A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Dit protocol heeft tot doel een nieuwe methodologie te beschrijven om de intrinsieke cardiale vuursnelheid te meten met behulp van micro-elektrode array-registratie van het hele sinoatriale knoopweefsel om pacemaking-defecten bij muizen te identificeren. Farmacologische middelen kunnen ook in deze methode worden geïntroduceerd om hun effecten op intrinsieke pacemaking te bestuderen.

Abstract

De sinoatriale knoop (SAN), gelegen in het rechter atrium, bevat de pacemakercellen van het hart en disfunctie van dit gebied kan tachycardie of bradycardie veroorzaken. Betrouwbare identificatie van cardiale pacemakingdefecten vereist de meting van intrinsieke hartslagen door grotendeels de invloed van het autonome zenuwstelsel te voorkomen, wat snelheidstekorten kan maskeren. Traditionele methoden om de intrinsieke pacemakerfunctie te analyseren, omvatten door geneesmiddelen geïnduceerde autonome blokkade om in vivo hartslagen te meten, geïsoleerde hartopnamen om intrinsieke hartslagen te meten en sinoatriale strip of eencellige patch-clamp-opnames van sinoatriale pacemakercellen om spontane actiepotentiaalvuursnelheden te meten. Deze meer traditionele technieken kunnen echter technisch uitdagend en moeilijk uit te voeren zijn. Hier presenteren we een nieuwe methodologie om de intrinsieke cardiale vuursnelheid te meten door micro-elektrode array (MEA) opnames uit te voeren van whole-mount sinoatriale knooppreparaten van muizen. MEAs zijn samengesteld uit meerdere micro-elektroden gerangschikt in een rasterachtig patroon voor het registreren van in vitro extracellulaire veldpotentiaalen. De hierin beschreven methode heeft het gecombineerde voordeel dat het relatief sneller, eenvoudiger en nauwkeuriger is dan eerdere benaderingen voor het registreren van intrinsieke hartslagen, terwijl het ook eenvoudige farmacologische ondervraging mogelijk maakt.

Introduction

Het hart is een complex orgaan dat wordt bestuurd door zowel cardiale intrinsieke als extrinsieke invloeden zoals die afkomstig zijn uit de hersenen. De sinoatriale knoop (SAN) is een gedefinieerd gebied in het hart dat de pacemakercellen (ook wel sinoatriale cellen of SA-cellen genoemd) herbergt die verantwoordelijk zijn voor het initiëren en bestendigen van de hartslag van zoogdieren^1,2. De intrinsieke hartslag is de snelheid die wordt aangedreven door de pacemakercellen zonder invloed van andere cardiale of neurohumorale invloeden, maar traditionele metingen van de hartslag bij mensen en levende dieren, zoals elektrocardiogrammen, weerspiegelen zowel de pacemaker als neurale invloeden op het hart. De meest opvallende neurale invloed op SA-cellen is afkomstig van het autonome zenuwstelsel, dat voortdurend vuurpatronen moduleert om aan de fysiologische vereisten van het lichaam te voldoen³. Ter ondersteuning van dit idee zijn zowel sympathische als parasympathische projecties te vinden in de buurt van de SAN⁴. Het intrinsieke hart-zenuwstelsel (ICNS) is een andere belangrijke neurale invloed waarbij ganglionated plexi, met name in de rechter boezems, de activiteit van de SAN innerveert en reguleert^5,6.

Het begrijpen van tempomakende tekorten is klinisch belangrijk, omdat disfunctie ten grondslag kan liggen aan veel hartaandoeningen en kan bijdragen aan het risico op andere complicaties. Sick sinus syndrome (SSS) is een categorie ziekten die wordt gekenmerkt door disfunctie van de sinoatriale knoop die een goede pacemaking belemmert^7,8. SSS kan zich presenteren met sinus bradycardie, sinuspauzes, sinusstilstand, sinoatriale uitgangsblok en afwisselend bradyarrythmieën en tachyaritmieën⁹ en kan leiden tot complicaties, waaronder een verhoogd risico op embolische beroerte en plotselinge dood^8,10. Degenen met het Brugada-syndroom, een hartaandoening gekenmerkt door ventriculaire fibrillatie met een verhoogd risico op plotselinge hartdood, lopen een groter risico op aritmogene gebeurtenissen als ze ook comorbide SAN-disfunctie hebben^11,12. Sinoatriale disfunctie kan ook fysiologische gevolgen hebben buiten het hart. Er is bijvoorbeeld waargenomen dat SSS epileptische aanvallen bij een patiënt veroorzaakt als gevolg van cerebrale hypoperfusie¹³.

