Denne protokollen tar sikte på å beskrive en ny metodikk for å måle iboende hjerteavfyringshastighet ved hjelp av mikroelektrode array-opptak av hele sinoatrial nodevevet for å identifisere pacemaking-defekter hos mus. Farmakologiske midler kan også innføres i denne metoden for å studere deres effekter på iboende pacemaking.
Den sinoatriale noden (SAN), som ligger i høyre atrium, inneholder pacemakercellene i hjertet, og dysfunksjon i denne regionen kan forårsake takykardi eller bradykardi. Pålitelig identifisering av hjerte-pacemaking-defekter krever måling av iboende hjertefrekvenser ved i stor grad å forhindre påvirkning av det autonome nervesystemet, noe som kan maskere hastighetsunderskudd. Tradisjonelle metoder for å analysere iboende hjerte pacemaker funksjon inkluderer narkotika-indusert autonom blokade for å måle in vivo hjertefrekvens, isolerte hjerteopptak for å måle iboende hjertefrekvenser, og sinoatrial stripe eller encellet patch-clamp opptak av sinoatrial pacemaker celler for å måle spontan handling potensielle avfyringshastigheter. Imidlertid kan disse mer tradisjonelle teknikkene være teknisk utfordrende og vanskelige å utføre. Her presenterer vi en ny metodikk for å måle egen hjerteavfyringshastighet ved å utføre mikroelektrode array (MEA) opptak av helmonterte sinoatriale nodepreparater fra mus. MEAer består av flere mikroelektroder arrangert i et rutenettlignende mønster for registrering av in vitro ekstracellulære feltpotensialer. Metoden som er beskrevet her, har den kombinerte fordelen av å være relativt raskere, enklere og mer presis enn tidligere tilnærminger for registrering av iboende hjertefrekvenser, samtidig som det tillater lett farmakologisk forhør.
Hjertet er et komplekst organ styrt av både hjerte-iboende og ekstrinsiske påvirkninger som de som stammer fra hjernen. Den sinoatriale noden (SAN) er en definert region i hjertet som huser pacemakercellene (også referert til som sinoatriale celler eller SA-celler) som er ansvarlige for initiering og videreføring av pattedyrets hjerteslag1,2. Den iboende hjertefrekvensen er frekvensen drevet av pacemakercellene uten påvirkning av andre hjerte- eller nevro-humorale påvirkninger, men tradisjonelle mål på hjertefrekvens hos mennesker og levende dyr, som elektrokardiogrammer, gjenspeiler både pacemakeren og nevrale påvirkninger på hjertet. Den mest bemerkelsesverdige nevrale påvirkningen på SA-celler er fra det autonome nervesystemet, som hele tiden modulerer avfyringsmønstre for å møte kroppens fysiologiske krav3. Støtte denne ideen, både sympatiske og parasympatiske projeksjoner finnes i nærheten av SAN4. Det iboende hjertenervesystemet (ICNS) er en annen viktig nevral påvirkning der ganglionated plexi, spesielt i høyre atria, innervate og regulerer aktiviteten til SAN5,6.
Å forstå tempomaking underskudd er klinisk viktig, da dysfunksjon kan underbe tro mange hjertesykdommer, samt bidra til risikoen for andre komplikasjoner. Syk sinus syndrom (SSS) er en kategori av sykdommer preget av dysfunksjon av sinoatrial noden som hindrer riktig pacemaking7,8. SSS kan presentere med sinus bradykardi, sinus pauser, sinus arrestasjon, sinoatrial exit blokk, og vekslende bradyarrythmias og tachyarrhythmias9 og kan føre til komplikasjoner inkludert økt risiko for embolisk slag og plutselig død8,10. De med Brugada syndrom, en hjertesykdom preget av ventrikulær fibrillasjon med økt risiko for plutselig hjertedød, har større risiko for arytmogene hendelser hvis de også har komorbid SAN dysfunksjon11,12. Sinoatrial dysfunksjon kan også ha fysiologiske konsekvenser utover hjertet. For eksempel har SSS blitt observert for å utløse anfall hos en pasient på grunn av cerebral hypoperfusjon13.
