Summary
Este protocolo visa descrever uma nova metodologia para medir a taxa de disparo cardíaco intrínseco usando o registro de matriz de microeletrínda de todo o tecido do nódulo sinoatrial para identificar defeitos de marcação de ritmo em camundongos. Agentes farmacológicos também podem ser introduzidos neste método para estudar seus efeitos no ritmo intrínseco.
Abstract
O nódulo sinoatrial (SAN), localizado no átrio direito, contém as células marcapasso do coração, e a disfunção desta região pode causar taquicardia ou bradicardia. A identificação confiável de defeitos cardíacos de pacemaking requer a medição de frequências cardíacas intrínsecas, impedindo em grande parte a influência do sistema nervoso autônomo, que pode mascarar déficits de taxas. Os métodos tradicionais para analisar a função de marca-passo cardíaco intrínseco incluem bloqueio autônomo induzido por drogas para medir as frequências cardíacas in vivo, registros cardíacos isolados para medir as frequências cardíacas intrínsecas e registros sinoatrial de células-chave de remendo de células-passo sinoatrial para medir as taxas de disparo potenciais de ação espontânea. No entanto, essas técnicas mais tradicionais podem ser tecnicamente desafiadoras e difíceis de executar. Aqui, apresentamos uma nova metodologia para medir a taxa de disparo cardíaco intrínseco realizando gravações de matriz de microeletrínda (MEA) de preparações de nós sinoatrial de conjunto inteiro de camundongos. Os MEAs são compostos de múltiplos microeletrodos dispostos em um padrão semelhante à grade para gravação de potenciais de campo extracelular in vitro. O método descrito aqui tem a vantagem combinada de ser relativamente mais rápido, simples e mais preciso do que abordagens anteriores para registrar frequências cardíacas intrínsecas, ao mesmo tempo em que permite um interrogatório farmacológico fácil.
Introduction
O coração é um órgão complexo governado por influências cardíacas-intrínsecas e extrínsecas, como as que se originam no cérebro. O nódulo sinoatrial (SAN) é uma região definida no coração que abriga as células marcapasso (também conhecidas como células sinoatrial, ou células SA) responsáveis pela iniciação e perpetuação dos batimentos cardíacos mamíferos1,2. A frequência cardíaca intrínseca é a taxa impulsionada pelas células marcapasso sem influência por outras influências cardíacas ou neuro-humorais, mas medidas tradicionais de frequência cardíaca em humanos e animais vivos, como eletrocardiogramas, refletem tanto o marca-passo quanto as influências neurais no coração. A influência neural mais notável nas células SA é do sistema nervoso autônomo, que modula constantemente padrões de disparo para atender aos requisitos fisiológicos do corpo3. Apoiando essa ideia, projeções simpáticas e parassimpáticas podem ser encontradas perto da SAN4. O sistema nervoso cardíaco intrínseco (ICNS) é outra importante influência neural onde plexi ganglioado, especificamente na ária direita, inerva e regula a atividade da SAN5,6.
Entender os déficits de pacemaking é clinicamente importante, pois a disfunção pode fundamentar muitos distúrbios cardíacos, bem como contribuir para o risco de outras complicações. A síndrome do seio doente (SSS) é uma categoria de doenças caracterizadas pela disfunção do nódulo sinoatrial que impede o bom funcionamento do ritmo7,8. SSS pode apresentar sinus bradycardia, pausas sinusas, parada sinusal, bloco de saída sinoatrial, e bradidinathmias alternadas e taquiarritmias9 e pode levar a complicações, incluindo aumento do risco de derrame embólico e morte súbita8,10. Aqueles com síndrome de Brugada, uma doença cardíaca marcada pela fibrilação ventricular com risco aumentado de morte cardíaca súbita, correm maior risco de eventos arrhitogênicos se também tiverem disfunção comorbóide de SAN11,12. A disfunção sinoatrial também pode ter consequências fisiológicas além do coração. Por exemplo, a SSS tem sido observada para desencadear convulsões em um paciente devido à hipoperfusão cerebral13.
Para identificar déficits de pacemaking sinoatrial, as frequências cardíacas intrínsecas precisam ser determinadas medindo a atividade da SAN sem a influência do sistema nervoso autônomo ou fatores humorísticos. Clinicamente, isso pode ser aproximado pelo bloqueio autônomo farmacológico14,mas essa mesma técnica também pode ser aplicada em modelos mamíferos para estudar a função cardíaca intrínseca15,16. Embora essa abordagem bloqueie uma grande parte das influências neurais contribuintes e permita o exame cardíaco in vivo, ela não elimina completamente todas as influências extrínsecas no coração. Outra técnica de pesquisa usada para estudar a função cardíaca intrínseca em modelos animais são as gravações cardíacas isoladas usando corações perfumados langendorff, que normalmente envolvem medidas usando eletrogramas, ritmo ou matrizes multieletrínois epicáridas17,18,19,20. Embora essa técnica seja mais específica para a função cardíaca, pois envolve a remoção do coração do corpo, as medidas ainda podem ser influenciadas por mecanismos autoregulatórios mecano-elétricos que podem influenciar as medições intrínsecas da frequência cardíaca21. As gravações cardíacas isoladas também podem ser influenciadas pela regulação autônoma através do ICNS5,6,22,23. Além disso, manter uma temperatura fisiologicamente relevante do coração, que é fundamental para as medidas de função cardíaca, pode ser difícil em abordagens cardíacas isoladas20. Um método mais direto para estudar a função SAN é isolar especificamente o tecido SAN e medir sua atividade. Isso pode ser realizado através de tiras SAN (tecido SAN isolado) ou células-passo isoladas de SAN24,25. Ambos requerem um alto grau de treinamento técnico, já que a SAN é uma região muito pequena e altamente definida, e o isolamento celular representa um desafio ainda maior, pois a dissociação pode prejudicar a saúde geral da célula se não for realizada corretamente. Além disso, essas técnicas requerem habilidades eletrofisiológicas especializadas para registrar com sucesso a partir do tecido ou células usando microeletrodos de gravação individuais.
Neste protocolo, descrevemos uma técnica para registrar o SAN in vitro usando uma matriz de microeletríndia (MEA) para obter medições intrínsecas da frequência cardíaca. Essa abordagem tem a vantagem de tornar registros eletrofisiológicos altamente específicos acessíveis a pesquisadores sem habilidades eletrofisiológicas intensivas. Os MEAs já foram utilizados para estudar a função cardiomiócito nas culturas de cardiomiócito primário26,27,28,29,30,31,32, folhas cardíacas33,34,35,36,37,38,39, e montagems inteiras de tecido40, 41,42,43,44,45,46,47. Trabalhos anteriores também foram feitos para examinar os potenciais de campo no tecidoSAN 41,42. Aqui, fornecemos uma metodologia para usar o MEA para registrar e analisar as taxas de disparo de SAN intrínsecas murinas. Também descrevemos como essa técnica pode ser usada para testar efeitos farmacológicos de drogas em taxas de disparo intrínsecos de SAN, fornecendo um experimento amostral mostrando os efeitos de 4-aminopirridina (4-AP), um bloqueador de canal K+ canal fechado por tensão. Usando marcos anatômicos definidos, podemos registrar com precisão a SAN sem ter que realizar as extensas dissecções teciduais ou isolamentos celulares necessários em outros métodos. Embora o MEA possa ser proibitivo de custos, as gravações fornecem medidas altamente específicas e confiáveis de pacemaking que podem ser usadas em uma vasta gama de aplicações de pesquisa clínica e fisiológica.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais aqui descritos foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH), conforme aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Metodista do Sul.
1. Revestindo a matriz multieletrísda (MEA) para gravação
- Faça um buffer de borate de 25 mM.
- Dissolver 0,953 g de Na2B4O7·10 H2O em 80 mL de água destilada.
- Ajuste o pH para 8,4 com HCl e, em seguida, adicione água destilada a um volume final de 100 mL.
- Faça uma solução de estoque de 0,1% de polietileneimina (PEI).
- Adicione 100 μL de 50% (w/v) PEI a 4,9 mL de água destilada para fazer uma solução PEI de 1%.
- Diluir a solução PEI de 1% para 0,1% no buffer de borate adicionando 1 mL da solução PEI de 1% para 9 mL do buffer de 25 mM borate.
- Pipeta ~1 mL da solução PEI de 0,1% no prato de matriz de microeletrísmo (MEA) para que os eletrodos estejam completamente cobertos(Figura 1A e 1B).
NOTA: Os microelerodes do MEA são tipicamente compostos de nanotubo preto ou carbono platinado e isolados com poliimida (ou acrílico); ambos os materiais são hidrofóbicos. Ao revestir o MEA com um polímero cônico como o PEI, a superfície meofóbica mefóbica torna-se mais hidrofílica, permitindo que amostras de tecido façam melhor contato com a superfície MEA(Figura 1A1). - Cubra o prato MEA com película termoplástica para reduzir a evaporação e deixe o MEA durante a noite em temperatura ambiente(Figura 1C).
- Aspire a solução PEI do prato MEA usando uma pipeta, tomando cuidado para não tocar na grade de eletrodos que pode danificar os eletrodos e, em seguida, enxágüe ≥4 vezes com água destilada(Figura 1D).
- Armazene o MEA revestido de PEI sob 1-2 mL de água ultrapura e selado com película termoplástica a 4 °C até que seja necessário. Alternativamente, armazene o MEA revestido submergindo-o em um béquer cheio de água ultrapura(Figura 1E).
NOTA: O processo de revestimento PEI só precisa ser realizado uma vez para o MEA antes de seu primeiro uso, e após cada sessão de gravação, o MEA deve ser armazenado submerso em água ultrapura.
2. Preparando a solução completa de Tyrode para dissecção tecidual
- Faça 1.000 mL de solução completa da Tyrode para dissecção; primeiro, adicione 8,1816 g de NaCl a 800 mL de água ultrapura.
- Adicionar a seguinte quantidade de produtos químicos à solução: 0,4025 g de KCl; 0,1633 g de KH2PO4; 1.1915 g de HEPES; 0,9999 g de glicose; 0,0952 g de MgCl2; 0,2646 g de CaCl2·2H2O.
- Ajuste o pH para 7.4 com NaOH e, em seguida, adicione água ultrauso até que o volume total seja de 1.000 mL.
NOTA: A composição final da solução completa de Tyrode será a seguinte (em mM): 140 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 KH2PO4, 5 HEPES, 5,55 glicose, 1 MgCl2, 1.8 CaCl2.
3. Preparar a solução oxigenada de Tyrode para gravação
- Fazer 500 mL da solução de Tyrode; adicionar 4.003 g de NaCl a 400 mL de água ultrapura.
- Adicione as seguintes quantidades de produtos químicos à solução: 0,651 g de NaHCO3; 0,042 g de NaH2PO4; 0,132 g de CaCl2·2H2O; 0,149 g de KCL; 0,0476 g de MgCl2; 0,999 g de glicose.
- Ajuste o pH para 7,4 com HCl e, em seguida, adicione água ultrauso até que o volume total seja de 500 mL.
- Oxigene a solução com carbogen por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente antes de iniciar a gravação.
NOTA: A composição final da solução de Tyrode será a seguinte (em mM): 137 NaCl, 15,5 NaHCO3, 0,7 NaH2PO4, 1.8 CaCl2, 4 KCl, 1 MgCl2, 11,1 glicose. Esta solução da Tyrode tem uma composição ligeiramente diferente da solução Completa Tyrode usada para dissecção.
4. Preparando a solução de 4-aminopirdina (4-AP) para modulação farmacológica
- Faça uma solução de trabalho de 1 mM de 4-AP; adicionar 18,82 mg de 4-AP a 200 mL da solução tyrode a partir do passo 3.
- Oxigene a solução 4-AP por pelo menos 30 minutos antes do experimento.
5. Preparando a placa de Petri para dissecção
- Misture os componentes do elastômero de silicone em uma proporção de 10:1 (por peso) da base ao agente de cura.
- Despeje ~15 mL de mistura de elastômero de silicone em uma placa de Petri de 60 mm de diâmetro.
- Deixe que o elastômero cure à temperatura ambiente por 48 h antes de usar.
NOTA: A placa de Petri siliconada pode ser reutilizada para futuras dissecções.
6. Dissecando o nó sinoatrial (SAN)
- Prepare a solução heparinizada completa da Tyrode para dissecção de SAN.
- Adicione 400 μL de heparina (1.000 USP/mL) a 40 mL de solução completa de Tyrode e morque em um banho de água de 37 °C.
- Injete o rato intraperitonealmente com 200-300 μL de heparina (1000 USP/mL) e permita que o animal se sente por 10 minutos.
- Eutanize o rato heparinizado por overdose de isoflurane.
- Coloque o mouse em uma pequena câmara de vidro que contenha vapores de isoflurano gerados adicionando 200-300 μL de isoflurane líquido a um papel filtro dentro de um tubo de plástico perfurado.
NOTA: Como o isoflurano pode causar irritação na pele e também pode ser absorvido pela pele, o líquido não deve entrar em contato diretamente com o camundongo. Portanto, o lenço encharcado de isofrano é colocado em um tubo perfurado para administração. - Verifique a morte por cessação do esforço de movimento e respiração e pela ausência de um reflexo de beliscão do dedo do dedo. A morte geralmente leva cerca de 1-2 minutos após a colocação na câmara.
NOTA: A morte é geralmente acompanhada de urinação.
- Coloque o mouse em uma pequena câmara de vidro que contenha vapores de isoflurano gerados adicionando 200-300 μL de isoflurane líquido a um papel filtro dentro de um tubo de plástico perfurado.
- Coloque o mouse em uma posição supina em uma placa de dissecção com as patas estendidas e fixe as patas na placa usando agulhas de seringa de 1 polegada de comprimento e calibre 23. Em seguida, remova a pele nas proximidades da parte inferior da caixa torácica usando uma tesoura cirúrgica e cortando a pele nas raízes.
NOTA: Para uma placa de dissecção, podem ser usadas tampas de refrigerador de poliestireno. - Enquanto segura a pele com um hemostat, use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão transversal na pele logo abaixo do fundo da caixa torácica de cerca do arco costal esquerdo para o arco costal direito(Figura 3A).
- Corte o peritônio com uma tesoura cirúrgica e separe cuidadosamente o fígado do diafragma, tomando cuidado para não cortar o fígado, o que causará sangramento excessivo(Figura 3B). Incisar o diafragma ao longo do tórax para expor a cavidade torácica (Figura 3C-D).
- Utilizando uma tesoura cirúrgica, corte as paredes laterais da caixa torácica das bordas dos arcos costais até as clavículas para expor o coração, tomando cuidado para evitar danificar o coração(Figura 3D). Em seguida, use uma agulha de seringa calibre 23 para fixar a caixa torácica sobre o ombro, segurando-a no lugar e fora do caminho do campo cirúrgico.
- Use uma pipeta de transferência para gotejar quente (37 °C) heparinizado solução completa tyrode para o coração para mantê-lo úmido.
NOTA: Não deixe o coração secar. - Remova os pulmões segurando-os com fórceps graefe extra finos e cortando a traqueia com uma tesoura cirúrgica(Figura 3E).
- Segure o ápice do coração com fórceps graefe extra finos e remova-o cortando a aorta e a cava de venae com uma tesoura cirúrgica. Transfira o coração para uma placa de Petri contendo elastômero de silicone curado(Figura 4A) e use uma pipeta de transferência para banhar o coração com 2-3 mL de solução de Tyrode heparinizada heparinizada.
NOTA: Tenha cuidado para não danificar a delicada parede posterior da ária direita, que contém a SAN, e as veias atrial direita conectadas. Banhar o coração com a solução completa de Tyrode impede que o coração seque, mas não submerga totalmente o coração em solução, pois prejudicará a visibilidade durante a dissecção. - Oriente o coração com o átrio direito à direita do experimentador e o átrio esquerdo à esquerda do experimentador.
NOTA: A dissecação do tecido san deve ser feita rapidamente para evitar lesões relacionadas à isquemia. - Coloque o ápice do coração no prato com um pino de dissecção. Em seguida, ao segurar a veia cava inferior com Dumont #2 fórceps de laminectomia, insira uma agulha de seringa de 22 G através da cava vena inferior e superior para localizar sua posição no átrio direito, que também identifica a posição aproximada da SAN (localizada no patch de tecido entre a veia cava inferior e superior(Figura 4B).
- Usando pequenos pinos de dissecção, fixar os apêndices atrial esquerdo e direito ao prato.
- Enquanto segurava o apêndice atrial esquerdo com Dumont #2 fórceps de laminectomia, coloque um pino de dissecção através do apêndice atrial esquerdo para mantê-lo no lugar.
- Enquanto segurava o apêndice atrial direito com Dumont #55 fórceps, coloque um pino de dissecção através do apêndice atrial direito para mantê-lo no lugar.
NOTA: O mesmo tipo de fórceps pode ser usado para segurar os apêndices atrial esquerdo e direito, se desejar.
- Remova a agulha de seringa que abrange a cava de venae.
- Para liberar sangue do coração, use a tesoura Castroviejo para remover o ápice do coração (ou seja, a metade inferior) fazendo uma incisão transversal através dos ventrículos(Figura 4C). Em seguida, lave o coração adicionando a solução de Tyrode completa heparinizada com uma pipeta de transferência.
- Use a tesoura Castroviejo para cortar ao longo do septo atrioventricular mantendo a incisão mais perto do ventrículo do que a atria. Continue cortando ao longo do septo atrioventricular até que a ária seja separada dos ventrículos.
- Corte ao longo do septo interarial para remover o átrio esquerdo.
- Coloque pinos de dissecção na periferia do átrio direito para deixá-lo liso(Figura 4D). Remova qualquer gordura, vasos ou tecido restantes do átrio usando a tesoura Castroviejo.
- Localize o SAN no átrio direito, que nesta orientação é aproximadamente bordado pela veia cava superior (na parte superior), veia cava inferior (na parte inferior) e cristae terminalis (à esquerda) (Figura 4D).
NOTA: O terminal crista aparece como uma crista muscular escura entre o apêndice atrial direito e o SAN. Muitas vezes a artéria SAN também pode ser vista correndo através da SAN (Figura 4D).
7. Preparando o sistema MEA para gravação
- Adicione a solução de Tyrode (do passo 3) ao frasco de solução de entrada(Figura 5C) e oxigene-o ligando o fluxo de gás carbógeno(Figura 5A) ao sistema.
NOTA: A solução da Tyrode utilizada para a gravação é ligeiramente diferente na composição da solução completa de Tyrode usada para a dissecção. - Verifique o fluxo de carbogênio observando bolhas no frasco cônico, que é usado para umidificar o gás (Figura 5B), e o frasco de solução de entrada(Figura 5C).
- Insira a tubulação de entrada da bomba peristáltica(Figura 5D) na solução de gravação do Tyrode(Figura 5C). Em seguida, insira a tubulação de saída da bomba peristáltica na garrafa de coleta(Figura 5I).
- Defina a bomba peristáltica a 25 rpm, o que dá uma vazão de 2 mL/min e inicie a bomba. Verifique se há vazamento ou estouro de buffer no sistema.
- Coloque o controlador de temperatura a 37 °C, a temperatura fisiológica dos camundongos(Figura 5E).
8. Colocar o tecido cardíaco na grade MEA
- Transfira o tecido de SAN dissecado com a ajuda de uma escova de tinta(Figura 6A) da placa de Petri dissecando para a grade MEA(Figura 1A1).
- Ao olhar sob um microscópio invertido, posicione suavemente o tecido com uma escova de tinta macia para que a região de SAN sobreponha a grade de eletrodos.
- Reesencular o tecido conforme necessário para garantir que ele esteja plano na grade de eletrodos, fazendo um bom contato com os eletrodos.
NOTA: É necessário um pincel de tinta macia para mover o tecido para evitar danificar a rede de eletrodos.
- Uma vez que o tecido esteja corretamente posicionado, use fórceps ósseos (ou quaisquer fórceps curvos) para colocar a malha sobre o tecido(Figura 6A) . Em seguida, use os fórceps ósseos para colocar a âncora da harpa(Figura 6A) na malha para manter tudo no lugar(Figura 6B).
- Tire uma foto do posicionamento do tecido no MEA para que a atividade de eletrodos individuais possa ser correlacionada com sua localização anatômica durante a gravação. Isso pode ser feito segurando um smartphone até o objetivo do microscópio invertido ou usando uma câmera de microscópio anexada.
NOTA: Se a orientação do MEA não for alterada após a realização da imagem, o eletrodo superior esquerdo aparecerá como o primeiro canal (Ch1) durante a gravação. - Coloque o prato MEA na placa do conector(Figura 5F e 6C) e coloque cuidadosamente a tampa de perfusão(Figura 6C) no prato MEA sem perturbar a âncora da fatia de harpa. A tampa de perfusão pode ser ainda mais fixada usando um pedaço de fita de laboratório(Figura 6C).
NOTA: Além de ter tubos de entrada e saída de solução ajustáveis, a tampa também possui uma porta para a entrega de gás(Figura 6C). Além disso, o anel de eletrodo de referência atravessa a tampa (Figura 6C). - Deixe que o tecido se recupere do manuseio e aclimata na câmara por 15-20 minutos antes da gravação.
9. Definindo o protocolo de aquisição de dados para gravação
NOTA: As seguintes etapas descrevem a abertura do protocolo de software para gravação espontânea de batidas e definição das condições de gravação. As especificidades dessas etapas podem variar dependendo do software específico que está sendo utilizado, mas o contorno geral deve permanecer o mesmo.
- Ligue o amplificador (Figura 5G)e configure um fluxo de trabalho para a gravação no software no computador(Figura 5H).
- Abra o software e clique no Fluxo de Trabalho.
- Selecione Abrir nova pasta.
- Abra a pasta De Modelos.
- Selecione 64MD1-1920X1080 (dependendo da resolução do seu desktop).
- Abra a pasta QT.
- Abra a pasta de gravação espontânea.
- Selecione Beat_recording.moflo e abra-o(Figura 7A).
- Defina os parâmetros de gravação para especificar o número de vestígios, duração do traço, intervalo de rastreamento, tensão de entrada, taxa de amostragem, etc., de acordo com as condições de gravação desejadas(Figura 7B).
NOTA: Para a frequência de batidas e aquisição de dados interspike, normalmente usam uma tensão de alcance de entrada de 2,9 mV, um filtro de passe alto de 1-Hz, um filtro de passagem baixa de 1000 Hz e uma taxa de amostragem de 20 kHz. - Para marcar diferentes fases ou condições do experimento, como antes e depois da administração de medicamentos, clique na guia Anotações para adicionar as notações desejadas(Figura 7C).
- Para especificar o destino do arquivo para que os dados sejam coletados, selecione a caixa Ativar armazenamento e digite o nome do arquivo desejado na caixa modificador de nome de arquivo.
10. Realizar a gravação e coleta de dados
- Clique no botão Gravar e Reproduzir na barra de menu mais alta do software de aquisição para iniciar a gravação. Adquira dados para 10 vestígios de 1 min de duração com intervalos de 2 minutos entre os traços.
- A partir desses traços iniciais, verifique se as formas de onda registradas são consistentes com uma preparação de tecido saudável e de alta qualidade, confirmando que a maioria dos canais de gravação exibe amplitudes de sinal de ≥ intervalos interpesados de 0,5 mV e idênticos(Figura 8).
NOTA: Uma avaliação inicial da atividade e das formas de onda dos microeletrodos individuais correspondentes aos seus locais anatômicos pode ser realizada fazendo referência ao quadro adquirido após o posicionamento do tecido no MEA. - Para medir os efeitos das drogas no tecido, pausa a gravação após a aquisição de dados iniciais da linha de base clicando no botão de pausa na barra de menu superior.
NOTA: A fase de resposta à droga do experimento pode ser notada na gravação clicando na guia Anotações e adicionando a notação desejada conforme descrito acima(Figura 7C). - Pause a bomba e troque a tubulação de entrada da bomba da solução de gravação normal para a solução de Tyrode contendo a droga desejada de escolha.
NOTA: No experimento de exemplo, a solução de Tyrode foi utilizada com 1 mM 4-aminopirridina (4-AP). - Reinicie a bomba e desemprese a gravação para começar a coletar dados novamente.
- Uma vez que a solução de Tyrode infundida com drogas tenha atingido o tecido, registos da mesma maneira que feito anteriormente para as gravações da linha de base.
NOTA: Os traços levarão algum tempo para estabilizar à medida que a droga se infundi na câmara de gravação. O mecanismo de ação da droga também pode afetar a estabilidade do registro. Para medicamentos que possuem mecanismos reversíveis de ação, também deve ser registrado um período de lavagem para confirmar a restauração da atividade aos níveis de linha de base, que é um indicador de tecido saudável. - Clique em Parar para concluir as gravações.
- Tire uma foto final do posicionamento do tecido no MEA sob o microscópio no caso de o tecido ter se deslocado após o procedimento inicial de configuração de gravação.
11. Limpeza da configuração após a gravação
- Limpe o MEA.
- Após terminar a gravação, remova suavemente a solução de gravação do prato MEA usando uma micropipette de 1 mL.
NOTA: Tenha cuidado para não entrar em contato com os eletrodos MEA que podem danificá-los. - Remova a âncora de malha e harpa com fórceps ósseos (ou quaisquer fórceps curvos). Em seguida, use uma escova de tinta para desalojar o tecido da superfície MEA sempre tendo cuidado para não tocar nos microeletrodos individuais.
- Usando uma garrafa de lavagem, enxágue suavemente o prato MEA com água ultrapurada cerca de 3 a 4 vezes.
- Armazene o MEA limpo imerso em água ultrauso a 4 °C.
- Após terminar a gravação, remova suavemente a solução de gravação do prato MEA usando uma micropipette de 1 mL.
- Enxágüe a tubulação do sistema executando água ultrauso através dele por pelo menos 5 minutos usando a configuração de velocidade máxima na bomba peristáltica.
NOTA: Para evitar o crescimento fúngico, nenhuma solução de água ou tampão deve ser deixada dentro da tubulação após a limpeza.
12. Analisando as gravações de MEA para medir a frequência de batidas de SAN
- Abra o arquivo de dados gravado salvo no modelo "Beat_frequency_analysis" do software de análise (Figura 9).
- Clique no botão Reproduzir e permitir que toda a gravação seja executada para visualizar o conjunto de dados e atribuir parâmetros de análise apropriados.
- Selecione a janela binning para o formato de exibição desejado dos dados, se ele é exibido como uma média por traço ou média por tempo(Figura 10A).
- Selecione os canais a serem incluídos na análise e defina os valores de limiar de amplitude maxima ou amplitude necessários para identificação automatizada de pico de forma de onda(Figura 10B).
NOTA: Um canal individual, uma combinação de canais ou todos os 64 canais podem ser selecionados para análise nesta etapa (Figura 9). Se os valores de limiar selecionados estiverem muito próximos dos valores máximos e minimas da forma de onda, alguns picos de forma de onda podem não ser identificados pelo software de análise. - Defina a quantidade de tempo pré-pico e pós-pico a ser incluído na análise.
NOTA: Configurações de 50 ms pré-pico e 100 ms pós-pico geralmente funcionam bem (Figura 10B).
- Depois de definir as condições de análise, clique no botão Reproduzir novamente para refazer o conjunto de dados e confirmar que os parâmetros de análise são apropriados para extração de pico.
- Para análise, identifique os três traços consecutivos mais estáveis que apresentam taxa de espancamento estável para cada traço na maioria dos canais, tanto durante o período de base do experimento quanto outros três traços estáveis consecutivos durante o período de exposição à droga (Figura 10A).
- Especifique os traços de início e término para análise e digite a duração do tempo de cada traço a ser analisado(Figura 9).
- Antes de iniciar a análise, selecione as caixas habilitadoras tanto para salvar batida por minuto quanto para salvar o intervalo interspike (Figura 10B).
- Digite o nome do arquivo desejado na caixa modificadora de nome do arquivo (Figura 10B). Os dados analisados para frequência de batida e intervalo de interspike serão salvos na forma do formato ASCII (texto).
NOTA: Para analisar diferentes condições (como linha de base e resposta a medicamentos), a análise deve ser executada separadamente para cada condição. - Clique no botão Reproduzir e Gravar na barra superior da guia para iniciar a análise.
- Para exportar os dados para outros aplicativos, selecione as caixas para salvar batida por minuto e Salvar intervalo interspike (Figura 10B). Digite o nome do arquivo desejado na caixa modificador de nome do arquivo (Figura 10B) e clique em Salvar os dados analisados no formato de texto ASCII na pasta selecionada.
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Representative Results
Depois de permitir que o tecido se aclimate no prato por 15 minutos, 10 traços de um min são registrados. Nosso protocolo atual registra atividade por mais de uma hora, mas registramos padrões estáveis de disparo por ≥4 h em dados não mostrados aqui. Se uma preparação experimental for boa para a coleta de dados, cada canal de gravação deve exibir formas de onda recorrentes consistentes e espaçadas uniformemente (ou seja, picos) de forma uniforme para um determinado canal(Figura 11D). Essas formas de onda correspondem a batimentos cardíacos individuais que refletem atividade de pacemaking cardíaco intrínseco. Os intervalos de interspike devem ser os mesmos para todos os canais, mesmo que não estejam perfeitamente alinhados entre os canais devido a pequenas diferenças em sua localização em relação ao local de iniciação da despolarização(Figura 8). Embora a forma das formas de onda para um determinado canal deva ser consistente, a forma das formas de onda variará entre os canais, dependendo da localização do eletrodo no tecido(Figura 8). O grau de contato do tecido com o eletrodo também pode influenciar características de forma de onda, como a amplitude. No entanto, a amplitude máxima deve ser de pelo menos 0,5 mV para a maioria dos canais se a preparação for satisfatória. Dos 10 traços registrados, os três canais consecutivos que melhor atendem aos critérios de qualidade descritos acima foram escolhidos para análise posterior descrita abaixo. A Figura 10A mostra uma amostra de frequência de batida estável (painel superior) e intervalo de interspike (painel médio) para três traços consecutivos. O tecido que não atende a esses critérios não deve ser registrado, pois há danos teciduais prováveis que dificultarão a coleta precisa de dados. A Figura 11 mostra exemplos de padrões de espetos extraídos ruins que estão ausentes(A),influenciados pelo ruído(B), ou instáveis(C).
Os dados amostrais apresentados nos números foram coletados de um rato wildtype black suíço (Tac:N:NIHS-BC) de 45 dias de idade. O procedimento de análise retratado nas Figuras 9 e Figura 10 foi utilizado para extrair a taxa de disparo intrínseca e exibir picos de linha de base que podem ser vistos na Figura 12A. A taxa de disparo é a taxa média de 60.000 ms de cada um dos três traços, mas o padrão de pico na Figura 12A mostra 5 s de representação subindo de um único traço. Utilizando software de análise automatizada, a taxa de disparo intrínseca (ou seja, frequência de batida) dos três traços selecionados em todos os 64 canais foi encontrada em aproximadamente 320 bpm em nossos dados amostrais(Figura 12A). Em geral, observamos uma gama de valores de cerca de 290-340 bpm em nossas gravações para ratos de tipo selvagem. A taxa de disparo também pode ser usada como um método secundário para avaliar a qualidade da preparação. Taxas instáveis ou significativamente inferiores a 300 bpm são menos propensas a serem boas para análise. Esses valores são comparáveis tanto ao coração isolado quanto a gravações de células únicas que relatam frequências cardíacas intrínsecas na faixa de aproximadamente 300-500 bpm25,48,49. Portanto, a técnica de gravação mea é capaz de gerar medidas confiáveis e precisas da frequência cardíaca intrínseca.
Uma vantagem do sistema MEA é que permite fácil aplicação de agentes medicamentosos para testar efeitos farmacológicos. No experimento amostral, testamos os efeitos de 1 mM 4-AP na taxa de disparo, o que deve retardar a atividade de SAN, uma vez que o bloqueio dos canais K+ fechados por tensão é conhecido por prejudicar a potencial de repolarização da ação nas células SA24,50. A Figura 12B mostra que a introdução do 4-AP aumentou os intervalos de interspike como esperado. Este intervalo de pico prolongado correspondeu a uma diminuição na frequência de batidas de 320 bpm para 210 bpm. Esta taxa de disparo após a administração 4-AP é semelhante a um estudo anterior que examinou os efeitos de 4-AP na taxa de disparo san usando gravações de eletrodos únicos de tecido isolado. Esse estudo mediu uma taxa de disparo de aproximadamente 190 bpm na presença de 4-AP50. Assim, o sistema MEA pode ser usado como uma ferramenta conveniente e valiosa para testar efeitos farmacológicos de intervenções medicamentosas na função cardíaca intrínseca.
Figura 1: Revestindo a matriz de microeletrodos (MEA) antes do uso. (A) O MEA é composto por um pequeno prato plástico com uma grade de 64 microeletrodos no centro (como mostrado no painel A1) e quatro eletrodos de referência ao redor da periferia em um padrão quadrado. (B) Adição de 1 mL de tampão PEI para revestir o MEA. (C) Cobrindo o prato MEA com filme termoplástico para incubação durante a noite a temperatura ambiente. (D) Aspirando o tampão PEI do prato MEA, que é seguido por pelo menos quatro enxágues com água destilada. (E) Armazenar a sonda MEA revestida sob água ultrapurada para evitar que ela seque. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ferramentas utilizadas para dissecção do nó sinoatrial (SAN). As seguintes ferramentas são utilizadas durante a parte de dissecção do protocolo: (i) placa de Petri com elastômero de silicone e pequenos pinos de dissecção; (ii) Pipeta de transferência plástica; (iii) Tesoura castroviejo, tamanho 4"; (iv) Tesoura cirúrgica (reta) para procedimentos de corte; v Ado pórceps de #2 Delâmo; (vi) Dumont #55 fórceps; (vii) Fórceps graefe extra finos; (viii) Hemostats (curvado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Remoção do coração. (A) Incisão transversal na pele logo abaixo da parte inferior da caixa torácica de cerca do arco costal esquerdo para o arco costal direito. (B) Incisão peritoneal. (C,D) Incisão do diafragma ao longo do tórax para expor a cavidade torácica. (E) Remoção do coração após a excisão dos pulmões. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Dissecção do nó sinoatrial (SAN) ( A) A aparência do coração na placa de Petri após a remoção do corpo. (B) Inserção da agulha de seringa através da veia cava inferior (IVC) e da veia cava superior (SVC) do átrio direito. O pino no ápice do coração também é mostrado. (C) Excisão do ápice (ou seja, a metade inferior) do coração para liberar o sangue. Os pinos nos apêndices atrial também são mostrados. (D) A aparição final da região de SAN do átrio direito no final da dissecação. A região encaixotado corresponde à localização aproximada da SAN. A artéria SAN também pode ser levemente vista correndo pela SAN em uma orientação vertical. As Abreviaturas: AO, aorta; CT, crista terminalis; IVC, veia cava inferior; LA, átrio esquerdo; RA, átrio direito; RAA, anexo atrial direito; SAN, nó sinoatrial; SVC, veia cava superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Esquema da configuração do sistema de gravação da matriz de microeletrodos (MEA). Os seguintes componentes compreendem o sistema: (A) cilindro de gás (carbogen: 95% O2/ 5% CO2); (B) frasco cônico com água destilada para umidificar o gás; (C) gravação da garrafa de solução da Tyrode que fornece entrada no prato MEA; (D) bomba peristáltica para bombear solução de e para o prato MEA; (E) regulador de temperatura; (F) placa conectora MEA que recebe sinais do prato MEA; (G) amplificador; (H)computador; (I) garrafa de coleta para solução de resíduos usados a partir do prato MEA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Posicionamento do tecido nãodal SA no MEA. (A) Ferramentas utilizadas no posicionamento do tecido: (i) Malha com tamanho de grade de 1,5 mm, (ii) âncora de harpa, (iii) fórceps ósseos, (iv) pincel de tinta. (B) Posicionamento do tecido no MEA. A caixa amarela indica a área aproximada da região do nódulo sinoatrial sob a malha e âncora no prato MEA. (C) Arranjo do prato MEA com tecido fechado na placa do conector para gravação potencial de campo: (i) entrada para a solução de gravação; (ii) entrada para gás (carbogen); (iii) saída para a solução; (iv) placa do conector de microeletrodo; v Tampa de perfusão; (vi) anel de eletrodo de referência anexado à tampa; fita (vii) para segurar a tampa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Definir o protocolo de aquisição de dados no software. (A)Um exemplo de modelo de gravação mostrando arranjo de todos os 64 canais. (B) Um exemplo das propriedades de entrada de software para as condições de gravação. (C) Um exemplo do menu Anotações mostrando como adicionar nova fase durante a gravação, como para medir efeitos de drogas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Diferentes regiões dos tecidos apresentando diferentes formas de onda de atividade. Exemplo de captura de tela mostrando formas de onda com diferentes formas e amplitudes em diferentes canais. No entanto, todos os canais mostram intervalos de interspike idênticos e frequências de disparo. Os canais dentro da caixa vermelha correspondem aproximadamente aos eletrodos colocados na região de SAN do tecido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Modelo de análise de frequência de batida. Modelo de exemplo mostrando arranjo de todos os 64 canais no modelo de análise de frequência beat. O conjunto de dados brutos replay mostra um exemplo das propriedades de entrada da janela de análise. Neste exemplo, foram selecionados traços de 5 a 7 para análise e a duração da análise de cada traço foi designada como 60.000 ms. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Definindo parâmetros de análise para extração de pico. (A) Resultados do modelo de análise representativo para 3 traços selecionados de um único canal. O painel superior exibe a frequência de batidas para os três traços selecionados (três agrupamentos definidos de pontos de dados) e cada ponto representa uma média de 10 s para a frequência de batida durante o rastreamento específico. O painel intermediário exibe intervalo de interpeso para os três traços selecionados (três agrupamentos definidos de pontos de dados) e cada ponto de dados representa o intervalo entre dois picos consecutivos. O painel inferior esquerdo mostra espinhos extraídos pelo representante selecionado para os últimos 5 s do terceiro traço, enquanto o painel inferior direito mostra uma forma de onda extraída derivada do grupo de 5 s de espigões extraídos no painel inferior esquerdo. (B) Visão ampliada da janela de análise mostrando parâmetros utilizados na análise da frequência de batida para os 3 traços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Figura representativa mostrando extração de dados bons versus ruins para um determinado canal. Extração de dados ruins: (A) Ausência de picos extraídos; (B) Espigões extraídos com sinais de ruído; (C) Espigões extraídos instáveis. (D) Bons dados mostrando picos extraídos estáveis sem sinais de ruído. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12: Gravações na linha de base e após administração de 1mM 4-Aminopyridine (4-AP). (A) A Gravação de linha de base de um único microeletrou mostra formas de onda com uma frequência de disparo estável de 320 bpm em um coração WT. (B) Após a administração do 4-AP, a frequência de disparo desacelera para uma taxa estável de 210 bpm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Praticar e dominar o processo de dissecção de SAN é imprescindível, uma vez que o tecido é frágil e o tecido saudável é necessário para uma gravação bem sucedida. Durante a dissecção da SAN, a orientação correta é essencial para obter a região adequada do tecido. No entanto, a orientação original do coração pode ser facilmente perdida durante o processo de dissecção, o que complica esse esforço. Portanto, para garantir a orientação adequada à esquerda e à direita, o atria deve ser inspecionado visualmente. Normalmente, o átrio direito tende a ser mais transparente, enquanto o átrio esquerdo é geralmente mais escuro e mais vermelho na cor25,48. Além disso, é essencial não esticar o tecido san enquanto trabalha com ele ou montá-lo na rede de eletrodos, pois o tecido é facilmente danificadomecanicamente 51. Uma dica para verificar o tecido SAN saudável e devidamente dissecado é examiná-lo na solução completa de Tyrode sob o microscópio para verificar se o tecido está batendo. Uma vez que a técnica é dominada, pelo menos 90% das preparações teciduais devem ser boas para o registro.
Várias considerações podem melhorar a probabilidade de gravações bem sucedidas e análises subsequentes de dados. Para garantir as melhores gravações, as soluções devem ser cuidadosamente preparadas e testadas na prática de amostras de mouse antes das gravações experimentais. Trabalhamos extensivamente para adaptar e modificar a solução de gravação para otimizar a saúde do tecido SAN. Além disso, certifique-se de que o gás utilizado para o registro é carbogen (ou seja, 95% O2/5% CO2). Gravações de células únicas geralmente usam oxigênio puro devido à composição química específica da solução tyrode usada para essa aplicação, mas a solução usada para gravação no MEA requer carbogênio para manter um pH estável. O uso de oxigênio puro com a solução do Tyrode para as gravações de MEA causará flutuações no pH que podem levar à rápida deterioração do tecido. Avaliar a amplitude máxima nos canais descritos anteriormente ajudará a determinar se o tecido é de boa qualidade de gravação. Finalmente, para auxiliar a análise após a gravação, tirar uma imagem do tecido SAN montado na matriz de eletrodos MEA após o término da gravação é muito útil. O tecido pode mudar ligeiramente durante a configuração inicial do MEA, e isso fornece a avaliação mais precisa da colocação de eletrodos para análise.
Propomos gravações mea como uma maneira completa e precisa de caracterizar a taxa de disparo san. Uma vantagem da técnica MEA é que permite ao experimentador capturar taxas de disparo em par com gravações de célula única sem a necessidade de ter extensa experiência eletrofisiológica. A técnica do MEA também tem a vantagem de eliminar as potenciais influências de confusão de mecanismos neurohumorais e mecano-elétricos, inerentes a gravações cardíacas isoladas e medidas de bloqueio autônomo in vivo 21. Contração ventricular e respiração são as principais influências mecano-elétricas que podem alterar o disparo de SAN, mas são eliminadas em nossa preparação tecidual 52,53. Embora nossa técnica elimine a maioria das influências autônomas na SAN, um número limitado de projeções remanescentes de ICNS no atria direito poderia potencialmente impactar o disparo de SAN, uma limitação teórica que deve ser mantida em mente durante a interpretação dos resultados5,6,22,23. Outra vantagem da técnica MEA descrita aqui é que ela pode ser adaptada para muitos outros tipos de estudos cardíacos. Por exemplo, embora este protocolo demonstrasse os efeitos do 4-AP na atividade de SAN, estudos futuros poderiam olhar para um número quase ilimitado de agentes farmacológicos, bem como os efeitos de mutações genéticas no disparo intrínseco da SAN. Por exemplo, a ivabradina, um bloqueador específico do canal Hcn4 específico de SAN, poderia ser usada para estudar contribuições atuais engraçadas para a taxa de demissão54. O sistema MEA também pode ser usado para medir a função cardíaca em outras regiões do coração, permitindo uma caracterização detalhada e específica da região. No entanto, o registro de outras regiões cardíacas exigiria diferentes abordagens de dissecção e a possibilidade de secção fina de tecidos antes de gravar. Uma limitação potencialmente significativa dessa técnica é o alto custo de compra de um sistema MEA que pode ser proibitivo. Vários sistemas MEA estão disponíveis no mercado com características e funcionalidades semelhantes, mas o alto custo permanece o mesmo. No entanto, uma vez adquiridos os equipamentos e softwares iniciais, o custo para manter e usar o sistema MEA é bastante baixo. Outra limitação é que o sistema MEA só permite o registro de potenciais de campo extracelulares que não são propícios a comparações precisas de características potenciais de ação (por exemplo, amplitude e forma) entre preparações como podem ser alcançadas com gravações intracelulares de célula única. Em resumo, este protocolo fornece um fluxo de trabalho eficiente para medir e analisar taxas intrínsecas de disparo cardíaco no tecido san do rato com a capacidade de estudar os efeitos da intervenção farmacológica na taxa de disparo de forma altamente específica.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, números de subvenções R01NS100954 e R01NS099188.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920x1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
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