Microelectrode Array Gravação da Taxa de Disparo de Nó Sinoatrial para identificar defeitos intrínsecos de marcação cardíaca em camundongos
Summary
Este protocolo visa descrever uma nova metodologia para medir a taxa de disparo cardíaco intrínseco usando o registro de matriz de microeletrínda de todo o tecido do nódulo sinoatrial para identificar defeitos de marcação de ritmo em camundongos. Agentes farmacológicos também podem ser introduzidos neste método para estudar seus efeitos no ritmo intrínseco.
Abstract
O nódulo sinoatrial (SAN), localizado no átrio direito, contém as células marcapasso do coração, e a disfunção desta região pode causar taquicardia ou bradicardia. A identificação confiável de defeitos cardíacos de pacemaking requer a medição de frequências cardíacas intrínsecas, impedindo em grande parte a influência do sistema nervoso autônomo, que pode mascarar déficits de taxas. Os métodos tradicionais para analisar a função de marca-passo cardíaco intrínseco incluem bloqueio autônomo induzido por drogas para medir as frequências cardíacas in vivo, registros cardíacos isolados para medir as frequências cardíacas intrínsecas e registros sinoatrial de células-chave de remendo de células-passo sinoatrial para medir as taxas de disparo potenciais de ação espontânea. No entanto, essas técnicas mais tradicionais podem ser tecnicamente desafiadoras e difíceis de executar. Aqui, apresentamos uma nova metodologia para medir a taxa de disparo cardíaco intrínseco realizando gravações de matriz de microeletrínda (MEA) de preparações de nós sinoatrial de conjunto inteiro de camundongos. Os MEAs são compostos de múltiplos microeletrodos dispostos em um padrão semelhante à grade para gravação de potenciais de campo extracelular in vitro. O método descrito aqui tem a vantagem combinada de ser relativamente mais rápido, simples e mais preciso do que abordagens anteriores para registrar frequências cardíacas intrínsecas, ao mesmo tempo em que permite um interrogatório farmacológico fácil.
Introduction
O coração é um órgão complexo governado por influências cardíacas-intrínsecas e extrínsecas, como as que se originam no cérebro. O nódulo sinoatrial (SAN) é uma região definida no coração que abriga as células marcapasso (também conhecidas como células sinoatrial, ou células SA) responsáveis pela iniciação e perpetuação dos batimentos cardíacos mamíferos1,2. A frequência cardíaca intrínseca é a taxa impulsionada pelas células marcapasso sem influência por outras influências cardíacas ou neuro-humorais, mas medidas tradicionais de frequência cardíaca em humanos e animais vivos, como eletrocardiogramas, refletem tanto o marca-passo quanto as influências neurais no coração. A influência neural mais notável nas células SA é do sistema nervoso autônomo, que modula constantemente padrões de disparo para atender aos requisitos fisiológicos do corpo3. Apoiando essa ideia, projeções simpáticas e parassimpáticas podem ser encontradas perto da SAN4. O sistema nervoso cardíaco intrínseco (ICNS) é outra importante influência neural onde plexi ganglioado, especificamente na ária direita, inerva e regula a atividade da SAN5,6.
Entender os déficits de pacemaking é clinicamente importante, pois a disfunção pode fundamentar muitos distúrbios cardíacos, bem como contribuir para o risco de outras complicações. A síndrome do seio doente (SSS) é uma categoria de doenças caracterizadas pela disfunção do nódulo sinoatrial que impede o bom funcionamento do ritmo7,8. SSS pode apresentar sinus bradycardia, pausas sinusas, parada sinusal, bloco de saída sinoatrial, e bradidinathmias alternadas e taquiarritmias9 e pode levar a complicações, incluindo aumento do risco de derrame embólico e morte súbita8,10. Aqueles com síndrome de Brugada, uma doença cardíaca marcada pela fibrilação ventricular com risco aumentado de morte cardíaca súbita, correm maior risco de eventos arrhitogênicos se também tiverem disfunção comorbóide de SAN11,12. A disfunção sinoatrial também pode ter consequências fisiológicas além do coração. Por exemplo, a SSS tem sido observada para desencadear convulsões em um paciente devido à hipoperfusão cerebral13.
Para identificar déficits de pacemaking sinoatrial, as frequências cardíacas intrínsecas precisam ser determinadas medindo a atividade da SAN sem a influência do sistema nervoso autônomo ou fatores humorísticos. Clinicamente, isso pode ser aproximado pelo bloqueio autônomo farmacológico14,mas essa mesma técnica também pode ser aplicada em modelos mamíferos para estudar a função cardíaca intrínseca15,16. Embora essa abordagem bloqueie uma grande parte das influências neurais contribuintes e permita o exame cardíaco in vivo, ela não elimina completamente todas as influências extrínsecas no coração. Outra técnica de pesquisa usada para estudar a função cardíaca intrínseca em modelos animais são as gravações cardíacas isoladas usando corações perfumados langendorff, que normalmente envolvem medidas usando eletrogramas, ritmo ou matrizes multieletrínois epicáridas17,18,19,20. Embora essa técnica seja mais específica para a função cardíaca, pois envolve a remoção do coração do corpo, as medidas ainda podem ser influenciadas por mecanismos autoregulatórios mecano-elétricos que podem influenciar as medições intrínsecas da frequência cardíaca21. As gravações cardíacas isoladas também podem ser influenciadas pela regulação autônoma através do ICNS5,6,22,23. Além disso, manter uma temperatura fisiologicamente relevante do coração, que é fundamental para as medidas de função cardíaca, pode ser difícil em abordagens cardíacas isoladas20. Um método mais direto para estudar a função SAN é isolar especificamente o tecido SAN e medir sua atividade. Isso pode ser realizado através de tiras SAN (tecido SAN isolado) ou células-passo isoladas de SAN24,25. Ambos requerem um alto grau de treinamento técnico, já que a SAN é uma região muito pequena e altamente definida, e o isolamento celular representa um desafio ainda maior, pois a dissociação pode prejudicar a saúde geral da célula se não for realizada corretamente. Além disso, essas técnicas requerem habilidades eletrofisiológicas especializadas para registrar com sucesso a partir do tecido ou células usando microeletrodos de gravação individuais.
Neste protocolo, descrevemos uma técnica para registrar o SAN in vitro usando uma matriz de microeletríndia (MEA) para obter medições intrínsecas da frequência cardíaca. Essa abordagem tem a vantagem de tornar registros eletrofisiológicos altamente específicos acessíveis a pesquisadores sem habilidades eletrofisiológicas intensivas. Os MEAs já foram utilizados para estudar a função cardiomiócito nas culturas de cardiomiócito primário26,27,28,29,30,31,32, folhas cardíacas33,34,35,36,37,38,39, e montagems inteiras de tecido40, 41,42,43,44,45,46,47. Trabalhos anteriores também foram feitos para examinar os potenciais de campo no tecidoSAN 41,42. Aqui, fornecemos uma metodologia para usar o MEA para registrar e analisar as taxas de disparo de SAN intrínsecas murinas. Também descrevemos como essa técnica pode ser usada para testar efeitos farmacológicos de drogas em taxas de disparo intrínsecos de SAN, fornecendo um experimento amostral mostrando os efeitos de 4-aminopirridina (4-AP), um bloqueador de canal K+ canal fechado por tensão. Usando marcos anatômicos definidos, podemos registrar com precisão a SAN sem ter que realizar as extensas dissecções teciduais ou isolamentos celulares necessários em outros métodos. Embora o MEA possa ser proibitivo de custos, as gravações fornecem medidas altamente específicas e confiáveis de pacemaking que podem ser usadas em uma vasta gama de aplicações de pesquisa clínica e fisiológica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Praticar e dominar o processo de dissecção de SAN é imprescindível, uma vez que o tecido é frágil e o tecido saudável é necessário para uma gravação bem sucedida. Durante a dissecção da SAN, a orientação correta é essencial para obter a região adequada do tecido. No entanto, a orientação original do coração pode ser facilmente perdida durante o processo de dissecção, o que complica esse esforço. Portanto, para garantir a orientação adequada à esquerda e à direita, o atria deve ser inspecionado…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, números de subvenções R01NS100954 e R01NS099188.
Materials
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
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