Dit protocol heeft tot doel een nieuwe methodologie te beschrijven om de intrinsieke cardiale vuursnelheid te meten met behulp van micro-elektrode array-registratie van het hele sinoatriale knoopweefsel om pacemaking-defecten bij muizen te identificeren. Farmacologische middelen kunnen ook in deze methode worden geïntroduceerd om hun effecten op intrinsieke pacemaking te bestuderen.
De sinoatriale knoop (SAN), gelegen in het rechter atrium, bevat de pacemakercellen van het hart en disfunctie van dit gebied kan tachycardie of bradycardie veroorzaken. Betrouwbare identificatie van cardiale pacemakingdefecten vereist de meting van intrinsieke hartslagen door grotendeels de invloed van het autonome zenuwstelsel te voorkomen, wat snelheidstekorten kan maskeren. Traditionele methoden om de intrinsieke pacemakerfunctie te analyseren, omvatten door geneesmiddelen geïnduceerde autonome blokkade om in vivo hartslagen te meten, geïsoleerde hartopnamen om intrinsieke hartslagen te meten en sinoatriale strip of eencellige patch-clamp-opnames van sinoatriale pacemakercellen om spontane actiepotentiaalvuursnelheden te meten. Deze meer traditionele technieken kunnen echter technisch uitdagend en moeilijk uit te voeren zijn. Hier presenteren we een nieuwe methodologie om de intrinsieke cardiale vuursnelheid te meten door micro-elektrode array (MEA) opnames uit te voeren van whole-mount sinoatriale knooppreparaten van muizen. MEAs zijn samengesteld uit meerdere micro-elektroden gerangschikt in een rasterachtig patroon voor het registreren van in vitro extracellulaire veldpotentiaalen. De hierin beschreven methode heeft het gecombineerde voordeel dat het relatief sneller, eenvoudiger en nauwkeuriger is dan eerdere benaderingen voor het registreren van intrinsieke hartslagen, terwijl het ook eenvoudige farmacologische ondervraging mogelijk maakt.
Het hart is een complex orgaan dat wordt bestuurd door zowel cardiale intrinsieke als extrinsieke invloeden zoals die afkomstig zijn uit de hersenen. De sinoatriale knoop (SAN) is een gedefinieerd gebied in het hart dat de pacemakercellen (ook wel sinoatriale cellen of SA-cellen genoemd) herbergt die verantwoordelijk zijn voor het initiëren en bestendigen van de hartslag van zoogdieren1,2. De intrinsieke hartslag is de snelheid die wordt aangedreven door de pacemakercellen zonder invloed van andere cardiale of neurohumorale invloeden, maar traditionele metingen van de hartslag bij mensen en levende dieren, zoals elektrocardiogrammen, weerspiegelen zowel de pacemaker als neurale invloeden op het hart. De meest opvallende neurale invloed op SA-cellen is afkomstig van het autonome zenuwstelsel, dat voortdurend vuurpatronen moduleert om aan de fysiologische vereisten van het lichaam te voldoen3. Ter ondersteuning van dit idee zijn zowel sympathische als parasympathische projecties te vinden in de buurt van de SAN4. Het intrinsieke hart-zenuwstelsel (ICNS) is een andere belangrijke neurale invloed waarbij ganglionated plexi, met name in de rechter boezems, de activiteit van de SAN innerveert en reguleert5,6.
Het begrijpen van tempomakende tekorten is klinisch belangrijk, omdat disfunctie ten grondslag kan liggen aan veel hartaandoeningen en kan bijdragen aan het risico op andere complicaties. Sick sinus syndrome (SSS) is een categorie ziekten die wordt gekenmerkt door disfunctie van de sinoatriale knoop die een goede pacemaking belemmert7,8. SSS kan zich presenteren met sinus bradycardie, sinuspauzes, sinusstilstand, sinoatriale uitgangsblok en afwisselend bradyarrythmieën en tachyaritmieën9 en kan leiden tot complicaties, waaronder een verhoogd risico op embolische beroerte en plotselinge dood8,10. Degenen met het Brugada-syndroom, een hartaandoening gekenmerkt door ventriculaire fibrillatie met een verhoogd risico op plotselinge hartdood, lopen een groter risico op aritmogene gebeurtenissen als ze ook comorbide SAN-disfunctie hebben11,12. Sinoatriale disfunctie kan ook fysiologische gevolgen hebben buiten het hart. Er is bijvoorbeeld waargenomen dat SSS epileptische aanvallen bij een patiënt veroorzaakt als gevolg van cerebrale hypoperfusie13.
Om sinoatriale tempotekorten te identificeren, moeten intrinsieke hartslagen worden bepaald door de activiteit van de SAN te meten zonder de invloed van het autonome zenuwstelsel of humorale factoren. Klinisch kan dit worden benaderd door farmacologische autonome blokkade14, maar dezelfde techniek kan ook worden toegepast in zoogdiermodellen om de intrinsieke hartfunctie te bestuderen15,16. Hoewel deze aanpak een groot deel van de bijdragende neurale invloeden blokkeert en in vivo cardiaal onderzoek mogelijk maakt, elimineert het niet alle extrinsieke invloeden op het hart volledig. Een andere onderzoekstechniek die wordt gebruikt om de intrinsieke hartfunctie in diermodellen te bestuderen, is geïsoleerde hartopnamen met behulp van Langendorff-geperfuseerde harten, die meestal metingen omvatten met behulp van elektrogrammen, pacing of epicardiale multi-elektrode arrays17,18,19,20. Hoewel deze techniek specifieker is voor de hartfunctie, omdat het gaat om het verwijderen van het hart uit het lichaam, kunnen de metingen nog steeds worden beïnvloed door mechanisch-elektrische autoregulatoriemechanismen die intrinsieke hartslagmetingen kunnen beïnvloeden21. De geïsoleerde hartopnamen kunnen ook nog steeds worden beïnvloed door autonome regulatie via de ICNS5,6,22,23. Bovendien kan het handhaven van een fysiologisch relevante temperatuur van het hart, die van cruciaal belang is voor hartfunctiemetingen, moeilijk zijn in geïsoleerde hartbenaderingen20. Een meer directe methode om de SAN-functie te bestuderen, is om SAN-weefsel specifiek te isoleren en de activiteit ervan te meten. Dit kan worden bereikt door SAN-strips (geïsoleerd SAN-weefsel) of geïsoleerde SAN-pacemakercellen24,25. Beide vereisen een hoge mate van technische training, omdat het SAN een zeer klein en sterk gedefinieerd gebied is, en celisolatie vormt een nog grotere uitdaging omdat dissociatie de algehele gezondheid van de cel kan schaden als het niet correct wordt uitgevoerd. Bovendien vereisen deze technieken deskundige elektrofysiologische vaardigheden om met succes van het weefsel of de cellen te registreren met behulp van individuele registrerende micro-elektroden.
In dit protocol beschrijven we een techniek om het SAN in vitro vast te leggen met behulp van een micro-elektrode array (MEA) om intrinsieke hartslagmetingen te verkrijgen. Deze aanpak heeft het voordeel dat zeer specifieke elektrofysiologische opnames toegankelijk zijn voor onderzoekers zonder intensieve elektrofysiologische vaardigheden. MEA’s zijn eerder gebruikt om de cardiomyocytenfunctie in primaire cardiomyocytenculturen26,27,28,29,30,31,32,cardiale vellen33,34,35,36,37,38,39en weefsel hele mounts40tebestuderen, 41,42,43,44,45,46,47. Eerder werk is ook gedaan om veldpotentiaal in SAN-weefsel41,42te onderzoeken. Hier bieden we een methodologie om de MEA te gebruiken om murine intrinsieke SAN-vuursnelheden vast te leggen en te analyseren. We beschrijven ook hoe deze techniek kan worden gebruikt om farmacologische effecten van geneesmiddelen op san intrinsieke vuursnelheden te testen door een monsterexperiment te leveren dat de effecten van 4-aminopyridine (4-AP), een voltage-gated K+ kanaalblokker, laat zien. Met behulp van gedefinieerde anatomische oriëntatiepunten kunnen we het SAN nauwkeurig registreren zonder de uitgebreide weefseldissecties of celisolaties uit te voeren die bij andere methoden vereist zijn. Hoewel de MEA onbetaalbaar kan zijn, bieden de opnames zeer specifieke en betrouwbare metingen van pacemaking die kunnen worden gebruikt in een breed scala aan klinische en fysiologische onderzoekstoepassingen.
Het oefenen en beheersen van het SAN-dissectieproces is noodzakelijk omdat het weefsel kwetsbaar is en gezond weefsel noodzakelijk is voor een succesvolle opname. Tijdens de SAN-dissectie is de juiste oriëntatie essentieel om het juiste weefselgebied te verkrijgen. De oorspronkelijke oriëntatie van het hart kan echter gemakkelijk verloren gaan tijdens het dissectieproces, wat dit streven bemoeilijkt. Daarom moeten de atria visueel worden geïnspecteerd om de juiste oriëntatie links-rechts te garanderen. Meestal is het…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health, subsidienummers R01NS100954 en R01NS099188.
4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
Dissection Microscope | Jenco | ||
Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |