Microelectrode Array Recording av sinoatrial node avfyringshastighet for å identifisere iboende hjerte pacemaking defekter hos mus
Summary
Denne protokollen tar sikte på å beskrive en ny metodikk for å måle iboende hjerteavfyringshastighet ved hjelp av mikroelektrode array-opptak av hele sinoatrial nodevevet for å identifisere pacemaking-defekter hos mus. Farmakologiske midler kan også innføres i denne metoden for å studere deres effekter på iboende pacemaking.
Abstract
Den sinoatriale noden (SAN), som ligger i høyre atrium, inneholder pacemakercellene i hjertet, og dysfunksjon i denne regionen kan forårsake takykardi eller bradykardi. Pålitelig identifisering av hjerte-pacemaking-defekter krever måling av iboende hjertefrekvenser ved i stor grad å forhindre påvirkning av det autonome nervesystemet, noe som kan maskere hastighetsunderskudd. Tradisjonelle metoder for å analysere iboende hjerte pacemaker funksjon inkluderer narkotika-indusert autonom blokade for å måle in vivo hjertefrekvens, isolerte hjerteopptak for å måle iboende hjertefrekvenser, og sinoatrial stripe eller encellet patch-clamp opptak av sinoatrial pacemaker celler for å måle spontan handling potensielle avfyringshastigheter. Imidlertid kan disse mer tradisjonelle teknikkene være teknisk utfordrende og vanskelige å utføre. Her presenterer vi en ny metodikk for å måle egen hjerteavfyringshastighet ved å utføre mikroelektrode array (MEA) opptak av helmonterte sinoatriale nodepreparater fra mus. MEAer består av flere mikroelektroder arrangert i et rutenettlignende mønster for registrering av in vitro ekstracellulære feltpotensialer. Metoden som er beskrevet her, har den kombinerte fordelen av å være relativt raskere, enklere og mer presis enn tidligere tilnærminger for registrering av iboende hjertefrekvenser, samtidig som det tillater lett farmakologisk forhør.
Introduction
Hjertet er et komplekst organ styrt av både hjerte-iboende og ekstrinsiske påvirkninger som de som stammer fra hjernen. Den sinoatriale noden (SAN) er en definert region i hjertet som huser pacemakercellene (også referert til som sinoatriale celler eller SA-celler) som er ansvarlige for initiering og videreføring av pattedyrets hjerteslag1,2. Den iboende hjertefrekvensen er frekvensen drevet av pacemakercellene uten påvirkning av andre hjerte- eller nevro-humorale påvirkninger, men tradisjonelle mål på hjertefrekvens hos mennesker og levende dyr, som elektrokardiogrammer, gjenspeiler både pacemakeren og nevrale påvirkninger på hjertet. Den mest bemerkelsesverdige nevrale påvirkningen på SA-celler er fra det autonome nervesystemet, som hele tiden modulerer avfyringsmønstre for å møte kroppens fysiologiske krav3. Støtte denne ideen, både sympatiske og parasympatiske projeksjoner finnes i nærheten av SAN4. Det iboende hjertenervesystemet (ICNS) er en annen viktig nevral påvirkning der ganglionated plexi, spesielt i høyre atria, innervate og regulerer aktiviteten til SAN5,6.
Å forstå tempomaking underskudd er klinisk viktig, da dysfunksjon kan underbe tro mange hjertesykdommer, samt bidra til risikoen for andre komplikasjoner. Syk sinus syndrom (SSS) er en kategori av sykdommer preget av dysfunksjon av sinoatrial noden som hindrer riktig pacemaking7,8. SSS kan presentere med sinus bradykardi, sinus pauser, sinus arrestasjon, sinoatrial exit blokk, og vekslende bradyarrythmias og tachyarrhythmias9 og kan føre til komplikasjoner inkludert økt risiko for embolisk slag og plutselig død8,10. De med Brugada syndrom, en hjertesykdom preget av ventrikulær fibrillasjon med økt risiko for plutselig hjertedød, har større risiko for arytmogene hendelser hvis de også har komorbid SAN dysfunksjon11,12. Sinoatrial dysfunksjon kan også ha fysiologiske konsekvenser utover hjertet. For eksempel har SSS blitt observert for å utløse anfall hos en pasient på grunn av cerebral hypoperfusjon13.
