Summary
Questo protocollo mira a descrivere una nuova metodologia per misurare la velocità di sparo cardiaca intrinseca utilizzando la registrazione di array di microelettrodi dell'intero tessuto del nodo senoatriale per identificare i difetti di pacemaking nei topi. Gli agenti farmacologici possono anche essere introdotti in questo metodo per studiare i loro effetti sul pacemaking intrinseco.
Abstract
Il nodo senoatriale (SAN), situato nell'atrio destro, contiene le cellule pacemaker del cuore e la disfunzione di questa regione può causare tachicardia o bradicardia. L'identificazione affidabile dei difetti cardiaci di pacemaking richiede la misurazione della frequenza cardiaca intrinseca prevenendo in gran parte l'influenza del sistema nervoso autonomo, che può mascherare i deficit di frequenza. I metodi tradizionali per analizzare la funzione intrinseca del pacemaker cardiaco includono il blocco autonomo indotto da farmaci per misurare le frequenze cardiache in vivo, le registrazioni cardiache isolate per misurare le frequenze cardiache intrinseche e le registrazioni a striscia sinoatriale o patch-clamp a singola cellula delle cellule pacemaker senoatriali per misurare le velocità di attivazione del potenziale d'azione spontanea. Tuttavia, queste tecniche più tradizionali possono essere tecnicamente impegnative e difficili da eseguire. Qui, presentiamo una nuova metodologia per misurare la velocità di sparo cardiaco intrinseco eseguendo registrazioni MEA (microelectrode array) di preparati di nodi senoatriali a montaggio intero da topi. I MEA sono composti da più microelettrodi disposti in uno schema a griglia per la registrazione in vitro di potenziali di campo extracellulare. Il metodo qui descritto ha il vantaggio combinato di essere relativamente più veloce, più semplice e più preciso rispetto agli approcci precedenti per la registrazione delle frequenze cardiache intrinseche, consentendo al contempo un facile interrogatorio farmacologico.
Introduction
Il cuore è un organo complesso governato da influenze sia cardiache intrinseche che estrinseche come quelle che hanno origine nel cervello. Il nodo senoatriale (SAN) è una regione definita nel cuore che ospita le cellule pacemaker (note anche come cellule senoatriali, o cellule SA) responsabili dell'inizio e della perpetuazione del battito cardiaco dei mammiferi1,2. La frequenza cardiaca intrinseca è la frequenza guidata dalle cellule pacemaker senza influenza da altre influenze cardiache o neuro-umorali, ma le misure tradizionali della frequenza cardiaca negli esseri umani e negli animali vivi, come gli elettrocardiogrammi, riflettono sia il pacemaker che le influenze neurali sul cuore. L'influenza neurale più notevole sulle cellule SA proviene dal sistema nervoso autonomo, che modula costantemente i modelli di attivazione per soddisfare i requisiti fisiologici del corpo3. A sostegno di questa idea, sia le proiezioni simpatiche che parasimpatiche possono essere trovate vicino alla SAN4. Il sistema nervoso cardiaco intrinseco (ICNS) è un'altra importante influenza neurale in cui il plesso ganglionato, in particolare negli atri destri, innerva e regola l'attività della SAN5,6.
Comprendere i deficit di pacemaking è clinicamente importante, poiché la disfunzione può essere alla base di molti disturbi cardiaci e contribuire al rischio di altre complicanze. La sindrome del seno malato (SSS) è una categoria di malattie caratterizzate da disfunzione del nodo senoatriale che impedisce il corretto pacemaking7,8. La SSS può presentarsi con bradicardia sinusale, pause sinusali, arresto sinusale, blocco di uscita senoatriale e bradiarritmie e tachiaritmiealternate 9 e può portare a complicazioni tra cui aumento del rischio di ictus embolico e morte improvvisa8,10. Quelli con sindrome di Brugada, un disturbo cardiaco caratterizzato da fibrillazione ventricolare con un aumentato rischio di morte cardiaca improvvisa, sono a maggior rischio di eventi aritmogeni se hanno anche una disfunzione SAN comorbidità11,12. La disfunzione senoatriale può anche avere conseguenze fisiologiche oltre il cuore. Ad esempio, È stato osservato che la SSS innesca convulsioni in un paziente a causa dell'ipoperfusione cerebrale13.
Per identificare i deficit di pacemaking senoatriale, le frequenze cardiache intrinseche devono essere determinate misurando l'attività della SAN senza l'influenza del sistema nervoso autonomo o di fattori umorali. Clinicamente, questo può essere approssimato dal blocco autonomo farmacologico14, ma questa stessa tecnica può essere applicata anche in modelli di mammiferi per studiare la funzione cardiaca intrinseca15,16. Mentre questo approccio blocca gran parte delle influenze neurali che contribuiscono e consente l'esame cardiaco in vivo, non elimina completamente tutte le influenze estrinseche sul cuore. Un'altra tecnica di ricerca utilizzata per studiare la funzione cardiaca intrinseca in modelli animali è la registrazione cardiaca isolata utilizzando cuori perfusi di Langendorff, che in genere comportano misurazioni utilizzando elettrogrammi, stimolazione o array multielettrodi epicardali17,18,19,20. Mentre questa tecnica è più specifica per la funzione cardiaca poiché comporta la rimozione del cuore dal corpo, le misurazioni possono ancora essere influenzate da meccanismi autoregolatori meccano-elettrici che potrebbero influenzare le misurazioni intrinseche della frequenza cardiaca21. Le registrazioni cardiache isolate possono anche essere ancora influenzate dalla regolazione autonomica attraverso l'ICNS5,6,22,23. Inoltre, il mantenimento di una temperatura fisiologicamente rilevante del cuore, che è fondamentale per le misurazioni della funzione cardiaca, può essere difficile negli approcci cardiaci isolati20. Un metodo più diretto per studiare la funzione SAN è quello di isolare specificamente il tessuto SAN e misurarne l'attività. Questo può essere realizzato attraverso strisce SAN (tessuto SAN isolato) o cellule pacemaker SAN isolate24,25. Entrambi richiedono un alto grado di formazione tecnica, poiché la SAN è una regione molto piccola e altamente definita, e l'isolamento cellulare rappresenta una sfida ancora maggiore in quanto la dissociazione può danneggiare la salute generale della cellula se non eseguita correttamente. Inoltre, queste tecniche richiedono competenze elettrofisiologiche esperte al fine di registrare con successo dal tessuto o dalle cellule utilizzando singoli microelettrodi di registrazione.
In questo protocollo, descriviamo una tecnica per registrare la SAN in vitro utilizzando un array di microelettrodi (MEA) per ottenere misurazioni intrinseche della frequenza cardiaca. Questo approccio ha il vantaggio di rendere le registrazioni elettrofisiologiche altamente specifiche accessibili ai ricercatori privi di competenze elettrofisiologiche intensive. I MEA sono stati precedentemente utilizzati per studiare la funzione dei cardiomiociti in colture primarie di cardiomiociti26,27, 28,29,30,31,32,fogli cardiaci33,34,35,36,37,38,39e supporti interi di tessuto40, 41,42,43,44,45,46,47. Il lavoro precedente è stato fatto anche per esaminare i potenziali di campo nel tessuto SAN41,42. Qui, forniamo una metodologia per utilizzare il MEA per registrare e analizzare i tassi di cottura intrinseci della SAN murina. Descriviamo anche come questa tecnica può essere utilizzata per testare gli effetti farmacologici dei farmaci sulle velocità di cottura intrinseche SAN fornendo un esperimento di esempio che mostra gli effetti della 4-aminopiridina (4-AP), un bloccante del canale K+ voltaggio-moggio. Utilizzando punti di riferimento anatomici definiti, possiamo registrare con precisione la SAN senza dover eseguire le estese dissezioni tissutali o gli isolamenti cellulari richiesti in altri metodi. Mentre il MEA può essere proibitivo in termini di costi, le registrazioni forniscono misure altamente specifiche e affidabili di pacemaking che possono essere utilizzate in una vasta gamma di applicazioni di ricerca clinica e fisiologica.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali qui descritte sono state eseguite in conformità con le linee guida del National Institutes of Health (NIH), come approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Southern Methodist University.
1. Rivestimento dell'array multielettrode (MEA) per la registrazione
- Crea un buffer di borato da 25 mM.
- Sciogliere 0,953 g di Na2B4O7·10 H2O in 80 ml di acqua distillata.
- Regolare il pH a 8,4 con HCl e quindi aggiungere acqua distillata a un volume finale di 100 ml.
- Fare una soluzione stock al 0,1% di polietileneimmina (PEI).
- Aggiungere 100 μL di PEI al 50% (p/v) a 4,9 mL di acqua distillata per produrre una soluzione di PEI all'1%.
- Diluire la soluzione di PEI all'1% allo 0,1% in tampone borato aggiungendo 1 mL della soluzione di PEI all'1% a 9 mL del tampone borato da 25 mM.
- Pipettare ~1 mL della soluzione di PEI allo 0,1% nella parabola MEA (microelectrode array) in modo che gli elettrodi siano completamente coperti (Figura 1A e 1B).
NOTA: I microelettrodi del MEA sono tipicamente composti da nanotubi di platino nero o carbonio e isolati con poliimmide (o acrilico); entrambi i materiali sono idrofobici. Rivestendo il MEA con un polimero cationico come il PEI, la superficie idrofobica DEL MEA viene resa più idrofila, consentendo ai campioni di tessuto di avere un migliore contatto con la superficie MEA (Figura 1A1). - Coprire la teglia MEA con film termoplastico per ridurre l'evaporazione e lasciare il MEA durante la notte a temperatura ambiente (Figura 1C).
- Aspirare la soluzione di PEI dalla parabola MEA utilizzando una pipetta, facendo attenzione a non toccare la griglia dell'elettrodo che può danneggiare gli elettrodi, quindi risciacquare ≥4 volte con acqua distillata (Figura 1D).
- Conservare il MEA rivestito in PEI sotto 1-2 ml di acqua ultrapura e sigillato con film termoplastico a 4 °C fino a quando necessario. In alternativa, conservare il MEA rivestito immergendolo in un becher riempito con acqua ultrapura (Figura 1E).
NOTA: il processo di rivestimento PEI deve essere eseguito solo una volta per il MEA prima del suo primo utilizzo e, dopo ogni sessione di registrazione, il MEA deve essere conservato immerso in acqua ultrapura.
2. Preparazione della soluzione completa di Tyrode per la dissezione dei tessuti
- Produrre 1.000 ml di soluzione completa di Tyrode per la dissezione; in primo luogo, aggiungere 8,1816 g di NaCl a 800 ml di acqua ultrapura.
- Aggiungere la seguente quantità di sostanze chimiche alla soluzione: 0,4025 g di KCl; 0,1633 g di KH2PO4; 1,1915 g di HEPES; 0,9999 g di glucosio; 0,0952 g di MgCl2; 0,2646 g di CaCl2·2H2O.
- Regolare il pH a 7,4 con NaOH e quindi aggiungere acqua ultrapura fino a quando il volume totale è di 1.000 ml.
NOTA: La composizione finale della soluzione di Tyrode completa sarà la seguente (in mM): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 KH2PO4,5 HEPES, 5,55 glucosio, 1 MgCl2,1,8 CaCl2.
3. Preparazione della soluzione di Tyrode ossigenata per la registrazione
- Produrre 500 ml di soluzione di Tyrode; aggiungere 4.003 g di NaCl a 400 ml di acqua ultrapura.
- Aggiungere le seguenti quantità di sostanze chimiche alla soluzione: 0,651 g di NaHCO3; 0,042 g di NaH2PO4; 0,132 g di CaCl2·2H2O; 0,149 g di KCl; 0,0476 g di MgCl2; 0,999 g di glucosio.
- Regolare il pH a 7,4 con HCl e quindi aggiungere acqua ultrapura fino a quando il volume totale è di 500 ml.
- Ossigenare la soluzione con carbogeno per almeno 30 minuti a temperatura ambiente prima di iniziare la registrazione.
NOTA: La composizione finale della soluzione di Tyrode sarà la seguente (in mM): 137 NaCl, 15,5 NaHCO3, 0,7 NaH2PO4, 1,8 CaCl2, 4 KCl, 1 MgCl2, 11,1 glucosio. Questa soluzione di Tyrode ha una composizione leggermente diversa dalla soluzione di Tyrode completa utilizzata per la dissezione.
4. Preparazione della soluzione di 4-aminopiridina (4-AP) per la modulazione farmacologica
- Realizzare una soluzione di lavoro da 1 mM di 4-AP; aggiungere 18,82 mg di 4-AP a 200 ml di soluzione di Tyrode dal passaggio 3.
- Ossigenare la soluzione 4-AP per almeno 30 minuti prima dell'esperimento.
5. Preparare la capsula di Petri per la dissezione
- Mescolare i componenti in elastomero siliconico in un rapporto 10:1 (in peso) tra la base e l'agente polimerizzante.
- Versare ~ 15 ml di miscela di elastomero siliconico in una capsula di Petri di 60 mm di diametro.
- Lasciare polimerizzare l'elastomero a temperatura ambiente per 48 ore prima dell'uso.
NOTA: La capsula di Petri siliconata può essere riutilizzata per future dissezioni.
6. Dissezione del nodo senoatriale (SAN)
- Preparare la soluzione completa di Tyrode eparinizzata per la dissezione SAN.
- Aggiungere 400 μL di eparina (1.000 USP/mL) a 40 mL di soluzione di Complete Tyrode e riscaldare a bagnomaria a 37 °C.
- Iniettare il topo per via intraperitoneale con 200-300 μL di eparina (1000 USP/mL) e lasciare riposare l'animale per 10 minuti.
- Eutanasia del topo eparinato per sovradosaggio di isoflurano.
- Posizionare il mouse in una piccola camera di vetro che contiene vapori di isoflurano generati aggiungendo 200-300 μL di isoflurano liquido a una carta da filtro all'interno di un tubo di plastica perforato.
NOTA: Poiché l'isoflurano può causare irritazione cutanea e può anche essere assorbito attraverso la pelle, il liquido non deve contattare direttamente il mouse. Pertanto, la salvietta imbevuta di isoflurano viene posta in un tubo perforato per la somministrazione. - Verificare la morte per cessazione del movimento e dello sforzo respiratorio e per l'assenza di un riflesso di pizzicamento della dita. La morte di solito richiede circa 1-2 minuti dopo il posizionamento nella camera.
