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चूहों में आंतरिक हृदय गतिमान दोषों की पहचान करने के लिए सिनोट्रायल नोड फायरिंग रेट की माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी रिकॉर्डिंग

Published: July 5, 2021 doi: 10.3791/62735
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य चूहों में पेसमेकिंग दोषों की पहचान करने के लिए पूरे सिनोट्रायल नोड ऊतक की माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी रिकॉर्डिंग का उपयोग करके आंतरिक कार्डियक फायरिंग दर को मापने के लिए एक नई पद्धति का वर्णन करना है। आंतरिक पेसमेकिंग पर उनके प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इस विधि में औषधीय एजेंटों को भी पेश किया जा सकता है।

Abstract

सही एट्रियम में स्थित सिनोट्रायल नोड (सैन) में दिल की पेसमेकर कोशिकाएं होती हैं, और इस क्षेत्र की शिथिलता टैचिकार्डिया या ब्रैडकार्डिया का कारण बन सकती है। हृदय गतिमान दोषों की विश्वसनीय पहचान काफी हद तक स्वायत्त तंत्रिका तंत्र है, जो मुखौटा दर घाटे कर सकते है के प्रभाव को रोकने के द्वारा आंतरिक दिल की दर के माप की आवश्यकता है । आंतरिक कार्डियक पेसमेकर फ़ंक्शन का विश्लेषण करने के लिए पारंपरिक तरीकों में वीवो हृदय दरों में मापने के लिए दवा-प्रेरित स्वायत्त नाकाबंदी, आंतरिक हृदय दरों को मापने के लिए अलग-थलग दिल रिकॉर्डिंग, और सहज कार्रवाई संभावित फायरिंग दरों को मापने के लिए सिनोट्रायल पेसमेकर कोशिकाओं की सिनोट्रायल स्ट्रिप या एकल-सेल पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग शामिल हैं। हालांकि, इन अधिक पारंपरिक तकनीकों तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हो सकता है । यहां, हम चूहों से पूरे माउंट सिनोट्रायल नोड की रिकॉर्डिंग की माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (विदेश मंत्रालय) रिकॉर्डिंग का प्रदर्शन करके आंतरिक हृदय फायरिंग दर को मापने के लिए एक नई पद्धति पेश करते हैं। एमईए विट्रो एक्स्ट्रासेलुलर फील्ड क्षमता में रिकॉर्डिंग के लिए ग्रिड जैसे पैटर्न में व्यवस्थित कई माइक्रोइलेक्ट्रोड से बना है। यहां वर्णित विधि में आंतरिक हृदय दरों को रिकॉर्ड करने के लिए पिछले दृष्टिकोणों की तुलना में अपेक्षाकृत तेज, सरल और अधिक सटीक होने का संयुक्त लाभ है, जबकि आसान औषधीय पूछताछ की अनुमति भी है।

Introduction

हृदय एक जटिल अंग है जो हृदय-आंतरिक और बाह्य दोनों प्रभावों से संचालित होता है जैसे कि मस्तिष्क में उत्पन्न होने वाले। सिनोट्रायल नोड (सैन) दिल में एक परिभाषित क्षेत्र है जिसमें पेसमेकर कोशिकाएं (जिसे सिनोट्रायल कोशिकाओं, या एसए कोशिकाओं के रूप में भी जाना जाता है) स्तनधारी दिल की धड़कन1,2की दीक्षा और स्थायीकरण के लिए जिम्मेदार है। आंतरिक हृदय गति अन्य हृदय या न्यूरो-ह्यूमरल प्रभावों के प्रभाव के बिना पेसमेकर कोशिकाओं द्वारा संचालित दर है, लेकिन मनुष्यों और जीवित जानवरों में हृदय गति के पारंपरिक उपाय, जैसे इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम, दिल पर पेसमेकर और तंत्रिका प्रभाव दोनों को प्रतिबिंबित करते हैं। एसए कोशिकाओं पर सबसे उल्लेखनीय तंत्रिका प्रभाव स्वायत्त तंत्रिका तंत्र से है, जो शरीर की शारीरिक आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए लगातार फायरिंग पैटर्न को संशोधित करता है3। इस विचार का समर्थन करते हुए, सहानुभूतिपूर्ण और परानुभूति दोनों अनुमानों को सैन4के पास पाया जा सकता है । आंतरिक हृदय तंत्रिका तंत्र (आईसीएन) एक और महत्वपूर्ण तंत्रिका प्रभाव है जहां गैंगलियोनेट प्लेक्सी, विशेष रूप से सही अटरिया, इनरवेट में और सैन5,6की गतिविधि को विनियमित करता है।

पेसमेकिंग घाटे को समझना चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि शिथिलता कई हृदय विकारों को कम कर सकती है, साथ ही अन्य जटिलताओं के जोखिम में योगदान दे सकती है। बीमार साइनस सिंड्रोम (एसएसएस) सिनोट्रायल नोड की शिथिलता की विशेषता वाली बीमारियों की एक श्रेणी है जो उचित पेसमेकिंग7,8में बाधा डालती है। एसएसएस साइनस ब्रैडीकार्डिया, साइनस पॉज़, साइनस गिरफ्तारी, साइनोट्रायल एग्जिट ब्लॉक, और बारी-बारी से ब्रैडीरिथिमियास और टैचियारहिथमियास9 के साथ पेश कर सकता है और एम्बोलिक स्ट्रोक और अचानक मौत8,10के बढ़ते जोखिम सहित जटिलताओं का कारण बन सकता है। ब्रुगाडा सिंड्रोम वाले, अचानक हृदय मृत्यु के बढ़ते जोखिम के साथ वेंट्रिकुलर फिब्रिलेशन द्वारा चिह्नित कार्डियक डिसऑर्डर, अतालता की घटनाओं के लिए अधिक जोखिम में हैं, अगर उनके पास कोमोरबिड सैन डिसफंक्शन11,12भी हैं। सिनोलियल डिसफंक्शन के दिल से परे शारीरिक परिणाम भी हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, सेरेब्रल हाइपोपरफ्यूजन13के कारण रोगी में दौरे को ट्रिगर करने के लिए एसएसएस देखा गया है।

सिनोट्रायल पेसमेकिंग घाटे की पहचान करने के लिए, आंतरिक हृदय दरों को स्वायत्त तंत्रिका तंत्र या विनोदी कारकों के प्रभाव के बिना सैन की गतिविधि को मापने के द्वारा निर्धारित करने की आवश्यकता होती है। चिकित्सकीय रूप से, यह औषधीय स्वायत्त नाकाबंदी14द्वारा अनुमानित किया जा सकता है, लेकिन आंतरिक हृदय समारोह15,16का अध्ययन करने के लिए स्तनधारी मॉडलों में भी यही तकनीक लागू की जा सकती है। हालांकि यह दृष्टिकोण तंत्रिका प्रभावों का योगदान करने के एक बड़े हिस्से को अवरुद्ध करता है और वीवो कार्डियक परीक्षा में अनुमति देता है, यह दिल पर सभी बाह्य प्रभावों को पूरी तरह से खत्म नहीं करता है। पशु मॉडल में आंतरिक हृदय समारोह का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक अन्य शोध तकनीक लैंगेंडोर्फ-परफ्यूस्ड दिलों का उपयोग करके अलग-अलग दिल रिकॉर्डिंग है, जिसमें आम तौर पर इलेक्ट्रोग्राम, पेसिंग, या एपिकार्डियलमल्टीइलेक्ट्रोड सरणी17, 18,19,20का उपयोग करके माप शामिल होते हैं। हालांकि यह तकनीक हृदय कार्य के लिए अधिक विशिष्ट है क्योंकि इसमें शरीर से दिल को हटाना शामिल है, माप अभी भी मशीनो-इलेक्ट्रिक ऑटोरेगुलेटरी तंत्र से प्रभावित हो सकते हैं जो आंतरिक हृदय गति माप21को प्रभावित कर सकते हैं। अलग दिल की रिकॉर्डिंग अभी भी आईसीएनएस5, 6 , 22 ,23केमाध्यम से स्वायत्त नियमन से प्रभावित हो सकती है । इसके अलावा, दिल के एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक तापमान को बनाए रखने, जो हृदय समारोह माप के लिए महत्वपूर्ण है, अलग दिल दृष्टिकोण20में मुश्किल हो सकता है । सैन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक अधिक प्रत्यक्ष तरीका विशेष रूप से सैन ऊतक को अलग करना और इसकी गतिविधि को मापना है। इसे सैन स्ट्रिप्स (अलग सैन ऊतक) या अलग सैन पेसमेकर कोशिकाओं24, 25के माध्यम से पूरा किया जा सकता है। दोनों को उच्च स्तर के तकनीकी प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, क्योंकि सैन एक बहुत छोटा और अत्यधिक परिभाषित क्षेत्र है, और सेल अलगाव एक और भी बड़ी चुनौती बन गया है क्योंकि वियोजन सही ढंग से प्रदर्शन न करने पर कोशिका के समग्र स्वास्थ्य को नुकसान पहुंचा सकता है। इसके अलावा, इन तकनीकों को व्यक्तिगत रिकॉर्डिंग माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग करके ऊतक या कोशिकाओं से सफलतापूर्वक रिकॉर्ड करने के लिए विशेषज्ञ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल कौशल की आवश्यकता होती है।

इस प्रोटोकॉल में, हम आंतरिक हृदय गति माप प्राप्त करने के लिए माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (विदेश मंत्रालय) का उपयोग करके सैन इन विट्रो को रिकॉर्ड करने की तकनीक का वर्णन करते हैं। इस दृष्टिकोण में गहन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल स्किलसेट की कमी वाले शोधकर्ताओं के लिए अत्यधिक विशिष्ट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग को सुलभ बनाने का लाभ है। एमईए का उपयोग पहले प्राथमिक कार्डियोमायोसाइटसंस्कृतियों26, 27, 28, 29,30,31,32,हृदय पत्रक33,34,35, 36,37,38,39,और ऊतक पूरे माउंट40,में कार्डियोमायोसाइट फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए किया गयाहै। 41,42,43,44,45,46,47. सैन टिश्यू41,42में क्षेत्र की क्षमता की जांच करने के लिएपिछलाकार्य भी किया गया है . यहां, हम मूरीन आंतरिक सैन फायरिंग दरों को रिकॉर्ड करने और विश्लेषण करने के लिए विदेश मंत्रालय का उपयोग करने के लिए एक पद्धति प्रदान करते हैं। हम यह भी वर्णन करते हैं कि कैसे इस तकनीक का उपयोग सैन आंतरिक फायरिंग दरों पर दवाओं के औषधीय प्रभावों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, जो एक वोल्टेज-गेटेड के+ चैनल अवरोधक 4-अमीनोपिरिडीन (4-एपी) के प्रभाव को दर्शाने वाला नमूना प्रयोग प्रदान करता है। परिभाषित शारीरिक स्थलों का उपयोग करके, हम अन्य तरीकों में आवश्यक व्यापक ऊतक विच्छेदन या सेल अलगाव को किए बिना सैन को सटीक रूप से रिकॉर्ड कर सकते हैं। जबकि विदेश मंत्रालय लागत निषेधात्मक हो सकता है, रिकॉर्डिंग पेसमेकिंग के अत्यधिक विशिष्ट और विश्वसनीय उपाय प्रदान करती है जिसका उपयोग नैदानिक और शारीरिक अनुसंधान अनुप्रयोगों की एक विशाल सरणी में किया जा सकता है।

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Protocol

यहां वर्णित सभी प्रायोगिक प्रक्रियाएं दक्षिणी मेथोडिस्ट विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के दिशा-निर्देशों के अनुसार की गई हैं ।

1. रिकॉर्डिंग के लिए मल्टीइलेक्ट्रोड सरणी (विदेश मंत्रालय) कोटिंग

  1. 25 एमएम बोरेट बफर करें।
    1. 80 मिलील डिफाल पानी में 0.953 ग्राम एनए2बी4ओ7·10एच 2 ओ घोलें।
    2. एचसीएल के साथ पीएच को 8.4 में समायोजित करें और फिर 100 एमएल की अंतिम मात्रा में आसुत पानी जोड़ें।
  2. पॉलीथीनिमाइन (पी) का 0.1% स्टॉक समाधान बनाएं।
    1. 1% पी समाधान बनाने के लिए 50% (w/v) पी के 4.9 मिलियन मिलियन डिस्टिल पानी में 100 माइक्रोन जोड़ें।
    2. 25 एमएल बोरेट बफर के 9 एमएल में 1% पी सॉल्यूशन के 1 एमएल जोड़कर बोरेट बफर में 0.1% तक 1% पी समाधान को पतला करें।
  3. माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) डिश में 0.1% पी समाधान का पिपेट ~ 1 एमसीए ताकि इलेक्ट्रोड पूरी तरह से कवर हो जाएं(चित्रा 1A और 1B)।
    नोट: विदेश मंत्रालय के माइक्रोइलेक्ट्रोड्स आमतौर पर प्लेटिनम ब्लैक या कार्बन नैनोट्यूब से बने होते हैं और पॉलीमाइड (या ऐक्रेलिक) से अछूता होते हैं; दोनों सामग्री हाइड्रोफोबिक हैं। विदेश मंत्रालय को पी जैसे एक cationic बहुलक के साथ कोटिंग करके, हाइड्रोफोबिक विदेश मंत्रालय की सतह को अधिक हाइड्रोफिलिक बनाया जाता है, जिससे ऊतक के नमूनों को विदेश मंत्रालय की सतह(चित्रा 1A1)के साथ बेहतर संपर्क बनाने की अनुमति दी जाती है।
  4. वाष्पीकरण को कम करने के लिए थर्मोप्लास्टिक फिल्म के साथ विदेश मंत्रालय पकवान को कवर करें और विदेश मंत्रालय को रात भर कमरे के तापमान(चित्रा 1C)पर छोड़ दें।
  5. एक पिपेट का उपयोग करके विदेश मंत्रालय के पकवान से पी समाधान को एस्पिरेट करें, इलेक्ट्रोड ग्रिड को छूने के लिए सावधान न रहें जो इलेक्ट्रोड को नुकसान पहुंचा सकता है, और फिर आसुत पानी(चित्रा 1D)के साथ ≥4 बार कुल्ला।
  6. अल्ट्रापुरे पानी के 1-2 मिलील के तहत पी-लेपित विदेश मंत्रालय को स्टोर करें और जरूरत तक थर्मोप्लास्टिक फिल्म के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर सील करें। वैकल्पिक रूप से, लेपित विदेश मंत्रालय को अल्ट्रापुरे पानी(चित्रा 1E)से भरे बीकर में जलमग्न करके स्टोर करें।
    नोट: पी कोटिंग प्रक्रिया केवल अपने पहले उपयोग से पहले विदेश मंत्रालय के लिए एक बार प्रदर्शन की जरूरत है, और प्रत्येक रिकॉर्डिंग सत्र के बाद, विदेश मंत्रालय अल्ट्रापुरे पानी में जलमग्न संग्रहीत किया जाना चाहिए ।

2. ऊतक विच्छेदन के लिए पूर्ण टायरोड का समाधान तैयार करना

  1. विच्छेदन के लिए पूर्ण टायरोड के समाधान का 1,000 मिलियन एमएल बनाएं; सबसे पहले, एनएसीएल के 8.1816 ग्राम को 800 एमएल अल्ट्रापुरे पानी में जोड़ें।
  2. समाधान में रसायनों की निम्नलिखित मात्रा जोड़ें: केसीएल के 0.4025 ग्राम; 0.1633 जी केएच2पीओ4; 1.1915 ग्राम हेपेस; 0.9999 ग्राम ग्लूकोज; 0.0952 ग्राम एमजीसीएल2; 0.2646 ग्राम सीएसीएल2· 2H2O।
  3. पीएच को नाओएच के साथ 7.4 पर समायोजित करें और फिर अल्ट्रापुरे पानी जोड़ें जब तक कि कुल मात्रा 1,000 एमएल न हो जाए।
    नोट: पूर्ण टायरोड के समाधान की अंतिम संरचना निम्नलिखित (एमएमएम में): 140 एनएसीएल, 5.4 केसीएल, 1.2 केएच2पीओ4,5 एचईपीई, 5.55 ग्लूकोज, 1 एमजीसीएल2,1.8 सीएसीएल2होगी।

3. रिकॉर्डिंग के लिए ऑक्सीजनयुक्त टायरोड का समाधान तैयार करना

  1. टायरोड के समाधान का 500 एमएल बनाएं; 400 एमएल में एनएसीएल के 4.003 ग्राम अल्ट्रापुरे पानी डालें।
  2. समाधान में रसायनों की निम्नलिखित मात्रा जोड़ें: 0.651 ग्राम नाएचसीओ3; 0.042 ग्राम एनएएच2पीओ4; 0.132 ग्राम सीएसीएल2· 2एच2ओ; 0.149 ग्राम केसीएल; 0.0476 ग्राम एमजीसीएल2; 0.999 ग्राम ग्लूकोज।
  3. एचसीएल के साथ पीएच को 7.4 में समायोजित करें और फिर कुल मात्रा 500 एमएल होने तक अल्ट्रापुरे पानी जोड़ें।
  4. रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए कार्बोजन के साथ समाधान को ऑक्सीजन करें।
    नोट: टायरोड के समाधान की अंतिम संरचना निम्नलिखित (एमएमएम में): 137 एनएसीएल, 15.5 एनएएचसीओ3,0.7 एनएएच2पीओ4,1.8 सीएसीएल2,4 केसीएल, 1 एमजीसीएल2,11.1 ग्लूकोज होगा। इस टायरोड के समाधान में विच्छेदन के लिए उपयोग किए जाने वाले पूर्ण टायरोड के समाधान से थोड़ा अलग संरचना है।

4. फार्माकोलॉजिकल मॉड्यूलेशन के लिए 4-अमीनोपीरिडीन (4-एपी) समाधान तैयार करना

  1. 4-एपी का 1 mm काम समाधान बनाओ; स्टेप 3 से टायरोड के समाधान के 200 एमएल में 4-एपी की 18.82 मिलीग्राम जोड़ें।
  2. प्रयोग से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए 4-एपी समाधान ऑक्सीजन।

5. विच्छेदन के लिए पेट्री डिश तैयार करना

  1. बेस के 10:1 अनुपात (वजन के अनुसार) में सिलिकॉन इलास्टोमर घटकों को इलाज एजेंट में मिलाएं।
  2. 60 मिमी व्यास पेट्री डिश में सिलिकॉन इलास्टोमर मिश्रण के ~ 15 एमएल डालें।
  3. इलास्टोमर को उपयोग से पहले 48 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इलाज करने की अनुमति दें।
    नोट: सिलिकॉन पेट्री डिश को भविष्य के विच्छेदन के लिए पुन: इस् तेम किया जा सकता है।

6. सिनोट्रायल नोड (सैन) विच्छेदन

  1. सैन विच्छेदन के लिए हेपरिनाइज्ड कंप्लीट टायरोड का समाधान तैयार करें।
    1. पूर्ण टायरोड के समाधान के 40 एमएल में हेपरिन (1,000 यूएसपी/एमएल) के 400 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म करें।
  2. माउस को 200-300 μL हेपरिन (1000 यूएसपी/एमएल) के साथ इंजेक्ट करें और जानवर को 10 मिनट तक बैठने की अनुमति दें।
  3. आइसोफ्लुने ओवरडोज द्वारा हेपरिनाइज्ड माउस को इच्छामृत्यु दें।
    1. माउस को एक छोटे से ग्लास कक्ष में रखें जिसमें आइसोफलुरेन वाष्प होता है जो छिद्रित प्लास्टिक ट्यूब के अंदर एक फिल्टर पेपर में तरल आइसोफ्लोरैन के 200-300 माइक्रोन जोड़कर उत्पन्न होता है।
      नोट: क्योंकि आइसोफ्लुएंज त्वचा में जलन पैदा कर सकता है और त्वचा के माध्यम से भी अवशोषित किया जा सकता है, तरल सीधे माउस से संपर्क नहीं करना चाहिए। इसलिए, आइसोफ्लुरेन से लथपथ पोंछ को प्रशासन के लिए छिद्रित ट्यूब में रखा जाता है।
    2. आंदोलन और श्वास प्रयास की समाप्ति और एक अंगुली चुटकी पलटा की अनुपस्थिति से मौत का सत्यापन करें। मौत आमतौर पर कक्ष में प्लेसमेंट के बाद लगभग 1-2 मिनट लेती है।
      नोट: मौत आमतौर पर पेशाब के साथ होती है।
  4. पंजे के साथ एक विच्छेदन बोर्ड पर एक रीढ़ की स्थिति में माउस रखें और 1 इंच लंबी, 23 गेज सिरिंज सुई का उपयोग कर बोर्ड के लिए पंजे को ठीक करें । फिर सर्जिकल कैंची का उपयोग करके और जड़ों पर फर को काटकर रिब पिंजरे के नीचे के आसपास फर को हटा दें।
    नोट: विच्छेदन बोर्ड के लिए, पॉलीस्टीरिन कूलर ढक्कन का उपयोग किया जा सकता है।
  5. त्वचा को हेमोस्टेट के साथ पकड़े हुए, सर्जिकल कैंची का उपयोग करने के लिए बस रिब पिंजरे के नीचे के नीचे से सही कॉस्टल आर्क(चित्रा 3A)के लिए बाएं कोस्टल आर्क के नीचे से त्वचा में एक उलट चीरा बनाने के लिए ।
  6. कट सर्जिकल कैंची के साथ पेरिटोनम खोलें और ध्यान से डायाफ्राम से जिगर को अलग करें, लिवर को निक न करने के लिए सावधान रहें, जिससे अत्यधिक रक्तस्राव(चित्रा 3B)हो जाएगा। छाती गुहा(चित्रा 3C-D)का पर्दाफाश करने के लिए छाती के साथ डायाफ्राम को चीरना।
  7. सर्जिकल कैंची का उपयोग करना, दिल को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए सावधान रहने के लिए दिल को बेनकाब करने के लिए, दिल को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए, दिल को बेनकाब करने के लिए तटीय मेहराब के किनारों से रिब पिंजरे की पार्श्व दीवारों को काटदें। फिर कंधे पर रिब पिंजरे को पिन करने के लिए 23 गेज सिरिंज सुई का उपयोग करें, इसे जगह में और सर्जिकल क्षेत्र के रास्ते से बाहर रखें।
  8. इसे नम रखने के लिए दिल पर गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) ड्रिप गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें।
    नोट: दिल को सूखने न दें।
  9. उन्हें अतिरिक्त ठीक ग्रीफे संदंश के साथ पकड़ और सर्जिकल कैंची(चित्रा 3E)के साथ श्वासनली तोड़ द्वारा फेफड़ों को हटा दें ।
  10. अतिरिक्त ठीक ग्रीफे संदंश के साथ दिल के शीर्ष पकड़ो और सर्जिकल कैंची के साथ महाधमनी और वेने कैवे को काटकर इसे हटा दें। ठीक सिलिकॉन इलास्टोमर(चित्रा 4A)युक्त पेट्री डिश में दिल को स्थानांतरित करें और दिल को गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) के 2-3 एमएल के साथ स्नान करने के लिए एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें।
    नोट: सावधान रहें कि सही अटरिया की नाजुक पीछे की दीवार को नुकसान न पहुंचाएं, जिसमें सैन, और कनेक्टेड राइट अलिंद नसों शामिल हैं। पूर्ण टायरोड के समाधान के साथ दिल स्नान दिल को सूखने से रोकता है लेकिन पूरी तरह से समाधान में दिल को जलमग्न नहीं करता है क्योंकि यह विच्छेदन के दौरान दृश्यता को ख़राब कर देगा।
  11. प्रयोगकर्ता के दाईं ओर सही एट्रियम के साथ दिल उन्मुख और प्रयोगकर्ता के बाईं ओर बाएं एट्रियम।
    नोट: सैन ऊतक का विच्छेदन जल्दी से किया जाना चाहिए ताकि इस्केमिया से संबंधित चोट को रोकने के लिए ।
  12. एक विच्छेदन पिन के साथ पकवान के लिए दिल के शीर्ष संलग्न करें। फिर, ड्यूमोंट #2 लेमिनेक्टॉमी संदंश के साथ अवर वेना कावा को पकड़े हुए, सही एट्रियम में अपनी स्थिति का पता लगाने के लिए अवर और बेहतर वेना कावा के माध्यम से 22 ग्राम सिरिंज सुई डालें, जो सैन की अनुमानित स्थिति (अवर और बेहतर वेना कैवा(चित्रा 4B)के बीच ऊतक के पैच में स्थित है।
  13. छोटे विच्छेदन पिन का उपयोग करके, बाएं और दाएं अलिंद उपांगों को पकवान पर पिन करें।
    1. ड्यूमोंट #2 लेमिनेक्टॉमी संदंश के साथ बाएं अलिंद उपांग को पकड़ते समय, इसे जगह में रखने के लिए बाएं अलिंद उपांग के माध्यम से एक विच्छेदन पिन डालें।
    2. ड्यूमोंट #55 संदंश के साथ सही अलिंद उपांग धारण करते समय, इसे जगह में रखने के लिए सही अलिंद उपांग के माध्यम से एक विच्छेदन पिन डालें।
      नोट: एक ही प्रकार के संदंश का उपयोग यदि वांछित हो तो बाएं और दाएं अलिंद उपांग को पकड़ने के लिए किया जा सकता है।
  14. वेनी कैवे तक फैली सिरिंज सुई निकालें।
  15. दिल से रक्त छोड़ने के लिए, वेंट्रिकल्स(चित्रा 4C)में एक ट्रांसवर्स चीरा बनाकर दिल के शीर्ष (यानी, नीचे आधा) को हटाने के लिए कास्त्रोविजो कैंची का उपयोग करें। फिर, एक स्थानांतरण पिपेट के साथ गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) हेपरिनाइज्ड पूर्ण टायरोड के समाधान को जोड़कर दिल को धोएं।
  16. अटरिया की तुलना में चीरा को वेंट्रिकल के करीब रखते हुए एट्रिओवेंट्रिकुलर सेप्टम के साथ काटने के लिए कास्त्रोविजो कैंची का उपयोग करें। अटरिया को वेंट्रिकल्स से अलग होने तक एट्रीवेंट्रिकुलर सेप्टम के साथ काटना जारी रखें।
  17. बाएं एट्रियम को हटाने के लिए इंटरएट्रायल पट के साथ काटें।
  18. विच्छेदन पिन को सही एट्रियम की परिधि में रखें ताकि यह फ्लैट(चित्रा 4D)बिछा सके। कैस्ट्रोविजो कैंची का उपयोग करके एट्रियम से किसी भी शेष वसा, जहाजों या ऊतक को हटा दें।
  19. सैन को सही एट्रियम में ढूंढें, जो इस अभिविन्यास में लगभग बेहतर वेना कावा (शीर्ष पर), अवर वेना कावा (नीचे), और क्रिस्टे टर्मिनल (बाईं ओर)(चित्र 4 डी)से घिरा हुआ है।
    नोट: क्रिस्टा टर्मिनल सही अलिंद उपांग और सैन के बीच एक अंधेरे पेशी रिज के रूप में प्रकट होता है । अक्सर सैन धमनी को सैन(चित्रा 4D)के माध्यम से भी देखा जा सकता है।

7. रिकॉर्डिंग के लिए विदेश मंत्रालय प्रणाली तैयार करना

  1. टाइरोड के समाधान (स्टेप 3 से) को इनपुट सॉल्यूशन बोतल(चित्रा 5C)में जोड़ें और सिस्टम में कार्बोजन गैस(चित्रा 5A)के प्रवाह को चालू करके इसे ऑक्सीजनित करें।
    नोट: रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किया जाने वाला टायरोड का समाधान विच्छेदन के लिए उपयोग किए जाने वाले पूर्ण टायरोड के समाधान से संरचना में थोड़ा अलग है।
  2. शंकु फ्लास्क में बुलबुले देख कर कार्बोजन के प्रवाह को सत्यापित करें, जिसका उपयोग गैस(चित्रा 5B)और इनपुट समाधान बोतल(चित्रा 5C)को आर्द्र करने के लिए किया जाता है।
  3. टायरोड के रिकॉर्डिंग सॉल्यूशन(चित्रा 5C)में पेरिस्टाल्टिक पंप इनफ्लो ट्यूबिंग(चित्रा 5D)डालें। फिर, संग्रह की बोतल(चित्रा 5I)में पेरिस्टाल्टिक पंप आउटफ्लो ट्यूबिंग डालें।
  4. पेरिस्टाल्टिक पंप को 25 आरपीएम सेट करें, जो 2 एमएल/मिनट का फ्लो रेट देता है और पंप शुरू करता है । किसी भी बफर रिसाव या ओवरफ्लो के लिए सिस्टम की जांच करें।
  5. तापमान नियंत्रक को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, चूहों का शारीरिक तापमान(चित्र 5E)।

8. विदेश मंत्रालय ग्रिड पर दिल के ऊतकों को रखना

  1. विच्छेदन पेट्री डिश से एक पेंट ब्रश(चित्रा 6A)की मदद से विच्छेदन सैन ऊतक को विदेश मंत्रालय ग्रिड(चित्रा 1A1) पर स्थानांतरित करें।
    1. एक उल्टे माइक्रोस्कोप के नीचे देखते हुए, धीरे-धीरे ऊतक को नरम पेंट ब्रश से स्थिति दें ताकि सैन क्षेत्र इलेक्ट्रोड ग्रिड को ओवरले करे।
    2. यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक ऊतक को फिर से रखें कि यह इलेक्ट्रोड ग्रिड पर फ्लैट देता है, जिससे इलेक्ट्रोड के साथ अच्छा संपर्क होता है।
      नोट: इलेक्ट्रोड ग्रिड को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए ऊतक को ले जाने के लिए एक नरम पेंट ब्रश की आवश्यकता होती है।
  2. एक बार जब ऊतक सही ढंग से तैनात हो जाता है, तो ऊतक(चित्र 6ए)पर जाल रखने के लिए हड्डी संदंश (या किसी भी घुमावदार संदंश) का उपयोग करें। फिर जगह में सब कुछ पकड़ (चित्रा6B)के लिए जाल पर वीणा लंगर(चित्रा 6A)जगह करने के लिए हड्डी संदंश का उपयोग करें ।
  3. विदेश मंत्रालय पर ऊतक की स्थिति की एक तस्वीर लें ताकि रिकॉर्डिंग के दौरान व्यक्तिगत इलेक्ट्रोड की गतिविधि को उनके शारीरिक स्थान के साथ सहसंबद्ध किया जा सके। यह उल्टे माइक्रोस्कोप उद्देश्य तक या एक संलग्न माइक्रोस्कोप कैमरे का उपयोग करके एक स्मार्टफोन पकड़ द्वारा किया जा सकता है ।
    नोट: यदि तस्वीर लेने के बाद विदेश मंत्रालय का अभिविन्यास नहीं बदला जाता है, तो रिकॉर्डिंग के दौरान शीर्ष बाएं इलेक्ट्रोड पहले चैनल (Ch1) के रूप में दिखाई देगा।
  4. कनेक्टर प्लेट(चित्रा 5F और 6C)पर विदेश मंत्रालय पकवान रखें और ध्यान से वीणा टुकड़ा लंगर परेशान बिना विदेश मंत्रालय पकवान पर perfusion टोपी(चित्रा 6C)जगह है । परफ्यूजन कैप को लैब टेप(चित्रा 6C)के एक टुकड़े का उपयोग करके और सुरक्षित किया जा सकता है।
    नोट: समायोज्य समाधान प्रवाह और बहिर्वाह पाइप होने के अलावा, टोपी भी गैस की डिलीवरी के लिए एक बंदरगाह है(चित्रा 6C)। इसके अलावा, संदर्भ इलेक्ट्रोड रिंग कैप(चित्रा 6C)के माध्यम से चलता है।
  5. ऊतक को हैंडलिंग से ठीक होने और रिकॉर्डिंग से पहले 15-20 मिनट के लिए कक्ष में स्वीकार करने की अनुमति दें।

9. रिकॉर्डिंग के लिए डेटा अधिग्रहण प्रोटोकॉल सेट करना

नोट: निम्नलिखित चरण सहज बीट रिकॉर्डिंग के लिए सॉफ्टवेयर प्रोटोकॉल खोलने और रिकॉर्डिंग शर्तों को परिभाषित करने का वर्णन करते हैं। इन चरणों की बारीकियों का उपयोग किए जा रहे विशिष्ट सॉफ्टवेयर के आधार पर भिन्न हो सकता है, लेकिन सामान्य रूपरेखा समान रहनी चाहिए।

  1. एम्पलीफायर(चित्रा 5G)चालू करें, और कंप्यूटर(चित्रा 5H)पर सॉफ्टवेयर में रिकॉर्डिंग के लिए एक वर्कफ्लो सेट करें।
    1. सॉफ्टवेयर खोलें और वर्कफ़्लोपर क्लिक करें।
    2. ओपन न्यू फोल्डरका चयन करें ।
    3. टेम्पलेट्स फोल्डर से खोलें।
    4. 64MD1-1920X1080 (अपने डेस्कटॉप के संकल्प के आधार पर) का चयन करें ।
    5. क्यूटी फोल्डर खोलें।
    6. सहज रिकॉर्डिंग फ़ोल्डर खोलें।
    7. Beat_recording.मोफ्लो टेम्पलेट का चयन करें और इसे(चित्रा 7A) खोलें।
  2. वांछित रिकॉर्डिंग शर्तों(चित्रा 7B)के अनुसार, निशान की संख्या, ट्रेस अवधि, ट्रेस अंतराल, इनपुट वोल्टेज, नमूना दर आदि को निर्दिष्ट करने के लिए रिकॉर्डिंग पैरामीटर सेट करें।
    नोट: बीट फ्रीक्वेंसी और इंटरस्पीक डेटा अधिग्रहण के लिए, आमतौर पर 2.9 एमवी की इनपुट रेंज वोल्टेज, 1-हर्ट्ज हाई पास फिल्टर, 1000-हर्ट्ज कम पास फिल्टर और 20 किलोहर्ट्ज की नमूना दर का उपयोग करें।
  3. प्रयोग के विभिन्न चरणों या शर्तों को चिह्नित करने के लिए, जैसे कि पहले और बाद में, वांछित नोटेशन(चित्रा 7C)जोड़ने के लिए एनोटेशन टैब पर क्लिक करें।
  4. एकत्र किए जाने वाले डेटा के लिए फ़ाइल गंतव्य निर्दिष्ट करने के लिए, सक्षम भंडारण बॉक्स का चयन करें और फ़ाइल नाम संशोधक बॉक्स में वांछित फ़ाइल नाम दर्ज करें।

10. रिकॉर्डिंग करना और डेटा एकत्र करना

  1. रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के सर्वोच्च मेनू बार पर रिकॉर्ड और प्ले बटन पर क्लिक करें। निशान के बीच 2 मिनट के अंतराल के साथ 1 मिनट की अवधि के 10 निशान के लिए डेटा प्राप्त करें।
  2. इन प्रारंभिक निशानों से, सत्यापित करें कि रिकॉर्ड किए गए तरंग एक स्वस्थ और उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक तैयारी के अनुरूप हैं, यह पुष्टि करके कि अधिकांश रिकॉर्डिंग चैनल ≥ 0.5 एमवी और समान अंतर-स्पाइक अंतराल(चित्रा 8)के सिग्नल आयाम प्रदर्शित करते हैं।
    नोट: विदेश मंत्रालय पर ऊतक की स्थिति के बाद अधिग्रहीत चित्र को संदर्भित करके उनके शारीरिक स्थानों के अनुरूप व्यक्तिगत माइक्रोइलेक्ट्रोड की गतिविधि और तरंग रूपों का प्रारंभिक आकलन किया जा सकता है।
  3. ऊतक पर दवाओं के प्रभाव को मापने के लिए, सबसे ऊपर मेनू बार पर ठहराव बटन पर क्लिक करके प्रारंभिक बेसलाइन डेटा प्राप्त करने के बाद रिकॉर्डिंग को थामने।
    नोट: प्रयोग के दवा प्रतिक्रिया चरण को एनोटेशन टैब पर क्लिक करके रिकॉर्डिंग में नोट किया जा सकता है और ऊपर वर्णित वांछित अंकन को जोड़कर(चित्र 7सी)।
  4. पंप को रोकें और सामान्य रिकॉर्डिंग समाधान से सामान्य रिकॉर्डिंग समाधान से पंप इनोफ्लो ट्यूबिंग को पसंद की वांछित दवा वाले टायरोड के समाधान पर स्विच करें।
    नोट: उदाहरण प्रयोग में, टायरोड के समाधान का उपयोग 1 mm 4-aminopyridine (4-एपी) के साथ किया गया था।
  5. पंप को पुनः आरंभ करें और फिर से डेटा एकत्र करना शुरू करने के लिए रिकॉर्डिंग को अन-पॉज़ करें।
  6. एक बार दवा संचार है Tyrode समाधान ऊतक तक पहुंच गया है, उसी तरीके से 10 निशान रिकॉर्ड के रूप में बेसलाइन रिकॉर्डिंग के लिए पहले किया ।
    नोट: निशान कुछ समय लेने के लिए स्थिर के रूप में दवा रिकॉर्डिंग चैंबर में संचार होगा । दवा की कार्रवाई का तंत्र रिकॉर्डिंग स्थिरता को भी प्रभावित कर सकता है। जिन दवाओं में कार्रवाई के प्रतिवर्ती तंत्र होते हैं, उनके लिए बेसलाइन स्तर पर गतिविधि की बहाली की पुष्टि करने के लिए एक वॉशआउट अवधि भी दर्ज की जानी चाहिए, जो स्वस्थ ऊतकों का संकेतक है।
  7. रिकॉर्डिंग समाप्त करने के लिए स्टॉप पर क्लिक करें।
  8. प्रारंभिक रिकॉर्डिंग सेटअप प्रक्रिया के बाद ऊतक स्थानांतरित होने की स्थिति में माइक्रोस्कोप के तहत विदेश मंत्रालय पर ऊतक की स्थिति की अंतिम तस्वीर लें।

11. रिकॉर्डिंग के बाद सेटअप की सफाई

  1. विदेश मंत्रालय को साफ करें।
    1. रिकॉर्डिंग खत्म करने के बाद, धीरे-धीरे 1 एमएल माइक्रोपिपेट का उपयोग करके विदेश मंत्रालय डिश से रिकॉर्डिंग समाधान निकालें।
      नोट: सावधान रहें कि विदेश मंत्रालय इलेक्ट्रोड से संपर्क न करें जो उन्हें नुकसान पहुंचा सकता है।
    2. अस्थि संदंश (या किसी भी घुमावदार संदंश) के साथ जाल और वीणा लंगर निकालें। फिर विदेश मंत्रालय की सतह से ऊतक को उखाड़ फेंकने के लिए एक पेंट ब्रश का उपयोग करें हमेशा व्यक्तिगत माइक्रोइलेक्ट्रोड को छूने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है।
    3. वॉश बॉटल का इस्तेमाल करते हुए धीरे-धीरे विदेश मंत्रालय की डिश को अल्ट्रापुरे पानी से करीब 3 से 4 बार कुल्ला करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर अल्ट्रापुरे पानी में डूबे स्वच्छ विदेश मंत्रालय को स्टोर करें।
  2. पेरिस्टाल्टिक पंप पर अधिकतम गति सेटिंग का उपयोग करके कम से कम 5 मिनट के लिए इसके माध्यम से अल्ट्रापुरे पानी चलाकर सिस्टम ट्यूबिंग कुल्ला करें।
    नोट: कवक विकास को रोकने के लिए, सफाई के बाद ट्यूबिंग के अंदर कोई पानी या बफर समाधान नहीं छोड़ा जाना चाहिए।

12. सैन बीट आवृत्ति को मापने के लिए विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग का विश्लेषण

  1. सेव किए गए रिकॉर्ड किए गए डेटा फ़ाइल को विश्लेषण सॉफ्टवेयर(चित्रा 9)के "Beat_frequency_analysis" टेम्पलेट में खोलें।
  2. प्ले बटन पर क्लिक करें और पूरी रिकॉर्डिंग को डेटा सेट की कल्पना करने और उचित विश्लेषण मापदंडों को असाइन करने की अनुमति दें।
    1. डेटा के वांछित डिस्प्ले प्रारूप के लिए बिनिंग विंडो का चयन करें, चाहे वह प्रति ट्रेस औसत या औसत प्रति समय(चित्रा 10A) केरूप में प्रदर्शित किया गया हो।
    2. विश्लेषण में शामिल किए जाने वाले चैनलों का चयन करें और स्वचालित तरंग शिखर पहचान(चित्रा 10 बी)के लिए वांछित आयाम मैक्सिमा या आयाम मिनीमा दहलीज मूल्यों को सेट करें।
      नोट: इस चरण(चित्रा 9)पर विश्लेषण के लिए एक व्यक्तिगत चैनल, चैनलों का संयोजन या सभी 64 चैनलों का चयन किया जा सकता है। यदि चयनित सीमा मान तरंग के मैक्सिमा और मिनीमा मूल्यों के बहुत करीब हैं, तो कुछ तरंग चोटियों को विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा पहचाना नहीं जा सकता है।
    3. विश्लेषण में शामिल होने के लिए प्री-स्पाइक और पोस्ट-स्पाइक समय की मात्रा निर्धारित करें।
      नोट: 50 एमएस प्री-स्पाइक और 100 एमएस पोस्ट-स्पाइक की सेटिंग्स आमतौर पर अच्छी तरह से काम करतीहैं (चित्रा 10B)।
  3. विश्लेषण की स्थिति सेट करने के बाद, डेटा सेट को फिर से चलाने के लिए प्ले बटन पर फिर से क्लिक करें और पुष्टि करें कि विश्लेषण पैरामीटर स्पाइक निष्कर्षण के लिए उपयुक्त हैं।
  4. विश्लेषण के लिए, तीन सबसे स्थिर लगातार निशान की पहचान करें जो प्रयोग की आधारभूत अवधि के दौरान अधिकांश चैनलों में प्रत्येक ट्रेस के लिए स्थिर पिटाई दर प्रदर्शित करते हैं और दवा एक्सपोजर अवधि(चित्रा 10A)के दौरान लगातार तीन स्थिर निशान हैं।
  5. विश्लेषण के लिए प्रारंभ और अंत के निशान निर्दिष्ट करें और विश्लेषण किए जाने वाले प्रत्येक ट्रेस की समय अवधि दर्जकरें (चित्र 9)।
  6. विश्लेषण शुरू करने से पहले, प्रति मिनट सेव बीट और इंटरसिक इंटरज़िक इंटरवल (चित्रा 10 बी)दोनों के लिए सक्षम बक्से का चयन करें।
  7. फाइल नाम मोडिफाईर बॉक्स(चित्रा 10B)में वांछित फाइल नाम दर्ज करें । बीट फ्रीक्वेंसी और इंटरसिक इंटरपिक इंटरवल के लिए विश्लेषण किए गए डेटा को एएससीआईआई (टेक्स्ट) प्रारूप के रूप में सहेजा जाएगा।
    नोट: विभिन्न स्थितियों (जैसे बेसलाइन और दवा प्रतिक्रिया) का विश्लेषण करने के लिए, विश्लेषण प्रत्येक स्थिति के लिए अलग से चलाया जाना चाहिए ।
  8. विश्लेषण शुरू करने के लिए शीर्ष टैब बार पर प्ले और रिकॉर्ड बटन पर क्लिक करें।
  9. अन्य अनुप्रयोगों के लिए डेटा निर्यात करने के लिए, प्रति मिनट सेव बीट के लिए बक्से का चयन करें और इंटरस्पीक इंटरवल (चित्रा 10 बी) को बचाएं। फाइल नाम मोडिफाईर बॉक्स(चित्रा 10B)में वांछित फ़ाइल नाम दर्ज करें और चयनित फ़ोल्डर में ASCII टेक्स्ट प्रारूप में विश्लेषण किए गए डेटा को सहेजने के लिए सेव पर क्लिक करें।

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Representative Results

ऊतक को 15 मिनट के लिए पकवान में acclimate करने की अनुमति देने के बाद, 10 1-मिनट के निशान दर्ज किए जाते हैं। हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल एक घंटे से अधिक के लिए गतिविधि रिकॉर्ड करता है, लेकिन हमने यहां नहीं दिखाए गए अप्रकाशित डेटा में ≥4 घंटे के लिए स्थिर फायरिंग पैटर्न दर्ज किए हैं। यदि कोई प्रयोगात्मक तैयारी डेटा संग्रह के लिए अच्छी है, तो प्रत्येक रिकॉर्डिंग चैनल को किसी दिए गए चैनल(चित्रा 11D)के लिए समान आकार के सुसंगत और समान रूप से दूरी वाले आवर्ती तरंग रूप (यानी स्पाइक्स) प्रदर्शित करना चाहिए। ये तरंग व्यक्तिगत हृदय धड़कन के अनुरूप होती है जो आंतरिक हृदय गति निर्माण गतिविधि को प्रतिबिंबित करती है। इंटरसिके अंतराल हर चैनल के लिए समान होना चाहिए, भले ही वे पूरी तरह से अपध्रुवीकरण(चित्रा 8)की दीक्षा स्थल के सापेक्ष अपने स्थान में छोटे अंतर के कारण चैनलों में पूरी तरह से गठबंधन न हों। यद्यपि किसी दिए गए चैनल के लिए तरंग रूपों का आकार सुसंगत होना चाहिए, लेकिन ऊतक(चित्र 8)में इलेक्ट्रोड के स्थान के आधार पर तरंग रूपों का आकार चैनलों में भिन्न होगा। इलेक्ट्रोड के साथ ऊतक के संपर्क की डिग्री भी आयाम जैसे तरंग विशेषताओं को प्रभावित कर सकती है। हालांकि, तैयारी संतोषजनक होने पर अधिकांश चैनलों के लिए आयाम मैक्सिमा कम से कम 0.5 एमवी होना चाहिए। 10 रिकॉर्ड किए गए निशानों से, ऊपर वर्णित गुणवत्ता मानदंडों को पूरा करने वाले लगातार तीन चैनलों को नीचे वर्णित आगे के विश्लेषण के लिए चुना गया था। चित्रा 10A लगातार तीन निशान के लिए स्थिर बीट आवृत्ति (शीर्ष पैनल) और इंटरसिके अंतराल (मध्य पैनल) का एक नमूना दिखाता है। ऊतक जो इन मानदंडों को पूरा नहीं करता है, उसे दर्ज नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि संभावित ऊतक क्षति है जो सटीक डेटा संग्रह में बाधा उत्पन्न करेगी। चित्रा 11 खराब निकाले गए स्पाइक पैटर्न के उदाहरण दिखाता है जो या तो अनुपस्थित(ए),शोर(बी)या अस्थिर(सी)से प्रभावित होते हैं।

आंकड़ों में प्रदर्शित नमूना डेटा एक ४५ दिन पुराने पुरुष वाइल्डटाइप ब्लैक स्विस (टीएसी: एन: NIHS-ईसा पूर्व) माउस से एकत्र किया गया था । चित्रा 9 और चित्रा 10 में दर्शाई गई विश्लेषण प्रक्रिया का उपयोग आंतरिक फायरिंग दर को निकालने और बेसलाइन स्पाइक्स प्रदर्शित करने के लिए किया गया था जिसे चित्र 12एमें देखा जा सकता है। फायरिंग दर तीन निशान में से प्रत्येक से ६०,००० एमएस भर में औसत दर है, लेकिन चित्रा 12A में स्पाइक पैटर्न एक ही ट्रेस से प्रतिनिधि स्पाइकिंग के 5 एस से पता चलता है । स्वचालित विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, सभी 64 चैनलों में चयनित तीन निशानों की आंतरिक फायरिंग दर (यानी, बीट फ्रीक्वेंसी) हमारे नमूना डेटा(चित्रा 12A)में लगभग 320 बीपीएम पाई गई। सामान्य तौर पर, हम वाइल्डटाइप चूहों के लिए हमारी रिकॉर्डिंग में लगभग 290-340 बीपीएम के मूल्यों की एक श्रृंखला का पालन करते हैं। फायरिंग दर भी तैयारी की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए एक माध्यमिक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। दरें जो या तो अस्थिर हैं या 300 बीपीएम से काफी कम हैं, विश्लेषण के लिए अच्छी होने की संभावना कम है। ये मूल्य अलग - अलग हृदय और एकल कोशिका रिकॉर्डिंग दोनों के बराबर हैं जो लगभग 300-500 बीपीएम25,48,49की सीमा में आंतरिक हृदय दरों की रिपोर्ट करते हैं। इसलिए, विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग तकनीक आंतरिक हृदय गति के विश्वसनीय और सटीक उपाय पैदा करने में सक्षम है।

विदेश मंत्रालय प्रणाली का एक लाभ यह है कि यह औषधीय प्रभावों का परीक्षण करने के लिए दवा एजेंटों के आसान आवेदन की अनुमति देता है। नमूना प्रयोग में, हमने फायरिंग दर पर 1 mM 4-AP के प्रभावों का परीक्षण किया, जो सैन गतिविधि को धीमा करना चाहिए क्योंकि वोल्टेज-गेटेड K+ चैनलों की नाकाबंदी एसए कोशिकाओं24,50में कार्रवाई संभावित पुनर्ध्रुवीकरण को ख़राब करने के लिए जानी जाती है। चित्रा 12B से पता चलता है कि 4-एपी की शुरूआत ने उम्मीद के अनुसार इंटरसिके अंतराल में वृद्धि की। यह लंबे समय तक स्पाइक अंतराल 320 बीपीएम से 210 बीपीएम तक बीट आवृत्ति में कमी से मेल खाता था। 4-एपी प्रशासन के बाद यह फायरिंग दर पिछले अध्ययन के समान है जिसने अलग-थलग ऊतक की एकल इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग का उपयोग करके सैन फायरिंग दर पर 4-एपी के प्रभावों की जांच की। उस अध्ययन में 4-एपी50की उपस्थिति में लगभग 190 बीपीएम की गोलीबारी दर मापी गई। इस प्रकार, विदेश मंत्रालय प्रणाली आंतरिक हृदय समारोह पर दवा हस्तक्षेप के औषधीय प्रभाव के परीक्षण के लिए एक सुविधाजनक और मूल्यवान उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1:उपयोग से पहले माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) को कोटिंग करना। (ए)विदेश मंत्रालय एक छोटे प्लास्टिक डिश से बना है जिसमें केंद्र में 64 माइक्रोइलेक्ट्रोड्स की ग्रिड सरणी होती है (जैसा कि पैनल A1में दिखाया गया है) और एक वर्ग पैटर्न में परिधि के चारों ओर चार संदर्भ इलेक्ट्रोड। (ख)विदेश मंत्रालय को कोट करने के लिए पीई बफर के 1 एमएल को जोड़ा जाना । (ग)कमरे के तापमान पर रात भर के लिए थर्मोप्लास्टिक फिल्म के साथ विदेश मंत्रालय पकवान इनक्यूबेशन को कवर । (घ)विदेश मंत्रालय के पकवान से पी बफर को एस्पिर करना, जिसके बाद आसुत जल के साथ कम से कम चार कुल्ला किया जाता है। (ई)अल्ट्रापुरे पानी के नीचे लेपित विदेश मंत्रालय की जांच को संग्रहीत करना ताकि इसे सूखने से रोका जा सके । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:साइनोट्रायल नोड (सैन) विच्छेदन के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण। प्रोटोकॉल के विच्छेदन भाग के दौरान निम्नलिखित उपकरणों का उपयोग किया जाता है: (i) सिलिकॉन इलास्टोमर और छोटे विच्छेदन पिन के साथ पेट्री डिश; (ii) प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट; (iii) कास्त्रोविजो कैंची, आकार 4"; (iv) प्रक्रियाओं को काटने के लिए सर्जिकल कैंची (सीधे), (v) ड्यूमोंट #2 लेमिनेक्टॉमी संदंश; (vi) ड्यूमोंट #55 संदंश; (vii) अतिरिक्त ठीक ग्रीफे संदंश; (viii) हेमोस्टेट्स (घुमावदार) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:हृदय को हटाना। (ए)रिब पिंजरे के नीचे के नीचे बाएं कोस्टल आर्क से दाएं कोबल आर्क तक त्वचा में ट्रांसवर्स चीरा।(ख)पेरिटोनियल चीरा। (C,D) छाती गुहा को बेनकाब करने के लिए छाती के साथ डायाफ्राम का चीरा। (ङ)फेफड़ों के उत्तेजना के बाद दिल को हटाना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:सिनओलियल (सैन) नोड का विच्छेदन। (ए)शरीर से हटाने के बाद पेट्री डिश में दिल की उपस्थिति । (ख)सही एट्रियम के अवर वेना कावा (आईवीसी) और सुपीरियर वेना कावा (एसवीसी) के माध्यम से सिरिंज सुई का सम्मिलन। दिल के शीर्ष में पिन भी दिखाया गया है। (ग)रक्त को छोड़ने के लिए हृदय के शीर्ष (यानी नीचे आधा) का उत्तेजन। एट्रियल उपांगों में पिन भी दिखाए जाते हैं। (घ)विच्छेदन के अंत में सही एट्रियम के सैन क्षेत्र की अंतिम उपस्थिति । बॉक्स्ड क्षेत्र सैन के अनुमानित स्थान से मेल खाता है। सैन धमनी को एक ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास में सैन के माध्यम से बेहोशी से भी देखा जा सकता है। संक्षिप्त: एओ, महाधमनी; सीटी, क्रिस्टा टर्मिनल्स; आईवीसी, अवर वेना कावा; ला, छोड़ दिया आलिंद; आरए, राइट एट्रियम; आरएए, सही अलिंद उपांग; सैन, सिनोट्रायल नोड; एसवीसी, सुपीरियर वेना कावा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (विदेश मंत्रालय) रिकॉर्डिंग सिस्टम सेटअप की योजनाबद्ध। निम्नलिखित घटकों में सिस्टम शामिल है:(ए)गैस सिलेंडर (कारबोजन: 95% O2/ 5% CO2); (ख)गैस को आर्द्र करने के लिए आसुत पानी के साथ शंकुधारी फ्लास्क; (ग)रिकॉर्डिंग टायरोड की समाधान बोतल जो विदेश मंत्रालय के पकवान में प्रवाह प्रदान करती है; (घ)पेरिस्टाल्टिक पंप के लिए और विदेश मंत्रालय पकवान से समाधान पंप करने के लिए; (ई)तापमान नियामक; (एफ)विदेश मंत्रालय कनेक्टर प्लेट जो विदेश मंत्रालय पकवान से संकेत प्राप्त करता है; (जी)एम्पलीफायर; (ज)कंप्यूटर; (I)विदेश मंत्रालय डिश से इस्तेमाल किया अपशिष्ट समाधान के लिए संग्रह बोतल । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:विदेश मंत्रालय पर एसए नोडल ऊतक की स्थिति । (A)ऊतक की स्थिति में उपयोग किए जाने वाले उपकरण: (i) 1.5-मिमी ग्रिड आकार के साथ जाल, (ii) वीणा एंकर, (iii) अस्थि संदंश, (iv) पेंट ब्रश। (ख)विदेश मंत्रालय पर ऊतक की स्थिति । पीला बॉक्स विदेश मंत्रालय पकवान में जाल और लंगर के तहत सिनोट्रायल नोड क्षेत्र के अनुमानित क्षेत्र को इंगित करता है। (ग)फील्ड संभावित रिकॉर्डिंग के लिए कनेक्टर प्लेट पर संलग्न ऊतक के साथ विदेश मंत्रालय पकवान की व्यवस्था: (i) रिकॉर्डिंग समाधान के लिए इनलेट; (ii) गैस के लिए इनलेट (कार्बोजेन); (iii) समाधान के लिए आउटलेट; (iv) माइक्रोइलेक्ट्रोड कनेक्टर प्लेट; (v) परफ्यूजन कैप; (vi) टोपी से जुड़ा संदर्भ इलेक्ट्रोड रिंग; (vii) टोपी धारण करने के लिए टेप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7:सॉफ्टवेयर में डेटा अधिग्रहण प्रोटोकॉल स्थापित करना। (A)रिकॉर्डिंग टेम्पलेट का एक उदाहरण जिसमें सभी 64 चैनलों की व्यवस्था दिखाई गई है। (ख)रिकॉर्डिंग शर्तों के लिए सॉफ्टवेयर इनपुट गुणों का एक उदाहरण। (ग) एनोटेशन मेनू का एक उदाहरण जिसमें रिकॉर्डिंग के दौरान नए चरण को जोड़ने का तरीका दिखाया गया है, जैसे कि दवा प्रभावों को मापने के लिए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8:ऊतकों के विभिन्न क्षेत्रों में विभिन्न गतिविधि तरंग दिखाई देती है। उदाहरण स्क्रीन शॉट विभिन्न चैनलों में विभिन्न आकृतियों और आयामों के साथ तरंग रूप दिखाता है। हालांकि, सभी चैनल समान इंटरसिक अंतराल और फायरिंग आवृत्तियों को दिखाते हैं। लाल बॉक्स के भीतर चैनल ऊतक के सैन क्षेत्र के भीतर रखे इलेक्ट्रोड के लिए लगभग मेल खाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9:बीट फ्रीक्वेंसी विश्लेषण टेम्पलेट। उदाहरण टेम्पलेट बीट फ्रीक्वेंसी विश्लेषण टेम्पलेट में सभी 64 चैनलों की व्यवस्था दिखा रहा है। रीप्ले रॉ डेटा फाइल इनसेट विश्लेषण विंडो के इनपुट गुणों का एक उदाहरण दिखाता है। इस उदाहरण में, विश्लेषण के लिए 5 से 7 निशान का चयन किया गया है और प्रत्येक ट्रेस के लिए विश्लेषण की अवधि को 60,000 एमएस के रूप में नामित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
चित्र 10:स्पाइक निष्कर्षण के लिए विश्लेषण मापदंडों को परिभाषित करना। (A)प्रतिनिधि विश्लेषण टेम्पलेट एक ही चैनल के 3 चयनित निशान के लिए परिणाम देता है। शीर्ष पैनल तीन चयनित निशान (डेटा अंक के तीन परिभाषित समूहों) के लिए बीट फ्रीक्वेंसी प्रदर्शित करता है, और प्रत्येक बिंदु विशिष्ट ट्रेस के दौरान बीट फ्रीक्वेंसी के लिए 10-एस औसत का प्रतिनिधित्व करता है। मध्य पैनल तीन चयनित निशान (डेटा अंक के तीन परिभाषित समूहों) के लिए अंतर-स्पाइक अंतराल प्रदर्शित करता है, और प्रत्येक डेटा बिंदु लगातार दो स्पाइक्स के बीच अंतर-स्पाइक अंतराल का प्रतिनिधित्व करता है। निचले बाएं पैनल तीसरे ट्रेस के अंतिम 5 एस के लिए चयनित प्रतिनिधि निकाले गए स्पाइक्स दिखाता है, जबकि निचले दाएं पैनल निचले बाएं पैनल में निकाले गए स्पाइक्स के 5-एस समूह से प्राप्त एक निकाले गए तरंग को दिखाता है। (ख)विश्लेषण खिड़की का विस्तारित दृश्य 3 निशानों के लिए धड़कन आवृत्ति के विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले मापदंडों को दिखाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 11
चित्रा 11:प्रतिनिधि आंकड़ा किसी विशेष चैनल के लिए अच्छा बनाम खराब डेटा निष्कर्षण दिखा रहा है। खराब डेटा निष्कर्षण:(ए)निकाले गए स्पाइक्स की अनुपस्थिति; (ख)शोर संकेतों के साथ निकाले गए स्पाइक्स; (ग)अस्थिर निकाले गए स्पाइक्स। (घ)शोर संकेतों के बिना स्थिर निकाले गए स्पाइक्स दिखाते हुए अच्छा डेटा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 12
चित्रा 12:बेसलाइन पर रिकॉर्डिंग और 1mM 4-Aminopyridine (4-एपी) के प्रशासन के बाद । (A)एक माइक्रोइलेक्ट्रोड से बेसलाइन रिकॉर्डिंग एक डब्ल्यूटी दिल में ३२० बीपीएम की एक स्थिर फायरिंग आवृत्ति के साथ तरंग रूपों से पता चलता है । (ख)4-एपी के प्रशासन के बाद, फायरिंग आवृत्ति २१० बीपीएम की एक स्थिर दर को धीमा कर देता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

अभ्यास और सैन विच्छेदन प्रक्रिया माहिर के बाद से ऊतक नाजुक है और स्वस्थ ऊतक एक सफल रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक है जरूरी है । सैन विच्छेदन के दौरान, ऊतक के उचित क्षेत्र को प्राप्त करने के लिए सही अभिविन्यास आवश्यक है। हालांकि, विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान दिल का मूल अभिविन्यास आसानी से खो सकता है, जो इस प्रयास को जटिल बनाता है। इसलिए, उचित बाएं-दाएं अभिविन्यास सुनिश्चित करने के लिए, अटरिया का नेत्रहीन निरीक्षण किया जाना चाहिए। आमतौर पर, सही एट्रियम अधिक पारदर्शी होता है, जबकि बाएं एट्रियम आमतौर पर गहरा और अधिक लाल रंग25,48 होताहै। इसके अलावा, इसके साथ काम करते समय या इसे इलेक्ट्रोड ग्रिड पर बढ़ते हुए सैन ऊतक को फैलाना आवश्यक नहीं है, क्योंकि ऊतक आसानी से यांत्रिक रूप से क्षतिग्रस्त हो जाता है51। स्वस्थ और ठीक से विच्छेदित सैन ऊतक को सत्यापित करने के लिए एक टिप माइक्रोस्कोप के तहत पूर्ण टायरोड के समाधान में इसकी जांच करना है ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि ऊतक धड़क रहा है। एक बार तकनीक में महारत हासिल हो जाने के बाद, कम से कम 90% ऊतक तैयारी रिकॉर्डिंग के लिए अच्छी होनी चाहिए।