For å identifisere sinoatrial pacemaking underskudd, iboende hjertefrekvenser må bestemmes ved å måle aktiviteten til SAN uten påvirkning av autonome nervesystemet eller humorale faktorer. Klinisk kan dette tilnærmes av farmakologisk autonom blokade14, men den samme teknikken kan også brukes i pattedyrmodeller for å studere iboende hjertefunksjon15,16. Selv om denne tilnærmingen blokkerer en stor del av å bidra med nevrale påvirkninger og tillater in vivo hjerteundersøkelse, eliminerer den ikke helt alle ekstrinsiske påvirkninger på hjertet. En annen forskningsteknikk som brukes til å studere iboende hjertefunksjon i dyremodeller, er isolerte hjerteopptak ved hjelp av Langendorff-perfused hjerter, som vanligvis innebærer målinger ved hjelp av elektrogrammer, pacing eller epikardiale multielektrode matriser17,18,19,20. Selv om denne teknikken er mer spesifikk for hjertefunksjon siden den innebærer å fjerne hjertet fra kroppen, kan målingene fortsatt påvirkes av mekano-elektriske autoregulatoriske mekanismer som kan påvirke iboende hjertefrekvensmålinger21. De isolerte hjerteopptakene kan også fortsatt påvirkes av autonom regulering gjennom ICNS5,6,22,23. Videre kan det være vanskelig å opprettholde en fysiologisk relevant temperatur i hjertet, som er kritisk for hjertefunksjonsmålinger, i isolerte hjertetilnærminger20. En mer direkte metode for å studere SAN-funksjonen er å isolere SAN-vev spesifikt og måle aktiviteten. Dette kan oppnås gjennom SAN-strimler (isolert SAN-vev) eller isolerte SAN pacemaker-celler24,25. Begge krever en høy grad av teknisk opplæring, da SAN er en svært liten og svært definert region, og celleisolasjon utgjør en enda større utfordring, da dissosiasjon kan skade cellens generelle helse hvis den ikke utføres riktig. Videre krever disse teknikkene ekspert elektrofysiologiske ferdigheter for å kunne registrere fra vevet eller cellene ved hjelp av individuelle opptaksmikroelektroder.
I denne protokollen beskriver vi en teknikk for å registrere SAN in vitro ved hjelp av en mikroelektrode array (MEA) for å oppnå iboende pulsmålinger. Denne tilnærmingen har fordelen av å gjøre svært spesifikke elektrofysiologiske opptak tilgjengelige for forskere som mangler intensive elektrofysiologiske ferdigheter. MEAer har tidligere blitt brukt til å studere kardiomyocyttfunksjon i primære kardiomyocyttkulturer26,27,28,29,30,31,32, hjerteark33,34,35,36,37,38,39og vev hele monteres40, 41,42,43,44,45,46,47. Tidligere arbeid er også gjort for å undersøke feltpotensialer i SAN vev41,42. Her tilbyr vi en metodikk for å bruke MEA til å registrere og analysere murine iboende SAN-avfyringshastigheter. Vi beskriver også hvordan denne teknikken kan brukes til å teste farmakologiske effekter av legemidler på SAN iboende avfyringshastigheter ved å gi et prøveeksperiment som viser effekten av 4-aminopyridin (4-AP), en spenningsportert K+ kanalblokker. Ved hjelp av definerte anatomiske landemerker kan vi registrere SAN nøyaktig uten å måtte utføre de omfattende vevspredningene eller celleisolasjonene som kreves i andre metoder. Selv om MEA kan være kostnadsforbudende, gir opptakene svært spesifikke og pålitelige mål på pacemaking som kan brukes i et stort utvalg av kliniske og fysiologiske forskningsapplikasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Å praktisere og mestre SAN-disseksjonsprosessen er viktig siden vevet er skjøre og sunt vev er nødvendig for en vellykket registrering. Under SAN-disseksjonen er riktig orientering viktig for å oppnå riktig vevsområde. Imidlertid kan hjertets opprinnelige orientering lett gå tapt under disseksjonsprosessen, noe som kompliserer denne bestrebelsen. Derfor, for å sikre riktig venstre-høyre orientering, bør atriene inspiseres visuelt. Vanligvis har høyre atrium en tendens til å være mer gjennomsiktig, mens venst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health, tilskuddsnummer R01NS100954 og R01NS099188.
Materials
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
References
- Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
- Josea, A. D., Collison, D. The normal range and determinants of the intrinsic heart rate in man. Cardiovascular Research. (4), 160-167 (1970).
- Peters, C. H., Sharpe, E. J., Proenza, C. Annual Review of Physiology Cardiac Pacemaker Activity and Aging. Annual Review of Physiology. 82, 21-43 (2019).
- Keith, A., Flack, M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. Journal of Anatomy and Physiology. 41 (3), 172-189 (1907).
- Wake, E., Brack, K. Characterization of the intrinsic cardiac nervous system. Autonomic Neuroscience. 199, (2016).
- Fedele, L., Brand, T. The intrinsic cardiac nervous system and its role in cardiac pacemaking and conduction. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 7 (4), 1-33 (2020).
- Mangrum, J. M., DiMarco, J. P. The evaluation and management of bradycardia. New England Journal of Medicine. 342 (10), 703-709 (2000).
- Adan, V., Crown, L. A. Diagnosis and treatment of Sick Sinus Syndrome. American Family Physician. 67 (8), 1725-1732 (2003).
- Semelka, M., Gera, J., Usman, S. Sick Sinus Syndrome: A Review. American Family Physician. 87 (10), 691-696 (2013).
- Zaragoza, M. V., et al. Exome sequencing identifies a novel LMNA splice-site mutation and multigenic heterozygosity of potential modifiers in a family with Sick Sinus Syndrome, dilated cardiomyopathy, and sudden cardiac death. PLoS ONE. 11 (5), 0155421 (2016).
- Brugada, J., Campuzano, O., Arbelo, E., Sarquella-Brugada, G., Brugada, R. Present status of Brugada Syndrome: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (9), 1046-1059 (2018).
- Rollin, A., et al. Prevalence, characteristics, and prognosis role of type 1 ST elevation in the peripheral ECG leads in patients with Brugada syndrome. Heart Rhythm. 10 (7), 1012-1018 (2013).
- Patel, N., Majeed, F., Sule, A. A. Seizure triggered by Sick Sinus Syndrome. BMJ case reports. 4, 2017222011 (2017).
- Knecht, S., et al. Impact of pharmacological autonomic blockade on complex fractionated atrial electrograms. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (7), 766-772 (2010).
- Saba, S., London, B., Ganz, L. Autonomic blockade unmasks maturational differences in rate-dependent atrioventricular nodal conduction and facilitation in the mouse. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 14 (2), 191-195 (2003).
- Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 51-56 (2002).
- Tse, G., Tse, V., Yeo, J. M., Sun, B. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts. PLoS ONE. 11 (2), 0148858 (2016).
- Tse, G., et al. Quantification of beat-to-beat variability of action potential durations in Langendorff-perfused mouse hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1578), 01578 (2018).
- Avula, U. M. R., et al. Heterogeneity of the action potential duration is required for sustained atrial fibrillation. JCI Insight. 5 (11), 128765 (2019).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. (135), e57617 (2018).
- Quinn, A. T., Kohl, P. Cardiac mechano-electric coupling: Acute effects of mechanical stimulation on heart rate and rhythm. Physiological Reviews. 101 (1), 37-92 (2021).
- Ripplinger, C. M., Noujaim, S. F., Linz, D. The nervous heart. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 199-209 (2016).
- Pauza, D. H., Pauziene, N., Pakeltyte, G., Stropus, R. Comparative quantitative study of the intrinsic cardiac ganglia and neurons in the rat, guinea pig, dog and human as revealed by histochemical staining for acetylcholinesterase. Annals of Anatomy. 184, 125-136 (2002).
- Golovko, V., Gonotkov, M., Lebedeva, E. Effects of 4-aminopyridine on action potentials generation in mouse sinoauricular node strips. Physiological Reports. 3 (7), 12447 (2015).
- Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), e54555 (2016).
- Doi, M., Ogawa, E., Arai, T. Effect of a photosensitization reaction performed during the first 3 min after exposure of rat myocardial cells to talaporfin sodium in vitro. Lasers in Medical Science. 32 (8), 1873-1878 (2017).
- Takanari, H., et al. A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology. Journal of Cellular Physiology. 231 (10), 2249-2256 (2016).
- Nakashima, T., et al. Rapid electrical stimulation causes alterations in cardiac intercellular junction proteins of cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1324-1333 (2014).
- Suzuki, S., et al. Effects of aldosterone on Cx43 gap junction expression in neonatal rat cultured cardiomyocytes. Circulation Journal. 73 (8), (2009).
