Summary
يهدف هذا البروتوكول إلى وصف منهجية جديدة لقياس معدل إطلاق القلب الجوهري باستخدام تسجيل صفيف microelectrode لأنسجة العقدة الصينية الصناعية بأكملها لتحديد عيوب صنع الإيقاع في الفئران. يمكن أيضا إدخال العوامل الدوائية في هذه الطريقة لدراسة آثارها على صنع الإيقاع الجوهري.
Abstract
العقدة سينواري (SAN)، وتقع في الأذين الأيمن، يحتوي على خلايا منظم ضربات القلب في القلب، والخلل الوظيفي في هذه المنطقة يمكن أن يسبب عدم دقات القلب أو بطء القلب. تحديد موثوق بها من عيوب صنع ضربات القلب يتطلب قياس معدلات ضربات القلب الجوهرية من خلال منع إلى حد كبير تأثير الجهاز العصبي اللاإرادي، والتي يمكن أن تخفي العجز معدل. وتشمل الطرق التقليدية لتحليل وظيفة تنظيم ضربات القلب الجوهرية الحصار اللاإرادي الناجم عن المخدرات لقياس معدلات ضربات القلب في الجسم الحي، وتسجيلات القلب المعزولة لقياس معدلات ضربات القلب الجوهرية، وشريط sinoatrial أو تسجيلات المشبك التصحيح خلية واحدة من خلايا منظم ضربات القلب sinoatrial لقياس معدلات إطلاق النار المحتملة العمل العفوي. ومع ذلك، يمكن أن تكون هذه التقنيات التقليدية أكثر تحديا من الناحية الفنية ويصعب تنفيذها. هنا ، نقدم منهجية جديدة لقياس معدل إطلاق القلب الجوهري من خلال إجراء تسجيلات صفيف microelectrode (MEA) لتحضيرات العقدة الصينية الكاملة من الفئران. وتتألف MEAs من microelectrodes متعددة مرتبة في نمط يشبه الشبكة لتسجيل في إمكانات حقل خارج الخلية المختبر. الطريقة الموصوفة هنا لديها ميزة مجتمعة لكونها أسرع نسبيا، أبسط، وأكثر دقة من النهج السابقة لتسجيل معدلات ضربات القلب الجوهرية، مع السماح أيضا الاستجواب الدوائية سهلة.
Introduction
القلب هو جهاز معقد تحكمه كل من التأثيرات القلبية الجوهرية والخارجية مثل تلك التي تنشأ في الدماغ. العقدة سينواتي (SAN) هي منطقة محددة في القلب التي تضم خلايا منظم ضربات القلب (يشار إليها أيضا باسم الخلايا الصينية، أو خلايا SA) المسؤولة عن بدء وإدامة ضربات القلب الثديية1،2. معدل ضربات القلب الجوهري هو المعدل الذي تدفعه خلايا تنظيم ضربات القلب دون تأثير من التأثيرات القلبية أو العصبية الفكاهية الأخرى ، ولكن التدابير التقليدية لمعدل ضربات القلب في البشر والحيوانات الحية ، مثل تخطيط القلب الكهربائي ، تعكس كل من منظم ضربات القلب والتأثيرات العصبية على القلب. التأثير العصبي الأبرز على خلايا SA هو من الجهاز العصبي اللاإرادي ، والذي يعدل باستمرار أنماط إطلاق النار لتلبية المتطلبات الفسيولوجية للجسم3. دعم هذه الفكرة، يمكن العثور على كل من التوقعات متعاطفة وشبه متعاطفة بالقرب من سان4. الجهاز العصبي القلبي الجوهري (ICNS) هو تأثير عصبي مهم آخر حيث plexi ganglionated، وتحديدا في الأذين الأيمن، innervate وتنظيم نشاط سان5،6.
فهم العجز في صنع الإيقاع مهم سريريا، حيث أن الخلل الوظيفي يمكن أن يكون وراء العديد من اضطرابات القلب، فضلا عن المساهمة في خطر حدوث مضاعفات أخرى. متلازمة الجيوب الأنفية المريضة (SSS) هي فئة من الأمراض التي تتميز بخلل وظيفي في العقدة الصينية التي تعوق صنع الإيقاع السليم7،8. SSS يمكن أن تقدم مع بطء القلب الجيوب الأنفية, توقف الجيوب الأنفية, اعتقال الجيوب الأنفية, كتلة الخروج سيناوي, وبالتناوب bradyarrythmias وtachyarrhythmias 9 ويمكن أن يؤدي إلى مضاعفات بما في ذلكزيادة خطر السكتة الدماغية الانسدادية والموت المفاجئ8,10. أولئك الذين يعانون من متلازمة بروغادا, اضطراب القلب تميزت الرجفان البطيني مع زيادة خطر الوفاة القلبية المفاجئة, هم أكثر عرضة للأحداث غير صحية إذا كان لديهم أيضا خلل سان comorbid11,12. قد يكون للخلل الصناعي الصيني أيضا عواقب فسيولوجية تتجاوز القلب. على سبيل المثال، وقد لوحظ SSS لتحريك المضبوطات في المريض بسبب نقص الترويةالدماغية 13.
لتحديد العجز في صناعة الإيقاع sinoatrial ، ومعدلات القلب الجوهرية تحتاج إلى تحديد من خلال قياس نشاط سان دون تأثير الجهاز العصبي اللاإرادي أو العوامل الفكاهية. سريريا، وهذا يمكن أن يكون تقريبيا عن طريق الحصار اللاإراديالدوائية 14،ولكن يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية نفسها في نماذج الثديياتلدراسة وظيفة القلب الجوهرية 15،16. في حين أن هذا النهج يمنع جزءا كبيرا من التأثيرات العصبية المساهمة ويسمح بإجراء فحص القلب في الجسم الحي ، فإنه لا يقضي تماما على جميع التأثيرات الخارجية على القلب. تقنية بحثية أخرى تستخدم لدراسة وظيفة القلب الجوهرية في النماذج الحيوانية هي تسجيلات القلب المعزولة باستخدام قلوب Langendorff perfused ، والتي تنطوي عادة على قياسات باستخدام الكتروجرامات ، وسرعة ، أو صفائف متعددة الأقطاب epicardial17،18،19،20. في حين أن هذه التقنية هي أكثر تحديدا لوظيفة القلب لأنه ينطوي على إزالة القلب من الجسم، قد لا تزال تتأثر القياسات من قبل آليات التنظيم الذاتي الميكانيكية الكهربائية التي يمكن أن تؤثر على قياسات معدل ضربات القلبالجوهرية 21. تسجيلات القلب المعزولة قد لا تزال تتأثر أيضا التنظيم اللاإرادي من خلال ICNS5,6,22,23. وعلاوة على ذلك، الحفاظ على درجة حرارة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للقلب، وهو أمر بالغ الأهمية لقياس وظيفة القلب، يمكن أن يكون من الصعب في القلب المعزول النهج20. وهناك طريقة أكثر مباشرة لدراسة وظيفة سان هو عزل أنسجة سان على وجه التحديد وقياس نشاطها. ويمكن تحقيق ذلك من خلال شرائط سان (أنسجة سان معزولة) أو معزولة SAN خلايا منظم ضربات القلب24,25. كلاهما يتطلب درجة عالية من التدريب التقني، كما SAN هي منطقة صغيرة جدا ومحددة للغاية، وعزل الخلايا يشكل تحديا أكبر لأن الانفصال يمكن أن تلحق الضرر بالصحة العامة للخلية إذا لم يتم تنفيذها بشكل صحيح. وعلاوة على ذلك، تتطلب هذه التقنيات مهارات الخبراء الكهربية من أجل تسجيل بنجاح من الأنسجة أو الخلايا باستخدام الخلايا الدقيقة تسجيل الفردية.
في هذا البروتوكول، نقوم بوصف تقنية لتسجيل SAN في المختبر باستخدام صفيف microelectrode (MEA) للحصول على قياسات معدل ضربات القلب الجوهرية. هذا النهج لديه ميزة جعل التسجيلات الكهربية محددة للغاية في متناول الباحثين الذين يفتقرون إلى skillsets الكهربية المكثفة. وقد سبق أن استخدمت MEAs لدراسة وظيفة cardiomyocyte في الثقافات القلبية الأولية26،27،28،29،30،31،32، أوراق القلب33،34،35،36،37،38،39، والأنسجة كلها يتصاعد40، 41،42،43،44،45،46،47. كما تم القيام بعمل سابق لدراسة الإمكانات الميدانية في أنسجة سان41،42. هنا ، ونحن نقدم منهجية لاستخدام MEA لتسجيل وتحليل مورين الجوهرية سان معدلات اطلاق النار. ونحن نصف أيضا كيف يمكن استخدام هذه التقنية لاختبار الآثار الدوائية للأدوية على معدلات إطلاق سان الجوهرية من خلال توفير تجربة عينة تبين آثار 4-aminopyridine (4-AP), والجهد بوابات K+ مانع القناة. باستخدام المعالم التشريحية المحددة، يمكننا تسجيل سان بدقة دون الحاجة إلى إجراء تشريح الأنسجة واسعة النطاق أو عزل الخلايا المطلوبة في أساليب أخرى. في حين أن MEA يمكن أن تكون باهظة التكلفة ، فإن التسجيلات توفر مقاييس محددة وموثوقة للغاية من صنع الإيقاع التي يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من تطبيقات البحوث السريرية والفسيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد نفذت جميع الإجراءات التجريبية الموصوفة هنا وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة، على النحو الذي وافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه في الجامعة الميثودية الجنوبية.
1. طلاء مجموعة متعددة الأقطاب (MEA) للتسجيل
- جعل 25 mM بورات المخزن المؤقت.
- حل 0.953 غرام من نا2B4O7· 10 H2O في 80 مل من الماء المقطر.
- ضبط درجة الحموضة إلى 8.4 مع HCl ثم إضافة الماء المقطر إلى حجم النهائي من 100 مل.
- جعل 0.1٪ حل الأسهم من البولي ايثيلين (PEI).
- أضف 100 ميكرولتر من 50٪ (ث/v) PEI إلى 4.9 مل من الماء المقطر لصنع حل PEI بنسبة 1٪.
- تمييع حل PEI بنسبة 1٪ إلى 0.1٪ في المخزن المؤقت للبورات عن طريق إضافة 1 مل من حل PEI بنسبة 1٪ إلى 9 مل من المخزن المؤقت للبورات 25 mM.
- Pipette ~ 1 مل من الحل PEI 0.1٪ في طبق صفيف microelectrode (MEA) بحيث يتم تغطية الأقطاب الكهربائية بالكامل(الشكل 1A و 1B).
ملاحظة: تتكون الميكروبيكترودات من MEA عادة من البلاتين الأسود أو الكربون نانوتوب ومعزولة مع البوليميد (أو الاكريليك)؛ كلا المواد هي مسعور. من خلال طلاء MEA مع البوليمر cationic مثل جزيرة الأمير إدوارد ، يتم إجراء سطح MEA الكاره للماء أكثر مائية ، مما يسمح لعينات الأنسجة بإجراء اتصال أفضل مع سطح MEA(الشكل 1A1). - تغطية طبق MEA مع فيلم بالحرارة للحد من التبخر وترك MEA بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة(الشكل 1C).
- يستنشق حل PEI من طبق MEA باستخدام ماصة ، مع الحرص على عدم لمس شبكة القطب الكهربائي التي يمكن أن تلحق الضرر بالأقطاب الكهربائية ، ثم شطف ≥4 مرات بالماء المقطر(الشكل 1D).
- تخزين MEA المغلفة جزيرة الأمير إدوارد تحت 1-2 مل من المياه فائقة البور ومختومة مع فيلم بالحرارة في 4 درجة مئوية حتى الحاجة. بدلا من ذلك، تخزين MEA المغلفة عن طريق غمرها في كوب مملوءة بالماء فائقة(الشكل 1E).
ملاحظة: يجب إجراء عملية طلاء PEI مرة واحدة فقط ل MEA قبل استخدامها لأول مرة ، وبعد كل جلسة تسجيل ، يجب تخزين MEA غارقة في مياه فائقة النبور.
2. إعداد حل تايرود الكامل لتشريح الأنسجة
- جعل 1000 مل من حل تايرود كاملة لتشريح; أولا، إضافة 8.1816 غرام من NaCl إلى 800 مل من المياه فائقة النبور.
- إضافة الكمية التالية من المواد الكيميائية إلى الحل: 0.4025 غرام من KCl; 0.1633 غرام من KH2PO4; 1.1915 غرام من HEPES؛ 0.9999 غرام من الجلوكوز. 0.0952 غرام من MgCl2; 0.2646 غرام من CaCl2· 2H2O.
- ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع NaOH ثم إضافة المياه فائقة النبور حتى يبلغ إجمالي حجم 1000 مل.
ملاحظة: التركيب النهائي للحل التيرود الكامل سيكون التالي (في mM): 140 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 KH2PO4, 5 HEPES, 5.55 الجلوكوز, 1 MgCl2, 1.8 CaCl2.
3. إعداد محلول التيرود المؤوكسجين للتسجيل
- جعل 500 مل من الحل التيرود; إضافة 4.003 غرام من NaCl إلى 400 مل من المياه فائقة البور.
- إضافة الكميات التالية من المواد الكيميائية إلى الحل: 0.651 غرام من NaHCO3; 0.042 غرام من ناه2PO4; 0.132 غرام من CaCl2· 2H2O; 0.149 غرام من KCl؛ 0.0476 غرام من MgCl2; 0.999 غرام من الجلوكوز.
- ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع HCl ثم إضافة المياه فائقة النبور حتى يبلغ إجمالي حجم 500 مل.
- أكسجين الحل مع كاربوجين لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة قبل بدء التسجيل.
ملاحظة: التركيب النهائي للحل التيرود سيكون التالي (في mM): 137 NaCl, 15.5 NaHCO3, 0.7 NaH2PO4, 1.8 CaCl2, 4 KCl, 1 MgCl2, 11.1 الجلوكوز. حل هذا التيرود لديه تكوين مختلف قليلا من حل تايرود كاملة تستخدم لتشريح.
4. إعداد 4-aminopyridine (4-AP) حل لتعديل الدوائية
- جعل 1 mM حل العمل من 4-AP; إضافة 18.82 ملغ من 4-AP إلى 200 مل من الحل التيرود من الخطوة 3.
- أكسجين الحل 4-AP لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التجربة.
5. إعداد طبق بيتري للتشريح
- مزيج مكونات الاستومر السيليكون في نسبة 10:1 (حسب الوزن) من قاعدة إلى عامل المعالجة.
- صب ~ 15 مل من خليط الاستومر السيليكون في طبق بيتري قطرها 60 ملم.
- السماح للإلدائن لعلاج في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة قبل الاستخدام.
ملاحظة: يمكن إعادة استخدام طبق بيتري السيليكوني للتشريح في المستقبل.
6. تشريح العقدة sinoatrial (سان)
- إعداد حل تايرود الكامل heparinized لتشريح سان.
- إضافة 400 ميكرولتر من الهيبارين (1000 USP / مل) إلى 40 مل من محلول تايرود كاملة ودافئة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- حقن الماوس intraperitoneally مع 200-300 ميكرولتر من الهيبارين (1000 USP/mL) والسماح للحيوان للجلوس لمدة 10 دقيقة.
- القتل الرحيم الماوس الهيبارين بواسطة جرعة زائدة من ايزوفلوران.
- ضع الماوس في غرفة زجاجية صغيرة تحتوي على أبخرة isoflurane التي تم إنشاؤها عن طريق إضافة 200-300 ميكرولتر من الأيزوفلوران السائل إلى ورقة تصفية داخل أنبوب بلاستيكي مثقب.
ملاحظة: لأن الأيزوفلوران يمكن أن يسبب تهيج الجلد ويمكن أيضا أن يمتص من خلال الجلد، يجب على السائل عدم الاتصال الماوس مباشرة. لذلك ، يتم وضع المسح المنقوع بالايسوفوران في أنبوب مثقب للإدارة. - تحقق من الموت عن طريق التوقف عن الحركة والجهد التنفس وعدم وجود قرصة إصبع القدم منعكس. الموت عادة ما يستغرق حوالي 1-2 دقيقة بعد التنسيب في الغرفة.
ملاحظة: عادة ما يكون الموت مصحوبا بالتبول.
- ضع الماوس في غرفة زجاجية صغيرة تحتوي على أبخرة isoflurane التي تم إنشاؤها عن طريق إضافة 200-300 ميكرولتر من الأيزوفلوران السائل إلى ورقة تصفية داخل أنبوب بلاستيكي مثقب.
- ضع الماوس في وضع ية على لوح تشريح مع الكفوف الممدودة وإصلاح الكفوف إلى اللوحة باستخدام إبر حقن بطول 1 بوصة و23 قياسا. ثم إزالة الفراء في محيط الجزء السفلي من القفص الصدري باستخدام مقص الجراحية وقطع الفراء في الجذور.
ملاحظة: بالنسبة إلى لوحة تشريح، يمكن استخدام أغطية مبردة البوليسترين. - في حين عقد الجلد مع hemostat، استخدم مقص الجراحية لجعل شق عرضية في الجلد فقط تحت الجزء السفلي من القفص الصدري من حوالي قوس كوستال اليسار إلى القوس كوستال الأيمن (الشكل 3A).
- قطع فتح الصفاق مع مقص الجراحية وفصل بعناية الكبد من الحجاب الحاجز، مع الحرص على عدم الكبد، والتي سوف تسبب نزيف مفرط(الشكل 3B). يسوس الحجاب الحاجز على طول الصدر لفضح تجويف الصدر (الشكل 3C- D).
- باستخدام مقص الجراحية، وقطع الجدران الجانبية من القفص الصدري من حواف الأقواس costal تصل إلى الترقوة لفضح القلب، مع الحرص على تجنب إلحاق الضرر بالقلب(الشكل 3D). ثم استخدم إبرة حقنة قياس 23 لتثبيت القفص الصدري على الكتف، وعقد في مكان والخروج من الطريق من المجال الجراحي.
- استخدام ماصة نقل لبالتنقيط الحارة (37 درجة مئوية) heparinized حل تام التيرود على القلب للحفاظ على رطوبة.
ملاحظة: لا تسمح للقلب بالجفاف. - إزالة الرئتين عن طريق عقد لهم مع ملقط Graefe غرامة اضافية وقطع القصبة الهوائية مع مقص الجراحية (الشكل 3E).
- عقد قمة القلب مع ملقط Graefe غرامة اضافية وإزالتها عن طريق قطع الشريان الأورطي وفيناي كافاي مع مقص الجراحية. نقل القلب إلى طبق بيتري التي تحتوي على شفيت السيليكون elastomer (الشكل 4A) واستخدام ماصة نقل للاستحمام القلب مع 2-3 مل من الحارة (37 درجة مئوية) heparinized حل تايرود الكامل.
ملاحظة: يجب الحرص على عدم إتلاف الجدار الخلفي الحساس من الأذين الأيمن، الذي يحتوي على سان، والأوردة الأذينية اليمنى المتصلة. الاستحمام القلب مع حل تام تايرود يحافظ على القلب من الجفاف ولكن لا تغمر تماما القلب في الحل لأنها سوف تضعف الرؤية أثناء تشريح. - توجيه القلب مع الأذين الأيمن على الأذين المجرب الأيمن والأذين الأيسر على يسار المجرب.
ملاحظة: يجب أن يتم تشريح أنسجة سان بسرعة من أجل منع الإصابة المرتبطة ب نقص التروية. - إرفاق قمة القلب إلى الطبق مع دبوس تشريح. ثم, في حين عقد كافا الوريد السفلي مع دومون #2 ملقط لامينكتوم, إدراج إبرة حقنة 22 G من خلال كافا الوريد أدنى ومتفوقة لتحديد موقعها في الأذين الأيمن, الذي يحدد أيضا الموقف التقريبي لسان (تقع في رقعة من الأنسجة بين كافا فينا أدنى ومتفوقة (الشكل 4B).
- باستخدام دبابيس تشريح صغيرة، دبوس الزوائد الأذيني الأيسر والأيحي إلى الطبق.
- أثناء عقد الملحق الأذيني الأيسر مع دومونت #2 ملقط استئصال اللامينكتوم ، ضع دبوس تشريح من خلال الملحق الأذيني الأيسر لتثبيته في مكانه.
- في حين عقد الملحق الأذيني الأيمن مع ملقط #55 دومون، وضع دبوس تشريح من خلال الملحق الأذيني الأيمن لعقد في مكانه.
ملاحظة: يمكن استخدام نفس نوع ملقط للاحتفاظ الزوائد الأذيني الأيسر والأينى إذا رغبت في ذلك.
- إزالة إبرة الحقنة التي تمتد فيناي كافاي.
- لتحرير الدم من القلب، استخدم مقص كاستروفيجو لإزالة قمة القلب (أي النصف السفلي) عن طريق إجراء شق عرضي عبر البطينين(الشكل 4C). ثم، وغسل القلب عن طريق إضافة دافئة (37 درجة مئوية) heparinized حل تايرود كاملة مع ماصة نقل.
- استخدام مقص كاستروفيجو لقطع على طول الحاجز الأذيني البطين الحفاظ على شق أقرب إلى البطين من الأذين. استمر في القطع على طول الحاجز الأذيني البطيني حتى يتم فصل الأذينين عن البطينين.
- قطع على طول الحاجز الصناعي لإزالة الأذين الأيسر.
- مكان دبابيس تشريح في محيط الأذين الأيمن لجعله وضع شقة (الشكل 4D). إزالة أي الدهون المتبقية، والأوعية، أو الأنسجة من الأذين باستخدام مقص كاستروفيجو.
- حدد موقع SAN في الأذين الأيمن ، والذي يحده في هذا الاتجاه تقريبا الوريدا الكافا المتفوق (في الأعلى) ، وفينا كافا السفلي (في الأسفل) ، و cristae terminalis (على اليسار) (الشكل 4D).
ملاحظة: يظهر المبنى كريستا ك سلسلة من التلال العضلية الداكنة بين الملحق الأذيني الأيمن و SAN. في كثير من الأحيان يمكن أيضا أن ينظر إلى الشريان سان coursing من خلال سان (الشكل 4D).
7. إعداد نظام MEA للتسجيل
- إضافة حل تايرود (من الخطوة 3) إلى زجاجة حل الإدخال (الشكل 5C) والأوكسيجين عن طريق تشغيل تدفق غاز كاربوجين(الشكل 5A)إلى النظام.
ملاحظة: حل التيرود المستخدمة للتسجيل يختلف قليلا في تكوين من حل التيرود الكامل المستخدمة لتشريح. - تحقق من تدفق كاربوجين من خلال مراقبة الفقاعات في القارورة المخروطية ، والتي تستخدم لترطيب الغاز (الشكل 5B) ، وزجاجة محلول الإدخال(الشكل 5C).
- إدراج أنابيب تدفق مضخة التجبير(الشكل 5D)في حل تسجيل التيرود(الشكل 5C). ثم أدخل أنابيب تدفق مضخة التجبير في زجاجة جمع(الشكل 5I).
- تعيين مضخة التجسيم إلى 25 دورة في الدقيقة، والذي يعطي معدل تدفق 2 مل / دقيقة وبدء المضخة. تحقق من النظام لأي تسرب عازل أو تجاوز.
- تعيين وحدة تحكم درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، ودرجة الحرارة الفسيولوجية للفئران (الشكل 5E).
8. وضع أنسجة القلب على شبكة MEA
- نقل الأنسجة SAN تشريح بمساعدة فرشاة الطلاء (الشكل 6A) من طبق بيتري تشريح على شبكة MEA (الشكل 1A1).
- أثناء النظر تحت المجهر المقلوب ، ضع الأنسجة برفق مع فرشاة طلاء ناعمة بحيث تغطي منطقة سان شبكة القطب الكهربائي.
- إعادة وضع الأنسجة حسب الضرورة لضمان وضعها شقة على شبكة القطب الكهربائي، مما يجعل اتصال جيد مع الأقطاب الكهربائية.
ملاحظة: مطلوب فرشاة الطلاء الناعمة لتحريك الأنسجة لتجنب إتلاف شبكة القطب الكهربائي.
- بمجرد وضع الأنسجة بشكل صحيح ، استخدم ملقط العظام (أو أي ملقط منحني) لوضع الشبكة فوق الأنسجة(الشكل 6A). ثم استخدم ملقط العظام لوضع مرساة القيثارة(الشكل 6A)على شبكة لعقد كل شيء في مكانه (الشكل 6B).
- التقاط صورة لتحديد المواقع من الأنسجة على MEA بحيث يمكن ربط نشاط الأقطاب الفردية مع موقعها التشريحي أثناء التسجيل. ويمكن القيام بذلك عن طريق عقد الهاتف الذكي تصل إلى الهدف المجهر مقلوب أو باستخدام كاميرا المجهر المرفقة.
ملاحظة: إذا لم يتم تغيير اتجاه MEA بعد التقاط الصورة، سيظهر القطب العلوي الأيسر كالقناة الأولى (Ch1) أثناء التسجيل. - وضع طبق MEA على لوحة موصل(الشكل 5F و 6C)ووضع بعناية غطاء التغلغل(الشكل 6C)على طبق MEA دون إزعاج مرساة شريحة القيثارة. يمكن تأمين غطاء التغلغل باستخدام قطعة من شريط المختبر(الشكل 6C).
ملاحظة: بالإضافة إلى وجود حل قابل للتعديل تدفق وتدفق الأنابيب، وسقف لديها أيضا منفذ لتسليم الغاز (الشكل 6C). وبالإضافة إلى ذلك، حلقة القطب المرجعي يمتد من خلال الغطاء(الشكل 6C). - السماح للأنسجة للتعافي من المناولة والتأقلم مع الغرفة لمدة 15-20 دقيقة قبل التسجيل.
9. وضع بروتوكول الحصول على البيانات للتسجيل
ملاحظة: تصف الخطوات التالية فتح بروتوكول البرنامج لتسجيل فوز عفوية وتعريف شروط التسجيل. قد تختلف تفاصيل هذه الخطوات اعتمادا على البرامج المحددة المستخدمة، ولكن يجب أن يظل المخطط العام كما هو.
- تشغيل مكبر للصوت (الشكل 5G)، وإعداد سير عمل للتسجيل في البرنامج على الكمبيوتر (الشكل 5H).
- افتح البرنامج وانقر على سير العمل.
- حدد فتح مجلد جديد.
- افتح المجلد من القوالب.
- حدد 64MD1-1920X1080 (اعتمادا على دقة سطح المكتب).
- افتح المجلد QT.
- افتح مجلد التسجيل التلقائي.
- حدد قالب Beat_recording.moflo وفتحه (الشكل 7A).
- تعيين معلمات التسجيل لتحديد عدد من آثار، مدة التتبع، الفاصل الزمني تتبع، الجهد المدخلات، معدل أخذ العينات، الخ، وفقا لشروط التسجيل المطلوب(الشكل 7B).
ملاحظة: للحصول على تردد النبض والحصول على البيانات بين البينية، استخدم عادة جهد نطاق الإدخال 2.9 mV، ومرشح تمرير عالية 1-Hz، ومرشح تمرير منخفض 1000-Hz، ومعدل أخذ العينات من 20 كيلوهرتز. - لوضع علامة على مراحل أو شروط مختلفة من التجربة، مثل قبل وبعد إدارة الدواء، انقر على علامة التبويب الشروح لإضافة العلامات المطلوبة(الشكل 7C).
- لتحديد وجهة الملف للبيانات التي سيتم تجميعها، حدد المربع تمكين التخزين وأدخل اسم الملف المطلوب في المربع تعديل اسم الملف.
10. تنفيذ التسجيل وجمع البيانات
- انقر فوق الزر تسجيل وتشغيل في أعلى شريط قائمة من برنامج الاستحواذ لبدء التسجيل. الحصول على بيانات ل 10 آثار لمدة دقيقة واحدة مع فترات من 2 دقيقة بين آثار.
- من هذه الآثار الأولية، تحقق من أن الأشكال الموجية المسجلة تتسق مع إعداد الأنسجة صحية وعالية الجودة من خلال تأكيد أن غالبية قنوات التسجيل تظهر سعة إشارة ≥ 0.5 mV وفواصل متطابقة بين الارتفاع(الشكل 8).
ملاحظة: يمكن إجراء تقييم أولي للنشاط وأشكال الموجات للموجات الدقيقة الفردية المقابلة لمواقعها التشريحية من خلال الرجوع إلى الصورة المكتسبة بعد وضع الأنسجة على MEA. - لقياس آثار الأدوية على الأنسجة، أوقف التسجيل مؤقتا بعد الحصول على بيانات خط الأساس الأولية بالنقر فوق زر الإيقاف المؤقت في أعلى شريط قائمة.
ملاحظة: يمكن تدوين مرحلة استجابة الدواء للتجربة في التسجيل بالنقر على علامة التبويب الشروح وإضافة التدوين المطلوب كما هو موضح أعلاه(الشكل 7C). - وقفة المضخة والتبديل أنابيب تدفق مضخة من حل تسجيل العادي إلى حل تايرود التي تحتوي على الدواء المطلوب من الاختيار.
ملاحظة: في تجربة المثال، تم استخدام الحل التيرود مع 1 MM 4-aminopyridine (4-AP). - أعد تشغيل المضخة وأوقف التسجيل مؤقتا لبدء جمع البيانات مرة أخرى.
- بمجرد وصول محلول التيرود المشبع بالمخدرات إلى الأنسجة ، سجل 10 آثار بنفس الطريقة التي تم إجراؤها سابقا للتسجيلات الأساسية.
ملاحظة: سوف آثار يستغرق بعض الوقت لتحقيق الاستقرار كما يبث المخدرات في غرفة التسجيل. آلية عمل الدواء قد تؤثر أيضا على تسجيل الاستقرار. بالنسبة للأدوية التي لديها آليات عمل قابلة للعكس ، يجب أيضا تسجيل فترة الاغتسال لتأكيد استعادة النشاط إلى مستويات خط الأساس ، وهو مؤشر على الأنسجة السليمة. - انقر فوق إيقاف لإنهاء التسجيلات.
- التقاط صورة نهائية لتحديد المواقع من الأنسجة على MEA تحت المجهر في حالة تحول الأنسجة بعد إجراء إعداد التسجيل الأولي.
11. تنظيف الإعداد بعد التسجيل
- تنظيف MEA.
- بعد الانتهاء من التسجيل، قم بإزالة محلول التسجيل برفق من طبق MEA باستخدام ميكروباينيت 1 مل.
ملاحظة: يجب الحرص على عدم الاتصال أقطاب MEA التي يمكن أن تلحق الضرر بها. - إزالة شبكة ومرساة القيثارة مع ملقط العظام (أو أي ملقط المنحني). ثم استخدم فرشاة الطلاء لطرد الأنسجة من سطح MEA دائما الحرص على عدم لمس microelectrodes الفردية.
- باستخدام زجاجة غسيل، اشطف طبق MEA برفق بالماء فائق النبور حوالي 3 إلى 4 مرات.
- تخزين MEA تنظيف مغمورة في المياه فائقة النبور في 4 °C.
- بعد الانتهاء من التسجيل، قم بإزالة محلول التسجيل برفق من طبق MEA باستخدام ميكروباينيت 1 مل.
- شطف أنابيب النظام عن طريق تشغيل المياه فائقة النضر من خلال ذلك لمدة 5 دقائق على الأقل باستخدام الإعداد أقصى سرعة على مضخة التجبير.
ملاحظة: لمنع نمو الفطريات، يجب ترك أي محلول الماء أو العازلة داخل الأنابيب بعد التنظيف.
12. تحليل التسجيلات MEA لقياس سان فاز تردد
- افتح ملف البيانات المسجل المحفوظة في قالب "Beat_frequency_analysis" لبرنامج التحليل (الشكل 9) .
- انقر على زر التشغيل والسماح للتسجيل بأكمله لتشغيل لتصور مجموعة البيانات وتعيين المعلمات التحليل المناسب.
- حدد إطار binning لتنسيق العرض المطلوب للبيانات، سواء تم عرضه كمتوسط لكل تتبع أو متوسط في كل مرة (الشكل 10A).
- حدد القنوات التي سيتم تضمينها في التحليل وتعيين الحد الأقصى للسعة المطلوبة أو قيم عتبة السعة المصغرة لتحديد ذروة الموجي الآلي(الشكل 10B).
ملاحظة: يمكن تحديد قناة فردية أو مجموعة من القنوات أو جميع القنوات ال 64 للتحليل في هذه الخطوة(الشكل 9). إذا كانت قيم العتبة المحددة قريبة جدا من قيم الحد الأقصى للموجة وقيم التوابع، فقد لا يتم تحديد بعض قمم الشكل الموجي من خلال برنامج التحليل. - تعيين مقدار وقت ما قبل الارتفاع وما بعد الارتفاع ليتم تضمينه في التحليل.
ملاحظة: إعدادات 50 مللي ثانية قبل الارتفاع و 100 مللي ثانية بعد ارتفاع عادة ما تعمل بشكل جيد(الشكل 10B).
- بعد تعيين شروط التحليل، انقر فوق الزر تشغيل مرة أخرى لإعادة تشغيل مجموعة البيانات وتأكيد أن معلمات التحليل مناسبة لاستخراج المسامير.
- للتحليل، حدد الآثار الثلاثة الأكثر استقرارا على التوالي التي تظهر معدل ضرب مستقر لكل أثر عبر غالبية القنوات خلال فترة خط الأساس للتجربة وثلاثة آثار مستقرة متتالية أخرى خلال فترة التعرض للمخدرات(الشكل 10A).
- حدد آثار البدء والنهاية للتحليل وأدخل المدة الزمنية لكل تتبع ليتم تحليله(الشكل 9).
- قبل البدء في التحليل، حدد مربعات تمكين لكل من حفظ فوز في الدقيقة الواحدة وحفظ الفاصل الزمني interspike (الشكل 10B).
- أدخل اسم الملف المطلوب في المربع تعديل اسم الملف ( الشكل10B). سيتم حفظ البيانات التي تم تحليلها لتردد النبض والفاصل الزمني بين البينية في شكل تنسيق ASCII (نص).
ملاحظة: لتحليل الحالات المختلفة (مثل خط الأساس والاستجابة الدوائية)، يجب إجراء التحليل بشكل منفصل لكل حالة. - انقر فوق الزر تشغيل وتسجيل في شريط علامة التبويب العلوي لبدء التحليل.
- لتصدير البيانات للتطبيقات الأخرى، حدد المربعات لحفظ فوز في الدقيقة الواحدة وحفظ الفاصل الزمني interspike (الشكل 10B). أدخل اسم الملف المطلوب في المربع تعديل اسم الملف ( الشكل10B) وانقر فوق حفظ لحفظ البيانات التي تم تحليلها بتنسيق نص ASCII في المجلد المحدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد السماح للأنسجة بالتأقلم في الطبق لمدة 15 دقيقة ، يتم تسجيل 10 آثار دقيقة واحدة. يسجل بروتوكولنا الحالي النشاط لأكثر من ساعة، ولكننا سجلنا أنماط إطلاق مستقرة ل ≥4 ساعة في بيانات غير منشورة غير مبينة هنا. إذا كان التحضير التجريبي جيدا لجمع البيانات ، فيجب أن تظهر كل قناة تسجيل أشكال موجات متكررة متسقة ومتباعدة بالتساوي (أي طفرات) الشكل الموحد لقناة معينة(الشكل 11D). تتوافق هذه الأشكال الموجية مع دقات القلب الفردية التي تعكس نشاط الإيقاع القلبي الجوهري. يجب أن تكون الفواصل الزمنية بين القنوات هي نفسها لكل قناة حتى لو لم تكن متوافقة تماما عبر القنوات بسبب اختلافات صغيرة في موقعها بالنسبة لموقع بدء إزالة الاستقطاب(الشكل 8). على الرغم من أن شكل الموجات لقناة معينة يجب أن يكون متسقا ، إلا أن شكل الأشكال الموجية سيختلف عبر القنوات اعتمادا على موقع القطب الكهربائي في الأنسجة(الشكل 8). قد تؤثر درجة ملامسة الأنسجة مع القطب أيضا على خصائص الشكل الموجي ، مثل السعة. ومع ذلك، يجب أن يكون الحد الأقصى للسعة 0.5 mV على الأقل بالنسبة لغالبية القنوات إذا كان الإعداد مرضيا. ومن بين الآثار العشرة المسجلة، اختيرت القنوات الثلاث المتتالية التي تستوفي معايير الجودة المبينة أعلاه على أفضل وجه لإجراء مزيد من التحليل المبين أدناه. يظهر الشكل 10A عينة من تردد النبض المستقر (اللوحة العليا) والفاصل الزمني بين البيني (اللوحة الوسطى) لثلاثة آثار متتالية. لا ينبغي تسجيل الأنسجة التي لا تستوفي هذه المعايير حيث من المحتمل أن يكون هناك تلف في الأنسجة من شأنه أن يعوق جمع البيانات بدقة. الشكل 11 يظهر أمثلة من أنماط ارتفاع مستخرج سيئة التي هي إما غائبة (أ)، تتأثر الضوضاء (ب)، أو غير مستقرة (C).
تم جمع بيانات العينة المعروضة في الأرقام من فأر أسود من النوع البري الأسود يبلغ من العمر 45 يوما (Tac:N:NIHS-BC). تم استخدام إجراء التحليل الموضح في الشكل 9 والشكل 10 لاستخراج معدل الإطلاق الجوهري وعرض طفرات خط الأساس التي يمكن رؤيتها في الشكل 12A. معدل إطلاق النار هو متوسط معدل عبر 60،000 مللي ثانية من كل من الآثار الثلاثة، ولكن نمط الارتفاع في الشكل 12A يظهر 5 ق من ممثل ترتفع من أثر واحد. باستخدام برامج التحليل الآلي ، تم العثور على معدل إطلاق النار الجوهري (أي تردد النبض) من الآثار الثلاثة المختارة عبر جميع القنوات ال 64 ليكون حوالي 320 bpm في بيانات العينة(الشكل 12A). بشكل عام ، نلاحظ مجموعة من القيم من حوالي 290-340 bpm في تسجيلاتنا للفئران البرية. ويمكن أيضا استخدام معدل إطلاق النار كطريقة ثانوية لتقييم جودة التحضير. المعدلات التي هي إما غير مستقرة أو أقل بكثير من 300 bpm هي أقل عرضة لتكون جيدة للتحليل. هذه القيم هي مماثلة لكل من القلب المعزول وتسجيلات الخلايا المفردة التي تبلغ عن معدلات القلب الجوهرية في نطاق ما يقرب من 300-500 bpm25،48،49. لذلك ، فإن تقنية تسجيل MEA قادرة على توليد مقاييس موثوقة ودقيقة لمعدل ضربات القلب الجوهري.
ميزة نظام MEA هو أنه يسمح بسهولة تطبيق عوامل المخدرات لاختبار الآثار الدوائية. في تجربة العينة ، اختبرنا آثار 1 mM 4-AP على معدل إطلاق النار ، والتي يجب أن تبطئ نشاط SAN منذ حصار قنوات K+ ذات بوابات الجهد معروف بإعاقة إعادة الاستقطاب المحتملة للعمل في خلايا SA24،50. ويبين الشكل 12B أن إدخال 4-AP زاد من فترات الفاصل الزمني بين البينية كما هو متوقع. هذا الفاصل الزمني ارتفاع لفترات طويلة تتوافق مع انخفاض في وتيرة فوز من 320 bpm إلى 210 bpm. هذا معدل اطلاق النار بعد 4-AP الإدارة مماثلة لدراسة سابقة التي درست آثار 4-AP على معدل إطلاق سان باستخدام تسجيلات القطب واحد من الأنسجة المعزولة. تلك الدراسة قياس معدل اطلاق النار من حوالي 190 bpm في وجود 4-AP50. وبالتالي ، يمكن استخدام نظام MEA كأداة مريحة وقيمة لاختبار الآثار الدوائية للتدخلات الدوائية على وظيفة القلب الجوهرية.
الشكل 1:طلاء صفيف microelectrode (MEA) قبل الاستخدام. (A) يتكون MEA من طبق بلاستيكي صغير مع مجموعة شبكة من 64 microelectrodes في المركز (كما هو موضح في لوحة A1)وأربعة أقطاب مرجعية حول المحيط في نمط مربع. (ب) إضافة 1 مل من العازلة جزيرة الأمير إدوارد لمعطف MEA. (ج)تغطي طبق MEA مع فيلم بالحرارة لاحتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. (د) Aspirating العازلة جزيرة الأمير إدوارد من طبق MEA، الذي يتبعه ما لا يقل عن أربعة شطف مع الماء المقطر. (ه) تخزين مجس MEA المغلفة تحت المياه فائقة النحافة لمنعها من الجفاف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الأدوات المستخدمة لتشريح العقدة الصينية (SAN). وتستخدم الأدوات التالية خلال الجزء تشريح البروتوكول: (1) طبق بيتري مع الاستومر السيليكون ودبابيس تشريح صغيرة؛ '2' طبق بيتري مع اللدائن السيليكون ودبابيس تشريح صغيرة؛ '2' طبق البتر مع اللدائن السيليكونية ودبابيس تشريح صغيرة؛ '2' طبق البتري مع السيلكون ودبابيس التشريح الصغيرة؛ '2' طبق البتر مع السيلكون ودبابيس التشريح الصغيرة؛ ' '2' ماصة نقل البلاستيك؛ '3' مقص كاستروفيجو، مقاس 4"؛ '4' مقص جراحي (مستقيم) لإجراء عمليات القطع؛ '5' دومون #2 ملقط استئصال الأمين؛ '6' ملقط #55 دومون؛ '7' ملقط غرايف الإضافي للغرامة؛ '8' الهموستات (المنحنية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إزالة القلب. (أ) شق عرضية في الجلد فقط تحت الجزء السفلي من القفص الصدري من حوالي قوس كوستال الأيسر إلى القوس كوستال الأيمن. (ب) شق الصفاق. (C, D) شق من الحجاب الحاجز على طول الصدر لفضح تجويف الصدر. (ه) إزالة القلب بعد استئصال الرئتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تشريح العقدة sinoatrial (SAN) . (أ) ظهور القلب في طبق بيتري بعد إزالة من الجسم. (ب) إدخال إبرة الحقنة من خلال الوريد الأجوف السفلي (IVC) والفافا الوريدي المتفوق (SVC) من الأذين الأيمن. يظهر الدبوس في قمة القلب أيضا. (ج)استئصال قمة (أي النصف السفلي) من القلب لإطلاق الدم. كما تظهر الدبابيس الموجودة في الزوائد الأذينية. (د)المظهر النهائي للمنطقة سان من الأذين الأيمن في نهاية تشريح. المنطقة محاصر يتوافق مع الموقع التقريبي لل SAN. ويمكن أيضا أن ينظر إلى الشريان سان باهتة coursing من خلال سان في اتجاه عمودي. الاختصارات: AO, الشريان الأورطي; CT, كريستا الطرفية; IVC, أدنى فينا كافا; لوس انجليس، الأذين الأيسر؛ RA، الأذين الأيمن. RAA، ملحق الأذين الأيمن؛ SAN، عقدة سينواتين؛ SVC، متفوقة فينا كافا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5:تخطيطي لإعداد نظام تسجيل صفيف microelectrode (MEA). وتشمل المكونات التالية النظام:(أ)اسطوانة غاز (كاربوجين: 95٪ O2/ 5٪ CO2); (ب) قارورة مخروطية مع الماء المقطر لترطيب الغاز؛ (ج) تسجيل زجاجة حل التيرود التي توفر تدفق إلى طبق MEA؛ (د) مضخة التجبير لضخ الحل من وإلى طبق MEA; (ه) منظم درجة الحرارة؛ (F) لوحة موصل MEA الذي يتلقى إشارات من طبق MEA; (G) مكبر للصوت; (H) الكمبيوتر; (I) زجاجة جمع لمحلول النفايات المستخدمة من طبق MEA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تحديد المواقع من الأنسجة العقدية SA على MEA. (أ) الأدوات المستخدمة في تحديد المواقع النسيج: (1) شبكة مع حجم الشبكة 1.5 ملم، (2) مرساة القيثارة، (3) ملقط العظام، (4) فرشاة الطلاء. (ب) تحديد موقع النسيج على MEA. يشير المربع الأصفر إلى المساحة التقريبية لمنطقة العقدة الصينية تحت الشبكة والمرساة في طبق MEA. (ج)ترتيب طبق MEA مع الأنسجة المغلقة على لوحة موصل لتسجيل حقل المحتملة: (1) مدخل لمحلول التسجيل؛ '2' مدخل لمحلول التسجيل؛ '2' مدخل لمحلول التسجيل؛ '2' مدخل لطبقة الأنسجة. '2' مدخل للغاز (كاربوجين)؛ '3' منفذ للحل؛ '4' لوحة موصل microelectrode؛ '5' غطاء التشويش؛ '6' حلقة قطب كهربائي مرجعية متصلة بالغطاء؛ '7' شريط للحفاظ على الغطاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: إعداد بروتوكول الحصول على البيانات في البرنامج. (أ) مثال على تسجيل قالب يظهر ترتيب جميع القنوات 64. (ب) مثال على خصائص إدخال البرامج لشروط التسجيل. (ج) مثال على قائمة التعليقات التوضيحية التي توضح كيفية إضافة مرحلة جديدة أثناء التسجيل، مثل قياس آثار المخدرات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: مناطق مختلفة من الأنسجة تظهر أشكال موجة نشاط مختلفة. مثال لقطة شاشة تظهر أشكال موجات بأشكال واتساعات مختلفة في قنوات مختلفة. ومع ذلك، تظهر جميع القنوات فترات فاصلة متطابقة وترددات إطلاق. تتوافق القنوات داخل الصندوق الأحمر تقريبا مع الأقطاب الكهربائية الموضوعة داخل منطقة سان في الأنسجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: قالب تحليل تردد Beat. مثال قالب يوضح ترتيب جميع القنوات ال 64 في قالب تحليل تردد النبض. يعرض مجموعة Inset ملف البيانات Raw Replay مثالا على خصائص الإدخال في إطار التحليل. في هذا المثال، تم اختيار الآثار من 5 إلى 7 للتحليل، وحددت مدة التحليل لكل أثر على أنها 60000 مللي ثانية.
الشكل 10: تحديد معلمات التحليل لاستخراج المسامير. (أ) نتائج قالب التحليل التمثيلي ل 3 آثار محددة لقناة واحدة. تعرض اللوحة العلوية تردد النبض للتتبعات الثلاثة المحددة (ثلاثة مجموعات محددة من نقاط البيانات)، وتمثل كل نقطة متوسط 10-s لتردد النبض أثناء التتبع المحدد. تعرض اللوحة الوسطى الفاصل الزمني بين الارتفاعات الثلاثة المحددة (ثلاثة مجموعات محددة من نقاط البيانات)، وتمثل كل نقطة بيانات الفاصل الزمني بين الارتفاع بين ارتفاعين متتاليين. تظهر اللوحة اليسرى السفلية مسامير مستخرجة ممثلة مختارة لآخر 5 ق من التتبع الثالث ، في حين تظهر اللوحة اليمنى السفلية شكل موجة مستخرج مشتق من مجموعة 5-s من المسامير المستخرجة في اللوحة اليسرى السفلية. (ب) عرض موسع لنافذة التحليل تظهر المعلمات المستخدمة في تحليل تردد الضرب لل آثار 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11:الرقم التمثيلي الذي يظهر استخراج بيانات جيدة مقابل سيئة لقناة معينة. استخراج البيانات السيئة: (أ) غياب مستخرج المسامير; (ب) مستخرج مسامير مع إشارات الضوضاء; (ج) مستخرجة غير مستقرة المسامير. (D) بيانات جيدة تظهر مسامير مستقرة مستخرجة دون إشارات الضوضاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 12: التسجيلات عند خط الأساس وبعد إدارة 1mM 4-Aminopyridine (4-AP). (A) تسجيل خط الأساس من microelectrode واحد يظهر الموجي مع تردد اطلاق مستقر من 320 bpm في قلب WT. (ب) بعد إدارة 4-AP، يتباطأ تردد إطلاق النار إلى معدل مستقر قدره 210 bpm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ممارسة واتقان عملية تشريح سان أمر حتمي لأن الأنسجة هشة والأنسجة السليمة ضرورية لتسجيل ناجح. أثناء تشريح سان، التوجه الصحيح ضروري للحصول على المنطقة المناسبة من الأنسجة. ومع ذلك ، يمكن بسهولة فقدان التوجه الأصلي للقلب أثناء عملية التشريح ، مما يعقد هذا المسعى. لذلك ، لضمان التوجه الصحيح بين اليسار واليمين ، يجب فحص الأذين بصريا. عادة، الأذين الأيمن يميل إلى أن يكون أكثر شفافية، في حين أن الأذين الأيسر عادة ما يكون أغمق وأكثر أحمر في اللون25،48. وعلاوة على ذلك، فمن الضروري عدم تمديد الأنسجة سان أثناء العمل معها أو تركيبها على شبكة القطب الكهربائي، كما هو تلف الأنسجة بسهولة ميكانيكيا51. نصيحة للتحقق من صحة وتشريح الأنسجة سان بشكل صحيح هو فحصه في حل تام تايرود تحت المجهر للتحقق من أن الأنسجة هو الضرب. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يجب أن يكون ما لا يقل عن 90٪ من مستحضرات الأنسجة جيدا للتسجيل.
ويمكن لعدة اعتبارات أن تحسن احتمال نجاح التسجيلات وتحليل البيانات اللاحق. لضمان أفضل التسجيلات، ينبغي إعداد الحلول بعناية واختبارها على عينات الماوس الممارسة قبل التسجيلات التجريبية. عملنا على نطاق واسع على التكيف وتعديل حل التسجيل لتحسين صحة أنسجة سان. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن الغاز المستخدم للتسجيل هو كاربوجين (أي 95٪ O2/5٪ CO2). غالبا ما تستخدم تسجيلات الخلايا المفردة الأكسجين النقي بسبب التركيب الكيميائي المحدد لمحلول التيرود المستخدم في هذا التطبيق ، ولكن الحل المستخدم للتسجيل على MEA يتطلب كاربوجين من أجل الحفاظ على رقم PH مستقر. استخدام الأكسجين النقي مع حل التيرود لتسجيلات MEA سوف يسبب تقلبات في الحموضة التي يمكن أن تؤدي إلى تدهور سريع في الأنسجة. تقييم الحد الأقصى للسعة في القنوات كما هو موضح سابقا سيساعد على تحديد ما إذا كان النسيج من نوعية تسجيل جيدة. وأخيرا ، للمساعدة في التحليل بعد التسجيل ، فإن التقاط صورة لأنسجة SAN المثبتة على صفيف القطب MEA بعد الانتهاء من التسجيل أمر مفيد للغاية. يمكن أن يتحول النسيج قليلا أثناء الإعداد الأولي ل MEA ، وهذا يوفر التقييم الأكثر دقة لوضع القطب للتحليل.
نقترح تسجيلات MEA كطريقة شاملة ودقيقة لوصف معدل إطلاق SAN. ميزة تقنية MEA هي أنها تسمح للمجرب بالتقاط معدلات إطلاق النار على قدم المساواة مع تسجيلات الخلايا المفردة دون الحاجة إلى خبرة كهربية واسعة النطاق. تقنية MEA لديها أيضا ميزة القضاء على التأثيرات المحيرة المحتملة للآليات العصبية والميكانو الكهربائية ، والتي هي متأصلة في تسجيلات القلب المعزولة وفي قياسات الحصار اللاإرادي في الجسم الحي 21. انكماش البطين والتنفس هي التأثيرات الرئيسية الميكانيكية الكهربائية التي يمكن أن تغير إطلاق SAN، ولكن يتم القضاء عليها في إعداد الأنسجة لدينا 52،53. في حين أن أسلوبنا يلغي معظم التأثيرات اللاإرادية على سان ، وعدد محدود من التوقعات ICNS المتبقية في الأذين الأيمن يمكن أن تؤثر على اطلاق النار سان ، وهو القيد النظري الذي ينبغي أن يوضع في الاعتبار خلال تفسير النتائج5،6،22،23. ميزة أخرى لتقنية MEA الموصوفة هنا هي أنه يمكن تكييفها للعديد من أنواع أخرى من دراسات القلب. على سبيل المثال ، على الرغم من أن هذا البروتوكول أظهر آثار 4-AP على نشاط سان ، يمكن للدراسات المستقبلية أن تنظر في عدد لا حدود له تقريبا من العوامل الدوائية ، فضلا عن آثار الطفرات الجينية على إطلاق SAN الجوهري. على سبيل المثال، يمكن استخدام إيفابرادين، وهو مانع محدد لقناة Hcn4 الخاصة ب SAN، لدراسة المساهمات الحالية المضحكة في معدل إطلاق النار54. يمكن استخدام نظام MEA أيضا لقياس وظيفة القلب في مناطق القلب الأخرى ، مما يسمح بتحديد مفصل لكل منطقة. ومع ذلك ، فإن التسجيل من مناطق القلب الأخرى يتطلب أساليب تشريح مختلفة وإمكانية تقسيم الأنسجة الرقيقة قبل التسجيل. أحد القيود الهامة المحتملة لهذه التقنية هو التكلفة العالية لشراء نظام MEA الذي يمكن أن يكون مانعا. تتوفر العديد من أنظمة MEA في السوق مع خصائص ووظائف مماثلة ، ولكن التكلفة العالية لا تزال هي نفسها. ومع ذلك، بمجرد الحصول على المعدات والبرمجيات الأولية، تكون تكلفة صيانة واستخدام نظام MEA منخفضة إلى حد ما. وثمة قيد آخر هو أن نظام MEA يسمح فقط بتسجيل إمكانات المجال خارج الخلية التي لا تؤدي إلى مقارنات دقيقة للخصائص المحتملة للعمل (مثل السعة والشكل) بين الاستعدادات مثل التي يمكن تحقيقها مع التسجيلات داخل الخلية الواحدة. باختصار، يوفر هذا البروتوكول سير عمل فعال لقياس وتحليل معدلات إطلاق القلب الجوهرية في أنسجة الماوس SAN مع القدرة على دراسة آثار التدخل الدوائي على معدل إطلاق النار بطريقة محددة للغاية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة، وأرقام المنح R01NS100954 وR01NS099188.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920x1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
References
- Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
- Josea, A. D., Collison, D. The normal range and determinants of the intrinsic heart rate in man. Cardiovascular Research. (4), 160-167 (1970).
- Peters, C. H., Sharpe, E. J., Proenza, C. Annual Review of Physiology Cardiac Pacemaker Activity and Aging. Annual Review of Physiology. 82, 21-43 (2019).
- Keith, A., Flack, M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. Journal of Anatomy and Physiology. 41 (3), 172-189 (1907).
- Wake, E., Brack, K. Characterization of the intrinsic cardiac nervous system. Autonomic Neuroscience. 199, (2016).
- Fedele, L., Brand, T. The intrinsic cardiac nervous system and its role in cardiac pacemaking and conduction. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 7 (4), 1-33 (2020).
- Mangrum, J. M., DiMarco, J. P. The evaluation and management of bradycardia. New England Journal of Medicine. 342 (10), 703-709 (2000).
- Adan, V., Crown, L. A. Diagnosis and treatment of Sick Sinus Syndrome. American Family Physician. 67 (8), 1725-1732 (2003).
- Semelka, M., Gera, J., Usman, S. Sick Sinus Syndrome: A Review. American Family Physician. 87 (10), 691-696 (2013).
- Zaragoza, M. V., et al. Exome sequencing identifies a novel LMNA splice-site mutation and multigenic heterozygosity of potential modifiers in a family with Sick Sinus Syndrome, dilated cardiomyopathy, and sudden cardiac death. PLoS ONE. 11 (5), 0155421 (2016).
- Brugada, J., Campuzano, O., Arbelo, E., Sarquella-Brugada, G., Brugada, R. Present status of Brugada Syndrome: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (9), 1046-1059 (2018).
- Rollin, A., et al. Prevalence, characteristics, and prognosis role of type 1 ST elevation in the peripheral ECG leads in patients with Brugada syndrome. Heart Rhythm. 10 (7), 1012-1018 (2013).
- Patel, N., Majeed, F., Sule, A. A. Seizure triggered by Sick Sinus Syndrome. BMJ case reports. 4, 2017222011 (2017).
- Knecht, S., et al. Impact of pharmacological autonomic blockade on complex fractionated atrial electrograms. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (7), 766-772 (2010).
- Saba, S., London, B., Ganz, L. Autonomic blockade unmasks maturational differences in rate-dependent atrioventricular nodal conduction and facilitation in the mouse. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 14 (2), 191-195 (2003).
- Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 51-56 (2002).
- Tse, G., Tse, V., Yeo, J. M., Sun, B. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts. PLoS ONE. 11 (2), 0148858 (2016).
- Tse, G., et al. Quantification of beat-to-beat variability of action potential durations in Langendorff-perfused mouse hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1578), 01578 (2018).
- Avula, U. M. R., et al. Heterogeneity of the action potential duration is required for sustained atrial fibrillation. JCI Insight. 5 (11), 128765 (2019).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. (135), e57617 (2018).
- Quinn, A. T., Kohl, P. Cardiac mechano-electric coupling: Acute effects of mechanical stimulation on heart rate and rhythm. Physiological Reviews. 101 (1), 37-92 (2021).
- Ripplinger, C. M., Noujaim, S. F., Linz, D. The nervous heart. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 199-209 (2016).
- Pauza, D. H., Pauziene, N., Pakeltyte, G., Stropus, R. Comparative quantitative study of the intrinsic cardiac ganglia and neurons in the rat, guinea pig, dog and human as revealed by histochemical staining for acetylcholinesterase. Annals of Anatomy. 184, 125-136 (2002).
- Golovko, V., Gonotkov, M., Lebedeva, E. Effects of 4-aminopyridine on action potentials generation in mouse sinoauricular node strips. Physiological Reports. 3 (7), 12447 (2015).
- Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), e54555 (2016).
- Doi, M., Ogawa, E., Arai, T. Effect of a photosensitization reaction performed during the first 3 min after exposure of rat myocardial cells to talaporfin sodium in vitro. Lasers in Medical Science. 32 (8), 1873-1878 (2017).
- Takanari, H., et al. A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology. Journal of Cellular Physiology. 231 (10), 2249-2256 (2016).
- Nakashima, T., et al. Rapid electrical stimulation causes alterations in cardiac intercellular junction proteins of cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1324-1333 (2014).
- Suzuki, S., et al. Effects of aldosterone on Cx43 gap junction expression in neonatal rat cultured cardiomyocytes. Circulation Journal. 73 (8), (2009).
- Horiba, M., et al. T-type Ca2+ channel blockers prevent cardiac cell hypertrophy through an inhibition of calcineurin-NFAT3 activation as well as L-type Ca2+ channel blockers. Life Sciences. 82 (11-12), 554-560 (2008).
- Inoue, N., et al. Rapid electrical stimulation of contraction modulates gap junction protein in neonatal rat cultured cardiomyocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases and effects of angiotensin II receptor agonist. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 914-922 (2004).
- Aalders, J., et al. Effects of fibrillin mutations on the behavior of heart muscle cells in Marfan syndrome. Scientific Reports. 10 (16756), (2020).
- Matsuura, K., et al. Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets. Biomaterials. 32 (30), 7355-7362 (2011).
- Fujita, H., Shimizu, K., Nagamori, E. Application of a cell sheet-polymer film complex with temperature sensitivity for increased mechanical strength and cell alignment capability. Biotechnology and Bioengineering. 103 (2), 370-377 (2009).
- Baba, S., et al. Generation of cardiac and endothelial cells from neonatal mouse testis-derived multipotent germline stem cells. Stem Cells. 25 (6), 1375-1383 (2007).
- Baba, S., et al. Flk1+ cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model. Cardiovascular Research. 76 (1), 119-131 (2007).
- Shimizu, K., et al. Construction of multi-layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 803-809 (2007).
- Haraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. Electrical coupling of cardiomyocyte sheets occurs rapidly via functional gap junction formation. Biomaterials. 27 (27), 4765-4774 (2006).
- Miyagawa, S., et al. Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: Their integration with recipient myocardium. Transplantation. 80 (11), 1586-1595 (2005).
- Watts, M., et al. Decreased bioavailability of hydrogen sulfide links vascular endothelium and atrial remodeling in atrial fibrillation. Redox Biology. 38, 101817 (2021).
- Feng, Y., Cao, H., Zhang, Y. Prediction model of sinoatrial node field potential using high order partial least squares. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 1805-1811 (2015).
- Feng, Y., Cao, H., Wang, Y., Zhang, Y. Fuzzy linguistic prediction model for sinoatrial node field potential analysis in acute hyperglycemia environment. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, Suppl 1 881-887 (2015).
- Suzuki, K., Matsumoto, A., Nishida, H., Reien, Y., Maruyama, H., Nakaya, H. Termination of aconitine-induced atrial fibrillation by the KACh-channel blocker tertiapin: underlying electrophysiological mechanism. Journal of Pharmacological Sciences. 125 (4), 406-414 (2014).
- Chang, S. -L., et al. Heart failure enhances arrhythmogenesis in pulmonary veins. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 38 (10), 666-674 (2011).
- Wang, Y. -J., et al. Time-dependent block of ultrarapid-delayed rectifier K+ currents by aconitine, a potent cardiotoxin, in heart-derived H9c2 myoblasts and in neonatal rat ventricular myocytes. Toxicological Sciences. 106 (2), 454-463 (2008).
- Lai, Y. -J., Huang, E. Y. -K., Yeh, H. -I., Chen, Y. -L., Lin, J. J. -C., Lin, C. -I. On the mechanisms of arrhythmias in the myocardium of mXinα-deficient murine left atrial-pulmonary veins. Life Sciences. 83 (7-8), 272-283 (2008).
- Gustafson-Wagner, E. A., et al. Loss of mXinα, an intercalated disk protein, results in cardiac hypertrophy and cardiomyopathy with conduction defects. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (5), 2680-2692 (2007).
- Clark, R. B., et al. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, 1757-1766 (2004).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Nikmaram, M. R., et al. Characterization of the effects of Ryanodine, TTX, E-4031 and 4-AP on the sinoatrial and atrioventricular nodes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 96 (1-3), 452-464 (2008).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
- Masé, M., Glass, L., Ravelli, F. A model for mechano-electrical feedback effects on atrial flutter interval variability. Bulletin of Mathematical Biology. 70 (5), 1326-1347 (2008).
- Franz, M. R., Bode, F. Mechano-electrical feedback underlying arrhythmias: The atrial fibrillation case. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 82 (1-3), 163-174 (2003).
- Bucchi, A., Tognati, A., Milanesi, R., Baruscotti, M., DiFrancesco, D. Properties of ivabradine-induced block of HCN1 and HCN4 pacemaker channels. Journal of Physiology. 572 (2), 335-346 (2006).
