इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य चूहों में पेसमेकिंग दोषों की पहचान करने के लिए पूरे सिनोट्रायल नोड ऊतक की माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी रिकॉर्डिंग का उपयोग करके आंतरिक कार्डियक फायरिंग दर को मापने के लिए एक नई पद्धति का वर्णन करना है। आंतरिक पेसमेकिंग पर उनके प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इस विधि में औषधीय एजेंटों को भी पेश किया जा सकता है।
सही एट्रियम में स्थित सिनोट्रायल नोड (सैन) में दिल की पेसमेकर कोशिकाएं होती हैं, और इस क्षेत्र की शिथिलता टैचिकार्डिया या ब्रैडकार्डिया का कारण बन सकती है। हृदय गतिमान दोषों की विश्वसनीय पहचान काफी हद तक स्वायत्त तंत्रिका तंत्र है, जो मुखौटा दर घाटे कर सकते है के प्रभाव को रोकने के द्वारा आंतरिक दिल की दर के माप की आवश्यकता है । आंतरिक कार्डियक पेसमेकर फ़ंक्शन का विश्लेषण करने के लिए पारंपरिक तरीकों में वीवो हृदय दरों में मापने के लिए दवा-प्रेरित स्वायत्त नाकाबंदी, आंतरिक हृदय दरों को मापने के लिए अलग-थलग दिल रिकॉर्डिंग, और सहज कार्रवाई संभावित फायरिंग दरों को मापने के लिए सिनोट्रायल पेसमेकर कोशिकाओं की सिनोट्रायल स्ट्रिप या एकल-सेल पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग शामिल हैं। हालांकि, इन अधिक पारंपरिक तकनीकों तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हो सकता है । यहां, हम चूहों से पूरे माउंट सिनोट्रायल नोड की रिकॉर्डिंग की माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (विदेश मंत्रालय) रिकॉर्डिंग का प्रदर्शन करके आंतरिक हृदय फायरिंग दर को मापने के लिए एक नई पद्धति पेश करते हैं। एमईए विट्रो एक्स्ट्रासेलुलर फील्ड क्षमता में रिकॉर्डिंग के लिए ग्रिड जैसे पैटर्न में व्यवस्थित कई माइक्रोइलेक्ट्रोड से बना है। यहां वर्णित विधि में आंतरिक हृदय दरों को रिकॉर्ड करने के लिए पिछले दृष्टिकोणों की तुलना में अपेक्षाकृत तेज, सरल और अधिक सटीक होने का संयुक्त लाभ है, जबकि आसान औषधीय पूछताछ की अनुमति भी है।
हृदय एक जटिल अंग है जो हृदय-आंतरिक और बाह्य दोनों प्रभावों से संचालित होता है जैसे कि मस्तिष्क में उत्पन्न होने वाले। सिनोट्रायल नोड (सैन) दिल में एक परिभाषित क्षेत्र है जिसमें पेसमेकर कोशिकाएं (जिसे सिनोट्रायल कोशिकाओं, या एसए कोशिकाओं के रूप में भी जाना जाता है) स्तनधारी दिल की धड़कन1,2की दीक्षा और स्थायीकरण के लिए जिम्मेदार है। आंतरिक हृदय गति अन्य हृदय या न्यूरो-ह्यूमरल प्रभावों के प्रभाव के बिना पेसमेकर कोशिकाओं द्वारा संचालित दर है, लेकिन मनुष्यों और जीवित जानवरों में हृदय गति के पारंपरिक उपाय, जैसे इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम, दिल पर पेसमेकर और तंत्रिका प्रभाव दोनों को प्रतिबिंबित करते हैं। एसए कोशिकाओं पर सबसे उल्लेखनीय तंत्रिका प्रभाव स्वायत्त तंत्रिका तंत्र से है, जो शरीर की शारीरिक आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए लगातार फायरिंग पैटर्न को संशोधित करता है3। इस विचार का समर्थन करते हुए, सहानुभूतिपूर्ण और परानुभूति दोनों अनुमानों को सैन4के पास पाया जा सकता है । आंतरिक हृदय तंत्रिका तंत्र (आईसीएन) एक और महत्वपूर्ण तंत्रिका प्रभाव है जहां गैंगलियोनेट प्लेक्सी, विशेष रूप से सही अटरिया, इनरवेट में और सैन5,6की गतिविधि को विनियमित करता है।
पेसमेकिंग घाटे को समझना चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि शिथिलता कई हृदय विकारों को कम कर सकती है, साथ ही अन्य जटिलताओं के जोखिम में योगदान दे सकती है। बीमार साइनस सिंड्रोम (एसएसएस) सिनोट्रायल नोड की शिथिलता की विशेषता वाली बीमारियों की एक श्रेणी है जो उचित पेसमेकिंग7,8में बाधा डालती है। एसएसएस साइनस ब्रैडीकार्डिया, साइनस पॉज़, साइनस गिरफ्तारी, साइनोट्रायल एग्जिट ब्लॉक, और बारी-बारी से ब्रैडीरिथिमियास और टैचियारहिथमियास9 के साथ पेश कर सकता है और एम्बोलिक स्ट्रोक और अचानक मौत8,10के बढ़ते जोखिम सहित जटिलताओं का कारण बन सकता है। ब्रुगाडा सिंड्रोम वाले, अचानक हृदय मृत्यु के बढ़ते जोखिम के साथ वेंट्रिकुलर फिब्रिलेशन द्वारा चिह्नित कार्डियक डिसऑर्डर, अतालता की घटनाओं के लिए अधिक जोखिम में हैं, अगर उनके पास कोमोरबिड सैन डिसफंक्शन11,12भी हैं। सिनोलियल डिसफंक्शन के दिल से परे शारीरिक परिणाम भी हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, सेरेब्रल हाइपोपरफ्यूजन13के कारण रोगी में दौरे को ट्रिगर करने के लिए एसएसएस देखा गया है।
सिनोट्रायल पेसमेकिंग घाटे की पहचान करने के लिए, आंतरिक हृदय दरों को स्वायत्त तंत्रिका तंत्र या विनोदी कारकों के प्रभाव के बिना सैन की गतिविधि को मापने के द्वारा निर्धारित करने की आवश्यकता होती है। चिकित्सकीय रूप से, यह औषधीय स्वायत्त नाकाबंदी14द्वारा अनुमानित किया जा सकता है, लेकिन आंतरिक हृदय समारोह15,16का अध्ययन करने के लिए स्तनधारी मॉडलों में भी यही तकनीक लागू की जा सकती है। हालांकि यह दृष्टिकोण तंत्रिका प्रभावों का योगदान करने के एक बड़े हिस्से को अवरुद्ध करता है और वीवो कार्डियक परीक्षा में अनुमति देता है, यह दिल पर सभी बाह्य प्रभावों को पूरी तरह से खत्म नहीं करता है। पशु मॉडल में आंतरिक हृदय समारोह का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक अन्य शोध तकनीक लैंगेंडोर्फ-परफ्यूस्ड दिलों का उपयोग करके अलग-अलग दिल रिकॉर्डिंग है, जिसमें आम तौर पर इलेक्ट्रोग्राम, पेसिंग, या एपिकार्डियलमल्टीइलेक्ट्रोड सरणी17, 18,19,20का उपयोग करके माप शामिल होते हैं। हालांकि यह तकनीक हृदय कार्य के लिए अधिक विशिष्ट है क्योंकि इसमें शरीर से दिल को हटाना शामिल है, माप अभी भी मशीनो-इलेक्ट्रिक ऑटोरेगुलेटरी तंत्र से प्रभावित हो सकते हैं जो आंतरिक हृदय गति माप21को प्रभावित कर सकते हैं। अलग दिल की रिकॉर्डिंग अभी भी आईसीएनएस5, 6 , 22 ,23केमाध्यम से स्वायत्त नियमन से प्रभावित हो सकती है । इसके अलावा, दिल के एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक तापमान को बनाए रखने, जो हृदय समारोह माप के लिए महत्वपूर्ण है, अलग दिल दृष्टिकोण20में मुश्किल हो सकता है । सैन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक अधिक प्रत्यक्ष तरीका विशेष रूप से सैन ऊतक को अलग करना और इसकी गतिविधि को मापना है। इसे सैन स्ट्रिप्स (अलग सैन ऊतक) या अलग सैन पेसमेकर कोशिकाओं24, 25के माध्यम से पूरा किया जा सकता है। दोनों को उच्च स्तर के तकनीकी प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, क्योंकि सैन एक बहुत छोटा और अत्यधिक परिभाषित क्षेत्र है, और सेल अलगाव एक और भी बड़ी चुनौती बन गया है क्योंकि वियोजन सही ढंग से प्रदर्शन न करने पर कोशिका के समग्र स्वास्थ्य को नुकसान पहुंचा सकता है। इसके अलावा, इन तकनीकों को व्यक्तिगत रिकॉर्डिंग माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग करके ऊतक या कोशिकाओं से सफलतापूर्वक रिकॉर्ड करने के लिए विशेषज्ञ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल कौशल की आवश्यकता होती है।
इस प्रोटोकॉल में, हम आंतरिक हृदय गति माप प्राप्त करने के लिए माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (विदेश मंत्रालय) का उपयोग करके सैन इन विट्रो को रिकॉर्ड करने की तकनीक का वर्णन करते हैं। इस दृष्टिकोण में गहन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल स्किलसेट की कमी वाले शोधकर्ताओं के लिए अत्यधिक विशिष्ट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग को सुलभ बनाने का लाभ है। एमईए का उपयोग पहले प्राथमिक कार्डियोमायोसाइटसंस्कृतियों26, 27, 28, 29,30,31,32,हृदय पत्रक33,34,35, 36,37,38,39,और ऊतक पूरे माउंट40,में कार्डियोमायोसाइट फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए किया गयाहै। 41,42,43,44,45,46,47. सैन टिश्यू41,42में क्षेत्र की क्षमता की जांच करने के लिएपिछलाकार्य भी किया गया है . यहां, हम मूरीन आंतरिक सैन फायरिंग दरों को रिकॉर्ड करने और विश्लेषण करने के लिए विदेश मंत्रालय का उपयोग करने के लिए एक पद्धति प्रदान करते हैं। हम यह भी वर्णन करते हैं कि कैसे इस तकनीक का उपयोग सैन आंतरिक फायरिंग दरों पर दवाओं के औषधीय प्रभावों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, जो एक वोल्टेज-गेटेड के+ चैनल अवरोधक 4-अमीनोपिरिडीन (4-एपी) के प्रभाव को दर्शाने वाला नमूना प्रयोग प्रदान करता है। परिभाषित शारीरिक स्थलों का उपयोग करके, हम अन्य तरीकों में आवश्यक व्यापक ऊतक विच्छेदन या सेल अलगाव को किए बिना सैन को सटीक रूप से रिकॉर्ड कर सकते हैं। जबकि विदेश मंत्रालय लागत निषेधात्मक हो सकता है, रिकॉर्डिंग पेसमेकिंग के अत्यधिक विशिष्ट और विश्वसनीय उपाय प्रदान करती है जिसका उपयोग नैदानिक और शारीरिक अनुसंधान अनुप्रयोगों की एक विशाल सरणी में किया जा सकता है।
अभ्यास और सैन विच्छेदन प्रक्रिया माहिर के बाद से ऊतक नाजुक है और स्वस्थ ऊतक एक सफल रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक है जरूरी है । सैन विच्छेदन के दौरान, ऊतक के उचित क्षेत्र को प्राप्त करने के लिए सही अभिविन्यास…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों, अनुदान संख्या R01NS100954 और R01NS099188 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
Dissection Microscope | Jenco | ||
Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |