이 프로토콜은 마우스의 페이스메이킹 결함을 식별하기 위해 전체 시노어심 노드 조직의 미세 전극 어레이 기록을 사용하여 본질적인 심장 발사 속도를 측정하는 새로운 방법론을 설명하는 것을 목표로합니다. 약리학 에이전트는 또한 본질적인 페이스 메이킹에 그들의 효력을 공부하기 위하여 이 방법에 소개될 수 있습니다.
오른쪽 심방 노드 (SAN)는 심장의 심박 동기 세포를 포함하고 있으며이 지역의 기능 장애는 빈맥이나 서맥을 유발할 수 있습니다. 심장 페이스 메이킹 결함의 신뢰할 수 있는 식별은 속도 적자를 마스크 할 수있는 자율 신경계의 영향을 크게 방지하여 본질적인 심박수의 측정을 필요로한다. 본질적인 심장 맥박조정기 기능을 분석하는 전통적인 방법은 생체 내 심박수에서 측정하기 위하여 약물 유도한 자율 봉쇄, 본질적인 심박수를 측정하기 위하여 고립된 심혼 기록, 및 sinoatrial 심박동기 세포의 sinoatrial 스트립 또는 단세포 패치 클램프 기록을 포함합니다 자발적인 행동 잠재적인 발사 비율을 측정하기 위하여. 그러나 이러한 보다 전통적인 기술은 기술적으로 어렵고 수행하기 어려울 수 있습니다. 여기에서, 우리는 마우스에서 전체 마운트 시노어 노드 제제의 마이크로 전극 어레이 (MEA) 기록을 수행하여 본질적인 심장 발사 속도를 측정하는 새로운 방법론을 제시합니다. MEA는 체외 외 세포 필드 잠재력을 기록하기 위해 그리드와 같은 패턴으로 배열된 여러 미세 전극으로 구성됩니다. 본 원에 기재된 방법은 본질적인 심박수를 기록하기 위한 이전 접근법보다 상대적으로 빠르고 간단하며 더 정밀해지는 동시에 간편한 약리학적 심문을 가능하게 하는 결합된 이점이 있다.
심장은 뇌에서 유래하는 것과 같은 심장 본질적인 및 외신 영향 모두에 의해 지배되는 복잡한 기관입니다. 시노아심 노드(SAN)는 포유류 심장 박동1,2의개시 및 영속에 대한 심장 박동세포(sinoatrial 세포, 또는 SA 세포라고도 함)를 수용하는 심장의 정의된 영역이다. 본질적인 심박수는 그밖 심장 또는 신경 유머 영향에 의해 영향 없이 심박동기 세포에 의해 구동되는 비율입니다, 그러나 심전도와 같은 인간과 살아있는 동물에 있는 심박수의 전통적인 측정은, 심장에 있는 심박동기 및 신경 영향 둘 다 반영합니다. SA 세포에 가장 주목할 만한 신경 영향은 신체의 생리적 요구 사항을 충족하기 위해 발사 패턴을 지속적으로 조절하는 자율 신경계에서3입니다. 이 아이디어를 지원, 모두 동정과 부교감 투영 SAN4근처에서 찾을 수 있습니다. 본질적인 심장 신경계(ICNS)는 특히 오른쪽 아리아에서 신경절플시가 SAN5,6의활동을 조절하는 또 다른 중요한 신경 영향이다.
기능 장애는 많은 심장 장애를 기초할 수 있고, 그밖 합병증의 리스크에 기여할 수 있기 때문에, 페이스 메이킹 적자를 이해하는 것은 임상적으로 중요합니다. 아픈 부비동 증후군 (SSS)은 적절한 페이스 메이킹7,8을방해하는 부상 절의 기능 장애를 특징으로하는 질병의 범주입니다. SSS는 부비동 서맥, 부비동 정지, 부비동 정지, 부비동 정지, 부비동 정지, 부도심 출구 블록, 번갈아 기다림 과 tachyarrhythmias9로 제시할 수 있고, 색전성 치기및 갑작스런 죽음의 증가한 리스크를 포함하여 합병증으로 이끌어 낼 수 있습니다8,10. 브루가다 증후군을 가진 사람들은, 급격한 심장 죽음의 증가한 리스크를 가진 심실 세동에 의해 표시된 심장 무질서, 또한 comorbid SAN 기능 장애11,12가있는 경우에 부정맥 사건에 대한 더 중대한리스크에있습니다. 시노온 임상 장애는 또한 심장 을 넘어 생리적인 결과가 있을 수 있습니다. 예를 들어, SSS는 대뇌저구혈(13)으로인해 환자에서 발작을 유발하는 것으로 관찰되었다.
시노어심 페이스 메이킹 적자를 식별하려면, 본질적인 심박수는 자율 신경계 또는 유머 요인의 영향 없이 SAN의 활동을 측정하여 결정되어야 합니다. 임상적으로, 이것은 약리학적 자율봉쇄(14)에의해 근사될 수 있다, 그러나 이 같은 기술은 또한 본질적인 심장 기능을 연구하기 위하여 포유류 모형에 적용될 수 있다(15,16). 이 접근법은 신경 영향 기여의 큰 부분을 차단하고 생체 내 심장 검사에서 허용하는 동안, 그것은 완전히 심장에 대한 모든 외외적 인 영향을 제거하지 않습니다. 동물 모델에서 본질적인 심장 기능을 연구하는 데 사용되는 또 다른 연구 기술은 일반적으로 전기그램, 속도 또는 상심 다중 전자 화물 배열17,18, 19,20을사용하여 측정을 포함하는 Langendorff-perfused 된 심혼을 사용하여 고립된 심장 기록이다. 이 기술은 신체에서 심장을 제거하는 것을 포함하기 때문에 심장 기능에 더 구체적이지만, 측정은 여전히 본질적인 심박수 측정21에영향을 미칠 수있는 메카노 전기 자동 조절 메커니즘에 의해 영향을받을 수 있습니다. 고립 된 심장 기록은 또한 여전히ICNS를통해 자율 조절에 의해 영향을받을 수있다5,6,22,23. 더욱이, 심장 기능 측정에 중요한 심장의 생리학적으로 관련된 온도를 유지하는 것은 고립된 심장 접근법20에서어려울 수 있다. SAN 기능을 연구하는 보다 직접적인 방법은 SAN 조직을 구체적으로 분리하고 활동을 측정하는 것입니다. 이는 SAN 스트립(절연 SAN 조직) 또는 고립된 SAN 맥박조정기세포(24,25)를 통해 달성될 수있다. SAN은 매우 작고 고도로 정의된 영역이므로 둘 다 높은 수준의 기술 적 교육이 필요하며, 세포 격리는 해리가 올바르게 수행되지 않으면 세포의 전반적인 상태를 손상시킬 수 있으므로 더 큰 도전을 제기합니다. 더욱이, 이러한 기술은 개별 기록 마이크로 전극을 사용하여 조직 또는 세포로부터 성공적으로 기록하기 위해 전문가 전기 생리학적 기술이 필요합니다.
이 프로토콜에서, 우리는 본질적인 심박수 측정을 얻기 위하여 마이크로 전극 배열 (MEA)를 사용하여 시험관 내SAN을 기록하는 기술을 기술합니다. 이 접근은 집중적인 전기 생리기술 세트가 결여된 연구원에 접근하기 위하여 높게 특정 한 전기 생리학 기록을 만드는 이점이 있습니다. MEA는 이전에 1 차 심근 세포배양26,27,28,29,30,31,32,심장 시트33,34,35,36,37,38,39및 조직 전체 탈산40에서심근세포 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 41,42, 43,44,45,46, 47. 이전 작업은 또한 SAN 조직41,42에서필드 잠재력을 검사하기 위하여 행해졌습니다. 여기에서는 MEA를 사용하여 뮤린 내성 SAN 발사 속도를 기록하고 분석하는 방법론을 제공합니다. 우리는 또한 이 기술이 4-aminopyridine (4-AP), 전압 게이트 K+ 채널 차단제의 효력을 보여주는 견본 실험을 제공함으로써 SAN 본질적인 발사 비율에 약리학 효력을 시험하기 위하여 어떻게 이용될 수 있는지 설명합니다. 정의된 해부학 적 랜드 마크를 사용하여, 우리는 정확하게 다른 방법에 필요한 광범위한 조직 해부 또는 세포 격리를 수행하지 않고 SAN을 기록 할 수 있습니다. MEA는 비용 금지 될 수 있지만, 기록은 임상 및 생리 연구 응용 프로그램의 광대 한 배열에 사용할 수있는 페이스 메이킹의 매우 구체적이고 신뢰할 수있는 측정을 제공합니다.
조직이 깨지기 쉽고 건강한 조직이 성공적인 기록을 위해 필요하기 때문에 SAN 해부 과정을 연습하고 마스터하는 것이 필수적입니다. SAN 해부 동안 올바른 방향은 조직의 적절한 영역을 얻기 위해 필수적입니다. 그러나, 심혼의 원래 방향은 이 노력을 복잡하게 하는 해부 과정에서 쉽게 분실될 수 있습니다. 따라서 적절한 좌우 방향을 보장하기 위해 아리아를 시각적으로 검사해야 합니다. 일반적?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 투자되었다, 보조금 번호 R01NS100954 및 R01NS099188.
4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
Dissection Microscope | Jenco | ||
Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |