Dit protocol heeft tot doel een nieuwe methodologie te beschrijven om de intrinsieke cardiale vuursnelheid te meten met behulp van micro-elektrode array-registratie van het hele sinoatriale knoopweefsel om pacemaking-defecten bij muizen te identificeren. Farmacologische middelen kunnen ook in deze methode worden geïntroduceerd om hun effecten op intrinsieke pacemaking te bestuderen.
De sinoatriale knoop (SAN), gelegen in het rechter atrium, bevat de pacemakercellen van het hart en disfunctie van dit gebied kan tachycardie of bradycardie veroorzaken. Betrouwbare identificatie van cardiale pacemakingdefecten vereist de meting van intrinsieke hartslagen door grotendeels de invloed van het autonome zenuwstelsel te voorkomen, wat snelheidstekorten kan maskeren. Traditionele methoden om de intrinsieke pacemakerfunctie te analyseren, omvatten door geneesmiddelen geïnduceerde autonome blokkade om in vivo hartslagen te meten, geïsoleerde hartopnamen om intrinsieke hartslagen te meten en sinoatriale strip of eencellige patch-clamp-opnames van sinoatriale pacemakercellen om spontane actiepotentiaalvuursnelheden te meten. Deze meer traditionele technieken kunnen echter technisch uitdagend en moeilijk uit te voeren zijn. Hier presenteren we een nieuwe methodologie om de intrinsieke cardiale vuursnelheid te meten door micro-elektrode array (MEA) opnames uit te voeren van whole-mount sinoatriale knooppreparaten van muizen. MEAs zijn samengesteld uit meerdere micro-elektroden gerangschikt in een rasterachtig patroon voor het registreren van in vitro extracellulaire veldpotentiaalen. De hierin beschreven methode heeft het gecombineerde voordeel dat het relatief sneller, eenvoudiger en nauwkeuriger is dan eerdere benaderingen voor het registreren van intrinsieke hartslagen, terwijl het ook eenvoudige farmacologische ondervraging mogelijk maakt.
Het hart is een complex orgaan dat wordt bestuurd door zowel cardiale intrinsieke als extrinsieke invloeden zoals die afkomstig zijn uit de hersenen. De sinoatriale knoop (SAN) is een gedefinieerd gebied in het hart dat de pacemakercellen (ook wel sinoatriale cellen of SA-cellen genoemd) herbergt die verantwoordelijk zijn voor het initiëren en bestendigen van de hartslag van zoogdieren1,2. De intrinsieke hartslag is de snelheid die wordt aangedreven door de pacemakercellen zonder invloed van andere cardiale of neurohumorale invloeden, maar traditionele metingen van de hartslag bij mensen en levende dieren, zoals elektrocardiogrammen, weerspiegelen zowel de pacemaker als neurale invloeden op het hart. De meest opvallende neurale invloed op SA-cellen is afkomstig van het autonome zenuwstelsel, dat voortdurend vuurpatronen moduleert om aan de fysiologische vereisten van het lichaam te voldoen3. Ter ondersteuning van dit idee zijn zowel sympathische als parasympathische projecties te vinden in de buurt van de SAN4. Het intrinsieke hart-zenuwstelsel (ICNS) is een andere belangrijke neurale invloed waarbij ganglionated plexi, met name in de rechter boezems, de activiteit van de SAN innerveert en reguleert5,6.
Het begrijpen van tempomakende tekorten is klinisch belangrijk, omdat disfunctie ten grondslag kan liggen aan veel hartaandoeningen en kan bijdragen aan het risico op andere complicaties. Sick sinus syndrome (SSS) is een categorie ziekten die wordt gekenmerkt door disfunctie van de sinoatriale knoop die een goede pacemaking belemmert7,8. SSS kan zich presenteren met sinus bradycardie, sinuspauzes, sinusstilstand, sinoatriale uitgangsblok en afwisselend bradyarrythmieën en tachyaritmieën9 en kan leiden tot complicaties, waaronder een verhoogd risico op embolische beroerte en plotselinge dood8,10. Degenen met het Brugada-syndroom, een hartaandoening gekenmerkt door ventriculaire fibrillatie met een verhoogd risico op plotselinge hartdood, lopen een groter risico op aritmogene gebeurtenissen als ze ook comorbide SAN-disfunctie hebben11,12. Sinoatriale disfunctie kan ook fysiologische gevolgen hebben buiten het hart. Er is bijvoorbeeld waargenomen dat SSS epileptische aanvallen bij een patiënt veroorzaakt als gevolg van cerebrale hypoperfusie13.
Om sinoatriale tempotekorten te identificeren, moeten intrinsieke hartslagen worden bepaald door de activiteit van de SAN te meten zonder de invloed van het autonome zenuwstelsel of humorale factoren. Klinisch kan dit worden benaderd door farmacologische autonome blokkade14, maar dezelfde techniek kan ook worden toegepast in zoogdiermodellen om de intrinsieke hartfunctie te bestuderen15,16. Hoewel deze aanpak een groot deel van de bijdragende neurale invloeden blokkeert en in vivo cardiaal onderzoek mogelijk maakt, elimineert het niet alle extrinsieke invloeden op het hart volledig. Een andere onderzoekstechniek die wordt gebruikt om de intrinsieke hartfunctie in diermodellen te bestuderen, is geïsoleerde hartopnamen met behulp van Langendorff-geperfuseerde harten, die meestal metingen omvatten met behulp van elektrogrammen, pacing of epicardiale multi-elektrode arrays17,18,19,20. Hoewel deze techniek specifieker is voor de hartfunctie, omdat het gaat om het verwijderen van het hart uit het lichaam, kunnen de metingen nog steeds worden beïnvloed door mechanisch-elektrische autoregulatoriemechanismen die intrinsieke hartslagmetingen kunnen beïnvloeden21. De geïsoleerde hartopnamen kunnen ook nog steeds worden beïnvloed door autonome regulatie via de ICNS5,6,22,23. Bovendien kan het handhaven van een fysiologisch relevante temperatuur van het hart, die van cruciaal belang is voor hartfunctiemetingen, moeilijk zijn in geïsoleerde hartbenaderingen20. Een meer directe methode om de SAN-functie te bestuderen, is om SAN-weefsel specifiek te isoleren en de activiteit ervan te meten. Dit kan worden bereikt door SAN-strips (geïsoleerd SAN-weefsel) of geïsoleerde SAN-pacemakercellen24,25. Beide vereisen een hoge mate van technische training, omdat het SAN een zeer klein en sterk gedefinieerd gebied is, en celisolatie vormt een nog grotere uitdaging omdat dissociatie de algehele gezondheid van de cel kan schaden als het niet correct wordt uitgevoerd. Bovendien vereisen deze technieken deskundige elektrofysiologische vaardigheden om met succes van het weefsel of de cellen te registreren met behulp van individuele registrerende micro-elektroden.
In dit protocol beschrijven we een techniek om het SAN in vitro vast te leggen met behulp van een micro-elektrode array (MEA) om intrinsieke hartslagmetingen te verkrijgen. Deze aanpak heeft het voordeel dat zeer specifieke elektrofysiologische opnames toegankelijk zijn voor onderzoekers zonder intensieve elektrofysiologische vaardigheden. MEA’s zijn eerder gebruikt om de cardiomyocytenfunctie in primaire cardiomyocytenculturen26,27,28,29,30,31,32,cardiale vellen33,34,35,36,37,38,39en weefsel hele mounts40tebestuderen, 41,42,43,44,45,46,47. Eerder werk is ook gedaan om veldpotentiaal in SAN-weefsel41,42te onderzoeken. Hier bieden we een methodologie om de MEA te gebruiken om murine intrinsieke SAN-vuursnelheden vast te leggen en te analyseren. We beschrijven ook hoe deze techniek kan worden gebruikt om farmacologische effecten van geneesmiddelen op san intrinsieke vuursnelheden te testen door een monsterexperiment te leveren dat de effecten van 4-aminopyridine (4-AP), een voltage-gated K+ kanaalblokker, laat zien. Met behulp van gedefinieerde anatomische oriëntatiepunten kunnen we het SAN nauwkeurig registreren zonder de uitgebreide weefseldissecties of celisolaties uit te voeren die bij andere methoden vereist zijn. Hoewel de MEA onbetaalbaar kan zijn, bieden de opnames zeer specifieke en betrouwbare metingen van pacemaking die kunnen worden gebruikt in een breed scala aan klinische en fysiologische onderzoekstoepassingen.
Alle experimentele procedures die hier worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH), zoals goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Southern Methodist University.
1. Coating van de multi-elektrode array (MEA) voor opname
2. Volledige Tyrode-oplossing bereiden voor weefseldissectie
3. Het bereiden van zuurstofrijke Tyrode’s oplossing voor opname
4. Bereiding van 4-aminopyridine (4-AP) oplossing voor farmacologische modulatie
5. De petrischaal klaarmaken voor dissectie
6. Het ontleden van de sinoatriale knoop (SAN)
7. Het MEA-systeem voorbereiden voor opname
8. Het hartweefsel op het MEA-rooster plaatsen
9. Het instellen van het data-acquisitieprotocol voor opname
OPMERKING: De volgende stappen beschrijven het openen van het softwareprotocol voor spontane beat-opname en het definiëren van de opnameomstandigheden. De details van deze stappen kunnen variëren afhankelijk van de specifieke software die wordt gebruikt, maar het algemene overzicht moet hetzelfde blijven.
10. Het uitvoeren van de registratie en het verzamelen van gegevens
11. De installatie schoonmaken na de opname
12. Analyse van de MEA-opnames om de SAN-beatfrequentie te meten
Het oefenen en beheersen van het SAN-dissectieproces is noodzakelijk omdat het weefsel kwetsbaar is en gezond weefsel noodzakelijk is voor een succesvolle opname. Tijdens de SAN-dissectie is de juiste oriëntatie essentieel om het juiste weefselgebied te verkrijgen. De oorspronkelijke oriëntatie van het hart kan echter gemakkelijk verloren gaan tijdens het dissectieproces, wat dit streven bemoeilijkt. Daarom moeten de atria visueel worden geïnspecteerd om de juiste oriëntatie links-rechts te garanderen. Meestal is het rechteratrium transparanter, terwijl het linkeratrium meestal donkerder en roder van kleuris 25,48. Bovendien is het essentieel om het SAN-weefsel niet uit te rekken terwijl u ermee werkt of het op het elektroderooster monteren, omdat het weefsel gemakkelijk mechanisch wordt beschadigd51. Een tip om gezond en goed ontleed SAN-weefsel te verifiëren, is om het in de oplossing van Complete Tyrode onder de microscoop te onderzoeken om te controleren of het weefsel klopt. Zodra de techniek onder de knie is, moet ten minste 90% van de weefselpreparaten goed zijn voor opname.
Verschillende overwegingen kunnen de kans op succesvolle opnames en daaropvolgende gegevensanalyses vergroten. Om de beste opnames te garanderen, moeten oplossingen zorgvuldig worden voorbereid en getest op oefenmuismonsters voorafgaand aan experimentele opnames. We hebben uitgebreid gewerkt aan het aanpassen en aanpassen van de opnameoplossing om de gezondheid van het SAN-weefsel te optimaliseren. Zorg er bovendien voor dat het gas dat voor de opname wordt gebruikt carbogen is (d.w.z. 95% O2/ 5% CO2). Eencellige opnames gebruiken vaak zuivere zuurstof vanwege de specifieke chemische samenstelling van de Tyrode-oplossing die voor die toepassing wordt gebruikt, maar de oplossing die wordt gebruikt voor registratie op de MEA vereist carbogen om een stabiele pH te behouden. Het gebruik van zuivere zuurstof met de Tyrode-oplossing voor de MEA-opnames zal schommelingen in de pH veroorzaken die kunnen leiden tot een snelle verslechtering van het weefsel. Het beoordelen van de amplitudemaxima in de kanalen zoals eerder beschreven, zal helpen bepalen of het weefsel van goede opnamekwaliteit is. Ten slotte, om de analyse na de opname te ondersteunen, is het zeer nuttig om een afbeelding te maken van het gemonteerde SAN-weefsel op de MEA-elektrode-array nadat de opname is voltooid. Het weefsel kan enigszins verschuiven tijdens de eerste opstelling van de MEA, en dit biedt de meest nauwkeurige beoordeling van de plaatsing van de elektrode voor analyse.
We stellen MEA-opnames voor als een grondige en nauwkeurige manier om de SAN-vuursnelheid te karakteriseren. Een voordeel van de MEA-techniek is dat het de experimentator in staat stelt om vuursnelheden vast te leggen die vergelijkbaar zijn met eencellige opnames zonder dat er uitgebreide elektrofysiologische expertise nodig is. De MEA-techniek heeft ook het voordeel dat het de potentiële verstorende invloeden van neurohumorale en mechano-elektrische mechanismen elimineert, die inherent zijn aan geïsoleerde hartopnamen en in vivo autonome blokkademetingen21. Ventriculaire contractie en ademhaling zijn de belangrijkste mechano-elektrische invloeden die SAN-vuren kunnen veranderen, maar ze worden geëlimineerd in ons weefselpreparaat 52,53. Hoewel onze techniek de meeste autonome invloeden op het SAN elimineert, kan een beperkt aantal resterende ICNS-projecties in de juiste atria mogelijk van invloed zijn op SAN-afvuren, een theoretische beperking die in gedachten moet worden gehouden tijdens de interpretatie van resultaten5,6,22,23. Een ander voordeel van de hier beschreven MEA-techniek is dat deze kan worden aangepast voor vele andere soorten hartonderzoek. Hoewel dit protocol bijvoorbeeld de effecten van 4-AP op SAN-activiteit aantoonde, zouden toekomstige studies kunnen kijken naar een bijna onbeperkt aantal farmacologische middelen, evenals de effecten van genmutaties op SAN-intrinsieke vuren. Ivabradine, een specifieke blokker van het SAN-specifieke Hcn4-kanaal, kan bijvoorbeeld worden gebruikt om grappige huidige bijdragen aan de vuursnelheid54te bestuderen . Het MEA-systeem kan ook worden gebruikt om de hartfunctie in andere delen van het hart te meten, waardoor gedetailleerde, regiospecifieke karakterisering mogelijk is. Registratie van andere hartregio’s zou echter verschillende dissectiebenaderingen en de mogelijkheid van dunne weefselsectie vereisen voordat deze wordt opgenomen. Een potentieel belangrijke beperking van deze techniek zijn de hoge kosten van de aanschaf van een MEA-systeem, wat onbetaalbaar kan zijn. Er zijn verschillende MEA-systemen op de markt met vergelijkbare kenmerken en functionaliteit, maar de hoge kosten blijven hetzelfde. Zodra de initiële apparatuur en software is aangeschaft, zijn de kosten voor onderhoud en gebruik van het MEA-systeem echter vrij laag. Een andere beperking is dat het MEA-systeem alleen registratie mogelijk maakt van extracellulaire veldpotentiaalen die niet bevorderlijk zijn voor nauwkeurige vergelijkingen van actiepotentiaalkenmerken (bijv. amplitude en vorm) tussen preparaten zoals kan worden bereikt met intracellulaire opnamen met één cel. Samenvattend biedt dit protocol een efficiënte workflow om intrinsieke cardiale vuursnelheden in SAN-weefsel van muizen te meten en te analyseren met de mogelijkheid om de effecten van farmacologische interventie op de vuursnelheid op een zeer specifieke manier te bestuderen.
The authors have nothing to disclose.
4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
Carbogen (95% O<sub>2</sub>, 5% CO<sub>2</sub>) | |||
Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
Dissection Microscope | Jenco | ||
Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
Magesium chloride (MgCl<sub>2</sub>) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
Potassium phosphate monobasic (KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |