JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Микроэлектродная запись скорости срабатывания синоатриального узла для выявления внутренних дефектов кардиостимуляции у мышей

Published: July 05, 2021
doi:
10.3791/62735
, , ,
1Department of Biological Sciences,Southern Methodist University

Summary

Этот протокол направлен на описание новой методологии измерения внутренней скорости сердечного возбуждения с использованием микроэлектродной записи всей ткани синоатриального узла для выявления дефектов кардиостимуляции у мышей. Фармакологические агенты также могут быть введены в этот метод для изучения их влияния на внутреннее кардиостимуляторы.

Abstract

Синоатриальный узел (САН), расположенный в правом предсердии, содержит кардиостимуляторы клетки сердца, и дисфункция этой области может вызвать тахикардию или брадикардию. Надежная идентификация дефектов кардиостимуляжа требует измерения внутренней частоты сердечных сокращений, в значительной степени предотвращая влияние вегетативной нервной системы, которая может маскировать дефицит частоты. Традиционные методы анализа внутренней функции кардиостимулятора включают вегетативную блокаду, вызванную лекарственными средствами, для измерения частоты сердечных ритмов in vivo, изолированные записи сердца для измерения внутренней частоты сердечных ритмов и синоатриальную полосу или одноклеточные записи зажимов синоатриальных клеток кардиостимулятора для измерения скорости спонтанного действия потенциального возбуждения. Тем не менее, эти более традиционные методы могут быть технически сложными и трудными для выполнения. Здесь мы представляем новую методологию измерения внутренней частоты сердечных возбуждений путем выполнения записей микроэлектродной решетки (MEA) препаратов синоатриального узла с цельным креплением у мышей. MEA состоят из нескольких микроэлектродов, расположенных в виде сетки для регистрации потенциалов внеклеточного поля in vitro. Способ, описанный в настоящем описании, имеет комбинированное преимущество в том, что он относительно быстрее, проще и точнее, чем предыдущие подходы к регистрации внутренней частоты сердечных частот, а также позволяет легко проводить фармакологический опрос.

Introduction

Сердце является сложным органом, управляемым как сердечными, так и внешними влияниями, такими как те, которые происходят в мозге. Синоатриальный узел (SAN) представляет собой определенную область в сердце, в которой находятся клетки кардиостимулятора (также называемые синоатриальными клетками или клетками SA), ответственные за инициирование и увековечение сердцебиения млекопитающих1,2. Внутренняя частота сердечных сокращений – это частота, управляемая клетками кардиостимулятора без влияния других сердечных или нервно-гуморальных влияний, но традиционные показатели частоты сердечных сокращений у людей и живых животных, такие как электрокардиограммы, отражают как кардиостимулятор, так и нейронные влияния на сердце. Наиболее заметное нейронное влияние на клетки SA происходит от вегетативной нервной системы, которая постоянно модулирует паттерны возбуждения для удовлетворения физиологических потребностей организма3. Поддерживая эту идею, как симпатические, так и парасимпатические проекции можно найти рядом с SAN4. Внутренняя сердечная нервная система (ICNS) является еще одним важным нейронным воздействием, где ганглионированные плексии, особенно в правых предсердиях, иннервируют и регулируют активность SAN5,6.

Понимание дефицита кардиостимуляциона клинически важно, так как дисфункция может лежать в основе многих сердечных расстройств, а также способствовать риску других осложнений. Синдром больного синуса (ССС) – это категория заболеваний, характеризующаяся дисфункцией синоатриального узла, которая препятствует правильному кардиостимуляции7,8. ССС может присутствовать при синусовой брадикардии, синусовых паузах, синусовой остановке, синоатриальном выходном блоке и чередующихся брадиаритмиях и тахиаритмиях9 и может привести к осложнениям, включая повышенный риск эмболического инсульта и внезапной смерти8,10. Люди с синдромом Бругада, сердечным расстройством, отмеченным фибрилляцией желудочков с повышенным риском внезапной сердечной смерти, подвергаются большему риску аритмогенных событий, если у них также есть коморбидная дисфункция SAN11,12. Синоатриальная дисфункция также может иметь физиологические последствия за пределами сердца. Например, было замечено, что SSS вызывает судороги у пациента из-за гипоперфузии головного мозга13.

Чтобы выявить синоатриальный дефицит кардиостимуляции, внутреннюю частоту сердечных сокращений необходимо определить путем измерения активности SAN без влияния вегетативной нервной системы или гуморальных факторов. Клинически это может быть аппроксимировано фармакологической вегетативной блокадой14,но этот же метод также может быть применен в моделях млекопитающих для изучения внутренней сердечной функции15,16. Хотя этот подход блокирует большую часть вносящих вклад нейронных влияний и позволяет проводить исследование сердца in vivo, он не полностью устраняет все внешние воздействия на сердце. Другим методом исследования, используемым для изучения внутренней сердечной функции на животных моделях, являются изолированные записи сердца с использованием перфузированных Лангендорфом сердец, которые обычно включают измерения с использованием электрограмм, кардиостимуляции или эпикардиальных многоэлектродных массивов17,18,19,20. Хотя этот метод более специфичн для сердечной функции, поскольку он включает в себя удаление сердца из организма, на измерения все еще могут влиять механоэлектрические механизмы авторегуляции, которые могут влиять на внутренние измерения частоты сердечных сокращений21. Изолированные записи сердца также могут по-прежнему подвергаться влиянию вегетативной регуляции через ICNS5,6,22,23. Кроме того, поддержание физиологически значимой температуры сердца, которая имеет решающее значение для измерения сердечной функции, может быть затруднено при изолированных сердечных приближенияхк 20. Более прямым методом изучения функции SAN является специальное выделение ткани SAN и измерение ее активности. Это может быть достигнуто с помощью полосок SAN (изолированная ткань SAN) или изолированных клеток кардиостимулятора SAN24,25. Оба требуют высокой степени технической подготовки, так как SAN является очень маленькой и четко определенной областью, и изоляция клеток представляет собой еще большую проблему, поскольку диссоциация может повредить общему здоровью клетки, если она не выполняется правильно. Кроме того, эти методы требуют экспертных электрофизиологических навыков для успешной записи из ткани или клеток с использованием отдельных регистрируя микроэлектроды.

В этом протоколе мы описываем метод записи SAN in vitro с использованием микроэлектродной матрицы (MEA) для получения внутренних измерений сердечного ритма. Преимущество этого подхода в том, что он делает высокоспецифичные электрофизиологические записи доступными для исследователей, не обладающих интенсивными электрофизиологическими навыками. MEAs ранее использовались для изучения функции кардиомиоцитов в первичных культурах кардиомиоцитов26,27,28,29,30,31,32,сердечных листах33,34,35,36,37,38,39и целых тканевых креплениях40, 41,42,43,44,45,46,47. Предыдущая работа также была выполнена для изучения полевых потенциалов в ткани SAN41,42. Здесь мы предоставляем методологию использования MEA для регистрации и анализа скорости стрельбы по SAN, присущей муринам. Мы также описываем, как этот метод может быть использован для проверки фармакологического воздействия лекарств на внутреннюю скорость срабатывания SAN, предоставив выборочный эксперимент, показывающий эффекты 4-аминопиридина (4-AP), блокатора каналов K+ с напряжением. Используя определенные анатомические ориентиры, мы можем точно записать SAN без необходимости выполнять обширные рассечения тканей или изоляцию клеток, необходимые в других методах. В то время как MEA может быть непомерно дорогим, записи обеспечивают очень специфические и надежные показатели кардиостимуляции, которые могут использоваться в широком спектре клинических и физиологических исследований.

Protocol

Все экспериментальные процедуры, описанные здесь, были проведены в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения (NIH), утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Южном методистском университете. <p class="j…

Representative Results

После того, как ткань акклиматизируется в блюде в течение 15 мин, регистрируется 10 одномиминные следы. Наш текущий протокол регистрирует активность более часа, но мы зафиксировали стабильные паттерны стрельбы в течение ≥4 ч в неопубликованных данных, не показанных здесь. Если экспериме?…

Discussion

Практика и освоение процесса рассечения SAN является обязательным, поскольку ткань хрупкая, а здоровая ткань необходима для успешной записи. Во время рассечения SAN правильная ориентация имеет важное значение для получения правильной области ткани. Однако первоначальная ориентация сер?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения, номера грантов R01NS100954 и R01NS099188.

Materials

4-Aminopyridine Sigma A78403-25G
22 gauge syringe needle Fisher Scientific 14-826-5A Used for dissection
23 gauge syringe needle Fisher Scientific 14-826-6C Used for dissection
60mm Petri Dishes Genesee Scientific 32-105G
500mL Pyrex Bottle Fisher Scientific 06-414-1C Used to store solutions
1000 mL Pyrex Bottle Fisher Scientific 06-414-1D Used to store solutions
Bone Forceps Fine Science Tools 16060-11
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C5080-500G
Carbogen (95% O2, 5% CO2)
Castroviejo Scissors, 4" Fine Science Tools 15024-10
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021-1KG
Data Acquisition PC CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080
Dissection Microscope Jenco
Dissecting Pins Fine Science Tools 26002-20
Dumont #2 Laminectomy Forceps Fine Science Tools 11223-20
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11295-51
 Extra Fine Graefe Forceps Fine Science Tools 11152-10
Glass Chamber Grainger 49WF30 Used for mouse euthanization
Harp Anchor Kit Warner Instruments  SHD-22CL/15 WI 64-0247
HCl Fisher Chemicals SA48-4 Used for pH balancing
Hemostat Fine Science Tools 13013-14
Heparin Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram NDC 63739-953-25
HEPES Sigma-Aldrich H3375-250G
Inverted Microscope Motic AE2000
Isoflurane Patterson Veterinary 07-893-1389
Lab Tape Fisher Scientific 15-950
Light for Dissection Microscope Dolan-Jenner MI150DG 660000391014
Magesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 208337-100G
MED64 Head Amplifier MED64 MED-A64HE1S
MED64 Main Amplifier MED64 MED-A64MD1A
MED64 Perfusion Cap MED64 MED-KCAP01
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit MED64 MED-KPK02
MED64 ThermoConnector MED64 MED-CP04
Mesh  Warner Instruments 640246
Microelectrode array (MEA) Alpha Med Scientific MED-R515A
Mobius Software WitWerx Inc. Specific software for the MED64
NaOH Fisher Chemicals S320-500 Used for pH balancing
Normal Saline Ultigiene NDC 50989-885-17
Paint Brush Fisher Scientific NC1751733
Parafilm Genesee Scientific PM-996
Peristaltic Pump Gilson F155009
Peristaltic Pump Tubing Fisher Scientific 14-171-298 1/8'' Interior Diameter
Polyethyleneimine Sigma P3143
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333-500G
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655-500G
Sodium Bicarbonate Sigma S6297
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-3
Sylgruard Elastomer Kit Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S6566
Sodium tetraborate Sigma S9640
Surgical Scissors Fine Science Tools 14074-09
Transfer Pipets (3mL graduated) Samco Scientific 225
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
  2. Josea, A. D., Collison, D. The normal range and determinants of the intrinsic heart rate in man. Cardiovascular Research. (4), 160-167 (1970).
  3. Peters, C. H., Sharpe, E. J., Proenza, C. Annual Review of Physiology Cardiac Pacemaker Activity and Aging. Annual Review of Physiology. 82, 21-43 (2019).
  4. Keith, A., Flack, M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. Journal of Anatomy and Physiology. 41 (3), 172-189 (1907).
  5. Wake, E., Brack, K. Characterization of the intrinsic cardiac nervous system. Autonomic Neuroscience. 199, (2016).
  6. Fedele, L., Brand, T. The intrinsic cardiac nervous system and its role in cardiac pacemaking and conduction. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 7 (4), 1-33 (2020).
  7. Mangrum, J. M., DiMarco, J. P. The evaluation and management of bradycardia. New England Journal of Medicine. 342 (10), 703-709 (2000).
  8. Adan, V., Crown, L. A. Diagnosis and treatment of Sick Sinus Syndrome. American Family Physician. 67 (8), 1725-1732 (2003).
  9. Semelka, M., Gera, J., Usman, S. Sick Sinus Syndrome: A Review. American Family Physician. 87 (10), 691-696 (2013).
  10. Zaragoza, M. V., et al. Exome sequencing identifies a novel LMNA splice-site mutation and multigenic heterozygosity of potential modifiers in a family with Sick Sinus Syndrome, dilated cardiomyopathy, and sudden cardiac death. PLoS ONE. 11 (5), 0155421 (2016).
  11. Brugada, J., Campuzano, O., Arbelo, E., Sarquella-Brugada, G., Brugada, R. Present status of Brugada Syndrome: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (9), 1046-1059 (2018).
  12. Rollin, A., et al. Prevalence, characteristics, and prognosis role of type 1 ST elevation in the peripheral ECG leads in patients with Brugada syndrome. Heart Rhythm. 10 (7), 1012-1018 (2013).
  13. Patel, N., Majeed, F., Sule, A. A. Seizure triggered by Sick Sinus Syndrome. BMJ case reports. 4, 2017222011 (2017).
  14. Knecht, S., et al. Impact of pharmacological autonomic blockade on complex fractionated atrial electrograms. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (7), 766-772 (2010).
  15. Saba, S., London, B., Ganz, L. Autonomic blockade unmasks maturational differences in rate-dependent atrioventricular nodal conduction and facilitation in the mouse. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 14 (2), 191-195 (2003).
  16. Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 51-56 (2002).
  17. Tse, G., Tse, V., Yeo, J. M., Sun, B. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts. PLoS ONE. 11 (2), 0148858 (2016).
  18. Tse, G., et al. Quantification of beat-to-beat variability of action potential durations in Langendorff-perfused mouse hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1578), 01578 (2018).
  19. Avula, U. M. R., et al. Heterogeneity of the action potential duration is required for sustained atrial fibrillation. JCI Insight. 5 (11), 128765 (2019).
  20. Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. (135), e57617 (2018).
  21. Quinn, A. T., Kohl, P. Cardiac mechano-electric coupling: Acute effects of mechanical stimulation on heart rate and rhythm. Physiological Reviews. 101 (1), 37-92 (2021).
  22. Ripplinger, C. M., Noujaim, S. F., Linz, D. The nervous heart. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 199-209 (2016).
  23. Pauza, D. H., Pauziene, N., Pakeltyte, G., Stropus, R. Comparative quantitative study of the intrinsic cardiac ganglia and neurons in the rat, guinea pig, dog and human as revealed by histochemical staining for acetylcholinesterase. Annals of Anatomy. 184, 125-136 (2002).
  24. Golovko, V., Gonotkov, M., Lebedeva, E. Effects of 4-aminopyridine on action potentials generation in mouse sinoauricular node strips. Physiological Reports. 3 (7), 12447 (2015).
  25. Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), e54555 (2016).
  26. Doi, M., Ogawa, E., Arai, T. Effect of a photosensitization reaction performed during the first 3 min after exposure of rat myocardial cells to talaporfin sodium in vitro. Lasers in Medical Science. 32 (8), 1873-1878 (2017).
  27. Takanari, H., et al. A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology. Journal of Cellular Physiology. 231 (10), 2249-2256 (2016).
  28. Nakashima, T., et al. Rapid electrical stimulation causes alterations in cardiac intercellular junction proteins of cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1324-1333 (2014).
  29. Suzuki, S., et al. Effects of aldosterone on Cx43 gap junction expression in neonatal rat cultured cardiomyocytes. Circulation Journal. 73 (8), (2009).
  30. Horiba, M., et al. T-type Ca2+ channel blockers prevent cardiac cell hypertrophy through an inhibition of calcineurin-NFAT3 activation as well as L-type Ca2+ channel blockers. Life Sciences. 82 (11-12), 554-560 (2008).
  31. Inoue, N., et al. Rapid electrical stimulation of contraction modulates gap junction protein in neonatal rat cultured cardiomyocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases and effects of angiotensin II receptor agonist. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 914-922 (2004).
  32. Aalders, J., et al. Effects of fibrillin mutations on the behavior of heart muscle cells in Marfan syndrome. Scientific Reports. 10 (16756), (2020).
  33. Matsuura, K., et al. Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets. Biomaterials. 32 (30), 7355-7362 (2011).
  34. Fujita, H., Shimizu, K., Nagamori, E. Application of a cell sheet-polymer film complex with temperature sensitivity for increased mechanical strength and cell alignment capability. Biotechnology and Bioengineering. 103 (2), 370-377 (2009).
  35. Baba, S., et al. Generation of cardiac and endothelial cells from neonatal mouse testis-derived multipotent germline stem cells. Stem Cells. 25 (6), 1375-1383 (2007).
  36. Baba, S., et al. Flk1+ cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model. Cardiovascular Research. 76 (1), 119-131 (2007).
  37. Shimizu, K., et al. Construction of multi-layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 803-809 (2007).
  38. Haraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. Electrical coupling of cardiomyocyte sheets occurs rapidly via functional gap junction formation. Biomaterials. 27 (27), 4765-4774 (2006).
  39. Miyagawa, S., et al. Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: Their integration with recipient myocardium. Transplantation. 80 (11), 1586-1595 (2005).
  40. Watts, M., et al. Decreased bioavailability of hydrogen sulfide links vascular endothelium and atrial remodeling in atrial fibrillation. Redox Biology. 38, 101817 (2021).
  41. Feng, Y., Cao, H., Zhang, Y. Prediction model of sinoatrial node field potential using high order partial least squares. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 1805-1811 (2015).
  42. Feng, Y., Cao, H., Wang, Y., Zhang, Y. Fuzzy linguistic prediction model for sinoatrial node field potential analysis in acute hyperglycemia environment. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 881-887 (2015).
  43. Suzuki, K., Matsumoto, A., Nishida, H., Reien, Y., Maruyama, H., Nakaya, H. Termination of aconitine-induced atrial fibrillation by the KACh-channel blocker tertiapin: underlying electrophysiological mechanism. Journal of Pharmacological Sciences. 125 (4), 406-414 (2014).
  44. Chang, S. -. L., et al. Heart failure enhances arrhythmogenesis in pulmonary veins. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 38 (10), 666-674 (2011).
  45. Wang, Y. -. J., et al. Time-dependent block of ultrarapid-delayed rectifier K+ currents by aconitine, a potent cardiotoxin, in heart-derived H9c2 myoblasts and in neonatal rat ventricular myocytes. Toxicological Sciences. 106 (2), 454-463 (2008).
  46. Lai, Y. -. J., Huang, E. Y. -. K., Yeh, H. -. I., Chen, Y. -. L., Lin, J. J. -. C., Lin, C. -. I. On the mechanisms of arrhythmias in the myocardium of mXinα-deficient murine left atrial-pulmonary veins. Life Sciences. 83 (7-8), 272-283 (2008).
  47. Gustafson-Wagner, E. A., et al. Loss of mXinα, an intercalated disk protein, results in cardiac hypertrophy and cardiomyopathy with conduction defects. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (5), 2680-2692 (2007).
  48. Clark, R. B., et al. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, 1757-1766 (2004).
  49. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
  50. Nikmaram, M. R., et al. Characterization of the effects of Ryanodine, TTX, E-4031 and 4-AP on the sinoatrial and atrioventricular nodes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 96 (1-3), 452-464 (2008).
  51. Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
  52. Masé, M., Glass, L., Ravelli, F. A model for mechano-electrical feedback effects on atrial flutter interval variability. Bulletin of Mathematical Biology. 70 (5), 1326-1347 (2008).
  53. Franz, M. R., Bode, F. Mechano-electrical feedback underlying arrhythmias: The atrial fibrillation case. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 82 (1-3), 163-174 (2003).
  54. Bucchi, A., Tognati, A., Milanesi, R., Baruscotti, M., DiFrancesco, D. Properties of ivabradine-induced block of HCN1 and HCN4 pacemaker channels. Journal of Physiology. 572 (2), 335-346 (2006).

Tags

Keywords: Microelectrode ArraySinoatrial NodeHeart RateCardiac PacemakingMouseDissectionTyrode’s SolutionHeart RemovalAtriumSinoatrial Node Location
check_url/62735?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kumar, P., Si, M., Paulhus, K., Glasscock, E. Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice. J. Vis. Exp. (173), e62735, doi:10.3791/62735 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image