कई विचार सफल रिकॉर्डिंग और बाद में डेटा विश्लेषण की संभावना में सुधार कर सकते हैं। सबसे अच्छा रिकॉर्डिंग सुनिश्चित करने के लिए, समाधान ध्यान से तैयार किया जाना चाहिए और प्रयोगात्मक रिकॉर्डिंग से पहले अभ्यास माउस नमूनों पर परीक्षण किया । हमने सैन ऊतक के स्वास्थ्य को अनुकूलित करने के लिए रिकॉर्डिंग समाधान को अनुकूलित और संशोधित करने के लिए बड़े पैमाने पर काम किया। इसके अतिरिक्त, सुनिश्चित करें कि रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग की जाने वाली गैस का कार्बोजन (यानी, 95% O2/5% सीओ2)है। एकल सेल रिकॉर्डिंग अक्सर उस आवेदन के लिए उपयोग किए जाने वाले टायरोड के समाधान की विशिष्ट रासायनिक संरचना के कारण शुद्ध ऑक्सीजन का उपयोग करती है, लेकिन विदेश मंत्रालय पर रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधान को स्थिर पीएच बनाए रखने के लिए कार्बोजन की आवश्यकता होती है। विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग के लिए टायरोड के समाधान के साथ शुद्ध ऑक्सीजन का उपयोग पीएच में उतार-चढ़ाव का कारण बनेगा जो ऊतक की तेजी से गिरावट का कारण बन सकता है। चैनलों में आयाम मैक्सिमा का आकलन करने के रूप में पहले वर्णित अगर ऊतक अच्छी रिकॉर्डिंग गुणवत्ता का है निर्धारित करने में मदद मिलेगी । अंत में, रिकॉर्डिंग के बाद विश्लेषण सहायता करने के लिए, रिकॉर्डिंग समाप्त होने के बाद विदेश मंत्रालय इलेक्ट्रोड सरणी पर घुड़सवार सैन ऊतक की एक छवि लेना बहुत उपयोगी है। ऊतक विदेश मंत्रालय के प्रारंभिक सेट अप के दौरान थोड़ा बदलाव कर सकते हैं, और यह विश्लेषण के लिए इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट का सबसे सटीक आकलन प्रदान करता है ।

हम सैन फायरिंग दर की विशेषता के लिए एक पूरी तरह से और सटीक तरीका के रूप में विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग का प्रस्ताव है । विदेश मंत्रालय तकनीक का एक लाभ यह है कि यह प्रयोगकर्ता को व्यापक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषज्ञता की आवश्यकता के बिना एकल सेल रिकॉर्डिंग के बराबर फायरिंग दरों पर कब्जा करने की अनुमति देता है। विदेश मंत्रालय तकनीक में न्यूरोह्यूमोरल और मेचानो-इलेक्ट्रिक तंत्र के संभावित जटिल प्रभावों को नष्ट करने का लाभ भी है, जो अलग दिल रिकॉर्डिंग में निहित हैं और वीवो स्वायत्त नाकाबंदी माप21 में। वेंट्रिकुलर संकुचन और श्वसन मुख्य मशीनो-इलेक्ट्रिक प्रभाव हैं जो सैन फायरिंग को बदल सकते हैं, लेकिन वे हमारे ऊतक तैयारी 52,53में समाप्त हो जाते हैं। जबकि हमारी तकनीक सैन पर अधिकांश स्वायत्त प्रभावों को समाप्त कर देती है, सही अटरिया में शेष आईसीएन अनुमानों की एक सीमित संख्या संभावित रूप से सैन फायरिंग को प्रभावित कर सकती है, एक सैद्धांतिक सीमा जिसे परिणामों की व्याख्या के दौरान ध्यान में रखा जाना चाहिए5,6,22, 23। विदेश मंत्रालय की तकनीक का एक और लाभ यहां वर्णित है कि इसे कई अन्य प्रकार के हृदय अध्ययनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हालांकि इस प्रोटोकॉल ने सैन गतिविधि पर 4-एपी के प्रभावों का प्रदर्शन किया, लेकिन भविष्य के अध्ययनों से औषधीय एजेंटों की लगभग असीम संख्या के साथ-साथ सैन आंतरिक गोलीबारी पर जीन म्यूटेशन के प्रभाव भी लग सकते हैं। उदाहरण के लिए, ivabradine, सैन विशिष्ट Hcn4 चैनल के एक विशिष्ट अवरोधक, फायरिंग दर५४के लिए अजीब वर्तमान योगदान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विदेश मंत्रालय प्रणाली भी दिल के अन्य क्षेत्रों में हृदय समारोह को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विस्तृत, क्षेत्र विशिष्ट लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है। हालांकि, अन्य हृदय क्षेत्रों से रिकॉर्डिंग के लिए विभिन्न विच्छेदन दृष्टिकोणों और रिकॉर्डिंग से पहले पतले ऊतक अनुभागिंग की संभावना की आवश्यकता होगी। इस तकनीक की एक संभावित महत्वपूर्ण सीमा एक विदेश मंत्रालय प्रणाली है जो निषेधात्मक हो सकता है खरीदने की उच्च लागत है । कई विदेश मंत्रालय प्रणाली समान विशेषताओं और कार्यक्षमता के साथ बाजार पर उपलब्ध हैं, लेकिन उच्च लागत एक ही रहता है । हालांकि, एक बार प्रारंभिक उपकरण और सॉफ्टवेयर का अधिग्रहण किया है, को बनाए रखने और विदेश मंत्रालय प्रणाली का उपयोग करने के लिए लागत काफी कम है । एक और सीमा यह है कि विदेश मंत्रालय प्रणाली केवल बाह्य क्षेत्र क्षमताओं की रिकॉर्डिंग की अनुमति देती है जो एकल सेल इंट्रासेलुलर रिकॉर्डिंग के साथ प्राप्त की जा सकने वाली तैयारियों के बीच कार्रवाई संभावित विशेषताओं (जैसे, आयाम और आकार) की सटीक तुलना के लिए अनुकूल नहीं हैं। संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल माउस सैन ऊतक में आंतरिक हृदय फायरिंग दरों को मापने और विश्लेषण करने के लिए एक कुशल कार्यप्रवाह प्रदान करता है, जिसमें अत्यधिक विशिष्ट तरीके से फायरिंग दर पर औषधीय हस्तक्षेप के प्रभावों का अध्ययन करने की क्षमता होती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों, अनुदान संख्या R01NS100954 और R01NS099188 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Aminopyridine Sigma A78403-25G
22 gauge syringe needle Fisher Scientific 14-826-5A Used for dissection
23 gauge syringe needle Fisher Scientific 14-826-6C Used for dissection
60mm Petri Dishes Genesee Scientific 32-105G
500mL Pyrex Bottle Fisher Scientific 06-414-1C Used to store solutions
1000 mL Pyrex Bottle Fisher Scientific 06-414-1D Used to store solutions
Bone Forceps Fine Science Tools 16060-11
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C5080-500G
Carbogen (95% O2, 5% CO2)
Castroviejo Scissors, 4" Fine Science Tools 15024-10
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021-1KG
Data Acquisition PC CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920x1080
Dissection Microscope Jenco
Dissecting Pins Fine Science Tools 26002-20
Dumont #2 Laminectomy Forceps Fine Science Tools 11223-20
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11295-51
 Extra Fine Graefe Forceps Fine Science Tools 11152-10
Glass Chamber Grainger 49WF30 Used for mouse euthanization
Harp Anchor Kit Warner Instruments  SHD-22CL/15 WI 64-0247
HCl Fisher Chemicals SA48-4 Used for pH balancing
Hemostat Fine Science Tools 13013-14
Heparin Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram NDC 63739-953-25
HEPES Sigma-Aldrich H3375-250G
Inverted Microscope Motic AE2000
Isoflurane Patterson Veterinary 07-893-1389
Lab Tape Fisher Scientific 15-950
Light for Dissection Microscope Dolan-Jenner MI150DG 660000391014
Magesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 208337-100G
MED64 Head Amplifier MED64 MED-A64HE1S
MED64 Main Amplifier MED64 MED-A64MD1A
MED64 Perfusion Cap MED64 MED-KCAP01
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit MED64 MED-KPK02
MED64 ThermoConnector MED64 MED-CP04
Mesh  Warner Instruments 640246
Microelectrode array (MEA) Alpha Med Scientific MED-R515A
Mobius Software WitWerx Inc. Specific software for the MED64
NaOH Fisher Chemicals S320-500 Used for pH balancing
Normal Saline Ultigiene NDC 50989-885-17
Paint Brush Fisher Scientific NC1751733
Parafilm Genesee Scientific PM-996
Peristaltic Pump Gilson F155009
Peristaltic Pump Tubing Fisher Scientific 14-171-298 1/8'' Interior Diameter
Polyethyleneimine Sigma P3143
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333-500G
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655-500G
Sodium Bicarbonate Sigma S6297
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-3
Sylgruard Elastomer Kit Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S6566
Sodium tetraborate Sigma S9640
Surgical Scissors Fine Science Tools 14074-09
Transfer Pipets (3mL graduated) Samco Scientific 225

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Kumar, P., Si, M., Paulhus, K., Glasscock, E. Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice. J. Vis. Exp. (173), e62735, doi:10.3791/62735 (2021).

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