Этот протокол направлен на описание новой методологии измерения внутренней скорости сердечного возбуждения с использованием микроэлектродной записи всей ткани синоатриального узла для выявления дефектов кардиостимуляции у мышей. Фармакологические агенты также могут быть введены в этот метод для изучения их влияния на внутреннее кардиостимуляторы.
Синоатриальный узел (САН), расположенный в правом предсердии, содержит кардиостимуляторы клетки сердца, и дисфункция этой области может вызвать тахикардию или брадикардию. Надежная идентификация дефектов кардиостимуляжа требует измерения внутренней частоты сердечных сокращений, в значительной степени предотвращая влияние вегетативной нервной системы, которая может маскировать дефицит частоты. Традиционные методы анализа внутренней функции кардиостимулятора включают вегетативную блокаду, вызванную лекарственными средствами, для измерения частоты сердечных ритмов in vivo, изолированные записи сердца для измерения внутренней частоты сердечных ритмов и синоатриальную полосу или одноклеточные записи зажимов синоатриальных клеток кардиостимулятора для измерения скорости спонтанного действия потенциального возбуждения. Тем не менее, эти более традиционные методы могут быть технически сложными и трудными для выполнения. Здесь мы представляем новую методологию измерения внутренней частоты сердечных возбуждений путем выполнения записей микроэлектродной решетки (MEA) препаратов синоатриального узла с цельным креплением у мышей. MEA состоят из нескольких микроэлектродов, расположенных в виде сетки для регистрации потенциалов внеклеточного поля in vitro. Способ, описанный в настоящем описании, имеет комбинированное преимущество в том, что он относительно быстрее, проще и точнее, чем предыдущие подходы к регистрации внутренней частоты сердечных частот, а также позволяет легко проводить фармакологический опрос.
Сердце является сложным органом, управляемым как сердечными, так и внешними влияниями, такими как те, которые происходят в мозге. Синоатриальный узел (SAN) представляет собой определенную область в сердце, в которой находятся клетки кардиостимулятора (также называемые синоатриальными клетками или клетками SA), ответственные за инициирование и увековечение сердцебиения млекопитающих1,2. Внутренняя частота сердечных сокращений – это частота, управляемая клетками кардиостимулятора без влияния других сердечных или нервно-гуморальных влияний, но традиционные показатели частоты сердечных сокращений у людей и живых животных, такие как электрокардиограммы, отражают как кардиостимулятор, так и нейронные влияния на сердце. Наиболее заметное нейронное влияние на клетки SA происходит от вегетативной нервной системы, которая постоянно модулирует паттерны возбуждения для удовлетворения физиологических потребностей организма3. Поддерживая эту идею, как симпатические, так и парасимпатические проекции можно найти рядом с SAN4. Внутренняя сердечная нервная система (ICNS) является еще одним важным нейронным воздействием, где ганглионированные плексии, особенно в правых предсердиях, иннервируют и регулируют активность SAN5,6.
Понимание дефицита кардиостимуляциона клинически важно, так как дисфункция может лежать в основе многих сердечных расстройств, а также способствовать риску других осложнений. Синдром больного синуса (ССС) – это категория заболеваний, характеризующаяся дисфункцией синоатриального узла, которая препятствует правильному кардиостимуляции7,8. ССС может присутствовать при синусовой брадикардии, синусовых паузах, синусовой остановке, синоатриальном выходном блоке и чередующихся брадиаритмиях и тахиаритмиях9 и может привести к осложнениям, включая повышенный риск эмболического инсульта и внезапной смерти8,10. Люди с синдромом Бругада, сердечным расстройством, отмеченным фибрилляцией желудочков с повышенным риском внезапной сердечной смерти, подвергаются большему риску аритмогенных событий, если у них также есть коморбидная дисфункция SAN11,12. Синоатриальная дисфункция также может иметь физиологические последствия за пределами сердца. Например, было замечено, что SSS вызывает судороги у пациента из-за гипоперфузии головного мозга13.
Чтобы выявить синоатриальный дефицит кардиостимуляции, внутреннюю частоту сердечных сокращений необходимо определить путем измерения активности SAN без влияния вегетативной нервной системы или гуморальных факторов. Клинически это может быть аппроксимировано фармакологической вегетативной блокадой14,но этот же метод также может быть применен в моделях млекопитающих для изучения внутренней сердечной функции15,16. Хотя этот подход блокирует большую часть вносящих вклад нейронных влияний и позволяет проводить исследование сердца in vivo, он не полностью устраняет все внешние воздействия на сердце. Другим методом исследования, используемым для изучения внутренней сердечной функции на животных моделях, являются изолированные записи сердца с использованием перфузированных Лангендорфом сердец, которые обычно включают измерения с использованием электрограмм, кардиостимуляции или эпикардиальных многоэлектродных массивов17,18,19,20. Хотя этот метод более специфичн для сердечной функции, поскольку он включает в себя удаление сердца из организма, на измерения все еще могут влиять механоэлектрические механизмы авторегуляции, которые могут влиять на внутренние измерения частоты сердечных сокращений21. Изолированные записи сердца также могут по-прежнему подвергаться влиянию вегетативной регуляции через ICNS5,6,22,23. Кроме того, поддержание физиологически значимой температуры сердца, которая имеет решающее значение для измерения сердечной функции, может быть затруднено при изолированных сердечных приближенияхк 20. Более прямым методом изучения функции SAN является специальное выделение ткани SAN и измерение ее активности. Это может быть достигнуто с помощью полосок SAN (изолированная ткань SAN) или изолированных клеток кардиостимулятора SAN24,25. Оба требуют высокой степени технической подготовки, так как SAN является очень маленькой и четко определенной областью, и изоляция клеток представляет собой еще большую проблему, поскольку диссоциация может повредить общему здоровью клетки, если она не выполняется правильно. Кроме того, эти методы требуют экспертных электрофизиологических навыков для успешной записи из ткани или клеток с использованием отдельных регистрируя микроэлектроды.
В этом протоколе мы описываем метод записи SAN in vitro с использованием микроэлектродной матрицы (MEA) для получения внутренних измерений сердечного ритма. Преимущество этого подхода в том, что он делает высокоспецифичные электрофизиологические записи доступными для исследователей, не обладающих интенсивными электрофизиологическими навыками. MEAs ранее использовались для изучения функции кардиомиоцитов в первичных культурах кардиомиоцитов26,27,28,29,30,31,32,сердечных листах33,34,35,36,37,38,39и целых тканевых креплениях40, 41,42,43,44,45,46,47. Предыдущая работа также была выполнена для изучения полевых потенциалов в ткани SAN41,42. Здесь мы предоставляем методологию использования MEA для регистрации и анализа скорости стрельбы по SAN, присущей муринам. Мы также описываем, как этот метод может быть использован для проверки фармакологического воздействия лекарств на внутреннюю скорость срабатывания SAN, предоставив выборочный эксперимент, показывающий эффекты 4-аминопиридина (4-AP), блокатора каналов K+ с напряжением. Используя определенные анатомические ориентиры, мы можем точно записать SAN без необходимости выполнять обширные рассечения тканей или изоляцию клеток, необходимые в других методах. В то время как MEA может быть непомерно дорогим, записи обеспечивают очень специфические и надежные показатели кардиостимуляции, которые могут использоваться в широком спектре клинических и физиологических исследований.
Практика и освоение процесса рассечения SAN является обязательным, поскольку ткань хрупкая, а здоровая ткань необходима для успешной записи. Во время рассечения SAN правильная ориентация имеет важное значение для получения правильной области ткани. Однако первоначальная ориентация сер?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения, номера грантов R01NS100954 и R01NS099188.
4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
Dissection Microscope | Jenco | ||
Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |