Registro de la matriz de microelectrodos de la tasa de disparo del nódulo sinoauricular para identificar defectos intrínsecos de marcapasos cardíacos en ratones
Summary
Este protocolo tiene como objetivo describir una nueva metodología para medir la velocidad de disparo cardíaco intrínseca utilizando el registro de la matriz de microelectrodos de todo el tejido del ganglio sinoauricular para identificar defectos de marcapasos en ratones. Los agentes farmacológicos también se pueden introducir en este método para estudiar sus efectos sobre el marcapasos intrínseco.
Abstract
El nódulo sinoauricular (SAN), ubicado en la aurícula derecha, contiene las células marcapasos del corazón, y la disfunción de esta región puede causar taquicardia o bradicardia. La identificación confiable de los defectos cardíacos de marcapasos requiere la medición de las frecuencias cardíacas intrínsecas mediante la prevención en gran medida de la influencia del sistema nervioso autónomo, que puede enmascarar los déficits de tasa. Los métodos tradicionales para analizar la función intrínseca del marcapasos cardíaco incluyen bloqueo autónomo inducido por medicamentos para medir las frecuencias cardíacas in vivo, registros cardíacos aislados para medir las frecuencias cardíacas intrínsecas y registros de tira sinoauricular o pinza de parche de una sola célula de células de marcapasos sinoauriculares para medir las tasas de disparo potencial de acción espontánea. Sin embargo, estas técnicas más tradicionales pueden ser técnicamente desafiantes y difíciles de realizar. Aquí, presentamos una nueva metodología para medir la velocidad de disparo cardíaco intrínseca mediante la realización de registros de matriz de microelectrodos (MEA) de preparaciones de ganglios sinoauriculares de montaje completo de ratones. Los AMUMA están compuestos por múltiples microelectrodos dispuestos en un patrón similar a una cuadrícula para registrar potenciales de campo extracelular in vitro. El método descrito en este documento tiene la ventaja combinada de ser relativamente más rápido, más simple y más preciso que los enfoques anteriores para registrar las frecuencias cardíacas intrínsecas, al tiempo que permite un fácil interrogatorio farmacológico.
Introduction
El corazón es un órgano complejo gobernado por influencias cardíaco-intrínsecas y extrínsecas como las que se originan en el cerebro. El nódulo sinoauricular (SAN) es una región definida en el corazón que alberga las células marcapasos (también conocidas como células sinoauriculares o células SA) responsables de la iniciación y perpetuación de los latidos del corazón de los mamíferos1,2. La frecuencia cardíaca intrínseca es la velocidad impulsada por las células marcapasos sin influencia de otras influencias cardíacas o neuro-humorales, pero las medidas tradicionales de la frecuencia cardíaca en humanos y animales vivos, como los electrocardiogramas, reflejan tanto el marcapasos como las influencias neuronales en el corazón. La influencia neuronal más notable en las células SA es del sistema nervioso autónomo, que modula constantemente los patrones de disparo para satisfacer los requisitos fisiológicos del cuerpo3. Apoyando esta idea, se pueden encontrar proyecciones simpáticas y parasimpáticas cerca del SAN4. El sistema nervioso cardíaco intrínseco (ICNS) es otra influencia neuronal importante donde los plexios ganglionados, específicamente en las aurículas derechas, inervan y regulan la actividad del SAN5,6.
Comprender los déficits de marcapasos es clínicamente importante, ya que la disfunción puede ser la base de muchos trastornos cardíacos, así como contribuir al riesgo de otras complicaciones. El síndrome del seno enfermo (SSS) es una categoría de enfermedades caracterizadas por la disfunción del nódulo sinoauricular que impide el marcapasos adecuado7,8. El SSS puede presentarse con bradicardia sinusal, pausas sinusales, paro sinusal, bloqueo de la salida sinoauricular y bradiaritmias y taquiarritmias alternas9 y puede conducir a complicaciones que incluyen un mayor riesgo de accidente cerebrovascular embólico y muerte súbita8,10. Las personas con síndrome de Brugada, un trastorno cardíaco marcado por fibrilación ventricular con un mayor riesgo de muerte súbita cardíaca, tienen un mayor riesgo de eventos arritmogénicos si también tienen disfunción SAN comórbida11,12. La disfunción sinoauricular también puede tener consecuencias fisiológicas más allá del corazón. Por ejemplo, se ha observado que el SSS desencadena convulsiones en un paciente debido a la hipoperfusión cerebral13.