Om sinoatriale tempotekorten te identificeren, moeten intrinsieke hartslagen worden bepaald door de activiteit van de SAN te meten zonder de invloed van het autonome zenuwstelsel of humorale factoren. Klinisch kan dit worden benaderd door farmacologische autonome blokkade¹⁴, maar dezelfde techniek kan ook worden toegepast in zoogdiermodellen om de intrinsieke hartfunctie te bestuderen^15,16. Hoewel deze aanpak een groot deel van de bijdragende neurale invloeden blokkeert en in vivo cardiaal onderzoek mogelijk maakt, elimineert het niet alle extrinsieke invloeden op het hart volledig. Een andere onderzoekstechniek die wordt gebruikt om de intrinsieke hartfunctie in diermodellen te bestuderen, is geïsoleerde hartopnamen met behulp van Langendorff-geperfuseerde harten, die meestal metingen omvatten met behulp van elektrogrammen, pacing of epicardiale multi-elektrode arrays^17,18,19,20. Hoewel deze techniek specifieker is voor de hartfunctie, omdat het gaat om het verwijderen van het hart uit het lichaam, kunnen de metingen nog steeds worden beïnvloed door mechanisch-elektrische autoregulatoriemechanismen die intrinsieke hartslagmetingen kunnen beïnvloeden²¹. De geïsoleerde hartopnamen kunnen ook nog steeds worden beïnvloed door autonome regulatie via de ICNS^5,6,22,23. Bovendien kan het handhaven van een fysiologisch relevante temperatuur van het hart, die van cruciaal belang is voor hartfunctiemetingen, moeilijk zijn in geïsoleerde hartbenaderingen²⁰. Een meer directe methode om de SAN-functie te bestuderen, is om SAN-weefsel specifiek te isoleren en de activiteit ervan te meten. Dit kan worden bereikt door SAN-strips (geïsoleerd SAN-weefsel) of geïsoleerde SAN-pacemakercellen^24,25. Beide vereisen een hoge mate van technische training, omdat het SAN een zeer klein en sterk gedefinieerd gebied is, en celisolatie vormt een nog grotere uitdaging omdat dissociatie de algehele gezondheid van de cel kan schaden als het niet correct wordt uitgevoerd. Bovendien vereisen deze technieken deskundige elektrofysiologische vaardigheden om met succes van het weefsel of de cellen te registreren met behulp van individuele registrerende micro-elektroden.

In dit protocol beschrijven we een techniek om het SAN in vitro vast te leggen met behulp van een micro-elektrode array (MEA) om intrinsieke hartslagmetingen te verkrijgen. Deze aanpak heeft het voordeel dat zeer specifieke elektrofysiologische opnames toegankelijk zijn voor onderzoekers zonder intensieve elektrofysiologische vaardigheden. MEA’s zijn eerder gebruikt om de cardiomyocytenfunctie in primaire cardiomyocytenculturen^{26,27,28,29,30,31,32,}cardiale vellen^{33,34,35,36,37,38,39}en weefsel hele mounts⁴⁰te^{bestuderen, 41,42,43,44,45,46,47}. Eerder werk is ook gedaan om veldpotentiaal in SAN-weefsel^41,42te onderzoeken. Hier bieden we een methodologie om de MEA te gebruiken om murine intrinsieke SAN-vuursnelheden vast te leggen en te analyseren. We beschrijven ook hoe deze techniek kan worden gebruikt om farmacologische effecten van geneesmiddelen op san intrinsieke vuursnelheden te testen door een monsterexperiment te leveren dat de effecten van 4-aminopyridine (4-AP), een voltage-gated K⁺ kanaalblokker, laat zien. Met behulp van gedefinieerde anatomische oriëntatiepunten kunnen we het SAN nauwkeurig registreren zonder de uitgebreide weefseldissecties of celisolaties uit te voeren die bij andere methoden vereist zijn. Hoewel de MEA onbetaalbaar kan zijn, bieden de opnames zeer specifieke en betrouwbare metingen van pacemaking die kunnen worden gebruikt in een breed scala aan klinische en fysiologische onderzoekstoepassingen.

Protocol

Alle experimentele procedures die hier worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH), zoals goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Southern Methodist University.

1. Coating van de multi-elektrode array (MEA) voor opname

1. Maak 25 mM boraatbuffer.
   1. Los 0,953 g Na₂B₄O₇·10 H₂O op in 80 ml gedestilleerd water.
   2. Stel de pH met HCl in op 8,4 en voeg vervolgens gedestilleerd water toe aan een eindvolume van 100 ml.
2. Maak een 0,1% stockoplossing van polyethyleenimine (PEI).
   1. Voeg 100 μL van 50% (w/v) PEI toe aan 4,9 ml gedestilleerd water om een 1% PEI-oplossing te maken.
   2. Verdun de 1% PEI-oplossing tot 0,1% in boraatbuffer door 1 ml van de 1% PEI-oplossing toe te voegen aan 9 ml van de boraatbuffer van 25 mM.
3. Pipetteer ~ 1 ml van de 0,1% PEI-oplossing in de micro-elektrode-array (MEA) schotel, zodat de elektroden volledig bedekt zijn(figuur 1A en 1B).
   OPMERKING: De micro-elektroden van de MEA zijn meestal samengesteld uit platinazwart of koolstofnanobuisje en geïsoleerd met polyimide (of acryl); beide materialen zijn hydrofoob. Door de MEA te coaten met een kationisch polymeer zoals PEI, wordt het hydrofobe MEA-oppervlak hydrofiel gemaakt, waardoor weefselmonsters beter contact kunnen maken met het MEA-oppervlak(figuur 1A1).
4. Dek de MEA-schaal af met thermoplastische film om verdamping te verminderen en laat de MEA een nacht op kamertemperatuur staan(figuur 1C).
5. Aspirateer de PEI-oplossing uit de MEA-schotel met behulp van een pipet, zorg ervoor dat u het elektroderooster niet aanraakt dat de elektroden kan beschadigen en spoel vervolgens ≥4 keer met gedestilleerd water(figuur 1D).
6. Bewaar de MET PEI gecoate MEA onder 1-2 ml ultrapuur water en verzegeld met thermoplastische film bij 4 °C totdat het nodig is. U kunt de gecoate MEA ook bewaren door deze onder te dompelen in een bekerglas gevuld met ultrapuur water(figuur 1E).
   OPMERKING: Het PEI-coatingproces hoeft slechts één keer te worden uitgevoerd voor de MEA voordat deze voor het eerst wordt gebruikt, en na elke opnamesessie moet de MEA worden ondergedompeld in ultrapuur water.