NOTA: La morte è di solito accompagnata da minzione.
- Posizionare il mouse in una piccola camera di vetro che contiene vapori di isoflurano generati aggiungendo 200-300 μL di isoflurano liquido a una carta da filtro all'interno di un tubo di plastica perforato.
- Posizionare il mouse in posizione supina su una scheda di dissezione con le zampe distese e fissare le zampe alla tavola utilizzando aghi per siringhe lunghe 1 pollice e calibro 23. Quindi rimuovere la pelliccia in prossimità del fondo della gabbia toracica usando forbici chirurgiche e tagliando la pelliccia alle radici.
NOTA: per un comitato di dissezione, è possibile utilizzare coperchi di raffreddamento in polistirolo. - Mentre si tiene la pelle con un mostato, utilizzare le forbici chirurgiche per praticare un'incisione trasversale nella pelle appena sotto il fondo della gabbia toracica da circa l'arco costale sinistro all'arco costale destro (Figura 3A).
- Tagliare il peritoneo con le forbici chirurgiche e separare accuratamente il fegato dal diaframma, facendo attenzione a non graffiare il fegato, che causerà un eccessivo sanguinamento (Figura 3B). Incidere il diaframma lungo il torace per esporre la cavità toracica (Figura 3C-D).
- Utilizzando le forbici chirurgiche, tagliare le pareti laterali della gabbia toracica dai bordi degli archi costali fino alle clavicola per esporre il cuore, facendo attenzione a evitare di danneggiare il cuore (Figura 3D). Quindi utilizzare un ago per siringa calibro 23 per fissare la gabbia toracica sopra la spalla, tenendola in posizione e fuori dal campo chirurgico.
- Utilizzare una pipetta di trasferimento per gocciolare la soluzione di Complete Tyrode eparinata a goccia (37 °C) sul cuore per mantenerlo umido.
NOTA: Non lasciare asciugare il cuore. - Rimuovere i polmoni tenendoli con una pinza Graefe extra fine e recidendo la trachea con forbici chirurgiche (Figura 3E).
- Tenere l'apice del cuore con una pinza Graefe extra fine e rimuoverla tagliando l'aorta e le vene cavae con forbici chirurgiche. Trasferire il cuore in una capsula di Petri contenente elastomero siliconico indurito (Figura 4A) e utilizzare una pipetta di trasferimento per bagnare il cuore con 2-3 mL di soluzione di Tyrode completa eparinata calda (37 °C).
NOTA: Fare attenzione a non danneggiare la delicata parete posteriore degli atri destri, che contiene la SAN, e le vene atriali destre collegate. Bagnare il cuore con la soluzione di Complete Tyrode impedisce al cuore di asciugarsi, ma non immergere completamente il cuore in soluzione in quanto comprometterà la visibilità durante la dissezione. - Orienta il cuore con l'atrio destro alla destra dello sperimentatore e l'atrio sinistro alla sinistra dello sperimentatore.
NOTA: La dissezione del tessuto SAN deve essere eseguita rapidamente al fine di prevenire lesioni correlate all'ischemia. - Attaccare l'apice del cuore al piatto con un perno di dissezione. Quindi, mentre si tiene la vena cava inferiore con dumont #2 pinna per laminectomia, inserire un ago siringa da 22 G attraverso la vena cava inferiore e superiore per individuare la loro posizione nell'atrio destro, che identifica anche la posizione approssimativa della SAN (situata nella zona di tessuto tra la vena cava inferiore e superiore (Figura 4B).
- Usando piccoli perni di dissezione, appuntare le appendici atriali sinistra e destra al piatto.
- Mentre tieni l'appendice atriale sinistra con Dumont #2 pinci per laminectomia, metti un perno di dissezione attraverso l'appendice atriale sinistra per tenerlo in posizione.
- Mentre tieni l'appendice atriale destra con Dumont #55 pina di forza, metti una spilla di dissezione attraverso l'appendice atriale destra per tenerla in posizione.
NOTA: Lo stesso tipo di pinp può essere utilizzato per contenere le appendici atriali sinistra e destra, se lo si desidera.
- Rimuovere l'ago della siringa che attraversa le venae cavae.
- Per rilasciare il sangue dal cuore, utilizzare le forbici Castroviejo per rimuovere l'apice del cuore (cioè la metà inferiore) praticando un'incisione trasversale attraverso i ventricoli (Figura 4C). Quindi, lavare il cuore aggiungendo la soluzione di Complete Tyrode eparinata calda (37 °C) con una pipetta di trasferimento.
- Utilizzare le forbici Castroviejo per tagliare lungo il setto atrioventricolare mantenendo l'incisione più vicina al ventricolo rispetto agli atri. Continuare a tagliare lungo il setto atrioventricolare fino a quando gli atri sono separati dai ventricoli.
- Tagliare lungo il setto interatriale per rimuovere l'atrio sinistro.
- Posizionare i perni di dissezione nella periferia dell'atrio destro per renderlo piatto (Figura 4D). Rimuovere il grasso, i vasi o il tessuto rimanenti dall'atrio usando le forbici Castroviejo.
- Individuare la SAN nell'atrio destro, che in questo orientamento è approssimativamente delimitato dalla vena cava superiore (in alto), dalla vena cava inferiore (in basso) e dalla cristae terminalis (a sinistra) (Figura 4D).
NOTA: La crista terminalis appare come una cresta muscolare scura tra l'appendice atriale destra e la SAN. Spesso l'arteria SAN può anche essere vista scorrere attraverso la SAN (Figura 4D).
7. Preparazione del sistema MEA per la registrazione
- Aggiungere la soluzione di Tyrode (dalla fase 3) alla bottiglia della soluzione di ingresso (Figura 5C) e ossigenarla attivando il flusso di gas carbogeno (Figura 5A) al sistema.
NOTA: La soluzione di Tyrode utilizzata per la registrazione è leggermente diversa nella composizione dalla soluzione di Tyrode completa utilizzata per la dissezione. - Verificare il flusso di carbogeno osservando le bolle nel pallone conico, che viene utilizzato per umidificare il gas (Figura 5B), e la bottiglia della soluzione in ingresso (Figura 5C) .
- Inserire il tubo di afflusso della pompa peristaltica (Figura 5D) nella soluzione di registrazione di Tyrode (Figura 5C). Quindi, inserire il tubo di deflusso della pompa peristaltica nel flacone di raccolta (Figura 5I).
- Impostare la pompa peristaltica a 25 giri/min, che dà una portata di 2 ml/min e avviare la pompa. Controllare il sistema per eventuali perdite o tracimazioni del buffer.
- Impostare il regolatore di temperatura a 37 °C, la temperatura fisiologica dei topi (Figura 5E).
8. Posizionamento del tessuto cardiaco sulla griglia MEA
- Trasferire il tessuto SAN sezionato con l'aiuto di un pennello (Figura 6A) dalla piastra di Petri sezionante sulla griglia MEA (Figura 1A1).
- Mentre guardi al microscopio invertito, posiziona delicatamente il tessuto con un pennello morbido in modo che la regione SAN si sovrapporrà alla griglia dell'elettrodo.
- Ricosizionare il tessuto secondo necessità per assicurarsi che si trovi piatto sulla griglia dell'elettrodo, facendo un buon contatto con gli elettrodi.
NOTA: per spostare il tessuto è necessario un pennello morbido per evitare di danneggiare la griglia dell'elettrodo.
- Una volta che il tessuto è posizionato correttamente, utilizzare una pinica ossea (o qualsiasi pinca curva) per posizionare la rete sopra il tessuto (Figura 6A). Quindi utilizzare la pinca ossea per posizionare l'ancora dell'arpa (Figura 6A) sulla rete per tenere tutto in posizione (Figura 6B).
- Scatta una foto del posizionamento del tessuto sul MEA in modo che l'attività dei singoli elettrodi possa essere correlata con la loro posizione anatomica durante la registrazione. Questo può essere fatto tenendo uno smartphone fino all'obiettivo del microscopio invertito o utilizzando una fotocamera del microscopio collegata.
NOTA: se l'orientamento del MEA non viene modificato dopo aver scattato la foto, l'elettrodo in alto a sinistra apparirà come primo canale (Ch1) durante la registrazione. - Posizionare la parabola MEA sulla piastra del connettore (Figura 5F e 6C) e posizionare con attenzione il tappo di perfusione (Figura 6C) sulla piastra MEA senza disturbare l'ancora della fetta di arpa. Il cappuccio di perfusione può essere ulteriormente fissato utilizzando un pezzo di nastro da laboratorio (Figura 6C).
NOTA: Oltre ad avere tubi di afflusso e deflusso della soluzione regolabili, il tappo ha anche una porta per l'erogazione del gas (Figura 6C). Inoltre, l'anello dell'elettrodo di riferimento attraversa il cappuccio (Figura 6C). - Lasciare che il tessuto si riprenda dalla manipolazione e si acclimati alla camera per 15-20 minuti prima della registrazione.
9. Impostazione del protocollo di acquisizione dati per la registrazione
NOTA: i seguenti passaggi descrivono l'apertura del protocollo software per la registrazione spontanea del battito e la definizione delle condizioni di registrazione. Le specifiche di questi passaggi possono variare a seconda del software specifico utilizzato, ma lo schema generale dovrebbe rimanere lo stesso.
- Accendere l'amplificatore (Figura 5G) e impostare un flusso di lavoro per la registrazione nel software sul computer (Figura 5H).
- Apri il software e fai clic su Workflow.
- Seleziona Apri nuova cartella.
- Aprire la cartella Da modelli.
- Selezionare 64MD1-1920X1080 (a seconda della risoluzione del desktop).
- Aprire la cartella QT.
- Aprire la cartella Registrazione spontanea.
- Selezionare Beat_recording.moflo e aprirlo (Figura 7A).
- Impostare i parametri di registrazione per specificare il numero di tracce, la durata della traccia, l'intervallo di traccia, la tensione di ingresso, la frequenza di campionamento, ecc., In base alle condizioni di registrazione desiderate (Figura 7B).
NOTA: per l'acquisizione dei dati in frequenza di battita e interspike, in genere utilizzare una tensione di intervallo di ingresso di 2,9 mV, un filtro passa alto a 1 Hz, un filtro passa-basso a 1000 Hz e una frequenza di campionamento di 20 kHz. - Per contrassegnare diverse fasi o condizioni dell'esperimento, ad esempio prima e dopo la somministrazione del farmaco, fare clic sulla scheda Annotazioni per aggiungere le notazioni desiderate (Figura 7C).
- Per specificare la destinazione del file per i dati da raccogliere, selezionare la casella Abilita archiviazione e immettere il nome file desiderato nella casella Modificatore nome file.
10. Esecuzione della registrazione e raccolta dei dati
- Fare clic sul pulsante Registra e riproduci nella barra dei menu più in alto del software di acquisizione per avviare la registrazione. Acquisire dati per 10 tracce della durata di 1 min con intervalli di 2 min tra le tracce.
- Da queste tracce iniziali, verificare che le forme d'onda registrate siano coerenti con una preparazione tissutale sana e di alta qualità confermando che la maggior parte dei canali di registrazione presenta ampiezze di segnale di ≥ 0,5 mV e intervalli inter-spike identici (Figura 8).
NOTA: Una prima valutazione dell'attività e delle forme d'onda dei singoli microelettrodi corrispondenti alle loro posizioni anatomiche può essere eseguita facendo riferimento all'immagine acquisita dopo aver posizionato il tessuto sul MEA. - Per misurare gli effetti dei farmaci sul tessuto, mettere in pausa la registrazione dopo aver acquisito i dati iniziali della linea di base facendo clic sul pulsante di pausa nella barra dei menu più in alto.
NOTA: La fase di risposta al farmaco dell'esperimento può essere annotata nella registrazione facendo clic sulla scheda Annotazioni e aggiungendo la notazione desiderata come descritto sopra (Figura 7C). - Mettere in pausa la pompa e commutare il tubo di afflusso della pompa dalla normale soluzione di registrazione alla soluzione di Tyrode contenente il farmaco desiderato di scelta.
NOTA: Nell'esperimento di esempio, la soluzione di Tyrode è stata utilizzata con 1 mM di 4-aminopiridina (4-AP). - Riavviare la pompa e annullare la pausa della registrazione per iniziare nuovamente a raccogliere i dati.
- Una volta che la soluzione di Tyrode infusa con il farmaco ha raggiunto il tessuto, registrare 10 tracce nello stesso modo in cui è stato fatto in precedenza per le registrazioni di base.
NOTA: Le tracce impiegheranno del tempo per stabilizzarsi mentre il farmaco si infonde nella camera di registrazione. Il meccanismo d'azione del farmaco può anche influenzare la stabilità della registrazione. Per i farmaci che hanno meccanismi d'azione reversibili, dovrebbe anche essere registrato un periodo di washout per confermare il ripristino dell'attività ai livelli basali, che è un indicatore di tessuto sano. - Fare clic su Stop per concludere le registrazioni.
- Scatta una foto finale del posizionamento del tessuto sul MEA al microscopio nel caso in cui il tessuto si sia spostato dopo la procedura di configurazione della registrazione iniziale.
11. Pulizia della configurazione dopo la registrazione
- Pulire il MEA.
- Al termine della registrazione, rimuovere delicatamente la soluzione di registrazione dalla parabola MEA utilizzando una micropipetta da 1 mL.
NOTA: Fare attenzione a non contattare gli elettrodi MEA che possono danneggiarli. - Rimuovere la rete e l'ancora dell'arpa con una pinica ossea (o qualsiasi pinca curva). Quindi utilizzare un pennello per rimuovere il tessuto dalla superficie MEA facendo sempre attenzione a non toccare i singoli microelettrodi.
- Usando un flacone di lavaggio, sciacquare delicatamente il piatto MEA con acqua ultrapura circa 3 o 4 volte.
- Conservare il MEA pulito immerso in acqua ultrapura a 4 °C.
- Al termine della registrazione, rimuovere delicatamente la soluzione di registrazione dalla parabola MEA utilizzando una micropipetta da 1 mL.
- Risciacquare il tubo del sistema facendo scorrere acqua ultrapura per almeno 5 minuti utilizzando l'impostazione della velocità massima sulla pompa peristaltica.
NOTA: Per prevenire la crescita di funghi, non deve essere lasciata acqua o soluzione tampone all'interno del tubo dopo la pulizia.
12. Analisi delle registrazioni MEA per misurare la frequenza del battito SAN
- Aprire il file di dati registrati salvato nel modello "Beat_frequency_analysis" del software di analisi (Figura 9) .
- Fare clic sul pulsante Riproduci e consentire l'esecuzione dell'intera registrazione per visualizzare il set di dati e assegnare i parametri di analisi appropriati.
- Selezionare la finestra di binning per il formato di visualizzazione desiderato dei dati, indipendentemente dal fatto che vengano visualizzati come media per traccia o media per volta (Figura 10A).
- Selezionare i canali da includere nell'analisi e impostare i valori di soglia minimi di ampiezza o ampiezza desiderati per l'identificazione automatica dei picchi di forma d'onda (Figura 10B).
NOTA: in questo passaggio è possibile selezionare un singolo canale, una combinazione di canali o tutti i 64 canali per l'analisi (Figura 9). Se i valori di soglia selezionati sono troppo vicini ai valori massimi e minimi della forma d'onda, alcuni picchi di forma d'onda potrebbero non essere identificati dal software di analisi. - Impostare la quantità di tempo pre-spike e post-spike da includere nell'analisi.
NOTA: le impostazioni di 50 ms pre-spike e 100 ms post-spike di solito funzionano bene (Figura 10B).
- Dopo aver impostato le condizioni di analisi, fare nuovamente clic sul pulsante Riproduci per eseguire nuovamente il set di dati e verificare che i parametri di analisi siano appropriati per l'estrazione del picco.
- Per l'analisi, identificare le tre tracce consecutive più stabili che mostrano un tasso di battito stabile per ogni traccia attraverso la maggior parte dei canali sia durante il periodo basale dell'esperimento che altre tre tracce stabili consecutive durante il periodo di esposizione al farmaco (Figura 10A).
- Specificare le tracce di inizio e di fine per l'analisi e immettere la durata temporale di ciascuna traccia da analizzare (Figura 9).
- Prima di iniziare l'analisi, selezionare le caselle di attivazione sia per Salva battuta al minuto che per Salva intervallo interspike (Figura 10B).
- Immettere il nome file desiderato nella casella Modificatore nome file (Figura 10B). I dati analizzati per la frequenza di battitura e l'intervallo interspike verranno salvati sotto forma di formato ASCII (testo).
NOTA: per analizzare condizioni diverse (come la risposta al basale e al farmaco), l'analisi deve essere eseguita separatamente per ciascuna condizione. - Fare clic sul pulsante Riproduci e registra sulla barra delle schede superiore per avviare l'analisi.
- Per esportare i dati per altre applicazioni, selezionare le caselle Salva battuta al minuto e Salva intervallo interspike (Figura 10B). Immettere il nome file desiderato nella casella Modificatore nome file (Figura 10B) e fare clic su Salva per salvare i dati analizzati in formato testo ASCII nella cartella selezionata.
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Representative Results
Dopo aver permesso al tessuto di acclimatarsi nel piatto per 15 minuti, vengono registrate 10 tracce di un minuto. Il nostro protocollo attuale registra l'attività per oltre un'ora, ma abbiamo registrato modelli di sparo stabili per ≥4 ore in dati non pubblicati non mostrati qui. Se una preparazione sperimentale è buona per la raccolta dei dati, ogni canale di registrazione dovrebbe presentare forme d'onda ricorrenti coerenti e uniformemente distanziate (cioè picchi) di forma uniforme per un dato canale (Figura 11D). Queste forme d'onda corrispondono ai singoli battiti cardiaci che riflettono l'attività intrinseca di pacemaking cardiaco. Gli intervalli interspike dovrebbero essere gli stessi per ogni canale anche se potrebbero non essere perfettamente allineati tra i canali a causa di piccole differenze nella loro posizione rispetto al sito di iniziazione della depolarizzazione (Figura 8). Sebbene la forma delle forme d'onda per un dato canale debba essere coerente, la forma delle forme d'onda varierà tra i canali a seconda della posizione dell'elettrodo nel tessuto (Figura 8). Il grado di contatto del tessuto con l'elettrodo può anche influenzare le caratteristiche della forma d'onda, come l'ampiezza. Tuttavia, l'ampiezza massima deve essere di almeno 0,5 mV per la maggior parte dei canali se la preparazione è soddisfacente. Tra le 10 tracce registrate, i tre canali consecutivi che meglio soddisfano i criteri di qualità sopra descritti sono stati scelti per ulteriori analisi descritte di seguito. La Figura 10A mostra un campione di frequenza di battito stabile (pannello superiore) e intervallo di interspike (pannello centrale) per tre tracce consecutive. Il tessuto che non soddisfa questi criteri non dovrebbe essere registrato in quanto è probabile che vi sia un danno tissutale che ostacolerà la raccolta accurata dei dati. La Figura 11 mostra esempi di modelli di picchi estratti male che sono assenti (A), influenzati dal rumore (B) o instabili (C).
I dati campione visualizzati nelle figure sono stati raccolti da un topo maschio wildtype Black Swiss (Tac:N:NIHS-BC) di 45 giorni. La procedura di analisi descritta nella Figura 9 e nella Figura 10 è stata utilizzata per estrarre la velocità di sparo intrinseca e visualizzare i picchi di base che possono essere visti nella Figura 12A. La velocità di sparo è la velocità media su 60.000 ms da ciascuna delle tre tracce, ma il modello di picco nella Figura 12A mostra 5 s di picco rappresentativo da una singola traccia. Utilizzando un software di analisi automatizzato, la velocità di sparo intrinseca (cioè la frequenza di battita) delle tre tracce selezionate su tutti i 64 canali è risultata essere di circa 320 bpm nei nostri dati di campionamento (Figura 12A). In generale, osserviamo un intervallo di valori di circa 290-340 bpm nelle nostre registrazioni per topi wildtype. La velocità di cottura può anche essere utilizzata come metodo secondario per valutare la qualità della preparazione. I tassi che sono instabili o significativamente inferiori a 300 bpm hanno meno probabilità di essere buoni per l'analisi. Questi valori sono paragonabili sia alle registrazioni cardiache isolate che a quella a singola cellula che riportano frequenze cardiache intrinseche nell'intervallo di circa 300-500 bpm25,48,49. Pertanto, la tecnica di registrazione MEA è in grado di generare misure affidabili e accurate della frequenza cardiaca intrinseca.
Un vantaggio del sistema MEA è che consente una facile applicazione di agenti farmacologici per testare gli effetti farmacologici. Nell'esperimento di esempio, abbiamo testato gli effetti di 1 mM 4-AP sulla velocità di sparo, che dovrebbe rallentare l'attività SAN poiché il blocco dei canali K+ voltaggio-dipendenti è noto per compromettere la ripolarizzazione del potenziale d'azione nelle celle SA24,50. La figura 12B mostra che l'introduzione del 4-AP ha aumentato gli intervalli interspike come previsto. Questo intervallo di picco prolungato corrispondeva a una diminuzione della frequenza di battita da 320 bpm a 210 bpm. Questa velocità di sparo dopo somministrazione di 4-AP è simile a uno studio precedente che ha esaminato gli effetti del 4-AP sulla velocità di sparo SAN utilizzando registrazioni a singolo elettrodo di tessuto isolato. Tale studio ha misurato una velocità di sparo di circa 190 bpm in presenza di 4-AP50. Pertanto, il sistema MEA può essere utilizzato come strumento conveniente e prezioso per testare gli effetti farmacologici degli interventi farmacologici sulla funzione cardiaca intrinseca.