Para identificar los déficits de marcapasos sinoauriculares, las frecuencias cardíacas intrínsecas deben determinarse midiendo la actividad de la SAN sin la influencia del sistema nervioso autónomo o los factores humorales. Clínicamente, esto puede ser aproximado por bloqueo autonómico farmacológico14,pero esta misma técnica también puede ser aplicada en modelos de mamíferos para estudiar la función cardíaca intrínseca15,16. Si bien este enfoque bloquea una gran parte de las influencias neuronales que contribuyen y permite el examen cardíaco in vivo, no elimina por completo todas las influencias extrínsecas en el corazón. Otra técnica de investigación utilizada para estudiar la función cardíaca intrínseca en modelos animales son los registros cardíacos aislados utilizando corazones perfundidos por Langendorff, que generalmente implican mediciones utilizando electrogramas, estimulación o matrices de multielectrodos epicárdicos17,18,19,20. Si bien esta técnica es más específica para la función cardíaca, ya que implica la eliminación del corazón del cuerpo, las mediciones aún pueden estar influenciadas por mecanismos autorreguladores mecano-eléctricos que podrían influir en las mediciones intrínsecas de la frecuencia cardíaca21. Las grabaciones cardíacas aisladas también pueden estar influenciadas por la regulación autonómica a través delCIE 5,6,22,23. Además, mantener una temperatura fisiológicamente relevante del corazón, que es crítica para las mediciones de la función cardíaca, puede ser difícil en aproximaciones cardíacas aisladas20. Un método más directo para estudiar la función de SAN es aislar específicamente el tejido SAN y medir su actividad. Esto se puede lograr a través de tiras san (tejido SAN aislado) o células de marcapasos SAN aisladas24,25. Ambos requieren un alto grado de capacitación técnica, ya que el SAN es una región muy pequeña y altamente definida, y el aislamiento celular plantea un desafío aún mayor, ya que la disociación puede dañar la salud general de la célula si no se realiza correctamente. Además, estas técnicas requieren habilidades electrofisiológicas expertas para registrar con éxito desde el tejido o las células utilizando microelectrodos de registro individuales.
En este protocolo, describimos una técnica para registrar el SAN in vitro mediante el uso de una matriz de microelectrodos (MEA) para obtener mediciones intrínsecas de la frecuencia cardíaca. Este enfoque tiene la ventaja de hacer que los registros electrofisiológicos altamente específicos sean accesibles para los investigadores que carecen de habilidades electrofisiológicas intensivas. Los AMUMA se han utilizado previamente para estudiar la función de los cardiomiocitos en cultivos de cardiomiocitos primarios26,27,28,29,30,31,32,hojas cardíacas33,34,35,36,37,38,39y montajes de tejido entero40, 41,42,43,44,45,46,47. También se han realizado trabajos previos para examinar los potenciales de campo en el tejido SAN41,42. Aquí, proporcionamos una metodología para usar el MEA para registrar y analizar las tasas de disparo de SAN intrínsecas murinas. También describimos cómo esta técnica se puede utilizar para probar los efectos farmacológicos de los fármacos sobre las tasas de disparo intrínsecas de SAN proporcionando un experimento de muestra que muestra los efectos de la 4-aminopiridina (4-AP), un bloqueador de canales K+ controlado por voltaje. Utilizando puntos de referencia anatómicos definidos, podemos registrar con precisión el SAN sin tener que realizar las extensas disecciones de tejido o aislamientos celulares requeridos en otros métodos. Si bien el MEA puede ser prohibitivo, las grabaciones proporcionan medidas altamente específicas y confiables de marcapasos que se pueden usar en una amplia gama de aplicaciones de investigación clínica y fisiológica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Practicar y dominar el proceso de disección de SAN es imperativo ya que el tejido es frágil y el tejido sano es necesario para una grabación exitosa. Durante la disección san, la orientación correcta es esencial para obtener la región adecuada del tejido. Sin embargo, la orientación original del corazón puede perderse fácilmente durante el proceso de disección, lo que complica este esfuerzo. Por lo tanto, para garantizar la orientación adecuada de izquierda a derecha, las aurículas deben inspeccionarse visual…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud, números de subvención R01NS100954 y R01NS099188.
Materials
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
References
- Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
- Josea, A. D., Collison, D. The normal range and determinants of the intrinsic heart rate in man. Cardiovascular Research. (4), 160-167 (1970).
- Peters, C. H., Sharpe, E. J., Proenza, C. Annual Review of Physiology Cardiac Pacemaker Activity and Aging. Annual Review of Physiology. 82, 21-43 (2019).
- Keith, A., Flack, M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. Journal of Anatomy and Physiology. 41 (3), 172-189 (1907).
- Wake, E., Brack, K. Characterization of the intrinsic cardiac nervous system. Autonomic Neuroscience. 199, (2016).
- Fedele, L., Brand, T. The intrinsic cardiac nervous system and its role in cardiac pacemaking and conduction. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 7 (4), 1-33 (2020).
- Mangrum, J. M., DiMarco, J. P. The evaluation and management of bradycardia. New England Journal of Medicine. 342 (10), 703-709 (2000).
- Adan, V., Crown, L. A. Diagnosis and treatment of Sick Sinus Syndrome. American Family Physician. 67 (8), 1725-1732 (2003).
- Semelka, M., Gera, J., Usman, S. Sick Sinus Syndrome: A Review. American Family Physician. 87 (10), 691-696 (2013).
- Zaragoza, M. V., et al. Exome sequencing identifies a novel LMNA splice-site mutation and multigenic heterozygosity of potential modifiers in a family with Sick Sinus Syndrome, dilated cardiomyopathy, and sudden cardiac death. PLoS ONE. 11 (5), 0155421 (2016).
- Brugada, J., Campuzano, O., Arbelo, E., Sarquella-Brugada, G., Brugada, R. Present status of Brugada Syndrome: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (9), 1046-1059 (2018).
- Rollin, A., et al. Prevalence, characteristics, and prognosis role of type 1 ST elevation in the peripheral ECG leads in patients with Brugada syndrome. Heart Rhythm. 10 (7), 1012-1018 (2013).
- Patel, N., Majeed, F., Sule, A. A. Seizure triggered by Sick Sinus Syndrome. BMJ case reports. 4, 2017222011 (2017).
- Knecht, S., et al. Impact of pharmacological autonomic blockade on complex fractionated atrial electrograms. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (7), 766-772 (2010).
- Saba, S., London, B., Ganz, L. Autonomic blockade unmasks maturational differences in rate-dependent atrioventricular nodal conduction and facilitation in the mouse. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 14 (2), 191-195 (2003).
- Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 51-56 (2002).
- Tse, G., Tse, V., Yeo, J. M., Sun, B. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts. PLoS ONE. 11 (2), 0148858 (2016).
- Tse, G., et al. Quantification of beat-to-beat variability of action potential durations in Langendorff-perfused mouse hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1578), 01578 (2018).
- Avula, U. M. R., et al. Heterogeneity of the action potential duration is required for sustained atrial fibrillation. JCI Insight. 5 (11), 128765 (2019).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. (135), e57617 (2018).
- Quinn, A. T., Kohl, P. Cardiac mechano-electric coupling: Acute effects of mechanical stimulation on heart rate and rhythm. Physiological Reviews. 101 (1), 37-92 (2021).
- Ripplinger, C. M., Noujaim, S. F., Linz, D. The nervous heart. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 199-209 (2016).
- Pauza, D. H., Pauziene, N., Pakeltyte, G., Stropus, R. Comparative quantitative study of the intrinsic cardiac ganglia and neurons in the rat, guinea pig, dog and human as revealed by histochemical staining for acetylcholinesterase. Annals of Anatomy. 184, 125-136 (2002).
- Golovko, V., Gonotkov, M., Lebedeva, E. Effects of 4-aminopyridine on action potentials generation in mouse sinoauricular node strips. Physiological Reports. 3 (7), 12447 (2015).
- Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), e54555 (2016).
- Doi, M., Ogawa, E., Arai, T. Effect of a photosensitization reaction performed during the first 3 min after exposure of rat myocardial cells to talaporfin sodium in vitro. Lasers in Medical Science. 32 (8), 1873-1878 (2017).
- Takanari, H., et al. A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology. Journal of Cellular Physiology. 231 (10), 2249-2256 (2016).
- Nakashima, T., et al. Rapid electrical stimulation causes alterations in cardiac intercellular junction proteins of cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1324-1333 (2014).
- Suzuki, S., et al. Effects of aldosterone on Cx43 gap junction expression in neonatal rat cultured cardiomyocytes. Circulation Journal. 73 (8), (2009).
- Horiba, M., et al. T-type Ca2+ channel blockers prevent cardiac cell hypertrophy through an inhibition of calcineurin-NFAT3 activation as well as L-type Ca2+ channel blockers. Life Sciences. 82 (11-12), 554-560 (2008).
- Inoue, N., et al. Rapid electrical stimulation of contraction modulates gap junction protein in neonatal rat cultured cardiomyocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases and effects of angiotensin II receptor agonist. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 914-922 (2004).
- Aalders, J., et al. Effects of fibrillin mutations on the behavior of heart muscle cells in Marfan syndrome. Scientific Reports. 10 (16756), (2020).
- Matsuura, K., et al. Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets. Biomaterials. 32 (30), 7355-7362 (2011).
- Fujita, H., Shimizu, K., Nagamori, E. Application of a cell sheet-polymer film complex with temperature sensitivity for increased mechanical strength and cell alignment capability. Biotechnology and Bioengineering. 103 (2), 370-377 (2009).
- Baba, S., et al. Generation of cardiac and endothelial cells from neonatal mouse testis-derived multipotent germline stem cells. Stem Cells. 25 (6), 1375-1383 (2007).
- Baba, S., et al. Flk1+ cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model. Cardiovascular Research. 76 (1), 119-131 (2007).
- Shimizu, K., et al. Construction of multi-layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 803-809 (2007).
- Haraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. Electrical coupling of cardiomyocyte sheets occurs rapidly via functional gap junction formation. Biomaterials. 27 (27), 4765-4774 (2006).
- Miyagawa, S., et al. Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: Their integration with recipient myocardium. Transplantation. 80 (11), 1586-1595 (2005).
- Watts, M., et al. Decreased bioavailability of hydrogen sulfide links vascular endothelium and atrial remodeling in atrial fibrillation. Redox Biology. 38, 101817 (2021).
- Feng, Y., Cao, H., Zhang, Y. Prediction model of sinoatrial node field potential using high order partial least squares. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 1805-1811 (2015).
- Feng, Y., Cao, H., Wang, Y., Zhang, Y. Fuzzy linguistic prediction model for sinoatrial node field potential analysis in acute hyperglycemia environment. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 881-887 (2015).
- Suzuki, K., Matsumoto, A., Nishida, H., Reien, Y., Maruyama, H., Nakaya, H. Termination of aconitine-induced atrial fibrillation by the KACh-channel blocker tertiapin: underlying electrophysiological mechanism. Journal of Pharmacological Sciences. 125 (4), 406-414 (2014).
- Chang, S. -. L., et al. Heart failure enhances arrhythmogenesis in pulmonary veins. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 38 (10), 666-674 (2011).
- Wang, Y. -. J., et al. Time-dependent block of ultrarapid-delayed rectifier K+ currents by aconitine, a potent cardiotoxin, in heart-derived H9c2 myoblasts and in neonatal rat ventricular myocytes. Toxicological Sciences. 106 (2), 454-463 (2008).
- Lai, Y. -. J., Huang, E. Y. -. K., Yeh, H. -. I., Chen, Y. -. L., Lin, J. J. -. C., Lin, C. -. I. On the mechanisms of arrhythmias in the myocardium of mXinα-deficient murine left atrial-pulmonary veins. Life Sciences. 83 (7-8), 272-283 (2008).
- Gustafson-Wagner, E. A., et al. Loss of mXinα, an intercalated disk protein, results in cardiac hypertrophy and cardiomyopathy with conduction defects. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (5), 2680-2692 (2007).
- Clark, R. B., et al. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, 1757-1766 (2004).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Nikmaram, M. R., et al. Characterization of the effects of Ryanodine, TTX, E-4031 and 4-AP on the sinoatrial and atrioventricular nodes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 96 (1-3), 452-464 (2008).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
- Masé, M., Glass, L., Ravelli, F. A model for mechano-electrical feedback effects on atrial flutter interval variability. Bulletin of Mathematical Biology. 70 (5), 1326-1347 (2008).
- Franz, M. R., Bode, F. Mechano-electrical feedback underlying arrhythmias: The atrial fibrillation case. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 82 (1-3), 163-174 (2003).
- Bucchi, A., Tognati, A., Milanesi, R., Baruscotti, M., DiFrancesco, D. Properties of ivabradine-induced block of HCN1 and HCN4 pacemaker channels. Journal of Physiology. 572 (2), 335-346 (2006).