- Horiba, M., et al. T-type Ca2+ channel blockers prevent cardiac cell hypertrophy through an inhibition of calcineurin-NFAT3 activation as well as L-type Ca2+ channel blockers. Life Sciences. 82 (11-12), 554-560 (2008).
- Inoue, N., et al. Rapid electrical stimulation of contraction modulates gap junction protein in neonatal rat cultured cardiomyocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases and effects of angiotensin II receptor agonist. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 914-922 (2004).
- Aalders, J., et al. Effects of fibrillin mutations on the behavior of heart muscle cells in Marfan syndrome. Scientific Reports. 10 (16756), (2020).
- Matsuura, K., et al. Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets. Biomaterials. 32 (30), 7355-7362 (2011).
- Fujita, H., Shimizu, K., Nagamori, E. Application of a cell sheet-polymer film complex with temperature sensitivity for increased mechanical strength and cell alignment capability. Biotechnology and Bioengineering. 103 (2), 370-377 (2009).
- Baba, S., et al. Generation of cardiac and endothelial cells from neonatal mouse testis-derived multipotent germline stem cells. Stem Cells. 25 (6), 1375-1383 (2007).
- Baba, S., et al. Flk1+ cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model. Cardiovascular Research. 76 (1), 119-131 (2007).
- Shimizu, K., et al. Construction of multi-layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 803-809 (2007).
- Haraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. Electrical coupling of cardiomyocyte sheets occurs rapidly via functional gap junction formation. Biomaterials. 27 (27), 4765-4774 (2006).
- Miyagawa, S., et al. Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: Their integration with recipient myocardium. Transplantation. 80 (11), 1586-1595 (2005).
- Watts, M., et al. Decreased bioavailability of hydrogen sulfide links vascular endothelium and atrial remodeling in atrial fibrillation. Redox Biology. 38, 101817 (2021).
- Feng, Y., Cao, H., Zhang, Y. Prediction model of sinoatrial node field potential using high order partial least squares. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 1805-1811 (2015).
- Feng, Y., Cao, H., Wang, Y., Zhang, Y. Fuzzy linguistic prediction model for sinoatrial node field potential analysis in acute hyperglycemia environment. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 881-887 (2015).
- Suzuki, K., Matsumoto, A., Nishida, H., Reien, Y., Maruyama, H., Nakaya, H. Termination of aconitine-induced atrial fibrillation by the KACh-channel blocker tertiapin: underlying electrophysiological mechanism. Journal of Pharmacological Sciences. 125 (4), 406-414 (2014).
- Chang, S. -. L., et al. Heart failure enhances arrhythmogenesis in pulmonary veins. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 38 (10), 666-674 (2011).
- Wang, Y. -. J., et al. Time-dependent block of ultrarapid-delayed rectifier K+ currents by aconitine, a potent cardiotoxin, in heart-derived H9c2 myoblasts and in neonatal rat ventricular myocytes. Toxicological Sciences. 106 (2), 454-463 (2008).
- Lai, Y. -. J., Huang, E. Y. -. K., Yeh, H. -. I., Chen, Y. -. L., Lin, J. J. -. C., Lin, C. -. I. On the mechanisms of arrhythmias in the myocardium of mXinα-deficient murine left atrial-pulmonary veins. Life Sciences. 83 (7-8), 272-283 (2008).
- Gustafson-Wagner, E. A., et al. Loss of mXinα, an intercalated disk protein, results in cardiac hypertrophy and cardiomyopathy with conduction defects. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (5), 2680-2692 (2007).
- Clark, R. B., et al. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, 1757-1766 (2004).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Nikmaram, M. R., et al. Characterization of the effects of Ryanodine, TTX, E-4031 and 4-AP on the sinoatrial and atrioventricular nodes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 96 (1-3), 452-464 (2008).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
- Masé, M., Glass, L., Ravelli, F. A model for mechano-electrical feedback effects on atrial flutter interval variability. Bulletin of Mathematical Biology. 70 (5), 1326-1347 (2008).
- Franz, M. R., Bode, F. Mechano-electrical feedback underlying arrhythmias: The atrial fibrillation case. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 82 (1-3), 163-174 (2003).
- Bucchi, A., Tognati, A., Milanesi, R., Baruscotti, M., DiFrancesco, D. Properties of ivabradine-induced block of HCN1 and HCN4 pacemaker channels. Journal of Physiology. 572 (2), 335-346 (2006).
