Summary
Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine neue Methodik zur Messung der intrinsischen Herzfeuerrate zu beschreiben, indem Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung des gesamten Sinusknotengewebes verwendet wird, um Schrittmacherfehler bei Mäusen zu identifizieren. Pharmakologische Wirkstoffe können auch in diese Methode eingeführt werden, um ihre Auswirkungen auf die intrinsische Schrittmacherei zu untersuchen.
Abstract
Der Sinusknoten (SAN), der sich im rechten Vorhof befindet, enthält die Herzschrittmacherzellen des Herzens, und eine Dysfunktion dieser Region kann Tachykardie oder Bradykardie verursachen. Die zuverlässige Identifizierung von Herzschrittmacherfehlern erfordert die Messung der intrinsischen Herzfrequenz, indem der Einfluss des autonomen Nervensystems, der Ratendefizite maskieren kann, weitgehend verhindert wird. Traditionelle Methoden zur Analyse der intrinsischen Herzschrittmacherfunktion umfassen eine medikamenteninduzierte autonome Blockade zur Messung der In-vivo-Herzfrequenz, isolierte Herzaufzeichnungen zur Messung der intrinsischen Herzfrequenz und sinoatriale Streifen- oder Einzelzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von sinoatrialen Schrittmacherzellen zur Messung spontaner Aktionspotenzial-Feuerraten. Diese traditionelleren Techniken können jedoch technisch anspruchsvoll und schwierig durchzuführen sein. Hier stellen wir eine neue Methodik zur Messung der intrinsischen Herzfeuerrate vor, indem wir Mikroelektrodenarray-Aufnahmen (MEA) von Sinusknotenpräparaten von Mäusen durchführen. MEAs bestehen aus mehreren Mikroelektroden, die in einem gitterartigen Muster angeordnet sind, um extrazelluläre In-vitro-Feldpotentiale aufzuzeichnen. Die hier beschriebene Methode hat den kombinierten Vorteil, dass sie relativ schneller, einfacher und präziser ist als frühere Ansätze zur Aufzeichnung intrinsischer Herzfrequenzen und gleichzeitig eine einfache pharmakologische Abfrage ermöglicht.
Introduction
Das Herz ist ein komplexes Organ, das sowohl von kardiale-intrinsischen als auch von extrinsischen Einflüssen gesteuert wird, wie sie im Gehirn entstehen. Der Sinusknoten (SAN) ist eine definierte Region im Herzen, die die Schrittmacherzellen (auch als Sinuszellen oder SA-Zellen bezeichnet) beherbergt, die für die Initiierung und Aufrechterhaltung des Herzschlags von Säugetieren verantwortlich sind1,2. Die intrinsische Herzfrequenz ist die Rate, die von den Herzschrittmacherzellen ohne Einfluss anderer kardialer oder neurohumoraler Einflüsse angetrieben wird, aber traditionelle Messungen der Herzfrequenz bei Menschen und lebenden Tieren, wie Elektrokardiogramme, spiegeln sowohl den Herzschrittmacher als auch neuronale Einflüsse auf das Herz wider. Der bemerkenswerteste neuronale Einfluss auf SA-Zellen kommt vom autonomen Nervensystem, das ständig Feuermuster moduliert, um die physiologischen Anforderungen des Körpers zu erfüllen3. Um diese Idee zu unterstützen, finden sich in der Nähe des SAN4sowohl sympathische als auch parasympathische Projektionen. Das intrinsische Herznervensystem (ICNS) ist ein weiterer wichtiger neuronaler Einfluss, bei dem ganglionierte Plexi, insbesondere in den rechten Vorhöfen, die Aktivität des SAN 5innervierenund regulieren5,6.
Das Verständnis von Schrittmacherdefiziten ist klinisch wichtig, da Funktionsstörungen vielen Herzerkrankungen zugrunde liegen und zum Risiko anderer Komplikationen beitragen können. Sick-Sinus-Syndrom (SSS) ist eine Kategorie von Krankheiten, die durch eine Dysfunktion des Sinusknotens gekennzeichnet sind, die die richtige Schrittmacherei behindert7,8. SSS kann mit Sinusbradykardie, Sinuspausen, Sinusstillstand, sinoatrialem Austrittsblock und abwechselnden Bradyarrythmien und Tachyarrhythmien9 auftreten und kann zu Komplikationen führen, einschließlich eines erhöhten Risikos für embolischen Schlaganfall und plötzlichen Tod8,10. Diejenigen mit Brugada-Syndrom, einer Herzerkrankung, die durch Kammerflimmern mit einem erhöhten Risiko für plötzlichen Herztod gekennzeichnet ist, haben ein höheres Risiko für arrhythmogene Ereignisse, wenn sie auch eine komorbide SAN-Dysfunktion haben11,12. Sinoatriale Dysfunktion kann auch physiologische Folgen über das Herz hinaus haben. Zum Beispiel wurde beobachtet, dass SSS Beifällen bei einem Patienten aufgrund einer zerebralen Hypoperfusion ausgelöst wird13.
Um sinoatriale Schrittmacherdefizite zu identifizieren, müssen die intrinsischen Herzfrequenzen durch Messung der Aktivität des SAN ohne den Einfluss des autonomen Nervensystems oder humoraler Faktoren bestimmt werden. Klinisch kann dies durch pharmakologische autonome Blockade14angenähert werden, aber dieselbe Technik kann auch in Säugetiermodellen angewendet werden, um die intrinsische Herzfunktion15,16zu untersuchen. Während dieser Ansatz einen großen Teil der beitragenden neuronalen Einflüsse blockiert und eine In-vivo-Herzuntersuchung ermöglicht, beseitigt er nicht alle extrinsischen Einflüsse auf das Herz vollständig. Eine weitere Forschungstechnik, die zur Untersuchung der intrinsischen Herzfunktion in Tiermodellen verwendet wird, sind isolierte Herzaufnahmen mit Langendorff-perfundierten Herzen, die typischerweise Messungen mit Elektrogrammen, Pacing oder epikarden Multielektrodenarrays17,18,19,20beinhalten . Während diese Technik spezifischer für die Herzfunktion ist, da sie das Herz aus dem Körper entfernt, können die Messungen immer noch durch mechanoelektrische Autoregulationsmechanismen beeinflusst werden, die die intrinsischen Herzfrequenzmessungen beeinflussen könnten21. Die isolierten Herzaufnahmen können auch noch durch autonome Regulation durch das ICNS 5,6,22,23beeinflusst werden. Darüber hinaus kann die Aufrechterhaltung einer physiologisch relevanten Temperatur des Herzens, die für Herzfunktionsmessungen entscheidend ist, bei isolierten Herzansätzen schwierig sein20. Eine direktere Methode zur Untersuchung der SAN-Funktion besteht darin, SAN-Gewebe spezifisch zu isolieren und seine Aktivität zu messen. Dies kann durch SAN-Streifen (isoliertes SAN-Gewebe) oder isolierte SAN-Schrittmacherzellen24,25erreicht werden. Beide erfordern ein hohes Maß an technischer Ausbildung, da das SAN eine sehr kleine und hoch definierte Region ist und die Zellisolierung eine noch größere Herausforderung darstellt, da die Dissoziation die allgemeine Gesundheit der Zelle schädigen kann, wenn sie nicht richtig durchgeführt wird. Darüber hinaus erfordern diese Techniken elektrophysiologische Fachkenntnisse, um mit einzelnen Aufzeichnungsmikroelektroden erfolgreich aus dem Gewebe oder den Zellen aufzunehmen.
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Technik zur Aufzeichnung des SAN in vitro mit einem Mikroelektrodenarray (MEA), um intrinsische Herzfrequenzmessungen zu erhalten. Dieser Ansatz hat den Vorteil, dass hochspezifische elektrophysiologische Aufzeichnungen forschern zugänglich gemacht werden, denen es an intensiven elektrophysiologischen Fähigkeiten mangelt. MEAs wurden zuvor verwendet, um die Kardiomyozytenfunktion in primären Kardiomyozytenkulturen26,27,28,29,30,31,32, Herzblättern33,34,35,36,37,38,39und Gewebe ganzen Mounts40zuuntersuchen. 41,42,43,44,45,46,47. Frühere Arbeiten wurden auch durchgeführt, um Feldpotentiale in SAN-Gewebe41,42zu untersuchen. Hier bieten wir eine Methodik zur Verwendung der MEA zur Aufzeichnung und Analyse der intrinsischen SAN-Feuerraten von Murinen. Wir beschreiben auch, wie diese Technik verwendet werden kann, um pharmakologische Wirkungen von Medikamenten auf die intrinsischen Zündraten von SAN zu testen, indem ein Beispielexperiment zur Verfügung gestellt wird, das die Auswirkungen von 4-Aminopyridin (4-AP), einem spannungsgesteuerten K+ Kanalblocker, zeigt. Mithilfe definierter anatomischer Landmarken können wir das SAN genau erfassen, ohne die umfangreichen Gewebedissektionen oder Zellisolierungen durchführen zu müssen, die für andere Methoden erforderlich sind. Während die MEA unerschwinglich sein kann, bieten die Aufzeichnungen hochspezifische und zuverlässige Messungen der Schrittmacherei, die in einer Vielzahl von klinischen und physiologischen Forschungsanwendungen verwendet werden können.
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Protocol
Alle hier beschriebenen experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Southern Methodist University genehmigt wurden.
1. Beschichtung des Multielektroden-Arrays (MEA) für die Aufnahme
- Machen Sie 25 mM Boratpuffer.
- 0,953 gNa2B4O7·10H2O in 80 ml destilliertem Wasser auflösen.
- Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 8,4 ein und fügen Sie dann destilliertes Wasser zu einem Endvolumen von 100 ml hinzu.
- Stellen Sie eine 0,1% ige Stammlösung aus Polyethylenimin (PEI) her.
- Fügen Sie 100 μL 50% (w/v) PEI zu 4,9 ml destilliertem Wasser hinzu, um eine 1% ige PEI-Lösung herzustellen.
- Verdünnen Sie die 1% ige PEI-Lösung auf 0,1% im Boratpuffer, indem Sie 1 ml der 1% igen PEI-Lösung zu 9 ml des 25 mM Boratpuffers hinzufügen.
- Pipette ~1 ml der 0,1% igen PEI-Lösung in die MEA-Schüssel (Microelectrode Array), so dass die Elektroden vollständig abgedeckt sind (Abbildung 1A und 1B).
HINWEIS: Die Mikroelektroden der MEA bestehen typischerweise aus Platinschwarz oder Kohlenstoffnanoröhre und sind mit Polyimid (oder Acryl) isoliert; beide Materialien sind hydrophob. Durch die Beschichtung der MEA mit einem kationischen Polymer wie PEI wird die hydrophobe MEA-Oberfläche hydrophiler, so dass Gewebeproben besser mit der MEA-Oberfläche in Kontakt kommen können (Abbildung 1A1). - Decken Sie die MEA-Schale mit thermoplastischer Folie ab, um die Verdunstung zu reduzieren, und lassen Sie die MEA über Nacht bei Raumtemperatur belassen (Abbildung 1C).
- Saugen Sie die PEI-Lösung mit einer Pipette aus der MEA-Schüssel ab, achten Sie darauf, das Elektrodengitter nicht zu berühren, das die Elektroden beschädigen kann, und spülen Sie dann ≥4 Mal mit destilliertem Wasser ab(Abbildung 1D).
- Lagern Sie das PEI-beschichtete MEA unter 1-2 mL Reinstwasser und versiegeln Sie es mit thermoplastischer Folie bei 4 °C, bis es benötigt wird. Alternativ können Sie das beschichtete MEA lagern, indem Sie es in ein mit Reinstwasser gefülltes Becherglas tauchen (Abbildung 1E).
HINWEIS: Der PEI-Beschichtungsprozess muss für den MEA vor seiner ersten Verwendung nur einmal durchgeführt werden, und nach jeder Aufnahmesitzung sollte der MEA in Reinstwasser getaunken gelagert werden.
2. Herstellung der vollständigen Tyrode-Lösung für die Gewebedissektion
- Machen Sie 1.000 ml vollständige Tyrode-Lösung zum Dissektionieren; Zuerst 8,1816 g NaCl zu 800 ml Reinstwasser hinzufügen.
- Fügen Sie der Lösung die folgende Menge an Chemikalien hinzu: 0,4025 g KCl; 0,1633 gKH2PO4; 1,1915 g HEPES; 0,9999 g Glukose; 0,0952 gMgCl2; 0,2646 g CaCl2·2H2 O.
- Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 ein und fügen Sie dann Reinstwasser hinzu, bis das Gesamtvolumen 1.000 ml beträgt.
HINWEIS: Die endgültige Zusammensetzung der vollständigen Tyrode-Lösung ist die folgende (in mM): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 KH2PO4,5 HEPES, 5,55 Glucose, 1 MgCl2, 1,8CaCl2.
3. Vorbereitung der sauerstoffhaltigen Tyrode-Lösung für die Aufnahme
- Machen Sie 500 ml Tyrodes Lösung; 4,003 g NaCl zu 400 ml Reinstwasser hinzufügen.
- Fügen Sie der Lösung die folgenden Mengen an Chemikalien hinzu: 0,651 g NaHCO3; 0,042 gNaH2PO4; 0,132 g CaCl2·2H2 O; 0,149 g KCl; 0,0476 gMgCl2; 0,999 g Glukose.
- Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4 ein und fügen Sie dann Reinstwasser hinzu, bis das Gesamtvolumen 500 ml beträgt.
- Sauerstoffanhalten Sie die Lösung mit Carbogen für mindestens 30 min bei Raumtemperatur, bevor Sie mit der Aufnahme beginnen.
HINWEIS: Die endgültige Zusammensetzung der Tyrode-Lösung ist die folgende (in mM): 137 NaCl, 15,5 NaHCO3,0,7 NaH2PO4,1,8 CaCl2,4 KCl, 1 MgCl2, 11,1 Glucose. Diese Tyrode-Lösung hat eine etwas andere Zusammensetzung als die Complete Tyrode-Lösung, die zum Dissektionieren verwendet wird.
4. Herstellung von 4-Aminopyridin (4-AP)-Lösung zur pharmakologischen Modulation
- Machen Sie eine 1 mM Arbeitslösung von 4-AP; Fügen Sie 18,82 mg 4-AP zu 200 ml der Tyrode-Lösung aus Schritt 3 hinzu.
- Sauerstoff die 4-AP-Lösung für mindestens 30 Minuten vor dem Experiment.
5. Vorbereitung der Petrischale für die Sezierung
- Mischen Sie Siliconelastomerkomponenten im Verhältnis 10:1 (nach Gewicht) der Basis zum Härter.
- Gießen Sie ~15 ml Silikonelastomermischung in eine Petrischale mit 60 mm Durchmesser.
- Lassen Sie das Elastomer vor Gebrauch 48 Stunden bei Raumtemperatur aushärten.
HINWEIS: Die silikonisierte Petrischale kann für zukünftige Dissektionen wiederverwendet werden.
6. Sezieren des Sinusknotens (SAN)
- Bereiten Sie die heparinisierte Komplettlösung von Tyrode für die SAN-Dissektion vor.
- 400 μL Heparin (1.000 USP/ml) zu 40 ml Komplettlösung von Tyrode geben und in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen.
- Injizieren Sie die Maus intraperitoneal mit 200-300 μL Heparin (1000 USP/ ml) und lassen Sie das Tier 10 Minuten sitzen.
- Euthanisieren Sie die heparinisierte Maus durch Isofluran-Überdosierung.
- Legen Sie die Maus in eine kleine Glaskammer, die Isoflurandämpfe enthält, die durch Zugabe von 200-300 μL flüssigem Isofluran zu einem Filterpapier in einem perforierten Kunststoffrohr erzeugt werden.
HINWEIS: Da Isofluran Hautreizungen verursachen kann und auch über die Haut aufgenommen werden kann, sollte die Flüssigkeit die Maus nicht direkt kontaktieren. Daher wird das isoflurangetränkte Tuch zur Verabreichung in ein perforiertes Röhrchen gegeben. - Überprüfen Sie den Tod durch Einstellung der Bewegung und Atmungsbemühung und durch das Fehlen eines Zehenquemmreflexes. Der Tod dauert normalerweise etwa 1-2 Minuten nach dem Einsetzen in die Kammer.
HINWEIS: Der Tod wird normalerweise vom Wasserlassen begleitet.
- Legen Sie die Maus in eine kleine Glaskammer, die Isoflurandämpfe enthält, die durch Zugabe von 200-300 μL flüssigem Isofluran zu einem Filterpapier in einem perforierten Kunststoffrohr erzeugt werden.
- Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein Sezierbrett mit ausgestreckten Pfoten und befestigen Sie die Pfoten mit 1 Zoll langen, 23-Gauge-Spritzennadeln am Brett. Dann entfernen Sie das Fell in der Nähe des Bodens des Brustkorbs, indem Sie eine chirurgische Schere verwenden und das Fell an den Wurzeln schneiden.
HINWEIS: Für eine Sezierplatte können Polystyrol-Kühlerdeckel verwendet werden. - Während Sie die Haut mit einem Hämostat halten, verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen Querschnitt in die Haut direkt unter der Unterseite des Brustkorbs vom linken Rippenbogen zum rechten Rippenbogen zu machen (Abbildung 3A).
- Schneiden Sie das Peritoneum mit einer chirurgischen Schere auf und trennen Sie die Leber vorsichtig vom Zwerchfell, wobei Sie darauf achten, die Leber nicht zu verneinen, was zu übermäßigen Blutungen führt (Abbildung 3B). Schneiden Sie die Membran entlang des Thorax ein, um die Brusthöhle freizulegen (Abbildung 3C-D).
- Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere die Seitenwände des Brustkorbs von den Rändern der Rippenbögen bis zu den Klappen, um das Herz freizulegen, wobei Sie darauf achten, das Herz nicht zu beschädigen (Abbildung 3D). Verwenden Sie dann eine 23-Gauge-Spritzennadel, um den Brustkorb über die Schulter zu stecken, ihn an Ort und Stelle und aus dem Weg des Operationsfeldes zu halten.
- Verwenden Sie eine Transferpipette, um warme (37 °C) heparinisierte Complete Tyrode-Lösung auf das Herz zu tropfen, um es feucht zu halten.
HINWEIS: Lassen Sie das Herz nicht austrocknen. - Entfernen Sie die Lunge, indem Sie sie mit einer extra feinen Graefe-Zette halten und die Luftröhre mit einer chirurgischen Schere durchtrennen (Abbildung 3E).
- Halten Sie die Herzspitze mit einer extra feinen Graefe-Zette und entfernen Sie sie, indem Sie die Aorta und die Hohlvene mit einer chirurgischen Schere schneiden. Übertragen Sie das Herz in eine Petrischale mit ausgehärtetem Silikonelastomer (Abbildung 4A) und verwenden Sie eine Transferpipette, um das Herz mit 2-3 ml warmer (37 °C) heparinisierter Komplettlösung von Tyrode zu baden.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die empfindliche Hinterwand der rechten Vorhöfe, die das SAN enthält, und die angeschlossenen rechten Vorhöfe nicht zu beschädigen. Das Baden des Herzens mit der Lösung von Complete Tyrode verhindert, dass das Herz austrocknet, aber tauchen Sie das Herz nicht vollständig in Lösung, da es die Sichtbarkeit während der Dissektion beeinträchtigt. - Richten Sie das Herz mit dem rechten Vorhof auf der rechten Seite des Experimentatores und dem linken Vorhof auf der linken Seite des Experimentatores aus.
HINWEIS: Die Dissektion des SAN-Gewebes sollte schnell durchgeführt werden, um ischämiebedingte Verletzungen zu vermeiden. - Befestigen Sie die Spitze des Herzens mit einem Sezierstift an der Schüssel. Dann, während Sie die untere Hohlvene mit Dumont #2 Laminektomie-Heerzette halten, führen Sie eine 22 G Spritzennadel durch die untere und obere Hohlvene ein, um ihre Position im rechten Vorhof zu lokalisieren, die auch die ungefähre Position des SAN identifiziert (im Gewebefleck zwischen der unteren und oberen Hohlvene (Abbildung 4B).
- Mit kleinen Sezierstiften die linken und rechten Vorhoffnsel an die Schüssel heften.
- Während Sie das linke Vorhoffnungsteil mit Dumont #2 Laminektomie-Pinge halten, legen Sie einen Sezierstift durch das linke Vorhoffliedsteil, um es an Ort und Stelle zu halten.
- Während Sie das rechte Vorhoffnungsteil mit Dumont #55 Zange halten, stecken Sie einen Sezierstift durch das rechte Vorhoffnungsteil, um es an Ort und Stelle zu halten.
HINWEIS: Die gleiche Art von Zette kann verwendet werden, um die linken und rechten Vorhoffnungsstücke zu halten, wenn gewünscht.
- Entfernen Sie die Spritzennadel, die die Venae Cavae überspannt.
- Um Blut aus dem Herzen freizusetzen, verwenden Sie eine Castroviejo-Schere, um die Spitze des Herzens (dh die untere Hälfte) zu entfernen, indem Sie einen Querschnitt über die Ventrikel machen (Abbildung 4C). Waschen Sie dann das Herz, indem Sie warme (37 °C) heparinisierte Complete Tyrode-Lösung mit einer Transferpipette hinzufügen.
- Verwenden Sie eine Castroviejo-Schere, um entlang des atrioventrikulären Septums zu schneiden, wobei der Schnitt näher am Ventrikel als an den Vorhöfen bleibt. Schneiden Sie weiter entlang des atrioventrikulären Septums, bis die Vorhöfe von den Ventrikeln getrennt sind.
- Schneiden Sie entlang des interatrialen Septums, um den linken Vorhof zu entfernen.
- Platzieren Sie Dissektionsstifte in der Peripherie des rechten Vorhofs, damit es flach liegt (Abbildung 4D). Entfernen Sie mit der Castroviejo-Schere verbleibendes Fett, Gefäße oder Gewebe aus dem Vorhof.
- Suchen Sie das SAN im rechten Vorhof, der in dieser Ausrichtung ungefähr von der oberen Hohlvene (oben), der unteren Hohlvene (unten) und der Cristae terminalis (links) umgeben ist (Abbildung 4D).
HINWEIS: Die Crista terminalis erscheint als dunkler Muskelkamm zwischen dem rechten Vorhoffnungsglied und dem SAN. Oft ist auch die SAN-Arterie durch das SAN zu sehen (Abbildung 4D).
7. Vorbereitung des MEA-Systems für die Aufzeichnung
- Fügen Sie tyrodes Lösung (aus Schritt 3) in die Eingangslösungsflasche(Abbildung 5C)hinzu und versorgen Sie sie mit Sauerstoff, indem Sie den Durchfluss von Carbogengas (Abbildung 5A) zum System einschalten.
HINWEIS: Die für die Aufnahme verwendete Tyrode-Lösung unterscheidet sich in ihrer Zusammensetzung geringfügig von der Lösung des Complete Tyrode, die für die Dissektion verwendet wird. - Überprüfen Sie den Durchfluss des Carbogens, indem Sie Blasen im konischen Kolben beobachten, der zur Befeuchtung des Gases(Abbildung 5B)verwendet wird, und in der Eingangslösungsflasche(Abbildung 5C).
- Führen Sie den Zulaufschlauch der Peristaltikpumpe (Abbildung 5D) in die Aufzeichnungslösung des Tyrode ein (Abbildung 5C). Führen Sie dann den Ausflussschlauch der Schlauchflasche der Schlauchpumpe in die Auffangflasche ein (Abbildung 5I).
- Stellen Sie die Peristaltikpumpe auf 25 U / min ein, was eine Durchflussrate von 2 ml / min ergibt, und starten Sie die Pumpe. Überprüfen Sie das System auf Pufferleckagen oder Überläufe.
- Stellen Sie den Temperaturregler auf 37 °C ein, die physiologische Temperatur von Mäusen (Abbildung 5E).
8. Platzieren des Herzgewebes auf dem MEA-Gitter
- Übertragen Sie das sezierte SAN-Gewebe mit Hilfe eines Pinsels (Abbildung 6A) von der sezierenden Petrischale auf das MEA-Gitter (Abbildung 1A1).
- Positionieren Sie das Gewebe vorsichtig mit einem weichen Pinsel, während Sie unter ein umgekehrtes Mikroskop schauen, so dass der SAN-Bereich das Elektrodengitter überlagert.