Figura 1: Rivestimento dell'array di microelettrodi (MEA) prima dell'uso. (A) Il MEA è composto da un piccolo piatto di plastica con una griglia di 64 microelettrodi al centro (come mostrato nel pannello A1) e quattro elettrodi di riferimento attorno alla periferia in un motivo quadrato. B)Aggiunta di 1 mL di tampone PEI per rivestire l'MEA. (C) Coprire il piatto MEA con film termoplastico per l'incubazione durante la notte a temperatura ambiente. (D) Aspirare il tampone PEI dalla piatta MEA, seguito da almeno quattro risciacqui con acqua distillata. (E) Conservare la sonda MEA rivestita sotto acqua ultrapura per evitare che si secchi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Strumenti utilizzati per la dissezione del nodo senoatriale (SAN). Durante la parte di dissezione del protocollo vengono utilizzati i seguenti strumenti: (i) capsula di Petri con elastomero siliconico e piccoli perni di dissezione; ii) pipetta di trasferimento in plastica; iii) forbice Castroviejo, taglia 4"; (iv) Forbici chirurgiche (dritte) per le procedure di taglio; v) Dumont #2 Pinciodo di laminectomia; vi) Dumont #55 pinsa; (vii) Pinsa Graefe extra fine; (viii) Emostatici (curvi). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rimozione del cuore. (A) Incisione trasversale nella pelle appena sotto il fondo della gabbia toracica da circa l'arco costale sinistro all'arco costale destro. (B) Incisione peritoneale. (C,D) Incisione del diaframma lungo il torace per esporre la cavità toracica. (E) Rimozione del cuore dopo l'escissione dei polmoni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Dissezione del nodo senoatriale (SAN). (A) L'aspetto del cuore nella capsula di Petri dopo la rimozione dal corpo. (B) Inserimento dell'ago della siringa attraverso la vena cava inferiore (IVC) e la vena cava superiore (SVC) dell'atrio destro. Viene mostrato anche il perno all'apice del cuore. (C)Escissione dell'apice (cioè la metà inferiore) del cuore per rilasciare il sangue. Vengono mostrati anche i pin nelle appendici atriali. (D) L'aspetto finale della regione SAN dell'atrio destro alla fine della dissezione. L'area in scatola corrisponde alla posizione approssimativa della SAN. L'arteria SAN può anche essere vista debolmente scorrere attraverso la SAN in un orientamento verticale. Le abbreviazioni: AO, aorta; CT, crista terminalis; IVC, vena cava inferiore; LA, atrio sinistro; RA, atrio destro; RAA, appendice atriale destra; SAN, nodo senoatriale; SVC, vena cava superiore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Schema della configurazione del sistema di registrazione MEA (Microelectrode Array). I seguenti componenti compongono il sistema:(A)bombola di gas (carbogeno: 95% O2/ 5% CO2); B) pallone conico con acqua distillata per umidificare il gas; (C) registrazione del flacone di soluzione di Tyrode che fornisce l'afflusso alla piatta MEA; (D) pompa peristaltica per pompare la soluzione da e verso la parabola MEA; (E) regolatore di temperatura; (F) piastra connettore MEA che riceve segnali dalla parabola MEA; (G) amplificatore; (H) computer; (I) bottiglia di raccolta per la soluzione di rifiuti usati dal piatto MEA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Posizionamento del tessuto nodale SA su MEA. (A) Strumenti utilizzati per il posizionamento del tessuto: (i) maglia con griglia di 1,5 mm, (ii) ancora per arpa, (iii) pinca ossea, (iv) pennello. (B) Posizionamento del tessuto sul MEA. La casella gialla indica l'area approssimativa della regione del nodo senoatriale sotto la mesh e l'ancoraggio nella parabola MEA. (C) Disposizione della parabola MEA con tessuto chiuso sulla piastra del connettore per la registrazione del potenziale di campo: i) ingresso per la soluzione di registrazione; ii) ingresso per gas (carbogeno); iii) uscita per la soluzione; iv) piastra del connettore microelettrodo; v) cappuccio di perfusione; vi) anello dell'elettrodo di riferimento fissato al cappuccio; vii) nastro adesivo per contenere il cappuccio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Impostazione del protocollo di acquisizione dati nel software. (A) Esempio di modello di registrazione che mostra la disposizione di tutti i 64 canali. (B) Un esempio delle proprietà di input del software per le condizioni di registrazione. (C) Un esempio del menu Annotazioni che mostra come aggiungere una nuova fase durante la registrazione, ad esempio per misurare gli effetti dei farmaci. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Diverse regioni dei tessuti che mostrano diverse forme d'onda di attività. Cattura di schermata di esempio che mostra forme d'onda con forme e ampiezze diverse in canali diversi. Tuttavia, tutti i canali mostrano intervalli interspike e frequenze di sparo identici. I canali all'interno della scatola rossa corrispondono approssimativamente agli elettrodi posti all'interno della regione SAN del tessuto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Modello di analisi della frequenza di battiti. Modello di esempio che mostra la disposizione di tutti i 64 canali nel modello di analisi della frequenza di battiti. L'inserto Riproduci file di dati grezzi mostra un esempio delle proprietà di input della finestra di analisi. In questo esempio, le tracce da 5 a 7 sono state selezionate per l'analisi e la durata dell'analisi per ogni traccia è stata designata come 60.000 ms. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Definizione dei parametri di analisi per l'estrazione dei picchi. (A) Risultati del modello di analisi rappresentativa per 3 tracce selezionate di un singolo canale. Il pannello superiore visualizza la frequenza di battimento per le tre tracce selezionate (tre raggruppamenti definiti di punti dati) e ogni punto rappresenta una media di 10 s per la frequenza di battitura durante la traccia specifica. Il pannello centrale visualizza l'intervallo inter-spike per le tre tracce selezionate (tre raggruppamenti definiti di punti dati) e ogni punto dati rappresenta l'intervallo inter-spike tra due picchi consecutivi. Il pannello in basso a sinistra mostra picchi estratti rappresentativi selezionati per gli ultimi 5 s della terza traccia, mentre il pannello in basso a destra mostra una forma d'onda estratta derivata dal gruppo 5-s di punte estratte nel pannello in basso a sinistra. (B) Vista espansa della finestra di analisi che mostra i parametri utilizzati nell'analisi della frequenza di battitura per le 3 tracce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11: Figura rappresentativa che mostra un'estrazione di dati buona rispetto a una cattiva estrazione per un particolare canale. Cattiva estrazione dei dati: (A) Assenza di picchi estratti; (B) Picchi estratti con segnali acustici; (C) Punte estratte instabili. (D) Buoni dati che mostrano picchi estratti stabili senza segnali di rumore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 12: Registrazioni al basale e dopo somministrazione di 1mM 4-aminopiridina (4-AP). (A) La registrazione al basale da un singolo microelettrodo mostra forme d'onda con una frequenza di accensione stabile di 320 bpm in un cuore WT. (B) Dopo la somministrazione di 4-AP, la frequenza di sparo rallenta ad una velocità stabile di 210 bpm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Praticare e padroneggiare il processo di dissezione SAN è imperativo poiché il tessuto è fragile e il tessuto sano è necessario per una registrazione di successo. Durante la dissezione SAN, il corretto orientamento è essenziale per ottenere la corretta regione del tessuto. Tuttavia, l'orientamento originale del cuore può essere facilmente perso durante il processo di dissezione, il che complica questo sforzo. Pertanto, per garantire il corretto orientamento sinistra-destra, gli atri devono essere ispezionati visivamente. Tipicamente, l'atrio destro tende ad essere più trasparente, mentre l'atrio sinistro è solitamente più scuro e più rosso di colore25,48. Inoltre, è essenziale non allungare il tessuto SAN mentre si lavora con esso o lo si monta sulla griglia dell'elettrodo, poiché il tessuto è facilmente danneggiato meccanicamente51. Un consiglio per verificare il tessuto SAN sano e correttamente sezionato è quello di esaminarlo nella soluzione di Complete Tyrode al microscopio per verificare che il tessuto stia battendo. Una volta che la tecnica è padroneggiata, almeno il 90% dei preparati tissutali dovrebbe essere buono per la registrazione.
Diverse considerazioni possono migliorare la probabilità di registrazioni di successo e la successiva analisi dei dati. Per garantire le migliori registrazioni, le soluzioni devono essere accuratamente preparate e testate su campioni di topi di pratica prima delle registrazioni sperimentali. Abbiamo lavorato a lungo per adattare e modificare la soluzione di registrazione per ottimizzare la salute del tessuto SAN. Inoltre, assicurarsi che il gas utilizzato per la registrazione sia carbogeno (cioè 95% O2/ 5% CO2). Le registrazioni a cella singola utilizzano spesso ossigeno puro a causa della composizione chimica specifica della soluzione di Tyrode utilizzata per tale applicazione, ma la soluzione utilizzata per la registrazione sul MEA richiede carbogeno per mantenere un pH stabile. L'uso di ossigeno puro con la soluzione di Tyrode per le registrazioni MEA causerà fluttuazioni del pH che possono portare a un rapido deterioramento del tessuto. Valutare i massimi di ampiezza nei canali come descritto in precedenza aiuterà a determinare se il tessuto è di buona qualità di registrazione. Infine, per facilitare l'analisi dopo la registrazione, è molto utile scattare un'immagine del tessuto SAN montato sull'array di elettrodi MEA al termine della registrazione. Il tessuto può spostarsi leggermente durante la configurazione iniziale del MEA e questo fornisce la valutazione più accurata del posizionamento dell'elettrodo per l'analisi.
Proponiamo le registrazioni MEA come un modo completo e accurato per caratterizzare la velocità di sparo SAN. Un vantaggio della tecnica MEA è che consente allo sperimentatore di catturare velocità di cottura alla pari con le registrazioni a cella singola senza la necessità di avere una vasta esperienza elettrofisiologica. La tecnica MEA ha anche il vantaggio di eliminare le potenziali influenze confondenti dei meccanismi neuroumorali e meccano-elettrici, che sono inerenti alle registrazioni cardiache isolate e alle misurazioni del blocco autonomo in vivo 21. La contrazione ventricolare e la respirazione sono le principali influenze meccano-elettriche che potrebbero alterare l'accensione del SAN, ma vengono eliminate nella nostra preparazione tissutale 52,53. Mentre la nostra tecnica elimina la maggior parte delle influenze autonome sulla SAN, un numero limitato di proiezioni ICNS rimanenti negli atri giusti potrebbe potenzialmente avere un impatto sul tiro SAN, una limitazione teorica che dovrebbe essere tenuta presente durante l'interpretazione dei risultati5,6,22,23. Un altro vantaggio della tecnica MEA qui descritta è che può essere adattata per molti altri tipi di studi cardiaci. Ad esempio, sebbene questo protocollo abbia dimostrato gli effetti del 4-AP sull'attività della SAN, studi futuri potrebbero esaminare un numero quasi illimitato di agenti farmacologici, nonché gli effetti delle mutazioni geniche sul fuoco intrinseco della SAN. Ad esempio, l'ivabradina, un bloccante specifico del canale Hcn4 specifico per SAN, potrebbe essere utilizzato per studiare divertenti contributi attuali alla velocità di sparo54. Il sistema MEA può anche essere utilizzato per misurare la funzione cardiaca in altre regioni del cuore, consentendo una caratterizzazione dettagliata e specifica della regione. Tuttavia, la registrazione da altre regioni cardiache richiederebbe diversi approcci di dissezione e la possibilità di sezionamento del tessuto sottile prima della registrazione. Una limitazione potenzialmente significativa di questa tecnica è l'alto costo di acquisto di un sistema MEA che può essere proibitivo. Diversi sistemi MEA sono disponibili sul mercato con caratteristiche e funzionalità simili, ma l'alto costo rimane lo stesso. Tuttavia, una volta acquisite le apparecchiature e il software iniziali, il costo per la manutenzione e l'utilizzo del sistema MEA è piuttosto basso. Un'altra limitazione è che il sistema MEA consente solo la registrazione di potenziali di campo extracellulare che non favoriscono confronti precisi delle caratteristiche del potenziale d'azione (ad esempio, ampiezza e forma) tra preparati come quelli che possono essere raggiunti con registrazioni intracellulari a singola cellula. In sintesi, questo protocollo fornisce un flusso di lavoro efficiente per misurare e analizzare le velocità intrinseche di attivazione cardiaca nel tessuto SAN del topo con la capacità di studiare gli effetti dell'intervento farmacologico sulla velocità di sparo in modo altamente specifico.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health, numeri di sovvenzione R01NS100954 e R01NS099188.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920x1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
References
- Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
- Josea, A. D., Collison, D. The normal range and determinants of the intrinsic heart rate in man. Cardiovascular Research. (4), 160-167 (1970).
- Peters, C. H., Sharpe, E. J., Proenza, C. Annual Review of Physiology Cardiac Pacemaker Activity and Aging. Annual Review of Physiology. 82, 21-43 (2019).
- Keith, A., Flack, M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. Journal of Anatomy and Physiology. 41 (3), 172-189 (1907).
- Wake, E., Brack, K. Characterization of the intrinsic cardiac nervous system. Autonomic Neuroscience. 199, (2016).
- Fedele, L., Brand, T. The intrinsic cardiac nervous system and its role in cardiac pacemaking and conduction. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 7 (4), 1-33 (2020).
- Mangrum, J. M., DiMarco, J. P. The evaluation and management of bradycardia. New England Journal of Medicine. 342 (10), 703-709 (2000).
- Adan, V., Crown, L. A. Diagnosis and treatment of Sick Sinus Syndrome. American Family Physician. 67 (8), 1725-1732 (2003).
- Semelka, M., Gera, J., Usman, S. Sick Sinus Syndrome: A Review. American Family Physician. 87 (10), 691-696 (2013).
- Zaragoza, M. V., et al. Exome sequencing identifies a novel LMNA splice-site mutation and multigenic heterozygosity of potential modifiers in a family with Sick Sinus Syndrome, dilated cardiomyopathy, and sudden cardiac death. PLoS ONE. 11 (5), 0155421 (2016).
- Brugada, J., Campuzano, O., Arbelo, E., Sarquella-Brugada, G., Brugada, R. Present status of Brugada Syndrome: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (9), 1046-1059 (2018).
- Rollin, A., et al. Prevalence, characteristics, and prognosis role of type 1 ST elevation in the peripheral ECG leads in patients with Brugada syndrome. Heart Rhythm. 10 (7), 1012-1018 (2013).
- Patel, N., Majeed, F., Sule, A. A. Seizure triggered by Sick Sinus Syndrome. BMJ case reports. 4, 2017222011 (2017).
- Knecht, S., et al. Impact of pharmacological autonomic blockade on complex fractionated atrial electrograms. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (7), 766-772 (2010).
- Saba, S., London, B., Ganz, L. Autonomic blockade unmasks maturational differences in rate-dependent atrioventricular nodal conduction and facilitation in the mouse. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 14 (2), 191-195 (2003).
- Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 51-56 (2002).
- Tse, G., Tse, V., Yeo, J. M., Sun, B. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts. PLoS ONE. 11 (2), 0148858 (2016).
- Tse, G., et al. Quantification of beat-to-beat variability of action potential durations in Langendorff-perfused mouse hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1578), 01578 (2018).
- Avula, U. M. R., et al. Heterogeneity of the action potential duration is required for sustained atrial fibrillation. JCI Insight. 5 (11), 128765 (2019).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. (135), e57617 (2018).
- Quinn, A. T., Kohl, P. Cardiac mechano-electric coupling: Acute effects of mechanical stimulation on heart rate and rhythm. Physiological Reviews. 101 (1), 37-92 (2021).
- Ripplinger, C. M., Noujaim, S. F., Linz, D. The nervous heart. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 199-209 (2016).
- Pauza, D. H., Pauziene, N., Pakeltyte, G., Stropus, R. Comparative quantitative study of the intrinsic cardiac ganglia and neurons in the rat, guinea pig, dog and human as revealed by histochemical staining for acetylcholinesterase. Annals of Anatomy. 184, 125-136 (2002).
- Golovko, V., Gonotkov, M., Lebedeva, E. Effects of 4-aminopyridine on action potentials generation in mouse sinoauricular node strips. Physiological Reports. 3 (7), 12447 (2015).
- Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), e54555 (2016).
- Doi, M., Ogawa, E., Arai, T. Effect of a photosensitization reaction performed during the first 3 min after exposure of rat myocardial cells to talaporfin sodium in vitro. Lasers in Medical Science. 32 (8), 1873-1878 (2017).
- Takanari, H., et al. A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology. Journal of Cellular Physiology. 231 (10), 2249-2256 (2016).
- Nakashima, T., et al. Rapid electrical stimulation causes alterations in cardiac intercellular junction proteins of cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1324-1333 (2014).
- Suzuki, S., et al. Effects of aldosterone on Cx43 gap junction expression in neonatal rat cultured cardiomyocytes. Circulation Journal. 73 (8), (2009).
- Horiba, M., et al. T-type Ca2+ channel blockers prevent cardiac cell hypertrophy through an inhibition of calcineurin-NFAT3 activation as well as L-type Ca2+ channel blockers. Life Sciences. 82 (11-12), 554-560 (2008).
- Inoue, N., et al. Rapid electrical stimulation of contraction modulates gap junction protein in neonatal rat cultured cardiomyocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases and effects of angiotensin II receptor agonist. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 914-922 (2004).
- Aalders, J., et al. Effects of fibrillin mutations on the behavior of heart muscle cells in Marfan syndrome. Scientific Reports. 10 (16756), (2020).
- Matsuura, K., et al. Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets. Biomaterials. 32 (30), 7355-7362 (2011).
- Fujita, H., Shimizu, K., Nagamori, E. Application of a cell sheet-polymer film complex with temperature sensitivity for increased mechanical strength and cell alignment capability. Biotechnology and Bioengineering. 103 (2), 370-377 (2009).
- Baba, S., et al. Generation of cardiac and endothelial cells from neonatal mouse testis-derived multipotent germline stem cells. Stem Cells. 25 (6), 1375-1383 (2007).
- Baba, S., et al. Flk1+ cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model. Cardiovascular Research. 76 (1), 119-131 (2007).
- Shimizu, K., et al. Construction of multi-layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 803-809 (2007).
- Haraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. Electrical coupling of cardiomyocyte sheets occurs rapidly via functional gap junction formation. Biomaterials. 27 (27), 4765-4774 (2006).
- Miyagawa, S., et al. Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: Their integration with recipient myocardium. Transplantation. 80 (11), 1586-1595 (2005).
- Watts, M., et al. Decreased bioavailability of hydrogen sulfide links vascular endothelium and atrial remodeling in atrial fibrillation. Redox Biology. 38, 101817 (2021).
- Feng, Y., Cao, H., Zhang, Y. Prediction model of sinoatrial node field potential using high order partial least squares. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 1805-1811 (2015).
- Feng, Y., Cao, H., Wang, Y., Zhang, Y. Fuzzy linguistic prediction model for sinoatrial node field potential analysis in acute hyperglycemia environment. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, Suppl 1 881-887 (2015).
- Suzuki, K., Matsumoto, A., Nishida, H., Reien, Y., Maruyama, H., Nakaya, H. Termination of aconitine-induced atrial fibrillation by the KACh-channel blocker tertiapin: underlying electrophysiological mechanism. Journal of Pharmacological Sciences. 125 (4), 406-414 (2014).
- Chang, S. -L., et al. Heart failure enhances arrhythmogenesis in pulmonary veins. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 38 (10), 666-674 (2011).
- Wang, Y. -J., et al. Time-dependent block of ultrarapid-delayed rectifier K+ currents by aconitine, a potent cardiotoxin, in heart-derived H9c2 myoblasts and in neonatal rat ventricular myocytes. Toxicological Sciences. 106 (2), 454-463 (2008).
- Lai, Y. -J., Huang, E. Y. -K., Yeh, H. -I., Chen, Y. -L., Lin, J. J. -C., Lin, C. -I. On the mechanisms of arrhythmias in the myocardium of mXinα-deficient murine left atrial-pulmonary veins. Life Sciences. 83 (7-8), 272-283 (2008).
- Gustafson-Wagner, E. A., et al. Loss of mXinα, an intercalated disk protein, results in cardiac hypertrophy and cardiomyopathy with conduction defects. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (5), 2680-2692 (2007).
- Clark, R. B., et al. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, 1757-1766 (2004).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Nikmaram, M. R., et al. Characterization of the effects of Ryanodine, TTX, E-4031 and 4-AP on the sinoatrial and atrioventricular nodes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 96 (1-3), 452-464 (2008).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
- Masé, M., Glass, L., Ravelli, F. A model for mechano-electrical feedback effects on atrial flutter interval variability. Bulletin of Mathematical Biology. 70 (5), 1326-1347 (2008).
- Franz, M. R., Bode, F. Mechano-electrical feedback underlying arrhythmias: The atrial fibrillation case. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 82 (1-3), 163-174 (2003).
- Bucchi, A., Tognati, A., Milanesi, R., Baruscotti, M., DiFrancesco, D. Properties of ivabradine-induced block of HCN1 and HCN4 pacemaker channels. Journal of Physiology. 572 (2), 335-346 (2006).