2. Volledige Tyrode-oplossing bereiden voor weefseldissectie

1. Maak 1.000 ml complete Tyrode’s oplossing voor dissectie; voeg eerst 8,1816 g NaCl toe aan 800 ml ultrapruim water.
2. Voeg de volgende hoeveelheid chemicaliën toe aan de oplossing: 0,4025 g KCl; 0,1633 g KH₂PO₄; 1.1915 g HEPES; 0,9999 g glucose; 0,0952 g MgCl₂; 0,2646 g CaCl₂·2H₂O.
3. Stel de pH in op 7,4 met NaOH en voeg vervolgens ultrapuur water toe tot het totale volume 1.000 ml is.
   OPMERKING: De uiteindelijke samenstelling van de oplossing van Complete Tyrode is de volgende (in mM): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 KH₂PO_4,5 HEPES, 5,55 glucose, 1 MgCl_2,1,8 CaCl₂.

3. Het bereiden van zuurstofrijke Tyrode’s oplossing voor opname

1. Maak 500 ml van tyrode’s oplossing; voeg 4,003 g NaCl toe aan 400 ml ultrapruimend water.
2. Voeg de volgende hoeveelheden chemicaliën toe aan de oplossing: 0,651 g NaHCO₃; 0,042 g NaH₂PO₄; 0,132 g CaCl₂·2H₂O; 0,149 g KCl; 0,0476 g MgCl₂; 0,999 g glucose.
3. Stel de pH met HCl in op 7,4 en voeg vervolgens ultrapuur water toe tot het totale volume 500 ml is.
4. Oxygeneer de oplossing met carbogen gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur voordat de opname wordt gestart.
   OPMERKING: De uiteindelijke samenstelling van de Oplossing van Tyrode is de volgende (in mM): 137 NaCl, 15,5 NaHCO₃, 0,7 NaH₂PO₄, 1,8 CaCl₂, 4 KCl, 1 MgCl₂, 11,1 glucose. Deze Tyrode-oplossing heeft een iets andere samenstelling dan de complete Tyrode-oplossing die wordt gebruikt voor dissectie.

4. Bereiding van 4-aminopyridine (4-AP) oplossing voor farmacologische modulatie

1. Maak een 1 mM werkende oplossing van 4-AP; voeg 18,82 mg 4-AP toe aan 200 ml van de Tyrode-oplossing uit stap 3.
2. Oxygeneer de 4-AP-oplossing gedurende ten minste 30 minuten vóór het experiment.

5. De petrischaal klaarmaken voor dissectie

1. Meng siliconenelastomeercomponenten in een 10:1-verhouding (per gewicht) van de basis tot het uithardingsmiddel.
2. Giet ~ 15 ml siliconenelastomeermengsel in een petrischaal met een diameter van 60 mm.
3. Laat elastomeer voor gebruik 48 uur uitharden bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: De gesiliconiseerde petrischaal kan worden hergebruikt voor toekomstige dissecties.

6. Het ontleden van de sinoatriale knoop (SAN)

1. Bereid de oplossing van heparinized Complete Tyrode voor SAN-dissectie voor.
   1. Voeg 400 μL heparine (1.000 USP/ml) toe aan 40 ml oplossing van Complete Tyrode en verwarm in een waterbad van 37 °C.
2. Injecteer de muis intraperitoneaal met 200-300 μL heparine (1000 USP/ml) en laat het dier 10 minuten zitten.
3. Euthanaseer de heparinized muis door een overdosis isofluraan.
   1. Plaats de muis in een kleine glazen kamer die isofluraandampen bevat die worden gegenereerd door 200-300 μL vloeibaar isofluraan toe te voegen aan een filterpapier in een geperforeerde plastic buis.
      OPMERKING: Omdat isofluraan huidirritatie kan veroorzaken en ook door de huid kan worden opgenomen, mag de vloeistof niet rechtstreeks in contact komen met de muis. Daarom wordt het met isofluraan doordrenkte doekje voor toediening in een geperforeerde buis geplaatst.
   2. Controleer de dood door het staken van beweging en ademhalingsinspanning en door de afwezigheid van een teenknijperreflex. De dood duurt meestal ongeveer 1-2 minuten na plaatsing in de kamer.
      OPMERKING: De dood gaat meestal gepaard met urineren.
4. Plaats de muis in rugligging op een dissectieplank met uitgestrekte poten en bevestig de poten aan het bord met behulp van 1 inch lange, 23-gauge spuitnaalden. Verwijder vervolgens de vacht in de buurt van de onderkant van de ribbenkast met behulp van een chirurgische schaar en knip de vacht bij de wortels.
   OPMERKING: Voor een dissectieplaat kunnen polystyreen koeldeksels worden gebruikt.
5. Gebruik tijdens het vasthouden van de huid met een hemostaat een chirurgische schaar om een dwarse incisie in de huid te maken net onder de onderkant van de ribbenkast van ongeveer de linker ribbenboog naar de rechter ribbenboog(figuur 3A).
6. Knip het peritoneum open met een chirurgische schaar en scheid de lever zorgvuldig van het diafragma, waarbij u voorzichtig bent om de lever niet te snijden, wat overmatig bloeden zal veroorzaken(figuur 3B). Insnijden van het diafragma langs de thorax om de thoracale holte bloot te leggen (Figuur 3C-D).
7. Knip met behulp van een chirurgische schaar de zijwanden van de ribbenkast van de randen van de ribbenbogen tot aan de sleutelbeenderen om het hart bloot te leggen, waarbij u voorzichtig bent om te voorkomen dat het hart wordt beschadigd(Figuur 3D). Gebruik vervolgens een 23-gauge spuitnaald om de ribbenkast over de schouder vast te pinnen, op zijn plaats en uit de weg van het operatieveld te houden.
8. Gebruik een transferpipet om de oplossing van Heparinized Complete Tyrode warm (37 °C) op het hart te druppelen om het vochtig te houden.
   OPMERKING: Laat het hart niet uitdrogen.
9. Verwijder de longen door ze vast te houden met een extra fijne Graefe-tang en de luchtpijp te snijden met een chirurgische schaar(figuur 3E).
10. Houd de apex van het hart vast met een extra fijne Graefe tang en verwijder deze door de aorta en venae cavae met een chirurgische schaar te knippen. Breng het hart over naar een petrischaal met uitgehard siliconenelastomeer(figuur 4A)en gebruik een transferpipet om het hart te baden met 2-3 ml warme (37 °C) gehepariniseerde complete tyrode-oplossing.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de delicate achterwand van de rechter atria, die de SAN bevat, en de aangesloten rechter atriumaders niet beschadigt. Het baden van het hart met de oplossing van Complete Tyrode voorkomt dat het hart uitdroogt, maar dompel het hart niet volledig onder in oplossing, omdat dit het zicht tijdens dissectie zal belemmeren.
11. Oriënteer het hart met het rechteratrium van de experimentator rechts en het linkeratrium links van de experimentator.
    OPMERKING: Dissectie van het SAN-weefsel moet snel worden uitgevoerd om ischemie-gerelateerd letsel te voorkomen.
12. Bevestig de top van het hart aan de schaal met een dissectiepen. Breng vervolgens, terwijl u de inferieure vena cava met Dumont #2 laminectomie tang vasthoudt, een 22 G spuitnaald door de inferieure en superieure vena cava om hun positie in het rechteratrium te lokaliseren, die ook de geschatte positie van de SAN identificeert (gelegen in het weefsel tussen de inferieure en superieure vena cava (figuur 4B).
13. Pin met behulp van kleine dissectiespelden de linker en rechter atriumaanhangsels op de schaal.
    1. Terwijl u het linker atriumaanhangsel met Dumont #2 laminectomie tang vasthoudt, plaatst u een dissectiepen door het linker atriumaanhangsel om het op zijn plaats te houden.
    2. Terwijl u het rechter atriumaanhangsel met Dumont #55 tang vasthoudt, plaatst u een dissectiespeld door het rechter atriumaanhangsel om het op zijn plaats te houden.
       OPMERKING: Hetzelfde type tang kan worden gebruikt om de linker en rechter atrium aanhangsels vast te houden indien gewenst.
14. Verwijder de naald van de spuit die de venae cavae overspant.
15. Om bloed uit het hart vrij te maken, gebruikt u een Castroviejo-schaar om de top van het hart (d.w.z. de onderste helft) te verwijderen door een dwarse incisie over de ventrikels te maken(figuur 4C). Was vervolgens het hart door warme (37 °C) gehepariniseerde Complete Tyrode’s oplossing toe te voegen met een transferpipet.
16. Gebruik de Castroviejo-schaar om langs het atrioventriculaire septum te knippen en houd de incisie dichter bij de ventrikel dan de atria. Blijf snijden langs het atrioventriculaire septum totdat de boezems zijn gescheiden van de ventrikels.
17. Snijd langs het interatriumtussenschot om het linkeratrium te verwijderen.
18. Plaats dissectiepennen in de periferie van het rechter atrium om het plat te laten liggen(figuur 4D). Verwijder eventueel achtergebleven vet, vaten of weefsel uit het atrium met de Castroviejo schaar.
19. Lokaliseer de SAN in het rechteratrium, dat in deze oriëntatie ongeveer wordt begrensd door de superieure vena cava (aan de bovenkant), inferieure vena cava (aan de onderkant) en cristae terminalis (aan de linkerkant)(Figuur 4D).
    OPMERKING: De crista terminalis verschijnt als een donkere gespierde richel tussen het rechter atriumaanhangsel en de SAN. Vaak is de SAN-slagader ook te zien via de SAN(Figuur 4D).

7. Het MEA-systeem voorbereiden voor opname

1. Voeg de oplossing van Tyrode (vanaf stap 3) toe aan de fles met de ingangsoplossing (figuur 5C) en zuurstof geef deze zuurstof door de stroom carbogengas (figuur 5A) aan het systeem aan te zetten.
   OPMERKING: De voor de opname gebruikte oplossing van Tyrode verschilt enigszins van samenstelling van de oplossing van Complete Tyrode die voor de dissectie wordt gebruikt.
2. Controleer de stroom van carbogen door bellen in de erlenmeyer te observeren, die wordt gebruikt om het gas te bevochtigen (figuur 5B) en de fles met invoeroplossing (figuur 5C).
3. Plaats de peristaltische pompinstroomslang (figuur 5D) in de opnameoplossing van Tyrode(figuur 5C). Steek vervolgens de uitstroombuis van de peristaltische pomp in de opvangfles(figuur 5I).
4. Stel de peristaltische pomp in op 25 tpm, wat een debiet van 2 ml / min geeft en start de pomp. Controleer het systeem op bufferlekkage of overloop.
5. Stel de temperatuurregelaar in op 37 °C, de fysiologische temperatuur van muizen(Figuur 5E).

8. Het hartweefsel op het MEA-rooster plaatsen

1. Breng het ontleedde SAN-weefsel met behulp van een verfkwast (figuur 6A) van de ontleed petrischaal over op het MEA-raster (figuur 1A1).
   1. Terwijl u onder een omgekeerde microscoop kijkt, plaatst u het weefsel voorzichtig met een zachte verfkwast zodat het SAN-gebied het elektroderaster bedekt.
   2. Plaats het weefsel indien nodig opnieuw om ervoor te zorgen dat het plat op het elektroderooster ligt en goed contact maakt met de elektroden.
      OPMERKING: Een zachte verfkwast is vereist voor het verplaatsen van het weefsel om beschadiging van het elektroderooster te voorkomen.
2. Zodra het weefsel correct is geplaatst, gebruikt u een botslot (of een gebogen tang) om het gaas over het weefsel te plaatsen(figuur 6A). Gebruik vervolgens de bothamer om het harpanker (Figuur 6A) op het gaas te plaatsen om alles op zijn plaats te houden (Figuur 6B).
3. Maak een foto van de positionering van het weefsel op de MEA, zodat de activiteit van individuele elektroden kan worden gecorreleerd met hun anatomische locatie tijdens de opname. Dit kan door een smartphone tegen het omgekeerde microscoopobject objectief te houden of door gebruik te maken van een bijgevoegde microscoopcamera.
   OPMERKING: Als de oriëntatie van de MEA niet wordt gewijzigd na het maken van de foto, verschijnt de elektrode linksboven als het eerste kanaal (Ch1) tijdens de opname.
4. Plaats de MEA-schaal op de verbindingsplaat (figuur 5F en 6C) en plaats de perfusiedop (figuur 6C) voorzichtig op de MEA-schaal zonder het anker van de harpschijf te verstoren. De perfusiedop kan verder worden vastgezet met behulp van een stuk laboratoriumtape(figuur 6C).
   OPMERKING: Naast instelbare in- en uitstroomleidingen heeft de dop ook een poort voor de levering van gas(figuur 6C). Bovendien loopt de referentie-elektrodering door de dop(figuur 6C).
5. Laat het weefsel herstellen van de behandeling en acclimatiseren aan de kamer gedurende 15-20 minuten voorafgaand aan de opname.

9. Het instellen van het data-acquisitieprotocol voor opname

OPMERKING: De volgende stappen beschrijven het openen van het softwareprotocol voor spontane beat-opname en het definiëren van de opnameomstandigheden. De details van deze stappen kunnen variëren afhankelijk van de specifieke software die wordt gebruikt, maar het algemene overzicht moet hetzelfde blijven.

1. Schakel de versterker in(Figuur 5G)en stel een workflow in voor de opname in de software op de computer(Figuur 5H).
   1. Open de software en klik op de Workflow.
   2. Selecteer Nieuwe map openen.
   3. Open de map Van sjablonen.
   4. Selecteer 64MD1-1920X1080 (afhankelijk van de resolutie van uw bureaublad).
   5. Open de QT-map.
   6. Open de map Spontane opname.
   7. Selecteer Beat_recording.moflo template en open deze (Figuur 7A).
2. Stel de opnameparameters in om het aantal sporen, traceerduur, spoorinterval, ingangsspanning, bemonsteringsfrequentie, enz. op te geven, afhankelijk van de gewenste opnameomstandigheden(figuur 7B).
   OPMERKING: Gebruik voor beatfrequentie- en interspike-gegevensacquisitie meestal een ingangsbereikspanning van 2,9 mV, een 1-Hz hoogdoorlaatfilter, een 1000-Hz laagdoorlaatfilter en een bemonsteringsfrequentie van 20 kHz.
3. Om verschillende fasen of omstandigheden van het experiment te markeren, zoals voor en na toediening van het geneesmiddel, klikt u op het tabblad Annotaties om de gewenste notaties toe te voegen(Figuur 7C).
4. Als u de bestandsbestemming voor de te verzamelen gegevens wilt opgeven, schakelt u het vak Opslag inschakelen in en voert u de gewenste bestandsnaam in het vak Bestandsnaam wijzigen in.

10. Het uitvoeren van de registratie en het verzamelen van gegevens

1. Klik op de knop Opnemen en afspelen in de bovenste menubalk van de acquisitiesoftware om de opname te starten. Verkrijg gegevens voor 10 sporen van 1 min duur met intervallen van 2 minuten tussen sporen.
2. Controleer aan de hand van deze eerste sporen of de opgenomen golfvormen consistent zijn met een gezond en hoogwaardig weefselpreparaat door te bevestigen dat de meerderheid van de opnamekanalen signaalamplitudes van ≥ 0,5 mV en identieke interpiene intervallen vertoont(figuur 8).
   OPMERKING: Een eerste beoordeling van de activiteit en golfvormen van de afzonderlijke micro-elektroden die overeenkomen met hun anatomische locaties kan worden uitgevoerd door te verwijzen naar het beeld dat is verkregen na het plaatsen van het weefsel op de MEA.
3. Om de effecten van geneesmiddelen op het weefsel te meten, pauzeert u de opname na het verkrijgen van de eerste basislijngegevens door op de pauzeknop op de bovenste menubalk te klikken.
   OPMERKING: De geneesmiddelresponsfase van het experiment kan in de opname worden vermeld door op het tabblad Annotaties te klikken en de gewenste notatie toe te voegen zoals hierboven beschreven(Figuur 7C).
4. Pauzeer de pomp en schakel de instroomslang van de pomp over van de normale opnameoplossing naar de oplossing van Tyrode met het gewenste geneesmiddel naar keuze.
   OPMERKING: In het voorbeeldexperiment werd de oplossing van Tyrode gebruikt met 1 mM 4-aminopyridine (4-AP).
5. Start de pomp opnieuw op en maak de opname ongedaan om opnieuw te beginnen met het verzamelen van gegevens.
6. Zodra de met het geneesmiddel geïnfundeerde Tyrode-oplossing het weefsel heeft bereikt, registreert u 10 sporen op dezelfde manier als eerder is gedaan voor de baseline-opnames.
   OPMERKING: Het duurt enige tijd voor tijd om de sporen te stabiliseren terwijl het medicijn in de opnamekamer wordt toegediend. Het werkingsmechanisme van het medicijn kan ook van invloed zijn op de opnamestabiliteit. Voor geneesmiddelen met omkeerbare werkingsmechanismen moet ook een uitwasperiode worden geregistreerd om het herstel van de activiteit tot de uitgangswaarden te bevestigen, wat een indicator is van gezond weefsel.
7. Klik op Stoppen om de opnames af te ronden.
8. Maak een laatste foto van de positionering van het weefsel op de MEA onder de microscoop voor het geval het weefsel is verschoven na de eerste opname-installatieprocedure.

11. De installatie schoonmaken na de opname

1. Maak de MEA schoon.
   1. Verwijder na het voltooien van de opname voorzichtig de opnameoplossing uit de MEA-schotel met behulp van een micropipette van 1 ml.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u niet in contact komt met de MEA-elektroden die ze kunnen beschadigen.
   2. Verwijder het gaas en het harpanker met een beenhamer (of een gebogen tang). Gebruik vervolgens een verfkwast om het weefsel van het MEA-oppervlak los te maken, waarbij u altijd voorzichtig bent om de afzonderlijke micro-elektroden niet aan te raken.
   3. Spoel de MEA-schaal met ultrapijns met ultrapijns water ongeveer 3 tot 4 keer af met ultrapijns water.
   4. Bewaar de gereinigde MEA ondergedompeld in ultrapijn water bij 4 °C.
2. Spoel de systeembuizen door er gedurende ten minste 5 minuten ultrapruim water doorheen te laten lopen met behulp van de maximale snelheidsinstelling op de peristaltische pomp.
   OPMERKING: Om schimmelgroei te voorkomen, mag er na het reinigen geen water of bufferoplossing in de slang worden achtergelaten.

12. Analyse van de MEA-opnames om de SAN-beatfrequentie te meten

1. Open het opgeslagen geregistreerde gegevensbestand in de sjabloon “Beat_frequency_analysis” van de analysesoftware(Figuur 9).
2. Klik op de knop Afspelen en laat de volledige opname uitvoeren om de dataset te visualiseren en de juiste analyseparameters toe te wijzen.
   1. Selecteer het binning-venster voor de gewenste weergave-indeling van de gegevens, ongeacht of deze wordt weergegeven als een gemiddelde per tracering of een gemiddelde per tijd(Figuur 10A).
   2. Selecteer de kanalen die in de analyse moeten worden opgenomen en stel de gewenste amplitudemamaxima of amplitudeminimadrempelwaarden in voor geautomatiseerde golfvormpiekidentificatie(figuur 10B).
      OPMERKING: Een afzonderlijk kanaal, een combinatie van kanalen of alle 64 kanalen kunnen in deze stap worden geselecteerd voor analyse(Figuur 9). Als de geselecteerde drempelwaarden te dicht bij de maxima en minimawaarden van de golfvorm liggen, worden sommige golfvormpieken mogelijk niet geïdentificeerd door de analysesoftware.
   3. Stel de hoeveelheid pre-spike en post-spike tijd in die in de analyse moet worden opgenomen.
      OPMERKING: Instellingen van 50 ms pre-spike en 100 ms post-spike werken meestal goed(Figuur 10B).
3. Nadat u de analysevoorwaarden hebt ingesteld, klikt u nogmaals op de knop Afspelen om de gegevensset opnieuw uit te voeren en te bevestigen dat de analyseparameters geschikt zijn voor spike-extractie.
4. Identificeer voor analyse de drie meest stabiele opeenvolgende sporen die een stabiele slagsnelheid vertonen voor elk spoor over de meeste kanalen, zowel tijdens de basislijnperiode van het experiment als nog eens drie opeenvolgende stabiele sporen tijdens de blootstellingsperiode van het geneesmiddel(figuur 10A).
5. Specificeer de begin- en eindsporen voor analyse en voer de tijdsduur in van elk te analyseren spoor(figuur 9).
6. Voordat u de analyse start, schakelt u de selectievakjes in voor zowel Beat per minuut opslaan als Interspike-interval opslaan (Figuur 10B).
7. Voer de gewenste bestandsnaam in het vak Bestandsnaammodifier in (Afbeelding 10B). De geanalyseerde gegevens voor beatfrequentie en interspike-interval worden opgeslagen in de vorm van ASCII (tekst) formaat.
   OPMERKING: Om verschillende aandoeningen te analyseren (zoals baseline en geneesmiddelrespons), moet de analyse voor elke aandoening afzonderlijk worden uitgevoerd.
8. Klik op de knop Afspelen en opnemen op de bovenste tabbladbalk om de analyse te starten.
9. Als u de gegevens voor andere toepassingen wilt exporteren, schakelt u de selectievakjes beat per minuut opslaan en Interspike-interval opslaan (Figuur 10B) in. Voer de gewenste bestandsnaam in het vak Bestandsnaammodifier (Afbeelding 10B) in en klik op Opslaan om de geanalyseerde gegevens in ASCII-tekstindeling op te slaan in de geselecteerde map.

Representative Results

Discussion

Het oefenen en beheersen van het SAN-dissectieproces is noodzakelijk omdat het weefsel kwetsbaar is en gezond weefsel noodzakelijk is voor een succesvolle opname. Tijdens de SAN-dissectie is de juiste oriëntatie essentieel om het juiste weefselgebied te verkrijgen. De oorspronkelijke oriëntatie van het hart kan echter gemakkelijk verloren gaan tijdens het dissectieproces, wat dit streven bemoeilijkt. Daarom moeten de atria visueel worden geïnspecteerd om de juiste oriëntatie links-rechts te garanderen. Meestal is het rechteratrium transparanter, terwijl het linkeratrium meestal donkerder en roder van kleur^{is 25,48}. Bovendien is het essentieel om het SAN-weefsel niet uit te rekken terwijl u ermee werkt of het op het elektroderooster monteren, omdat het weefsel gemakkelijk mechanisch wordt beschadigd⁵¹. Een tip om gezond en goed ontleed SAN-weefsel te verifiëren, is om het in de oplossing van Complete Tyrode onder de microscoop te onderzoeken om te controleren of het weefsel klopt. Zodra de techniek onder de knie is, moet ten minste 90% van de weefselpreparaten goed zijn voor opname.

Verschillende overwegingen kunnen de kans op succesvolle opnames en daaropvolgende gegevensanalyses vergroten. Om de beste opnames te garanderen, moeten oplossingen zorgvuldig worden voorbereid en getest op oefenmuismonsters voorafgaand aan experimentele opnames. We hebben uitgebreid gewerkt aan het aanpassen en aanpassen van de opnameoplossing om de gezondheid van het SAN-weefsel te optimaliseren. Zorg er bovendien voor dat het gas dat voor de opname wordt gebruikt carbogen is (d.w.z. 95% O₂/ 5% CO₂). Eencellige opnames gebruiken vaak zuivere zuurstof vanwege de specifieke chemische samenstelling van de Tyrode-oplossing die voor die toepassing wordt gebruikt, maar de oplossing die wordt gebruikt voor registratie op de MEA vereist carbogen om een stabiele pH te behouden. Het gebruik van zuivere zuurstof met de Tyrode-oplossing voor de MEA-opnames zal schommelingen in de pH veroorzaken die kunnen leiden tot een snelle verslechtering van het weefsel. Het beoordelen van de amplitudemaxima in de kanalen zoals eerder beschreven, zal helpen bepalen of het weefsel van goede opnamekwaliteit is. Ten slotte, om de analyse na de opname te ondersteunen, is het zeer nuttig om een afbeelding te maken van het gemonteerde SAN-weefsel op de MEA-elektrode-array nadat de opname is voltooid. Het weefsel kan enigszins verschuiven tijdens de eerste opstelling van de MEA, en dit biedt de meest nauwkeurige beoordeling van de plaatsing van de elektrode voor analyse.

We stellen MEA-opnames voor als een grondige en nauwkeurige manier om de SAN-vuursnelheid te karakteriseren. Een voordeel van de MEA-techniek is dat het de experimentator in staat stelt om vuursnelheden vast te leggen die vergelijkbaar zijn met eencellige opnames zonder dat er uitgebreide elektrofysiologische expertise nodig is. De MEA-techniek heeft ook het voordeel dat het de potentiële verstorende invloeden van neurohumorale en mechano-elektrische mechanismen elimineert, die inherent zijn aan geïsoleerde hartopnamen en in vivo autonome blokkademetingen²¹. Ventriculaire contractie en ademhaling zijn de belangrijkste mechano-elektrische invloeden die SAN-vuren kunnen veranderen, maar ze worden geëlimineerd in ons weefselpreparaat ^52,53. Hoewel onze techniek de meeste autonome invloeden op het SAN elimineert, kan een beperkt aantal resterende ICNS-projecties in de juiste atria mogelijk van invloed zijn op SAN-afvuren, een theoretische beperking die in gedachten moet worden gehouden tijdens de interpretatie van resultaten^5,6,22,23. Een ander voordeel van de hier beschreven MEA-techniek is dat deze kan worden aangepast voor vele andere soorten hartonderzoek. Hoewel dit protocol bijvoorbeeld de effecten van 4-AP op SAN-activiteit aantoonde, zouden toekomstige studies kunnen kijken naar een bijna onbeperkt aantal farmacologische middelen, evenals de effecten van genmutaties op SAN-intrinsieke vuren. Ivabradine, een specifieke blokker van het SAN-specifieke Hcn4-kanaal, kan bijvoorbeeld worden gebruikt om grappige huidige bijdragen aan de vuursnelheid⁵⁴te bestuderen . Het MEA-systeem kan ook worden gebruikt om de hartfunctie in andere delen van het hart te meten, waardoor gedetailleerde, regiospecifieke karakterisering mogelijk is. Registratie van andere hartregio’s zou echter verschillende dissectiebenaderingen en de mogelijkheid van dunne weefselsectie vereisen voordat deze wordt opgenomen. Een potentieel belangrijke beperking van deze techniek zijn de hoge kosten van de aanschaf van een MEA-systeem, wat onbetaalbaar kan zijn. Er zijn verschillende MEA-systemen op de markt met vergelijkbare kenmerken en functionaliteit, maar de hoge kosten blijven hetzelfde. Zodra de initiële apparatuur en software is aangeschaft, zijn de kosten voor onderhoud en gebruik van het MEA-systeem echter vrij laag. Een andere beperking is dat het MEA-systeem alleen registratie mogelijk maakt van extracellulaire veldpotentiaalen die niet bevorderlijk zijn voor nauwkeurige vergelijkingen van actiepotentiaalkenmerken (bijv. amplitude en vorm) tussen preparaten zoals kan worden bereikt met intracellulaire opnamen met één cel. Samenvattend biedt dit protocol een efficiënte workflow om intrinsieke cardiale vuursnelheden in SAN-weefsel van muizen te meten en te analyseren met de mogelijkheid om de effecten van farmacologische interventie op de vuursnelheid op een zeer specifieke manier te bestuderen.

Materials

4-Aminopyridine	Sigma	A78403-25G
22 gauge syringe needle	Fisher Scientific	14-826-5A	Used for dissection
23 gauge syringe needle	Fisher Scientific	14-826-6C	Used for dissection
60mm Petri Dishes	Genesee Scientific	32-105G
500mL Pyrex Bottle	Fisher Scientific	06-414-1C	Used to store solutions
1000 mL Pyrex Bottle	Fisher Scientific	06-414-1D	Used to store solutions
Bone Forceps	Fine Science Tools	16060-11
Calcium chloride dihydrate (CaCl<sub>2</sub>&middot;2H<sub>2</sub>O)	Sigma-Aldrich	C5080-500G
Carbogen (95% O<sub>2</sub>, 5% CO<sub>2</sub>)
Castroviejo Scissors, 4"	Fine Science Tools	15024-10
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
Data Acquisition PC			CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080
Dissection Microscope	Jenco
Dissecting Pins	Fine Science Tools	26002-20
Dumont #2 Laminectomy Forceps	Fine Science Tools	11223-20
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
&nbsp;Extra Fine Graefe Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Glass Chamber	Grainger	49WF30	Used for mouse euthanization
Harp Anchor Kit	Warner Instruments	&nbsp;SHD-22CL/15 WI 64-0247
HCl	Fisher Chemicals	SA48-4	Used for pH balancing
Hemostat	Fine Science Tools	13013-14
Heparin	Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram	NDC 63739-953-25
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-250G
Inverted Microscope	Motic	AE2000
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Lab Tape	Fisher Scientific	15-950
Light for Dissection Microscope	Dolan-Jenner	MI150DG 660000391014
Magesium chloride (MgCl<sub>2</sub>)	Sigma-Aldrich	208337-100G
MED64 Head Amplifier	MED64	MED-A64HE1S
MED64 Main Amplifier	MED64	MED-A64MD1A
MED64 Perfusion Cap	MED64	MED-KCAP01
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit	MED64	MED-KPK02
MED64 ThermoConnector	MED64	MED-CP04
Mesh	&nbsp;Warner Instruments	640246
Microelectrode array (MEA)	Alpha Med Scientific	MED-R515A
Mobius Software	WitWerx Inc.		Specific software for the MED64
NaOH	Fisher Chemicals	S320-500	Used for pH balancing
Normal Saline	Ultigiene	NDC 50989-885-17
Paint Brush	Fisher Scientific	NC1751733
Parafilm	Genesee Scientific	PM-996
Peristaltic Pump	Gilson	F155009
Peristaltic Pump Tubing	Fisher Scientific	14-171-298	1/8'' Interior Diameter
Polyethyleneimine	Sigma	P3143
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Potassium phosphate monobasic (KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>)	Sigma-Aldrich	P5655-500G
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6297
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S671-3
Sylgruard Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S6566
Sodium tetraborate	Sigma	S9640
Surgical Scissors	Fine Science Tools	14074-09
Transfer Pipets (3mL graduated)	Samco Scientific	225