For å identifisere sinoatrial pacemaking underskudd, iboende hjertefrekvenser må bestemmes ved å måle aktiviteten til SAN uten påvirkning av autonome nervesystemet eller humorale faktorer. Klinisk kan dette tilnærmes av farmakologisk autonom blokade14, men den samme teknikken kan også brukes i pattedyrmodeller for å studere iboende hjertefunksjon15,16. Selv om denne tilnærmingen blokkerer en stor del av å bidra med nevrale påvirkninger og tillater in vivo hjerteundersøkelse, eliminerer den ikke helt alle ekstrinsiske påvirkninger på hjertet. En annen forskningsteknikk som brukes til å studere iboende hjertefunksjon i dyremodeller, er isolerte hjerteopptak ved hjelp av Langendorff-perfused hjerter, som vanligvis innebærer målinger ved hjelp av elektrogrammer, pacing eller epikardiale multielektrode matriser17,18,19,20. Selv om denne teknikken er mer spesifikk for hjertefunksjon siden den innebærer å fjerne hjertet fra kroppen, kan målingene fortsatt påvirkes av mekano-elektriske autoregulatoriske mekanismer som kan påvirke iboende hjertefrekvensmålinger21. De isolerte hjerteopptakene kan også fortsatt påvirkes av autonom regulering gjennom ICNS5,6,22,23. Videre kan det være vanskelig å opprettholde en fysiologisk relevant temperatur i hjertet, som er kritisk for hjertefunksjonsmålinger, i isolerte hjertetilnærminger20. En mer direkte metode for å studere SAN-funksjonen er å isolere SAN-vev spesifikt og måle aktiviteten. Dette kan oppnås gjennom SAN-strimler (isolert SAN-vev) eller isolerte SAN pacemaker-celler24,25. Begge krever en høy grad av teknisk opplæring, da SAN er en svært liten og svært definert region, og celleisolasjon utgjør en enda større utfordring, da dissosiasjon kan skade cellens generelle helse hvis den ikke utføres riktig. Videre krever disse teknikkene ekspert elektrofysiologiske ferdigheter for å kunne registrere fra vevet eller cellene ved hjelp av individuelle opptaksmikroelektroder.
I denne protokollen beskriver vi en teknikk for å registrere SAN in vitro ved hjelp av en mikroelektrode array (MEA) for å oppnå iboende pulsmålinger. Denne tilnærmingen har fordelen av å gjøre svært spesifikke elektrofysiologiske opptak tilgjengelige for forskere som mangler intensive elektrofysiologiske ferdigheter. MEAer har tidligere blitt brukt til å studere kardiomyocyttfunksjon i primære kardiomyocyttkulturer26,27,28,29,30,31,32, hjerteark33,34,35,36,37,38,39og vev hele monteres40, 41,42,43,44,45,46,47. Tidligere arbeid er også gjort for å undersøke feltpotensialer i SAN vev41,42. Her tilbyr vi en metodikk for å bruke MEA til å registrere og analysere murine iboende SAN-avfyringshastigheter. Vi beskriver også hvordan denne teknikken kan brukes til å teste farmakologiske effekter av legemidler på SAN iboende avfyringshastigheter ved å gi et prøveeksperiment som viser effekten av 4-aminopyridin (4-AP), en spenningsportert K+ kanalblokker. Ved hjelp av definerte anatomiske landemerker kan vi registrere SAN nøyaktig uten å måtte utføre de omfattende vevspredningene eller celleisolasjonene som kreves i andre metoder. Selv om MEA kan være kostnadsforbudende, gir opptakene svært spesifikke og pålitelige mål på pacemaking som kan brukes i et stort utvalg av kliniske og fysiologiske forskningsapplikasjoner.
Å praktisere og mestre SAN-disseksjonsprosessen er viktig siden vevet er skjøre og sunt vev er nødvendig for en vellykket registrering. Under SAN-disseksjonen er riktig orientering viktig for å oppnå riktig vevsområde. Imidlertid kan hjertets opprinnelige orientering lett gå tapt under disseksjonsprosessen, noe som kompliserer denne bestrebelsen. Derfor, for å sikre riktig venstre-høyre orientering, bør atriene inspiseres visuelt. Vanligvis har høyre atrium en tendens til å være mer gjennomsiktig, mens venst…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health, tilskuddsnummer R01NS100954 og R01NS099188.
4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
Dissection Microscope | Jenco | ||
Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |