Registrazione di microelettrodi della velocità di attivazione dei nodi senoatriali per identificare i difetti intrinseci del pacemaking cardiaco nei topi
Summary
Questo protocollo mira a descrivere una nuova metodologia per misurare la velocità di sparo cardiaca intrinseca utilizzando la registrazione di array di microelettrodi dell’intero tessuto del nodo senoatriale per identificare i difetti di pacemaking nei topi. Gli agenti farmacologici possono anche essere introdotti in questo metodo per studiare i loro effetti sul pacemaking intrinseco.
Abstract
Il nodo senoatriale (SAN), situato nell’atrio destro, contiene le cellule pacemaker del cuore e la disfunzione di questa regione può causare tachicardia o bradicardia. L’identificazione affidabile dei difetti cardiaci di pacemaking richiede la misurazione della frequenza cardiaca intrinseca prevenendo in gran parte l’influenza del sistema nervoso autonomo, che può mascherare i deficit di frequenza. I metodi tradizionali per analizzare la funzione intrinseca del pacemaker cardiaco includono il blocco autonomo indotto da farmaci per misurare le frequenze cardiache in vivo, le registrazioni cardiache isolate per misurare le frequenze cardiache intrinseche e le registrazioni a striscia sinoatriale o patch-clamp a singola cellula delle cellule pacemaker senoatriali per misurare le velocità di attivazione del potenziale d’azione spontanea. Tuttavia, queste tecniche più tradizionali possono essere tecnicamente impegnative e difficili da eseguire. Qui, presentiamo una nuova metodologia per misurare la velocità di sparo cardiaco intrinseco eseguendo registrazioni MEA (microelectrode array) di preparati di nodi senoatriali a montaggio intero da topi. I MEA sono composti da più microelettrodi disposti in uno schema a griglia per la registrazione in vitro di potenziali di campo extracellulare. Il metodo qui descritto ha il vantaggio combinato di essere relativamente più veloce, più semplice e più preciso rispetto agli approcci precedenti per la registrazione delle frequenze cardiache intrinseche, consentendo al contempo un facile interrogatorio farmacologico.
Introduction
Il cuore è un organo complesso governato da influenze sia cardiache intrinseche che estrinseche come quelle che hanno origine nel cervello. Il nodo senoatriale (SAN) è una regione definita nel cuore che ospita le cellule pacemaker (note anche come cellule senoatriali, o cellule SA) responsabili dell’inizio e della perpetuazione del battito cardiaco dei mammiferi1,2. La frequenza cardiaca intrinseca è la frequenza guidata dalle cellule pacemaker senza influenza da altre influenze cardiache o neuro-umorali, ma le misure tradizionali della frequenza cardiaca negli esseri umani e negli animali vivi, come gli elettrocardiogrammi, riflettono sia il pacemaker che le influenze neurali sul cuore. L’influenza neurale più notevole sulle cellule SA proviene dal sistema nervoso autonomo, che modula costantemente i modelli di attivazione per soddisfare i requisiti fisiologici del corpo3. A sostegno di questa idea, sia le proiezioni simpatiche che parasimpatiche possono essere trovate vicino alla SAN4. Il sistema nervoso cardiaco intrinseco (ICNS) è un’altra importante influenza neurale in cui il plesso ganglionato, in particolare negli atri destri, innerva e regola l’attività della SAN5,6.
Comprendere i deficit di pacemaking è clinicamente importante, poiché la disfunzione può essere alla base di molti disturbi cardiaci e contribuire al rischio di altre complicanze. La sindrome del seno malato (SSS) è una categoria di malattie caratterizzate da disfunzione del nodo senoatriale che impedisce il corretto pacemaking7,8. La SSS può presentarsi con bradicardia sinusale, pause sinusali, arresto sinusale, blocco di uscita senoatriale e bradiarritmie e tachiaritmiealternate 9 e può portare a complicazioni tra cui aumento del rischio di ictus embolico e morte improvvisa8,10. Quelli con sindrome di Brugada, un disturbo cardiaco caratterizzato da fibrillazione ventricolare con un aumentato rischio di morte cardiaca improvvisa, sono a maggior rischio di eventi aritmogeni se hanno anche una disfunzione SAN comorbidità11,12. La disfunzione senoatriale può anche avere conseguenze fisiologiche oltre il cuore. Ad esempio, È stato osservato che la SSS innesca convulsioni in un paziente a causa dell’ipoperfusione cerebrale13.
Per identificare i deficit di pacemaking senoatriale, le frequenze cardiache intrinseche devono essere determinate misurando l’attività della SAN senza l’influenza del sistema nervoso autonomo o di fattori umorali. Clinicamente, questo può essere approssimato dal blocco autonomo farmacologico14, ma questa stessa tecnica può essere applicata anche in modelli di mammiferi per studiare la funzione cardiaca intrinseca15,16. Mentre questo approccio blocca gran parte delle influenze neurali che contribuiscono e consente l’esame cardiaco in vivo, non elimina completamente tutte le influenze estrinseche sul cuore. Un’altra tecnica di ricerca utilizzata per studiare la funzione cardiaca intrinseca in modelli animali è la registrazione cardiaca isolata utilizzando cuori perfusi di Langendorff, che in genere comportano misurazioni utilizzando elettrogrammi, stimolazione o array multielettrodi epicardali17,18,19,20. Mentre questa tecnica è più specifica per la funzione cardiaca poiché comporta la rimozione del cuore dal corpo, le misurazioni possono ancora essere influenzate da meccanismi autoregolatori meccano-elettrici che potrebbero influenzare le misurazioni intrinseche della frequenza cardiaca21. Le registrazioni cardiache isolate possono anche essere ancora influenzate dalla regolazione autonomica attraverso l’ICNS5,6,22,23. Inoltre, il mantenimento di una temperatura fisiologicamente rilevante del cuore, che è fondamentale per le misurazioni della funzione cardiaca, può essere difficile negli approcci cardiaci isolati20. Un metodo più diretto per studiare la funzione SAN è quello di isolare specificamente il tessuto SAN e misurarne l’attività. Questo può essere realizzato attraverso strisce SAN (tessuto SAN isolato) o cellule pacemaker SAN isolate24,25. Entrambi richiedono un alto grado di formazione tecnica, poiché la SAN è una regione molto piccola e altamente definita, e l’isolamento cellulare rappresenta una sfida ancora maggiore in quanto la dissociazione può danneggiare la salute generale della cellula se non eseguita correttamente. Inoltre, queste tecniche richiedono competenze elettrofisiologiche esperte al fine di registrare con successo dal tessuto o dalle cellule utilizzando singoli microelettrodi di registrazione.
In questo protocollo, descriviamo una tecnica per registrare la SAN in vitro utilizzando un array di microelettrodi (MEA) per ottenere misurazioni intrinseche della frequenza cardiaca. Questo approccio ha il vantaggio di rendere le registrazioni elettrofisiologiche altamente specifiche accessibili ai ricercatori privi di competenze elettrofisiologiche intensive. I MEA sono stati precedentemente utilizzati per studiare la funzione dei cardiomiociti in colture primarie di cardiomiociti26,27, 28,29,30,31,32,fogli cardiaci33,34,35,36,37,38,39e supporti interi di tessuto40, 41,42,43,44,45,46,47. Il lavoro precedente è stato fatto anche per esaminare i potenziali di campo nel tessuto SAN41,42. Qui, forniamo una metodologia per utilizzare il MEA per registrare e analizzare i tassi di cottura intrinseci della SAN murina. Descriviamo anche come questa tecnica può essere utilizzata per testare gli effetti farmacologici dei farmaci sulle velocità di cottura intrinseche SAN fornendo un esperimento di esempio che mostra gli effetti della 4-aminopiridina (4-AP), un bloccante del canale K+ voltaggio-moggio. Utilizzando punti di riferimento anatomici definiti, possiamo registrare con precisione la SAN senza dover eseguire le estese dissezioni tissutali o gli isolamenti cellulari richiesti in altri metodi. Mentre il MEA può essere proibitivo in termini di costi, le registrazioni forniscono misure altamente specifiche e affidabili di pacemaking che possono essere utilizzate in una vasta gamma di applicazioni di ricerca clinica e fisiologica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Praticare e padroneggiare il processo di dissezione SAN è imperativo poiché il tessuto è fragile e il tessuto sano è necessario per una registrazione di successo. Durante la dissezione SAN, il corretto orientamento è essenziale per ottenere la corretta regione del tessuto. Tuttavia, l’orientamento originale del cuore può essere facilmente perso durante il processo di dissezione, il che complica questo sforzo. Pertanto, per garantire il corretto orientamento sinistra-destra, gli atri devono essere ispezionati visiva…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health, numeri di sovvenzione R01NS100954 e R01NS099188.
Materials
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
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