Enregistrement par réseau de microélectrodes de la vitesse de tir du nœud sino-auriculaire pour identifier les défauts cardiaques intrinsèques de la fabrication du rythme chez la souris
Summary
Ce protocole vise à décrire une nouvelle méthodologie pour mesurer la vitesse de tir cardiaque intrinsèque en utilisant l’enregistrement par réseau de microélectrodes de l’ensemble du tissu du nœud sino-auriculaire afin d’identifier les défauts de stimulateur cardiaque chez la souris. Des agents pharmacologiques peuvent également être introduits dans cette méthode pour étudier leurs effets sur le rythme intrinsèque.
Abstract
Le nœud sino-auriculaire (SAN), situé dans l’oreillette droite, contient les cellules du stimulateur cardiaque, et le dysfonctionnement de cette région peut provoquer une tachycardie ou une bradycardie. L’identification fiable des défauts cardiaques nécessite la mesure de la fréquence cardiaque intrinsèque en empêchant en grande partie l’influence du système nerveux autonome, qui peut masquer les déficits de vitesse. Les méthodes traditionnelles d’analyse de la fonction intrinsèque des stimulateurs cardiaques comprennent le blocage autonome induit par les médicaments pour mesurer les fréquences cardiaques in vivo, les enregistrements cardiaques isolés pour mesurer les fréquences cardiaques intrinsèques et les enregistrements de bandes sino-auriculaires ou de patch-clamp unicellulaires de cellules de stimulateurs cardiaques sino-auriculaires pour mesurer les taux de déclenchement potentiels d’action spontanée. Cependant, ces techniques plus traditionnelles peuvent être techniquement difficiles et difficiles à exécuter. Nous présentons ici une nouvelle méthodologie pour mesurer la vitesse de tir cardiaque intrinsèque en effectuant des enregistrements de réseaux de microélectrodes (MEA) de préparations de nœuds sino-auriculaires à montage entier provenant de souris. Les MEA sont composés de plusieurs microélectrodes disposées selon un modèle en forme de grille pour l’enregistrement in vitro des potentiels de champ extracellulaire. La méthode décrite ici présente l’avantage combiné d’être relativement plus rapide, plus simple et plus précise que les approches précédentes pour l’enregistrement des fréquences cardiaques intrinsèques, tout en permettant un interrogatoire pharmacologique facile.
Introduction
Le cœur est un organe complexe régi à la fois par des influences cardiaques intrinsèques et extrinsèques telles que celles qui proviennent du cerveau. Le nœud sino-auriculaire (SAN) est une région définie dans le cœur qui abrite les cellules du stimulateur cardiaque (également appelées cellules sino-auriculaires, ou cellules SA) responsables de l’initiation et de la perpétuation du rythme cardiaque des mammifères1,2. La fréquence cardiaque intrinsèque est la fréquence entraînée par les cellules du stimulateur cardiaque sans influence par d’autres influences cardiaques ou neuro-humorales, mais les mesures traditionnelles de la fréquence cardiaque chez les humains et les animaux vivants, telles que les électrocardiogrammes, reflètent à la fois les influences du stimulateur cardiaque et neuronales sur le cœur. L’influence neuronale la plus notable sur les cellules SA provient du système nerveux autonome, qui module constamment les schémas de tir pour répondre aux besoins physiologiques du corps3. À l’appui de cette idée, des projections sympathiques et parasympathiques peuvent être trouvées près du SAN4. Le système nerveux cardiaque intrinsèque (ICNS) est une autre influence neuronale importante où le plexi ganglionnaire, en particulier dans les oreillettes droites, innerve et régule l’activité du SAN5,6.
Comprendre les déficits de rythme est cliniquement important, car le dysfonctionnement peut sous-tendre de nombreux troubles cardiaques et contribuer au risque d’autres complications. Le syndrome des sinus malades (SSS) est une catégorie de maladies caractérisées par un dysfonctionnement du nœud sino-auriculaire qui entrave le bon rythme7,8. Le SSS peut présenter une bradycardie sinusale, des pauses sinusales, un arrêt sinusal, un bloc de sortie sino-auriculaire et une alternance de bradyarythmies et de tachyarythmies9 et peut entraîner des complications, notamment un risque accru d’accident vasculaire cérébral embolique et de mort subite8,10. Les personnes atteintes du syndrome de Brugada, un trouble cardiaque marqué par une fibrillation ventriculaire avec un risque accru de mort subite cardiaque, sont plus à risque d’événements arythmogènes si elles ont également un dysfonctionnement comorbide du SAN11,12. Le dysfonctionnement sino-auriculaire peut également avoir des conséquences physiologiques au-delà du cœur. Par exemple, on a observé que le SSS déclenche des convulsions chez un patient en raison d’une hypoperfusion cérébrale13.
Pour identifier les déficits sino-auriculaires, les fréquences cardiaques intrinsèques doivent être déterminées en mesurant l’activité du SAN sans l’influence du système nerveux autonome ou des facteurs humoraux. Cliniquement, cela peut être approximé par le blocage pharmacologique autonome14, mais cette même technique peut également être appliquée dans des modèles de mammifères pour étudier la fonction cardiaque intrinsèque15,16. Bien que cette approche bloque une grande partie des influences neuronales contributives et permette un examen cardiaque in vivo, elle n’élimine pas complètement toutes les influences extrinsèques sur le cœur. Une autre technique de recherche utilisée pour étudier la fonction cardiaque intrinsèque dans les modèles animaux est l’enregistrement cardiaque isolé à l’aide de cœurs perfusés de Langendorff, qui impliquent généralement des mesures à l’aide d’électrogrammes, de stimulation ou de réseaux multiélectroïdes épicandiens17,18,19,20. Bien que cette technique soit plus spécifique à la fonction cardiaque puisqu’elle consiste à retirer le cœur du corps, les mesures peuvent encore être influencées par des mécanismes d’autorégulation mécano-électriques qui pourraient influencer les mesures intrinsèques de la fréquence cardiaque21. Les enregistrements cardiaques isolés peuvent également être encore influencés par la régulation autonome par l’intermédiaire de l’ICNS5,6,22,23. De plus, le maintien d’une température physiologiquement pertinente du cœur, qui est essentielle pour les mesures de la fonction cardiaque, peut être difficile dans les approches cardiaques isolées20. Une méthode plus directe pour étudier la fonction SAN consiste à isoler spécifiquement le tissu SAN et à mesurer son activité. Cela peut être accompli par le biais de bandelettes SAN (tissu SAN isolé) ou de cellules de stimulateurs cardiaques SAN isolées24,25. Les deux nécessitent un haut degré de formation technique, car le SAN est une région très petite et hautement définie, et l’isolement cellulaire pose un défi encore plus grand car la dissociation peut nuire à la santé globale de la cellule si elle n’est pas effectuée correctement. En outre, ces techniques nécessitent des compétences électrophysiologiques expertes afin d’enregistrer avec succès à partir du tissu ou des cellules à l’aide de microélectrodes d’enregistrement individuelles.
Dans ce protocole, nous décrivons une technique permettant d’enregistrer le SAN in vitro en utilisant un réseau de microélectrodes (MEA) pour obtenir des mesures de fréquence cardiaque intrinsèques. Cette approche présente l’avantage de rendre les enregistrements électrophysiologiques très spécifiques accessibles aux chercheurs dépourvus de compétences électrophysiologiques intensives. Les MEA ont déjà été utilisés pour étudier la fonction cardiomyocytaire dans des cultures cardiomyocytaires primaires26,27,28 ,29,30,31,32, feuilles cardiaques33,34,35,36,37,38,39, et des montures entières de tissus40, 41,42,43,44,45,46,47. Des travaux antérieurs ont également été effectués pour examiner les potentiels de terrain dans les tissus SAN41,42. Ici, nous fournissons une méthodologie pour utiliser le MEA pour enregistrer et analyser les taux de tir SAN intrinsèques murins. Nous décrivons également comment cette technique peut être utilisée pour tester les effets pharmacologiques des médicaments sur les taux de tir intrinsèques du SAN en fournissant un échantillon d’expérience montrant les effets de la 4-aminopyridine (4-AP), un bloqueur de canaux K+ dépendant de la tension. En utilisant des repères anatomiques définis, nous pouvons enregistrer avec précision le SAN sans avoir à effectuer les dissections tissulaires étendues ou les isolements cellulaires requis dans d’autres méthodes. Bien que le MEA puisse être prohibitif, les enregistrements fournissent des mesures très spécifiques et fiables du rythme qui peuvent être utilisées dans un large éventail d’applications de recherche clinique et physiologique.
Protocol
Representative Results
Discussion
La pratique et la maîtrise du processus de dissection SAN sont impératives car le tissu est fragile et un tissu sain est nécessaire pour un enregistrement réussi. Pendant la dissection SAN, une orientation correcte est essentielle pour obtenir la bonne région de tissu. Cependant, l’orientation originale du cœur peut être facilement perdue pendant le processus de dissection, ce qui complique cette entreprise. Par conséquent, pour assurer la bonne orientation gauche-droite, les oreillettes doivent être inspecté…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par les National Institutes of Health, numéros de subvention R01NS100954 et R01NS099188.
Materials
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
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