warner Instruments  SHD-22CL/15 WI 64-0247
HCl Fisher Chemicals SA48-4 Used for pH balancing
Hemostat Fine Science Tools 13013-14
Heparin Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram NDC 63739-953-25
HEPES Sigma-Aldrich H3375-250G
Inverted Microscope Motic AE2000
Isoflurane Patterson Veterinary 07-893-1389
Lab Tape Fisher Scientific 15-950
Light for Dissection Microscope Dolan-Jenner MI150DG 660000391014
Magesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 208337-100G
MED64 Head Amplifier MED64 MED-A64HE1S
MED64 Main Amplifier MED64 MED-A64MD1A
MED64 Perfusion Cap MED64 MED-KCAP01
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit MED64 MED-KPK02
MED64 ThermoConnector MED64 MED-CP04
Mesh  Warner Instruments 640246
Microelectrode array (MEA) Alpha Med Scientific MED-R515A
Mobius Software WitWerx Inc. Specific software for the MED64
NaOH Fisher Chemicals S320-500 Used for pH balancing
Normal Saline Ultigiene NDC 50989-885-17
Paint Brush Fisher Scientific NC1751733
Parafilm Genesee Scientific PM-996
Peristaltic Pump Gilson F155009
Peristaltic Pump Tubing Fisher Scientific 14-171-298 1/8'' Interior Diameter
Polyethyleneimine Sigma P3143
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333-500G
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655-500G
Sodium Bicarbonate Sigma S6297
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-3
Sylgruard Elastomer Kit Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S6566
Sodium tetraborate Sigma S9640
Surgical Scissors Fine Science Tools 14074-09
Transfer Pipets (3mL graduated) Samco Scientific 225

References

  1. Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
  2. Josea, A. D., Collison, D. The normal range and determinants of the intrinsic heart rate in man. Cardiovascular Research. (4), 160-167 (1970).
  3. Peters, C. H., Sharpe, E. J., Proenza, C. Annual Review of Physiology Cardiac Pacemaker Activity and Aging. Annual Review of Physiology. 82, 21-43 (2019).
  4. Keith, A., Flack, M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. Journal of Anatomy and Physiology. 41 (3), 172-189 (1907).
  5. Wake, E., Brack, K. Characterization of the intrinsic cardiac nervous system. Autonomic Neuroscience. 199, (2016).
  6. Fedele, L., Brand, T. The intrinsic cardiac nervous system and its role in cardiac pacemaking and conduction. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 7 (4), 1-33 (2020).
  7. Mangrum, J. M., DiMarco, J. P. The evaluation and management of bradycardia. New England Journal of Medicine. 342 (10), 703-709 (2000).
  8. Adan, V., Crown, L. A. Diagnosis and treatment of Sick Sinus Syndrome. American Family Physician. 67 (8), 1725-1732 (2003).
  9. Semelka, M., Gera, J., Usman, S. Sick Sinus Syndrome: A Review. American Family Physician. 87 (10), 691-696 (2013).
  10. Zaragoza, M. V., et al. Exome sequencing identifies a novel LMNA splice-site mutation and multigenic heterozygosity of potential modifiers in a family with Sick Sinus Syndrome, dilated cardiomyopathy, and sudden cardiac death. PLoS ONE. 11 (5), 0155421 (2016).
  11. Brugada, J., Campuzano, O., Arbelo, E., Sarquella-Brugada, G., Brugada, R. Present status of Brugada Syndrome: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (9), 1046-1059 (2018).
  12. Rollin, A., et al. Prevalence, characteristics, and prognosis role of type 1 ST elevation in the peripheral ECG leads in patients with Brugada syndrome. Heart Rhythm. 10 (7), 1012-1018 (2013).
  13. Patel, N., Majeed, F., Sule, A. A. Seizure triggered by Sick Sinus Syndrome. BMJ case reports. 4, 2017222011 (2017).
  14. Knecht, S., et al. Impact of pharmacological autonomic blockade on complex fractionated atrial electrograms. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (7), 766-772 (2010).
  15. Saba, S., London, B., Ganz, L. Autonomic blockade unmasks maturational differences in rate-dependent atrioventricular nodal conduction and facilitation in the mouse. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 14 (2), 191-195 (2003).
  16. Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 51-56 (2002).
  17. Tse, G., Tse, V., Yeo, J. M., Sun, B. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts. PLoS ONE. 11 (2), 0148858 (2016).
  18. Tse, G., et al. Quantification of beat-to-beat variability of action potential durations in Langendorff-perfused mouse hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1578), 01578 (2018).
  19. Avula, U. M. R., et al. Heterogeneity of the action potential duration is required for sustained atrial fibrillation. JCI Insight. 5 (11), 128765 (2019).
  20. Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. (135), e57617 (2018).
  21. Quinn, A. T., Kohl, P. Cardiac mechano-electric coupling: Acute effects of mechanical stimulation on heart rate and rhythm. Physiological Reviews. 101 (1), 37-92 (2021).
  22. Ripplinger, C. M., Noujaim, S. F., Linz, D. The nervous heart. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 199-209 (2016).
  23. Pauza, D. H., Pauziene, N., Pakeltyte, G., Stropus, R. Comparative quantitative study of the intrinsic cardiac ganglia and neurons in the rat, guinea pig, dog and human as revealed by histochemical staining for acetylcholinesterase. Annals of Anatomy. 184, 125-136 (2002).
  24. Golovko, V., Gonotkov, M., Lebedeva, E. Effects of 4-aminopyridine on action potentials generation in mouse sinoauricular node strips. Physiological Reports. 3 (7), 12447 (2015).
  25. Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), e54555 (2016).
  26. Doi, M., Ogawa, E., Arai, T. Effect of a photosensitization reaction performed during the first 3 min after exposure of rat myocardial cells to talaporfin sodium in vitro. Lasers in Medical Science. 32 (8), 1873-1878 (2017).
  27. Takanari, H., et al. A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology. Journal of Cellular Physiology. 231 (10), 2249-2256 (2016).
  28. Nakashima, T., et al. Rapid electrical stimulation causes alterations in cardiac intercellular junction proteins of cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1324-1333 (2014).
  29. Suzuki, S., et al. Effects of aldosterone on Cx43 gap junction expression in neonatal rat cultured cardiomyocytes. Circulation Journal. 73 (8), (2009).
  30. Horiba, M., et al. T-type Ca2+ channel blockers prevent cardiac cell hypertrophy through an inhibition of calcineurin-NFAT3 activation as well as L-type Ca2+ channel blockers. Life Sciences. 82 (11-12), 554-560 (2008).
  31. Inoue, N., et al. Rapid electrical stimulation of contraction modulates gap junction protein in neonatal rat cultured cardiomyocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases and effects of angiotensin II receptor agonist. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 914-922 (2004).
  32. Aalders, J., et al. Effects of fibrillin mutations on the behavior of heart muscle cells in Marfan syndrome. Scientific Reports. 10 (16756), (2020).
  33. Matsuura, K., et al. Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets. Biomaterials. 32 (30), 7355-7362 (2011).
  34. Fujita, H., Shimizu, K., Nagamori, E. Application of a cell sheet-polymer film complex with temperature sensitivity for increased mechanical strength and cell alignment capability. Biotechnology and Bioengineering. 103 (2), 370-377 (2009).
  35. Baba, S., et al. Generation of cardiac and endothelial cells from neonatal mouse testis-derived multipotent germline stem cells. Stem Cells. 25 (6), 1375-1383 (2007).
  36. Baba, S., et al. Flk1+ cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model. Cardiovascular Research. 76 (1), 119-131 (2007).
  37. Shimizu, K., et al. Construction of multi-layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 803-809 (2007).
  38. Haraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. Electrical coupling of cardiomyocyte sheets occurs rapidly via functional gap junction formation. Biomaterials. 27 (27), 4765-4774 (2006).
  39. Miyagawa, S., et al. Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: Their integration with recipient myocardium. Transplantation. 80 (11), 1586-1595 (2005).
  40. Watts, M., et al. Decreased bioavailability of hydrogen sulfide links vascular endothelium and atrial remodeling in atrial fibrillation. Redox Biology. 38, 101817 (2021).
  41. Feng, Y., Cao, H., Zhang, Y. Prediction model of sinoatrial node field potential using high order partial least squares. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 1805-1811 (2015).
  42. Feng, Y., Cao, H., Wang, Y., Zhang, Y. Fuzzy linguistic prediction model for sinoatrial node field potential analysis in acute hyperglycemia environment. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 881-887 (2015).
  43. Suzuki, K., Matsumoto, A., Nishida, H., Reien, Y., Maruyama, H., Nakaya, H. Termination of aconitine-induced atrial fibrillation by the KACh-channel blocker tertiapin: underlying electrophysiological mechanism. Journal of Pharmacological Sciences. 125 (4), 406-414 (2014).
  44. Chang, S. -. L., et al. Heart failure enhances arrhythmogenesis in pulmonary veins. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 38 (10), 666-674 (2011).
  45. Wang, Y. -. J., et al. Time-dependent block of ultrarapid-delayed rectifier K+ currents by aconitine, a potent cardiotoxin, in heart-derived H9c2 myoblasts and in neonatal rat ventricular myocytes. Toxicological Sciences. 106 (2), 454-463 (2008).
  46. Lai, Y. -. J., Huang, E. Y. -. K., Yeh, H. -. I., Chen, Y. -. L., Lin, J. J. -. C., Lin, C. -. I. On the mechanisms of arrhythmias in the myocardium of mXinα-deficient murine left atrial-pulmonary veins. Life Sciences. 83 (7-8), 272-283 (2008).
  47. Gustafson-Wagner, E. A., et al. Loss of mXinα, an intercalated disk protein, results in cardiac hypertrophy and cardiomyopathy with conduction defects. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (5), 2680-2692 (2007).
  48. Clark, R. B., et al. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, 1757-1766 (2004).
  49. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
  50. Nikmaram, M. R., et al. Characterization of the effects of Ryanodine, TTX, E-4031 and 4-AP on the sinoatrial and atrioventricular nodes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 96 (1-3), 452-464 (2008).
  51. Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
  52. Masé, M., Glass, L., Ravelli, F. A model for mechano-electrical feedback effects on atrial flutter interval variability. Bulletin of Mathematical Biology. 70 (5), 1326-1347 (2008).
  53. Franz, M. R., Bode, F. Mechano-electrical feedback underlying arrhythmias: The atrial fibrillation case. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 82 (1-3), 163-174 (2003).
  54. Bucchi, A., Tognati, A., Milanesi, R., Baruscotti, M., DiFrancesco, D. Properties of ivabradine-induced block of HCN1 and HCN4 pacemaker channels. Journal of Physiology. 572 (2), 335-346 (2006).

Play Video

Cite This Article
Kumar, P., Si, M., Paulhus, K., Glasscock, E. Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice. J. Vis. Exp. (173), e62735, doi:10.3791/62735 (2021).

View Video