- Positionieren Sie das Gewebe nach Bedarf neu, um sicherzustellen, dass es flach auf dem Elektrodengitter liegt und einen guten Kontakt mit den Elektroden herstellt.
HINWEIS: Ein weicher Pinsel ist erforderlich, um das Gewebe zu bewegen, um eine Beschädigung des Elektrodengitters zu vermeiden.
- Sobald das Gewebe richtig positioniert ist, verwenden Sie eine Knochenzette (oder eine gekrümmte Zange), um das Netz über das Gewebe zu legen (Abbildung 6A). Verwenden Sie dann die Knochenzette, um den Harfenanker (Abbildung 6A) auf dem Netz zu platzieren, um alles an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 6B).
- Machen Sie ein Bild von der Positionierung des Gewebes auf der MEA, so dass die Aktivität einzelner Elektroden während der Aufnahme mit ihrer anatomischen Position korreliert werden kann. Dies kann durch Halten eines Smartphones an das invertierte Mikroskopobjektiv oder durch Die Verwendung einer angeschlossenen Mikroskopkamera erfolgen.
HINWEIS: Wenn die Ausrichtung des MEA nach der Aufnahme des Bildes nicht geändert wird, wird die obere linke Elektrode während der Aufnahme als erster Kanal (Ch1) angezeigt. - Legen Sie die MEA-Schüssel auf die Anschlussplatte (Abbildung 5F und 6C) und legen Sie die Perfusionskappe (Abbildung 6C) vorsichtig auf die MEA-Schüssel, ohne den Harfenscheibenanker zu stören. Die Perfusionskappe kann mit einem Stück Laborband weiter gesichert werden (Abbildung 6C).
HINWEIS: Neben einstellbaren Lösungszu- und -ausströmrohren verfügt die Kappe auch über einen Anschluss für die Gaslieferung (Abbildung 6C). Zusätzlich verläuft der Referenzelektrodenring durch die Kappe (Abbildung 6C). - Lassen Sie das Gewebe sich von der Handhabung erholen und sich vor der Aufnahme 15-20 Minuten lang an die Kammer gewöhnen.
9. Einstellen des Datenerfassungsprotokolls für die Aufzeichnung
HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben das Öffnen des Softwareprotokolls für spontane Beataufnahmen und das Definieren der Aufnahmebedingungen. Die Besonderheiten dieser Schritte können je nach verwendeter Software variieren, aber die allgemeine Gliederung sollte gleich bleiben.
- Schalten Sie den Verstärker ein (Abbildung 5G), und richten Sie einen Workflow für die Aufzeichnung in der Software auf dem Computer ein (Abbildung 5H).
- Öffnen Sie die Software und klicken Sie auf den Workflow.
- Wählen Sie Neuen Ordner öffnen.
- Öffnen Sie den Ordner Aus Vorlagen.
- Wählen Sie 64MD1-1920X1080 (abhängig von der Auflösung Ihres Desktops).
- Öffnen Sie den QT-Ordner.
- Öffnen Sie den Ordner Spontane Aufzeichnung.
- Wählen Sie Beat_recording.moflo-Vorlage aus, und öffnen Sie sie (Abbildung 7A).
- Stellen Sie die Aufzeichnungsparameter ein, um die Anzahl der Leiterbahnen, die Leiterbahndauer, das Leiterbahnintervall, die Eingangsspannung, die Abtastrate usw. entsprechend den gewünschten Aufzeichnungsbedingungen anzugeben (Abbildung 7B).
HINWEIS: Verwenden Sie für die Beatfrequenz- und Interspike-Datenerfassung in der Regel eine Eingangsspannung von 2,9 mV, einen 1-Hz-Hochpassfilter, einen 1000-Hz-Tiefpassfilter und eine Abtastrate von 20 kHz. - Um verschiedene Phasen oder Bedingungen des Experiments zu markieren, z. B. vor und nach der Verabreichung des Arzneimittels, klicken Sie auf die Registerkarte Anmerkungen, um die gewünschten Notationen hinzuzufügen (Abbildung 7C).
- Um das Dateiziel für die zu erfassenden Daten anzugeben, aktivieren Sie das Feld Speicher aktivieren und geben Sie den gewünschten Dateinamen in das Feld Dateinamenmodifizierer ein.
10. Durchführung der Aufzeichnung und Erhebung von Daten
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Aufnahme und Wiedergabe in der obersten Menüleiste der Erfassungssoftware, um die Aufnahme zu starten. Erfassen Sie Daten für 10 Spuren von 1 Min. Dauer mit Intervallen von 2 min zwischen den Traces.
- Überprüfen Sie anhand dieser ersten Spuren, ob die aufgezeichneten Wellenformen mit einer gesunden und hochwertigen Gewebevorbereitung übereinstimmen, indem Sie bestätigen, dass die Mehrheit der Aufzeichnungskanäle Signalamplituden von ≥ 0,5 mV und identische Interspike-Intervalle aufweisen (Abbildung 8).
HINWEIS: Eine erste Beurteilung der Aktivität und der Wellenformen der einzelnen Mikroelektroden entsprechend ihrer anatomischen Position kann durchgeführt werden, indem auf das Bild verwiesen wird, das nach der Positionierung des Gewebes auf der MEA aufgenommen wurde. - Um die Auswirkungen von Medikamenten auf das Gewebe zu messen, pausieren Sie die Aufzeichnung nach der Erfassung der ersten Baseline-Daten, indem Sie auf die Pause-Schaltfläche in der obersten Menüleiste klicken.
HINWEIS: Die Drug-Response-Phase des Experiments kann in der Aufzeichnung notiert werden, indem Sie auf die Registerkarte Annotations klicken und die gewünschte Notation wie oben beschrieben hinzufügen (Abbildung 7C). - Pausieren Sie die Pumpe und schalten Sie den Pumpenzuflussschlauch von der normalen Aufzeichnungslösung auf Tyrodes Lösung um, die das gewünschte Medikament der Wahl enthält.
HINWEIS: Im Beispielexperiment wurde Tyrodes Lösung mit 1 mM 4-Aminopyridin (4-AP) verwendet. - Starten Sie die Pumpe neu und beenden Sie die Unterbrechung der Aufzeichnung, um erneut mit der Datenerfassung zu beginnen.
- Sobald die mit dem Medikament angereicherte Tyrode-Lösung das Gewebe erreicht hat, zeichnen Sie 10 Spuren auf die gleiche Weise auf, wie dies zuvor für die Baseline-Aufnahmen der Standardwertaufnahmen der Standard war.
HINWEIS: Die Spuren werden einige Zeit brauchen, um sich zu stabilisieren, wenn das Medikament in die Aufnahmekammer eindringt. Der Wirkungsmechanismus des Arzneimittels kann auch die Aufzeichnungsstabilität beeinflussen. Bei Arzneimitteln mit reversiblen Wirkmechanismen sollte auch eine Auswaschperiode aufgezeichnet werden, um die Wiederherstellung der Aktivität auf das Ausgangsniveau zu bestätigen, was ein Indikator für gesundes Gewebe ist. - Klicken Sie auf Beenden, um die Aufzeichnungen abzuschließen.
- Machen Sie ein abschließendes Bild der Positionierung des Gewebes auf dem MEA unter dem Mikroskop, falls sich das Gewebe nach dem ersten Aufnahmeaufbau verschoben hat.
11. Reinigen des Setups nach der Aufnahme
- Reinigen Sie den MEA.
- Nach Abschluss der Aufnahme die Aufnahmelösung vorsichtig mit einer 1 ml Mikropipette aus der MEA-Schüssel entfernen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die MEA-Elektroden nicht zu kontaktieren, die sie beschädigen können. - Entfernen Sie das Netz und den Harfenanker mit einer Knochenzette (oder einer gekrümmten Zange). Verwenden Sie dann einen Pinsel, um das Gewebe von der MEA-Oberfläche zu vertreiben, wobei Sie immer darauf achten, die einzelnen Mikroelektroden nicht zu berühren.
- Spülen Sie die MEA-Schale mit einer Waschflasche etwa 3 bis 4 Mal vorsichtig mit Reinstwasser ab.
- Lagern Sie das gereinigte MEA in Reinstwasser bei 4 °C.
- Nach Abschluss der Aufnahme die Aufnahmelösung vorsichtig mit einer 1 ml Mikropipette aus der MEA-Schüssel entfernen.
- Spülen Sie den Systemschlauch ab, indem Sie mindestens 5 Minuten lang Reinstwasser mit der maximalen Drehzahleinstellung an der Peristaltikpumpe durch ihn laufen lassen.
HINWEIS: Um Pilzwachstum zu verhindern, sollte nach der Reinigung kein Wasser oder Pufferlösung im Schlauch verbleiben.
12. Analyse der MEA-Aufnahmen zur Messung der SAN-Beat-Frequenz
- Öffnen Sie die gespeicherte aufgezeichnete Datendatei in der Vorlage "Beat_frequency_analysis" der Analysesoftware (Abbildung 9) .
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Play und lassen Sie die gesamte Aufzeichnung laufen, um den Datensatz zu visualisieren und entsprechende Analyseparameter zuzuweisen.
- Wählen Sie das Binning-Fenster für das gewünschte Anzeigeformat der Daten aus, unabhängig davon, ob es als Durchschnitt pro Trace oder als Durchschnitt pro Zeit angezeigt wird (Abbildung 10A).
- Wählen Sie die Kanäle aus, die in die Analyse einbezogen werden sollen, und legen Sie die gewünschten Amplitudenmaxima oder Amplitudenminima-Schwellenwerte für die automatisierte Wellenform-Peak-Identifizierung fest (Abbildung 10B).
HINWEIS: In diesem Schritt können ein einzelner Kanal, eine Kombination von Kanälen oder alle 64 Kanäle zur Analyse ausgewählt werden (Abbildung 9). Wenn die ausgewählten Schwellenwerte zu nahe an den Maxima- und Minimawerten der Wellenform liegen, werden einige Wellenformspitzen von der Analysesoftware möglicherweise nicht identifiziert. - Legen Sie die Zeit vor und nach der Spitze fest, die in die Analyse einbezogen werden soll.
HINWEIS: Einstellungen von 50 ms vor dem Spike und 100 ms nach dem Spike funktionieren normalerweise gut (Abbildung 10B).
- Nachdem Sie die Analysebedingungen festgelegt haben, klicken Sie erneut auf die Schaltfläche Wiedergabe, um den Datensatz erneut auslaufen zu lassen und zu bestätigen, dass die Analyseparameter für die Spike-Extraktion geeignet sind.
- Für die Analyse identifizieren Sie die drei stabilsten aufeinanderfolgenden Spuren, die eine stabile Prügelrate für jede Spur über die Mehrheit der Kanäle sowohl während des Ausgangszeitraums des Experiments als auch weitere drei aufeinanderfolgende stabile Spuren während des Arzneimittelexpositionszeitraums aufweisen (Abbildung 10A).
- Geben Sie die Start- und Endablaufverfolgungen für die Analyse an und geben Sie die Zeitdauer jedes zu analysierenden Ablaufverfolgungs ein (Abbildung 9).
- Bevor Sie mit der Analyse beginnen, aktivieren Sie die Aktivierungsfelder für Takt pro Minute speichern und Interspike-Intervall speichern ( Abbildung10B).
- Geben Sie den gewünschten Dateinamen in das Feld Dateinamenmodifizierer ein (Abbildung 10B). Die analysierten Daten für Beatfrequenz und Interspike-Intervall werden in Form von ASCII (Text) gespeichert.
HINWEIS: Um verschiedene Bedingungen (z. B. Ausgangswert und Arzneimittelreaktion) zu analysieren, muss die Analyse für jede Bedingung separat durchgeführt werden. - Klicken Sie in der oberen Registerkartenleiste auf die Schaltfläche Wiedergabe und Aufzeichnung, um die Analyse zu starten.
- Um die Daten für andere Anwendungen zu exportieren, aktivieren Sie die Kontrollkästchen Beat pro Minute speichern und Interspike-Intervall speichern ( Abbildung10B). Geben Sie den gewünschten Dateinamen in das Feld Dateinamenmodifizierer ein (Abbildung 10B) und klicken Sie auf Speichern, um die analysierten Daten im ASCII-Textformat im ausgewählten Ordner zu speichern.
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Representative Results
Nachdem sich das Gewebe 15 Minuten lang in der Schüssel akklimatisieren kann, werden 10 einminige Spuren aufgezeichnet. Unser aktuelles Protokoll zeichnet die Aktivität für über eine Stunde auf, aber wir haben stabile Feuermuster für ≥4 h in unveröffentlichten Daten aufgezeichnet, die hier nicht gezeigt werden. Wenn eine experimentelle Vorbereitung für die Datenerfassung gut ist, sollte jeder Aufzeichnungskanal konsistente und gleichmäßig verteilte wiederkehrende Wellenformen (d. H. Spikes) einheitlicher Form für einen bestimmten Kanal aufweisen (Abbildung 11D). Diese Wellenformen entsprechen individuellen Herzschlägen, die die intrinsische herzförmige Schrittmacheraktivität widerspiegeln. Die Interspike-Intervalle sollten für jeden Kanal gleich sein, auch wenn sie aufgrund geringer Unterschiede in ihrer Position relativ zum Initiationsort der Depolarisation möglicherweise nicht perfekt über die Kanäle ausgerichtet sind (Abbildung 8). Obwohl die Form der Wellenformen für einen bestimmten Kanal konsistent sein sollte, variiert die Form der Wellenformen über die Kanäle hinweg, abhängig von der Position der Elektrode im Gewebe (Abbildung 8). Der Grad des Kontakts des Gewebes mit der Elektrode kann auch die Wellenformeigenschaften wie die Amplitude beeinflussen. Die Amplitudenmaxima sollten jedoch für die meisten Kanäle mindestens 0,5 mV betragen, wenn die Zubereitung zufriedenstellend ist. Aus den 10 aufgezeichneten Spuren wurden die drei aufeinanderfolgenden Kanäle ausgewählt, die die oben beschriebenen Qualitätskriterien am besten erfüllen, um die unten beschriebenen weiteren Analysen durchzuführen. Abbildung 10A zeigt eine Stichprobe der stabilen Taktfrequenz (oberes Panel) und des Interspike-Intervalls (mittlerer Panel) für drei aufeinanderfolgende Spuren. Gewebe, das diese Kriterien nicht erfüllt, sollte nicht aufgezeichnet werden, da wahrscheinlich Gewebeschäden vorliegt, die eine genaue Datenerfassung behindern. Abbildung 11 zeigt Beispiele für schlecht extrahierte Spike-Muster, die entweder fehlen (A), durch Rauschen (B) beeinflusst werden oder instabil (C).
Die in den Abbildungen gezeigten Beispieldaten wurden von einer 45 Tage alten männlichen Wildtyp Black Swiss (Tac:N:NIHS-BC) Maus gesammelt. Das in Abbildung 9 und Abbildung 10 dargestellte Analyseverfahren wurde verwendet, um die intrinsische Feuerrate zu extrahieren und Baseline-Spitzen anzuzeigen, die in Abbildung 12Azu sehen sind. Die Feuerrate ist die durchschnittliche Rate über 60.000 ms von jeder der drei Spuren, aber das Spike-Muster in Abbildung 12A zeigt 5 s repräsentatives Spiking von einer einzigen Spur. Mit Hilfe einer automatisierten Analysesoftware wurde festgestellt, dass die intrinsische Feuerrate (d. h. die Taktfrequenz) der ausgewählten drei Spuren über alle 64 Kanäle in unseren Probendaten etwa 320 bpm betrug (Abbildung 12A). Im Allgemeinen beobachten wir in unseren Aufnahmen für Wildtyp-Mäuse einen Wertebereich von etwa 290-340 bpm. Die Feuerrate kann auch als sekundäre Methode zur Beurteilung der Präparationsqualität verwendet werden. Raten, die entweder instabil oder deutlich niedriger als 300 bpm sind, sind weniger wahrscheinlich gut für die Analyse. Diese Werte sind vergleichbar mit isolierten Herz- und Einzelzellaufzeichnungen, die intrinsische Herzfrequenzen im Bereich von ca. 300-500 bpm25,48,49melden. Daher ist die MEA-Aufzeichnungstechnik in der Lage, zuverlässige und genaue Messungen der intrinsischen Herzfrequenz zu generieren.
Ein Vorteil des MEA-Systems ist, dass es eine einfache Anwendung von Arzneimitteln ermöglicht, um pharmakologische Wirkungen zu testen. Im Beispielexperiment testeten wir die Auswirkungen von 1 mM 4-AP auf die Feuerrate, die die SAN-Aktivität verlangsamen sollte, da bekannt ist, dass die Blockade von spannungsgesteuerten K+ -Kanälen die Aktionspotentialrepolarisation in SA-Zellenbeeinträchtigt 24,50. Abbildung 12B zeigt, dass die Einführung von 4-AP die Interspike-Intervalle wie erwartet erhöht hat. Dieses verlängerte Spike-Intervall entsprach einer Abnahme der Schlagfrequenz von 320 bpm auf 210 bpm. Diese Feuerrate nach 4-AP-Verabreichung ähnelt einer früheren Studie, in der die Auswirkungen von 4-AP auf die SAN-Feuerrate unter Verwendung von Einzelelektrodenaufzeichnungen von isoliertem Gewebe untersucht wurden. Diese Studie maß eine Feuerrate von etwa 190 bpm in Gegenwart von 4-AP50. Somit kann das MEA-System als bequemes und wertvolles Werkzeug zur Prüfung pharmakologischer Wirkungen von Arzneimittelinterventionen auf die intrinsische Herzfunktion verwendet werden.
Abbildung 1: Beschichtung des Mikroelektrodenarrays (MEA) vor der Verwendung. (A) Die MEA besteht aus einer kleinen Kunststoffschale mit einem Gitter von 64 Mikroelektroden in der Mitte (wie im Panel A1gezeigt) und vier Referenzelektroden um die Peripherie in einem quadratischen Muster. (B) Zugabe von 1 ml PEI-Puffer zur Beschichtung des MEA. (C) Abdeckung der MEA-Schale mit thermoplastischer Folie zur Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. (D) Absaugen des PEI-Puffers aus der MEA-Schale, gefolgt von mindestens vier Spülungen mit destilliertem Wasser. (E) Lagerung der beschichteten MEA-Sonde unter Reinstwasser, um ein Austrocknen zu verhindern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2:Tools, die für die SAN-Dissektion (Sinoatrial Node) verwendet werden. Die folgenden Werkzeuge werden während des Sezierteils des Protokolls verwendet: (i) Petrischale mit Silikonelastomer und kleinen Sezierstiften; ii) Kunststoff-Transferpipette; iii) Castroviejo Schere, Größe 4"; iv) Chirurgische Schere (gerade) für Schneideverfahren; v) Dumont #2 Laminektomie-Hemung; vi) Dumont #55-Zette; vii) Extra feine Graefe-Zette; (viii) Hämostate (gekrümmt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Entfernung des Herzens. (A) Querschnitt in der Haut direkt unter dem Boden des Brustkorbs vom linken Rippenbogen bis zum rechten Rippenbogen. (B) Peritonealschnitt. (C,D) Schnitt des Zwerchfells entlang des Thorax, um die Brusthöhle freizulegen. (E) Entfernung des Herzens nach Exzision der Lunge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Dissektion des sinoatrialen (SAN) Knotens. (A) Das Auftreten des Herzens in der Petrischale nach Entfernung aus dem Körper. (B) Einsetzen der Spritzennadel durch die Untervene (IVC) und die Obere Hohlvene (SVC) des rechten Vorhofs. Der Stift in der Spitze des Herzens wird ebenfalls gezeigt. (C) Exzision der Spitze (d.h. der unteren Hälfte) des Herzens, um das Blut freizusetzen. Die Stifte in den Vorhoffnungsgehängseln sind ebenfalls dargestellt. (D) Das endgültige Erscheinungsbild des SAN-Bereichs des rechten Vorhofs am Ende der Dissektion. Der Boxed-Bereich entspricht dem ungefähren Standort des SAN. Die SAN-Arterie kann auch schwach gesehen werden, wie sie in vertikaler Ausrichtung durch das SAN schwingt. Die Abkürzungen: AO, Aorta; CT, Crista terminalis; IVC, Vena cava inferior; LA, linkes Atrium; RA, rechtes Atrium; RAA, rechtes Vorhoffnungsdarm; SAN, sinoatrialer Knoten; SVC, vena cava superior. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Schematische Darstellung des MEA-Aufzeichnungssystems (Microelectrode Array). Folgende Komponenten umfassen das System:(A)Gasflasche (Carbogen: 95%O2/ 5% CO2); B) konischer Kolben mit destilliertem Wasser zur Befeuchtung des Gases; C) Aufzeichnung der Lösungsflasche von Tyrode, die den Zufluss in die MEA-Schüssel ermöglicht; D) Schlauchpumpe zum Pumpen von und zur MEA-Schale; E) Temperaturregler; F) MEA-Anschlussplatte, die Signale von der MEA-Schüssel empfängt; (G) Verstärker; H)Computer; I) Sammelflasche für gebrauchte Abfalllösung aus der MEA-Schale. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Positionierung des SA-Knotengewebes auf MEA. (A) Werkzeuge zur Positionierung des Gewebes: (i) Netz mit 1,5 mm Rastergröße, (ii) Harfenanker, (iii) Knochenzette, (iv) Pinsel. (B) Positionierung des Gewebes auf dem MEA. Das gelbe Feld zeigt die ungefähre Fläche der sinoatrialen Knotenregion unter dem Netz und dem Anker in der MEA-Schüssel an. C)Anordnung der MEA-Schale mit geschlossenem Gewebe auf der Anschlussplatte für die Feldpotentialaufzeichnung: i) Einlass für die Aufzeichnungslösung; ii) Einlass für Gas (Carbogen); iii) Auslass für die Lösung; iv) Mikroelektroden-Anschlussplatte; v) Perfusionskappe; vi) referenzelektrodenring, der an der Kappe befestigt ist; vii) Klebeband zum Halten der Kappe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Einstellen des Datenerfassungsprotokolls in der Software. (A) Ein Beispiel für eine Aufzeichnungsvorlage, die die Anordnung aller 64 Kanäle zeigt. (B) Ein Beispiel für die Softwareeingabeeigenschaften für die Aufzeichnungsbedingungen. (C) Ein Beispiel für das Menü Anmerkungen, das zeigt, wie während der Aufzeichnung eine neue Phase hinzugefügt wird, z. B. zur Messung von Arzneimittelwirkungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Verschiedene Regionen des Gewebes, die unterschiedliche Aktivitätswellenformen aufweisen. Beispiel-Screenshot mit Wellenformen mit unterschiedlichen Formen und Amplituden in verschiedenen Kanälen. Alle Kanäle zeigen jedoch identische Interspike-Intervalle und Feuerfrequenzen. Die Kanäle innerhalb der roten Box entsprechen in etwa den Elektroden, die im SAN-Bereich des Gewebes platziert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9:Vorlage für die Beatfrequenzanalyse. Beispielvorlage, die die Anordnung aller 64 Kanäle in der Beatfrequenzanalysevorlage zeigt. Der Einschub "Rohdatendatei wiedergeben" zeigt ein Beispiel für die Eingabeeigenschaften des Analysefensters. In diesem Beispiel wurden die Spuren 5 bis 7 für die Analyse ausgewählt und die Analysedauer für jede Spur wurde mit 60.000 ms angegeben.
Abbildung 10: Definieren von Analyseparametern für die Spike-Extraktion. (A) Repräsentative Analysevorlagenergebnisse für 3 ausgewählte Spuren eines einzelnen Kanals. Das obere Bedienfeld zeigt die Taktfrequenz für die drei ausgewählten Leiterbahnen (drei definierte Gruppierungen von Datenpunkten) an, und jeder Punkt stellt einen 10-s-Durchschnitt für die Taktfrequenz während der spezifischen Spur dar. Im mittleren Bereich wird das Inter-Spike-Intervall für die drei ausgewählten Traces (drei definierte Gruppierungen von Datenpunkten) angezeigt, und jeder Datenpunkt stellt das Inter-Spike-Intervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Spikes dar. Das untere linke Feld zeigt ausgewählte repräsentativ extrahierte Spikes für die letzten 5 s der dritten Spur, während das untere rechte Panel eine extrahierte Wellenform zeigt, die aus der 5-s-Gruppe der extrahierten Spikes im unteren linken Bereich abgeleitet ist. (B) Erweiterte Ansicht des Analysefensters mit Parametern, die bei der Analyse der Schlagfrequenz für die 3 Spuren verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 11: Repräsentative Abbildung, die eine gute und eine schlechte Datenextraktion für einen bestimmten Kanal zeigt. Schlechte Datenextraktion: (A) Fehlen von extrahierten Spitzen; (B) Extrahierte Spitzen mit Rauschsignalen; (C) Instabile extrahierte Spikes. (D) Gute Daten, die stabile extrahierte Spitzen ohne Rauschsignale zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 12: Aufnahmen zu Studienbeginn und nach Verabreichung von 1mM 4-Aminopyridin (4-AP). (A) Die Baseline-Aufzeichnung einer einzelnen Mikroelektrode zeigt Wellenformen mit einer stabilen Zündfrequenz von 320 bpm in einem WT-Herzen. (B) Nach Verabreichung von 4-AP verlangsamt sich die Zündfrequenz auf eine stabile Rate von 210 bpm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das Üben und Beherrschen des SAN-Dissektionsprozesses ist unerlässlich, da das Gewebe zerbrechlich ist und gesundes Gewebe für eine erfolgreiche Aufnahme notwendig ist. Während der SAN-Dissektion ist eine korrekte Orientierung unerlässlich, um die richtige Geweberegion zu erhalten. Die ursprüngliche Ausrichtung des Herzens kann jedoch während des Dissektionsprozesses leicht verloren gehen, was dieses Unterfangen erschwert. Um die richtige Links-Rechts-Ausrichtung zu gewährleisten, sollten die Vorhöfe daher visuell inspiziert werden. Typischerweise ist der rechte Vorhof tendenziell transparenter, während der linke Vorhof normalerweise dunkler und roter in der Farbe25,48ist. Darüber hinaus ist es wichtig, das SAN-Gewebe nicht zu dehnen, während Sie damit arbeiten oder es auf dem Elektrodengitter montieren, da das Gewebe leicht mechanisch beschädigt wird51. Ein Tipp zur Überprüfung von gesundem und ordnungsgemäß seziertem SAN-Gewebe besteht darin, es in der Lösung von Complete Tyrode unter dem Mikroskop zu untersuchen, um zu überprüfen, ob das Gewebe schlägt. Sobald die Technik beherrscht ist, sollten mindestens 90% der Gewebepräparate gut für die Aufnahme sein.
Mehrere Überlegungen können die Wahrscheinlichkeit erfolgreicher Aufzeichnungen und anschließender Datenanalysen verbessern. Um die besten Aufnahmen zu gewährleisten, sollten Lösungen vor experimentellen Aufnahmen sorgfältig vorbereitet und an Übungsmausproben getestet werden. Wir haben intensiv daran gearbeitet, die Aufzeichnungslösung anzupassen und zu modifizieren, um den Zustand des SAN-Gewebes zu optimieren. Stellen Sie außerdem sicher, dass das für die Aufzeichnung verwendete Gas Carbogen ist (d. H. 95% O2/ 5% CO2). Einzelzellaufnahmen verwenden oft reinen Sauerstoff aufgrund der spezifischen chemischen Zusammensetzung der Tyrode-Lösung, die für diese Anwendung verwendet wird, aber die Lösung, die für die Aufzeichnung auf dem MEA verwendet wird, erfordert Carbogen, um einen stabilen pH-Wert aufrechtzuerhalten. Die Verwendung von reinem Sauerstoff mit der Lösung des Tyrode für die MEA-Aufzeichnungen führt zu Schwankungen des pH-Werts, die zu einer schnellen Verschlechterung des Gewebes führen können. Die Beurteilung der Amplitudenmaxima in den Kanälen wie zuvor beschrieben hilft festzustellen, ob das Gewebe eine gute Aufnahmequalität aufwertet. Um die Analyse nach der Aufzeichnung zu unterstützen, ist es schließlich sehr hilfreich, ein Bild des montierten SAN-Gewebes auf dem MEA-Elektrodenarray nach Abschluss der Aufzeichnung aufzunehmen. Das Gewebe kann sich während der anfänglichen Einrichtung der MEA leicht verschieben, was die genaueste Beurteilung der Elektrodenplatzierung für die Analyse ermöglicht.
Wir bieten MEA-Aufnahmen als gründliche und genaue Möglichkeit zur Charakterisierung der SAN-Feuerrate an. Ein Vorteil der MEA-Technik besteht darin, dass der Experimentator Feuerraten erfassen kann, die mit Einzelzellaufnahmen vergleichbar sind, ohne über umfangreiche elektrophysiologische Kenntnisse verfügen zu müssen. Die MEA-Technik hat auch den Vorteil, dass sie die potenziellen verwirrenden Einflüsse neurohumoraler und mechanoelektrischer Mechanismen eliminiert, die isolierten Herzaufnahmen und in vivo autonomen Blockademessungen innewohnen21. Ventrikuläre Kontraktion und Atmung sind die wichtigsten mechanoelektrischen Einflüsse, die das SAN-Feuern verändern könnten, aber sie werden in unserem Gewebepräparat eliminiert 52,53. Während unsere Technik die meisten autonomen Einflüsse auf das SAN eliminiert, könnte eine begrenzte Anzahl von verbleibenden ICNS-Projektionen in den richtigen Vorhöfen möglicherweise das SAN-Feuern beeinflussen, eine theoretische Einschränkung, die bei der Interpretation der Ergebnisse 5,6,22,23berücksichtigt werden sollte . Ein weiterer Vorteil der hier beschriebenen MEA-Technik ist, dass sie für viele andere Arten von Herzstudien angepasst werden kann. Obwohl dieses Protokoll beispielsweise die Auswirkungen von 4-AP auf die SAN-Aktivität zeigte, könnten zukünftige Studien eine fast unbegrenzte Anzahl pharmakologischer Wirkstoffe sowie die Auswirkungen von Genmutationen auf das SAN-intrinsische Feuern untersuchen. Zum Beispiel könnte Ivabradin, ein spezifischer Blocker des SAN-spezifischen Hcn4-Kanals, verwendet werden, um lustige aktuelle Beiträge zur Feuerrate54zu untersuchen. Das MEA-System kann auch zur Messung der Herzfunktion in anderen Regionen des Herzens verwendet werden, was eine detaillierte, regionsspezifische Charakterisierung ermöglicht. Die Aufnahme aus anderen Herzregionen würde jedoch unterschiedliche Dissektionsansätze und die Möglichkeit einer Dünngewebeschnitte vor der Aufnahme erfordern. Eine potenziell signifikante Einschränkung dieser Technik sind die hohen Kosten für den Kauf eines MEA-Systems, die unerschwinglich sein können. Mehrere MEA-Systeme sind auf dem Markt mit ähnlichen Eigenschaften und Funktionalitäten erhältlich, aber die hohen Kosten bleiben gleich. Sobald jedoch die Erstausrüstung und Software erworben ist, sind die Kosten für die Wartung und Nutzung des MEA-Systems ziemlich gering. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass das MEA-System nur die Aufzeichnung extrazellulärer Feldpotentiale ermöglicht, die für präzise Vergleiche von Aktionspotentialeigenschaften (z. B. Amplitude und Form) zwischen Präparaten, wie sie mit einzelligen intrazellulären Aufzeichnungen erreicht werden können, nicht förderlich sind. Zusammenfassend bietet dieses Protokoll einen effizienten Workflow zur Messung und Analyse der intrinsischen Herzfeuerraten im SAN-Gewebe von Mäusen mit der Fähigkeit, die Auswirkungen pharmakologischer Eingriffe auf die Feuerrate auf hochspezifische Weise zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health mit den Fördernummern R01NS100954 und R01NS099188 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920x1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
References
- Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
- Josea, A. D., Collison, D. The normal range and determinants of the intrinsic heart rate in man. Cardiovascular Research. (4), 160-167 (1970).
- Peters, C. H., Sharpe, E. J., Proenza, C. Annual Review of Physiology Cardiac Pacemaker Activity and Aging. Annual Review of Physiology. 82, 21-43 (2019).
- Keith, A., Flack, M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. Journal of Anatomy and Physiology. 41 (3), 172-189 (1907).
- Wake, E., Brack, K. Characterization of the intrinsic cardiac nervous system. Autonomic Neuroscience. 199, (2016).
- Fedele, L., Brand, T. The intrinsic cardiac nervous system and its role in cardiac pacemaking and conduction. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 7 (4), 1-33 (2020).
- Mangrum, J. M., DiMarco, J. P. The evaluation and management of bradycardia. New England Journal of Medicine. 342 (10), 703-709 (2000).
- Adan, V., Crown, L. A. Diagnosis and treatment of Sick Sinus Syndrome. American Family Physician. 67 (8), 1725-1732 (2003).
- Semelka, M., Gera, J., Usman, S. Sick Sinus Syndrome: A Review. American Family Physician. 87 (10), 691-696 (2013).
- Zaragoza, M. V., et al. Exome sequencing identifies a novel LMNA splice-site mutation and multigenic heterozygosity of potential modifiers in a family with Sick Sinus Syndrome, dilated cardiomyopathy, and sudden cardiac death. PLoS ONE. 11 (5), 0155421 (2016).
- Brugada, J., Campuzano, O., Arbelo, E., Sarquella-Brugada, G., Brugada, R. Present status of Brugada Syndrome: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (9), 1046-1059 (2018).
- Rollin, A., et al. Prevalence, characteristics, and prognosis role of type 1 ST elevation in the peripheral ECG leads in patients with Brugada syndrome. Heart Rhythm. 10 (7), 1012-1018 (2013).
- Patel, N., Majeed, F., Sule, A. A. Seizure triggered by Sick Sinus Syndrome. BMJ case reports. 4, 2017222011 (2017).
- Knecht, S., et al. Impact of pharmacological autonomic blockade on complex fractionated atrial electrograms. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (7), 766-772 (2010).
- Saba, S., London, B., Ganz, L. Autonomic blockade unmasks maturational differences in rate-dependent atrioventricular nodal conduction and facilitation in the mouse. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 14 (2), 191-195 (2003).
- Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 51-56 (2002).
- Tse, G., Tse, V., Yeo, J. M., Sun, B. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts. PLoS ONE. 11 (2), 0148858 (2016).
- Tse, G., et al. Quantification of beat-to-beat variability of action potential durations in Langendorff-perfused mouse hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1578), 01578 (2018).
- Avula, U. M. R., et al. Heterogeneity of the action potential duration is required for sustained atrial fibrillation. JCI Insight. 5 (11), 128765 (2019).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. (135), e57617 (2018).
- Quinn, A. T., Kohl, P. Cardiac mechano-electric coupling: Acute effects of mechanical stimulation on heart rate and rhythm. Physiological Reviews. 101 (1), 37-92 (2021).
- Ripplinger, C. M., Noujaim, S. F., Linz, D.
- Pauza, D. H., Pauziene, N., Pakeltyte, G., Stropus, R. Comparative quantitative study of the intrinsic cardiac ganglia and neurons in the rat, guinea pig, dog and human as revealed by histochemical staining for acetylcholinesterase. Annals of Anatomy. 184, 125-136 (2002).
- Golovko, V., Gonotkov, M., Lebedeva, E. Effects of 4-aminopyridine on action potentials generation in mouse sinoauricular node strips. Physiological Reports. 3 (7), 12447 (2015).
- Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), e54555 (2016).
- Doi, M., Ogawa, E., Arai, T. Effect of a photosensitization reaction performed during the first 3 min after exposure of rat myocardial cells to talaporfin sodium in vitro. Lasers in Medical Science. 32 (8), 1873-1878 (2017).
- Takanari, H., et al. A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology. Journal of Cellular Physiology. 231 (10), 2249-2256 (2016).
- Nakashima, T., et al. Rapid electrical stimulation causes alterations in cardiac intercellular junction proteins of cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1324-1333 (2014).
- Suzuki, S., et al. Effects of aldosterone on Cx43 gap junction expression in neonatal rat cultured cardiomyocytes. Circulation Journal. 73 (8), (2009).
- Horiba, M., et al. T-type Ca2+ channel blockers prevent cardiac cell hypertrophy through an inhibition of calcineurin-NFAT3 activation as well as L-type Ca2+ channel blockers. Life Sciences. 82 (11-12), 554-560 (2008).
- Inoue, N., et al. Rapid electrical stimulation of contraction modulates gap junction protein in neonatal rat cultured cardiomyocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases and effects of angiotensin II receptor agonist. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 914-922 (2004).
- Aalders, J., et al. Effects of fibrillin mutations on the behavior of heart muscle cells in Marfan syndrome. Scientific Reports. 10 (16756), (2020).
- Matsuura, K., et al. Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets. Biomaterials. 32 (30), 7355-7362 (2011).
- Fujita, H., Shimizu, K., Nagamori, E. Application of a cell sheet-polymer film complex with temperature sensitivity for increased mechanical strength and cell alignment capability. Biotechnology and Bioengineering. 103 (2), 370-377 (2009).
- Baba, S., et al. Generation of cardiac and endothelial cells from neonatal mouse testis-derived multipotent germline stem cells. Stem Cells. 25 (6), 1375-1383 (2007).
- Baba, S., et al. Flk1+ cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model. Cardiovascular Research. 76 (1), 119-131 (2007).
- Shimizu, K., et al. Construction of multi-layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 803-809 (2007).
- Haraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. Electrical coupling of cardiomyocyte sheets occurs rapidly via functional gap junction formation. Biomaterials. 27 (27), 4765-4774 (2006).
- Miyagawa, S., et al. Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: Their integration with recipient myocardium. Transplantation. 80 (11), 1586-1595 (2005).
- Watts, M., et al. Decreased bioavailability of hydrogen sulfide links vascular endothelium and atrial remodeling in atrial fibrillation. Redox Biology. 38, 101817 (2021).
- Feng, Y., Cao, H., Zhang, Y. Prediction model of sinoatrial node field potential using high order partial least squares. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 1805-1811 (2015).
- Feng, Y., Cao, H., Wang, Y., Zhang, Y. Fuzzy linguistic prediction model for sinoatrial node field potential analysis in acute hyperglycemia environment. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, Suppl 1 881-887 (2015).
- Suzuki, K., Matsumoto, A., Nishida, H., Reien, Y., Maruyama, H., Nakaya, H. Termination of aconitine-induced atrial fibrillation by the KACh-channel blocker tertiapin: underlying electrophysiological mechanism. Journal of Pharmacological Sciences. 125 (4), 406-414 (2014).
- Chang, S. -L., et al. Heart failure enhances arrhythmogenesis in pulmonary veins. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 38 (10), 666-674 (2011).
- Wang, Y. -J., et al. Time-dependent block of ultrarapid-delayed rectifier K+ currents by aconitine, a potent cardiotoxin, in heart-derived H9c2 myoblasts and in neonatal rat ventricular myocytes. Toxicological Sciences. 106 (2), 454-463 (2008).
- Lai, Y. -J., Huang, E. Y. -K., Yeh, H. -I., Chen, Y. -L., Lin, J. J. -C., Lin, C. -I. On the mechanisms of arrhythmias in the myocardium of mXinα-deficient murine left atrial-pulmonary veins. Life Sciences. 83 (7-8), 272-283 (2008).
- Gustafson-Wagner, E. A., et al. Loss of mXinα, an intercalated disk protein, results in cardiac hypertrophy and cardiomyopathy with conduction defects. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (5), 2680-2692 (2007).
- Clark, R. B., et al. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, 1757-1766 (2004).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Nikmaram, M. R., et al. Characterization of the effects of Ryanodine, TTX, E-4031 and 4-AP on the sinoatrial and atrioventricular nodes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 96 (1-3), 452-464 (2008).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
- Masé, M., Glass, L., Ravelli, F. A model for mechano-electrical feedback effects on atrial flutter interval variability. Bulletin of Mathematical Biology. 70 (5), 1326-1347 (2008).
- Franz, M. R., Bode, F. Mechano-electrical feedback underlying arrhythmias: The atrial fibrillation case. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 82 (1-3), 163-174 (2003).
- Bucchi, A., Tognati, A., Milanesi, R., Baruscotti, M., DiFrancesco, D. Properties of ivabradine-induced block of HCN1 and HCN4 pacemaker channels. Journal of Physiology. 572 (2), 335-346 (2006).
