Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Enregistrement par réseau de microélectrodes de la vitesse de tir du nœud sino-auriculaire pour identifier les défauts cardiaques intrinsèques de la fabrication du rythme chez la souris

Published: July 5, 2021 doi: 10.3791/62735
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

Summary

Ce protocole vise à décrire une nouvelle méthodologie pour mesurer la vitesse de tir cardiaque intrinsèque en utilisant l’enregistrement par réseau de microélectrodes de l’ensemble du tissu du nœud sino-auriculaire afin d’identifier les défauts de stimulateur cardiaque chez la souris. Des agents pharmacologiques peuvent également être introduits dans cette méthode pour étudier leurs effets sur le rythme intrinsèque.

Abstract

Le nœud sino-auriculaire (SAN), situé dans l’oreillette droite, contient les cellules du stimulateur cardiaque, et le dysfonctionnement de cette région peut provoquer une tachycardie ou une bradycardie. L’identification fiable des défauts cardiaques nécessite la mesure de la fréquence cardiaque intrinsèque en empêchant en grande partie l’influence du système nerveux autonome, qui peut masquer les déficits de vitesse. Les méthodes traditionnelles d’analyse de la fonction intrinsèque des stimulateurs cardiaques comprennent le blocage autonome induit par les médicaments pour mesurer les fréquences cardiaques in vivo, les enregistrements cardiaques isolés pour mesurer les fréquences cardiaques intrinsèques et les enregistrements de bandes sino-auriculaires ou de patch-clamp unicellulaires de cellules de stimulateurs cardiaques sino-auriculaires pour mesurer les taux de déclenchement potentiels d’action spontanée. Cependant, ces techniques plus traditionnelles peuvent être techniquement difficiles et difficiles à exécuter. Nous présentons ici une nouvelle méthodologie pour mesurer la vitesse de tir cardiaque intrinsèque en effectuant des enregistrements de réseaux de microélectrodes (MEA) de préparations de nœuds sino-auriculaires à montage entier provenant de souris. Les MEA sont composés de plusieurs microélectrodes disposées selon un modèle en forme de grille pour l’enregistrement in vitro des potentiels de champ extracellulaire. La méthode décrite ici présente l’avantage combiné d’être relativement plus rapide, plus simple et plus précise que les approches précédentes pour l’enregistrement des fréquences cardiaques intrinsèques, tout en permettant un interrogatoire pharmacologique facile.

Introduction

Le cœur est un organe complexe régi à la fois par des influences cardiaques intrinsèques et extrinsèques telles que celles qui proviennent du cerveau. Le nœud sino-auriculaire (SAN) est une région définie dans le cœur qui abrite les cellules du stimulateur cardiaque (également appelées cellules sino-auriculaires, ou cellules SA) responsables de l’initiation et de la perpétuation du rythme cardiaque des mammifères1,2. La fréquence cardiaque intrinsèque est la fréquence entraînée par les cellules du stimulateur cardiaque sans influence par d’autres influences cardiaques ou neuro-humorales, mais les mesures traditionnelles de la fréquence cardiaque chez les humains et les animaux vivants, telles que les électrocardiogrammes, reflètent à la fois les influences du stimulateur cardiaque et neuronales sur le cœur. L’influence neuronale la plus notable sur les cellules SA provient du système nerveux autonome, qui module constamment les schémas de tir pour répondre aux besoins physiologiques du corps3. À l’appui de cette idée, des projections sympathiques et parasympathiques peuvent être trouvées près du SAN4. Le système nerveux cardiaque intrinsèque (ICNS) est une autre influence neuronale importante où le plexi ganglionnaire, en particulier dans les oreillettes droites, innerve et régule l’activité du SAN5,6.

Comprendre les déficits de rythme est cliniquement important, car le dysfonctionnement peut sous-tendre de nombreux troubles cardiaques et contribuer au risque d’autres complications. Le syndrome des sinus malades (SSS) est une catégorie de maladies caractérisées par un dysfonctionnement du nœud sino-auriculaire qui entrave le bon rythme7,8. Le SSS peut présenter une bradycardie sinusale, des pauses sinusales, un arrêt sinusal, un bloc de sortie sino-auriculaire et une alternance de bradyarythmies et de tachyarythmies9 et peut entraîner des complications, notamment un risque accru d’accident vasculaire cérébral embolique et de mort subite8,10. Les personnes atteintes du syndrome de Brugada, un trouble cardiaque marqué par une fibrillation ventriculaire avec un risque accru de mort subite cardiaque, sont plus à risque d’événements arythmogènes si elles ont également un dysfonctionnement comorbide du SAN11,12. Le dysfonctionnement sino-auriculaire peut également avoir des conséquences physiologiques au-delà du cœur. Par exemple, on a observé que le SSS déclenche des convulsions chez un patient en raison d’une hypoperfusion cérébrale13.

Pour identifier les déficits sino-auriculaires, les fréquences cardiaques intrinsèques doivent être déterminées en mesurant l’activité du SAN sans l’influence du système nerveux autonome ou des facteurs humoraux. Cliniquement, cela peut être approximé par le blocage pharmacologique autonome14, mais cette même technique peut également être appliquée dans des modèles de mammifères pour étudier la fonction cardiaque intrinsèque15,16. Bien que cette approche bloque une grande partie des influences neuronales contributives et permette un examen cardiaque in vivo, elle n’élimine pas complètement toutes les influences extrinsèques sur le cœur. Une autre technique de recherche utilisée pour étudier la fonction cardiaque intrinsèque dans les modèles animaux est l’enregistrement cardiaque isolé à l’aide de cœurs perfusés de Langendorff, qui impliquent généralement des mesures à l’aide d’électrogrammes, de stimulation ou de réseaux multiélectroïdes épicandiens17,18,19,20. Bien que cette technique soit plus spécifique à la fonction cardiaque puisqu’elle consiste à retirer le cœur du corps, les mesures peuvent encore être influencées par des mécanismes d’autorégulation mécano-électriques qui pourraient influencer les mesures intrinsèques de la fréquence cardiaque21. Les enregistrements cardiaques isolés peuvent également être encore influencés par la régulation autonome par l’intermédiaire de l’ICNS5,6,22,23. De plus, le maintien d’une température physiologiquement pertinente du cœur, qui est essentielle pour les mesures de la fonction cardiaque, peut être difficile dans les approches cardiaques isolées20. Une méthode plus directe pour étudier la fonction SAN consiste à isoler spécifiquement le tissu SAN et à mesurer son activité. Cela peut être accompli par le biais de bandelettes SAN (tissu SAN isolé) ou de cellules de stimulateurs cardiaques SAN isolées24,25. Les deux nécessitent un haut degré de formation technique, car le SAN est une région très petite et hautement définie, et l’isolement cellulaire pose un défi encore plus grand car la dissociation peut nuire à la santé globale de la cellule si elle n’est pas effectuée correctement. En outre, ces techniques nécessitent des compétences électrophysiologiques expertes afin d’enregistrer avec succès à partir du tissu ou des cellules à l’aide de microélectrodes d’enregistrement individuelles.

Dans ce protocole, nous décrivons une technique permettant d’enregistrer le SAN in vitro en utilisant un réseau de microélectrodes (MEA) pour obtenir des mesures de fréquence cardiaque intrinsèques. Cette approche présente l’avantage de rendre les enregistrements électrophysiologiques très spécifiques accessibles aux chercheurs dépourvus de compétences électrophysiologiques intensives. Les MEA ont déjà été utilisés pour étudier la fonction cardiomyocytaire dans des cultures cardiomyocytaires primaires26,27,28 ,29,30,31,32, feuilles cardiaques33,34,35,36,37,38,39, et des montures entières de tissus40, 41,42,43,44,45,46,47. Des travaux antérieurs ont également été effectués pour examiner les potentiels de terrain dans les tissus SAN41,42. Ici, nous fournissons une méthodologie pour utiliser le MEA pour enregistrer et analyser les taux de tir SAN intrinsèques murins. Nous décrivons également comment cette technique peut être utilisée pour tester les effets pharmacologiques des médicaments sur les taux de tir intrinsèques du SAN en fournissant un échantillon d’expérience montrant les effets de la 4-aminopyridine (4-AP), un bloqueur de canaux K+ dépendant de la tension. En utilisant des repères anatomiques définis, nous pouvons enregistrer avec précision le SAN sans avoir à effectuer les dissections tissulaires étendues ou les isolements cellulaires requis dans d’autres méthodes. Bien que le MEA puisse être prohibitif, les enregistrements fournissent des mesures très spécifiques et fiables du rythme qui peuvent être utilisées dans un large éventail d’applications de recherche clinique et physiologique.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales décrites ici ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH), telles qu’approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de la Southern Methodist University.

1. Revêtement du réseau multiélectrodes (MEA) pour l’enregistrement

  1. Faire un tampon de borate de 25 mM.
    1. Dissoudre 0,953 g de Na2B4O7·10H2O dans 80 mL d’eau distillée.
    2. Ajuster le pH à 8,4 avec HCl, puis ajouter de l’eau distillée à un volume final de 100 mL.
  2. Faire une solution d’origine à 0,1 % de polyéthylèneimine (PEI).
    1. Ajouter 100 μL de 50 % (p/v) d’Î.-P.-É.-P. à 4,9 mL d’eau distillée pour faire une solution d’Î.-P.-É. à 1 %.
    2. Diluer la solution d’Î.-P.-É. à 1 % à 0,1 % dans un tampon de borate en ajoutant 1 mL de la solution d’Î.-P.-É. à 9 mL du tampon de borate de 25 mM.
  3. Pipette ~1 mL de la solution PEI à 0,1 % dans la boîte à réseau de microélectrodes (MEA) afin que les électrodes soient complètement recouvertes(Figure 1A et 1B).
    REMARQUE: Les microélectrodes de la MEA sont généralement composées de noir de platine ou de nanotubes de carbone et isolées avec du polyimide (ou de l’acrylique); les deux matériaux sont hydrophobes. En recouvrant le MEA d’un polymère cationique tel que le PEI, la surface hydrophobe du MEA est rendue plus hydrophile, ce qui permet aux échantillons de tissus d’entrer en contact avec la surface du MEA(Figure 1A1).
  4. Couvrir la boîte MEA avec un film thermoplastique pour réduire l’évaporation et laisser la MEA pendant la nuit à température ambiante(Figure 1C).
  5. Aspirer la solution PEI de la boîte MEA à l’aide d’une pipette, en prenant soin de ne pas toucher la grille d’électrodes qui peut endommager les électrodes, puis rincer ≥4 fois à l’eau distillée(Figure 1D).
  6. Conservez le MEA revêtu de PEI sous 1 à 2 mL d’eau ultrapure et scellé avec un film thermoplastique à 4 °C jusqu’à ce que nécessaire. Alternativement, stockez le MEA enduit en le submergeant dans un bécher rempli d’eau ultrapure (Figure 1E).
    REMARQUE: Le processus de revêtement PEI ne doit être effectué qu’une seule fois pour le MEA avant sa première utilisation, et après chaque session d’enregistrement, le MEA doit être stocké immergé dans de l’eau ultrapure.

2. Préparation de la solution complète de Tyrode pour la dissection tissulaire

  1. Fabriquer 1 000 mL de solution complète de Tyrode pour la dissection; tout d’abord, ajouter 8,1816 g de NaCl à 800 mL d’eau ultrapure.
  2. Ajouter la quantité suivante de produits chimiques à la solution: 0,4025 g de KCl; 0,1633 g de KH2PO4; 1,1915 g de HEPES; 0,9999 g de glucose; 0,0952 g de MgCl2; 0,2646 g de CaCl2·2H2O.
  3. Ajustez le pH à 7,4 avec du NaOH, puis ajoutez de l’eau ultrapure jusqu’à ce que le volume total soit de 1 000 mL.
    REMARQUE: La composition finale de la solution de Complete Tyrode sera la suivante (en mM): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 KH2PO4,5 HEPES, 5,55 glucose, 1 MgCl2,1,8 CaCl2.

3. Préparation de la solution de Tyrode oxygénée pour l’enregistrement

  1. Faire 500 mL de la solution de Tyrode; ajouter 4,003 g de NaCl à 400 mL d’eau ultrapure.
  2. Ajouter les quantités suivantes de produits chimiques à lasolution : 0,651 g de NaHCO3 ; 0,042 g de NaH2PO4; 0,132 g de CaCl2·2H2O; 0,149 g de KCl; 0,0476 g de MgCl2; 0,999 g de glucose.
  3. Ajustez le pH à 7,4 avec du HCl, puis ajoutez de l’eau ultrapure jusqu’à ce que le volume total soit de 500 mL.
  4. Oxygéner la solution avec du carbogène pendant au moins 30 min à température ambiante avant de commencer l’enregistrement.
    REMARQUE: La composition finale de la solution du Tyrode sera la suivante (en mM): 137 NaCl, 15,5 NaHCO3, 0,7 NaH2PO4, 1,8 CaCl2, 4 KCl, 1 MgCl2, 11,1 glucose. La solution de ce Tyrode a une composition légèrement différente de la solution de Tyrode Complète utilisée pour la dissection.

4. Préparation de la solution de 4-aminopyridine (4-AP) pour la modulation pharmacologique

  1. Faire une solution de travail de 1 mM de 4-AP; ajouter 18,82 mg de 4-AP à 200 mL de la solution du Tyrode à partir de l’étape 3.
  2. Oxygéner la solution de 4-AP pendant au moins 30 minutes avant l’expérience.

5. Préparation de la boîte de Petri pour la dissection

  1. Mélanger les composants en élastomère de silicone dans un rapport de 10:1 (en poids) de la base à l’agent de durcissement.
  2. Versez environ 15 mL de mélange d’élastomère de silicone dans une boîte de Petri de 60 mm de diamètre.
  3. Laisser durcir l’élastomère à température ambiante pendant 48 h avant utilisation.
    REMARQUE: La boîte de Petri siliconée peut être réutilisée pour de futures dissections.

6. Disséquage du nœud sino-auriculaire (SAN)

  1. Préparez la solution héparinisée de Complete Tyrode pour la dissection SAN.
    1. Ajouter 400 μL d’héparine (1 000 USP/mL) à 40 mL de solution de Complete Tyrode et réchauffer au bain-marie à 37 °C.
  2. Injecter à la souris par voie intrapéritonéale 200-300 μL d’héparine (1000 USP/mL) et laisser l’animal reposer pendant 10 min.
  3. Euthanasier la souris héparinisée par surdosage d’isoflurane.
    1. Placez la souris dans une petite chambre en verre qui contient des vapeurs d’isoflurane générées en ajoutant 200 à 300 μL d’isoflurane liquide à un papier filtre à l’intérieur d’un tube en plastique perforé.
      REMARQUE: Parce que l’isoflurane peut causer une irritation de la peau et peut également être absorbé par la peau, le liquide ne doit pas entrer en contact direct avec la souris. Par conséquent, la lingette imbibée d’isoflurane est placée dans un tube perforé pour administration.
    2. Vérifier la mort par l’arrêt du mouvement et de l’effort respiratoire et par l’absence d’un réflexe de pincement des orteils. La mort prend généralement environ 1-2 minutes après le placement dans la chambre.
      REMARQUE: La mort est généralement accompagnée d’une miction.
  4. Placez la souris en position couchée sur une planche de dissection avec les pattes tendues et fixez les pattes à la planche à l’aide d’aiguilles de seringue de 1 pouce de long et de calibre 23. Ensuite, retirez la fourrure à proximité du fond de la cage thoracique en utilisant des ciseaux chirurgicaux et en coupant la fourrure aux racines.
    REMARQUE: Pour une carte de dissection, des couvercles de refroidisseur en polystyrène peuvent être utilisés.
  5. Tout en tenant la peau avec un hémostat, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision transversale dans la peau juste en dessous du bas de la cage thoracique d’environ l’arc costal gauche à l’arc costal droit (Figure 3A).
  6. Coupez le péritoine avec des ciseaux chirurgicaux et séparez soigneusement le foie du diaphragme, en prenant soin de ne pas entailler le foie, ce qui provoquera des saignements excessifs (Figure 3B). Inciser le diaphragme le long du thorax pour exposer la cavité thoracique (Figure 3C-D).
  7. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, coupez les parois latérales de la cage thoracique des bords des arcs costaux jusqu’aux clavicules pour exposer le cœur, en prenant soin d’éviter d’endommager le cœur (Figure 3D). Ensuite, utilisez une aiguille de seringue de calibre 23 pour épingler la cage thoracique sur l’épaule, en la maintenant en place et hors du champ chirurgical.
  8. Utilisez une pipette de transfert pour égoutter la solution héparinisée de Tyrode complète au chaud (37 °C) sur le cœur pour le garder humide.
    REMARQUE: Ne laissez pas le cœur se dessécher.
  9. Retirez les poumons en les tenant avec une pince Graefe extra fine et coupez la trachée avec des ciseaux chirurgicaux (Figure 3E).
  10. Tenez l’apex du cœur avec une pince Graefe extra fine et retirez-la en coupant l’aorte et la veine cave avec des ciseaux chirurgicaux. Transférer le cœur dans une boîte de Petri contenant de l’élastomère de silicone durci(Figure 4A)et utiliser une pipette de transfert pour baigner le cœur avec 2-3 mL de solution chaude (37 °C) héparinisée de Tyrode complet.
    REMARQUE: Veillez à ne pas endommager la délicate paroi postérieure des oreillettes droites, qui contient le SAN, et les veines auriculaires droites connectées. Baigner le cœur avec la solution de Complete Tyrode empêche le cœur de se dessécher, mais ne submerge pas complètement le cœur dans la solution car cela nuirait à la visibilité pendant la dissection.
  11. Orientez le cœur avec l’oreillette droite à la droite de l’expérimentateur et l’oreillette gauche à la gauche de l’expérimentateur.
    REMARQUE: La dissection du tissu SAN doit être effectuée rapidement afin de prévenir les blessures liées à l’ischémie.
  12. Attachez l’apex du cœur au plat avec une épingle à dissection. Ensuite, tout en tenant la veine cave inférieure avec des pinces de laminectomie Dumont #2, insérez une aiguille de seringue de 22 G à travers la veine cave inférieure et supérieure pour localiser leur position dans l’oreillette droite, ce qui identifie également la position approximative du SAN (situé dans la tache de tissu entre la veine cave inférieure et supérieure (Figure 4B).
  13. À l’aide de petites broches de dissection, épinglez les appendices auriculaires gauche et droit au plat.
    1. Tout en tenant l’appendice auriculaire gauche avec du dumont #2 pinces de laminectomie, placez une broche de dissection à travers l’appendice auriculaire gauche pour le maintenir en place.
    2. Tout en tenant l’appendice auriculaire droit avec du dumont #55 pince, placez une broche de dissection à travers l’appendice auriculaire droit pour le maintenir en place.
      REMARQUE: Le même type de pince peut être utilisé pour maintenir les appendices auriculaires gauche et droit si vous le souhaitez.
  14. Retirez l’aiguille de la seringue qui s’étend sur la veine cave.
  15. Pour libérer le sang du cœur, utilisez des ciseaux Castroviejo pour enlever l’apex du cœur (c’est-à-dire la moitié inférieure) en faisant une incision transversale à travers les ventricules (Figure 4C). Ensuite, lavez le cœur en ajoutant la solution héparinisée chaude (37 °C) de Complete Tyrode avec une pipette de transfert.
  16. Utilisez des ciseaux Castroviejo pour couper le long du septum auriculo-ventriculaire en gardant l’incision plus proche du ventricule que des oreillettes. Continuez à couper le long du septum auriculo-ventriculaire jusqu’à ce que les oreillettes soient séparées des ventricules.
  17. Couper le long du septum interauriculaire pour enlever l’oreillette gauche.
  18. Placez les broches de dissection à la périphérie de l’oreillette droite pour le faire s’allonger à plat(Figure 4D). Retirez toute graisse, tout vaisseau ou tout tissu restant de l’oreillette à l’aide des ciseaux Castroviejo.
  19. Localisez le SAN dans l’oreillette droite, qui dans cette orientation est approximativement bordée par la veine cave supérieure (en haut), la veine cave inférieure (en bas) et la cristae terminalis (à gauche)(Figure 4D).
    REMARQUE: Le crista terminalis apparaît comme une crête musculaire sombre entre l’appendice auriculaire droit et le SAN. Souvent, l’artère SAN peut également être vue en cours d’application à travers le SAN (Figure 4D).

7. Préparation du système MEA pour l’enregistrement

  1. Ajouter la solution de Tyrode (à partir de l’étape 3) à la bouteille de solution d’entrée (Figure 5C) et l’oxygéner en allumant le flux de gaz carbogène (Figure 5A) vers le système.
    REMARQUE: La solution du Tyrode utilisée pour l’enregistrement est légèrement différente dans la composition de la solution du Tyrode complet utilisée pour la dissection.
  2. Vérifier l’écoulement du carbogène en observant des bulles dans la fiole conique, qui est utilisée pour humidifier le gaz (Figure 5B), et la bouteille de solution d’entrée (Figure 5C).
  3. Insérez le tuyau d’entrée de la pompe péristaltique (Figure 5D) dans la solution d’enregistrement du Tyrode (Figure 5C). Ensuite, insérez le tuyau de sortie de la pompe péristaltique dans le flacon de collecte (Figure 5I).
  4. Réglez la pompe péristaltique à 25 tr/min, ce qui donne un débit de 2 mL/ min et démarrez la pompe. Vérifiez que le système ne s’est pas vérifié s’il y a une fuite ou un débordement de la mémoire tampon.
  5. Réglez le régulateur de température à 37 °C, la température physiologique des souris (Figure 5E).

8. Placer le tissu cardiaque sur la grille MEA

  1. Transférer le tissu SAN disséqué à l’aide d’un pinceau (Figure 6A) de la boîte de Petri disséquante sur la grille MEA (Figure 1A1).
    1. Tout en regardant sous un microscope inversé, positionnez doucement le tissu avec un pinceau doux afin que la région SAN recouvre la grille d’électrodes.
    2. Re-positionnez le tissu si nécessaire pour vous assurer qu’il est à plat sur la grille d’électrodes, en établissant un bon contact avec les électrodes.
      REMARQUE: Un pinceau doux est nécessaire pour déplacer le tissu afin d’éviter d’endommager la grille d’électrodes.
  2. Une fois que le tissu est correctement positionné, utilisez une pince osseuse (ou toute pince incurvée) pour placer la maille sur le tissu (Figure 6A). Utilisez ensuite la pince à os pour placer l’ancre de la harpe (Figure 6A) sur le maillage pour maintenir tout en place (Figure 6B).
  3. Prenez une photo du positionnement du tissu sur le MEA afin que l’activité des électrodes individuelles puisse être corrélée avec leur emplacement anatomique pendant l’enregistrement. Cela peut être fait en tenant un smartphone jusqu’à l’objectif du microscope inversé ou en utilisant une caméra de microscope attachée.
    REMARQUE: Si l’orientation du MEA n’est pas modifiée après la prise de la photo, l’électrode en haut à gauche apparaîtra comme premier canal (Ch1) pendant l’enregistrement.
  4. Placez la boîte MEA sur la plaque de connexion (Figure 5F et 6C) et placez soigneusement le capuchon de perfusion (Figure 6C) sur la boîte MEA sans perturber l’ancrage de la tranche de harpe. Le bouchon de perfusion peut être fixé à l’aide d’un morceau de ruban adhésif de laboratoire(Figure 6C).
    REMARQUE: En plus d’avoir des tuyaux d’entrée et de sortie de solution réglables, le bouchon dispose également d’un port pour la livraison de gaz (Figure 6C). De plus, l’anneau d’électrode de référence traverse le capuchon (Figure 6C).
  5. Laissez le tissu se remettre de la manipulation et s’acclimater à la chambre pendant 15 à 20 minutes avant l’enregistrement.

9. Définition du protocole d’acquisition de données pour l’enregistrement

REMARQUE: Les étapes suivantes décrivent l’ouverture du protocole logiciel pour l’enregistrement spontané des battements et la définition des conditions d’enregistrement. Les spécificités de ces étapes peuvent varier en fonction du logiciel spécifique utilisé, mais les grandes lignes doivent rester les mêmes.

  1. Allumez l’amplificateur (Figure 5G) et configurez un flux de travail pour l’enregistrement dans le logiciel de l’ordinateur (Figure 5H).
    1. Ouvrez le logiciel et cliquez sur le Workflow.
    2. Sélectionnez Ouvrir un nouveau dossier.
    3. Ouvrez le dossier À partir des modèles.
    4. Sélectionnez 64MD1-1920X1080 (en fonction de la résolution de votre bureau).
    5. Ouvrez le dossier QT.
    6. Ouvrez le dossier Enregistrement spontané.
    7. Sélectionnez Beat_recording.moflo et ouvrez-le (Figure 7A).
  2. Définissez les paramètres d’enregistrement pour spécifier le nombre de traces, la durée de la trace, l’intervalle de trace, la tension d’entrée, la fréquence d’échantillonnage, etc., en fonction des conditions d’enregistrement souhaitées(Figure 7B).
    REMARQUE: Pour l’acquisition de données de fréquence de battement et d’inter-pointes, utilisez généralement une tension de plage d’entrée de 2,9 mV, un filtre passe-haut de 1 Hz, un filtre passe-bas de 1000 Hz et un taux d’échantillonnage de 20 kHz.
  3. Pour marquer différentes phases ou conditions de l’expérience, telles qu’avant et après l’administration du médicament, cliquez sur l’onglet Annotations pour ajouter les notations souhaitées (Figure 7C).
  4. Pour spécifier la destination du fichier pour les données à collecter, sélectionnez la zone Activer le stockage et entrez le nom de fichier souhaité dans la zone Modificateur de nom de fichier.

10. Effectuer l’enregistrement et la collecte des données

  1. Cliquez sur le bouton Enregistrer et lire dans la barre de menus la plus haute du logiciel d’acquisition pour démarrer l’enregistrement. Acquérir des données pour 10 traces d’une durée de 1 min avec des intervalles de 2 min entre les traces.
  2. À partir de ces traces initiales, vérifier que les formes d’onde enregistrées sont compatibles avec une préparation tissulaire saine et de haute qualité en confirmant que la majorité des canaux d’enregistrement présentent des amplitudes de signal de ≥ 0,5 mV et des intervalles d’inter-pointes identiques(Figure 8).
    NOTE: Une première évaluation de l’activité et des formes d’onde des microélectrodes individuelles correspondant à leurs emplacements anatomiques peut être effectuée en référençant l’image acquise après le positionnement du tissu sur le MEA.
  3. Pour mesurer les effets des médicaments sur les tissus, mettez en pause l’enregistrement après avoir acquis les données de base initiales en cliquant sur le bouton pause dans la barre de menus la plus haute.
    REMARQUE: La phase de réponse médicamenteuse de l’expérience peut être notée dans l’enregistrement en cliquant sur l’onglet Annotations et en ajoutant la notation souhaitée comme décrit ci-dessus (Figure 7C).
  4. Mettez la pompe en pause et basculez le tuyau d’entrée de la pompe de la solution d’enregistrement normale vers la solution de Tyrode contenant le médicament souhaité de votre choix.
    REMARQUE: Dans l’exemple d’expérience, la solution de Tyrode a été utilisée avec 1 mM de 4-aminopyridine (4-AP).
  5. Redémarrez la pompe et suspendez l’enregistrement pour recommencer à collecter des données.
  6. Une fois que la solution de Tyrode perfusée par le médicament a atteint le tissu, enregistrez 10 traces de la même manière que précédemment pour les enregistrements de base.
    REMARQUE: Les traces prendront un certain temps à se stabiliser lorsque le médicament infuse dans la chambre d’enregistrement. Le mécanisme d’action du médicament peut également affecter la stabilité de l’enregistrement. Pour les médicaments qui ont des mécanismes d’action réversibles, une période de lavage doit également être enregistrée pour confirmer la restauration de l’activité aux niveaux de base, ce qui est un indicateur de tissu sain.
  7. Cliquez sur Arrêter pour terminer les enregistrements.
  8. Prenez une photo finale du positionnement du tissu sur le MEA au microscope au cas où le tissu se serait déplacé après la procédure d’enregistrement initiale.

11. Nettoyage de la configuration après l’enregistrement

  1. Nettoyez le MEA.
    1. Une fois l’enregistrement terminé, retirez délicatement la solution d’enregistrement de la parabole MEA à l’aide d’une micropipette de 1 mL.
      REMARQUE: Veillez à ne pas entrer en contact avec les électrodes MEA qui peuvent les endommager.
    2. Retirez la maille et l’ancrage de la harpe à l’avec une pince à os (ou une pince incurvée). Ensuite, utilisez un pinceau pour déloger le tissu de la surface MEA en faisant toujours attention à ne pas toucher les microélectrodes individuelles.
    3. À l’aide d’un flacon de lavage, rincez doucement le plat MEA avec de l’eau ultrapure environ 3 à 4 fois.
    4. Conserver le MEA nettoyé immergé dans de l’eau ultrapure à 4 °C.
  2. Rincez le tube du système en y faisant couler de l’eau ultrapure pendant au moins 5 minutes en utilisant le réglage de la vitesse maximale de la pompe péristaltique.
    REMARQUE: Pour prévenir la croissance fongique, aucune solution d’eau ou de tampon ne doit être laissée à l’intérieur du tube après le nettoyage.

12. Analyse des enregistrements MEA pour mesurer la fréquence des battements SAN

  1. Ouvrez le fichier de données enregistré enregistré dans le modèle « Beat_frequency_analysis » du logiciel d’analyse (Figure 9).
  2. Cliquez sur le bouton Lecture et laissez l’ensemble de l’enregistrement s’exécuter pour visualiser l’ensemble de données et attribuer les paramètres d’analyse appropriés.
    1. Sélectionnez la fenêtre de binning pour le format d’affichage souhaité des données, qu’il s’agisse d’une moyenne par trace ou d’une moyenne par temps (Figure 10A).
    2. Sélectionnez les canaux à inclure dans l’analyse et définissez les maxima d’amplitude ou les valeurs seuils d’amplitude minimale souhaités pour l’identification automatisée des pics de forme d’onde (Figure 10B).
      REMARQUE : Un canal individuel, une combinaison de canaux ou les 64 canaux peuvent être sélectionnés pour analyse à cette étape (Figure 9). Si les valeurs seuils sélectionnées sont trop proches des valeurs maximales et minimales de la forme d’onde, certains pics de forme d’onde peuvent ne pas être identifiés par le logiciel d’analyse.
    3. Définissez la quantité de temps avant et après le pic à inclure dans l’analyse.
      REMARQUE : Les réglages de 50 ms avant le pic et de 100 ms après le pic fonctionnent généralement bien (Figure 10B).
  3. Après avoir défini les conditions d’analyse, cliquez à nouveau sur le bouton Lecture pour réexécuter l’ensemble de données et confirmer que les paramètres d’analyse sont appropriés pour l’extraction de pics.
  4. Aux fins de l’analyse, identifier les trois traces consécutives les plus stables qui présentent un taux de battement stable pour chaque trace dans la majorité des canaux à la fois pendant la période de référence de l’expérience et trois autres traces stables consécutives pendant la période d’exposition au médicament(Figure 10A).
  5. Spécifiez les traces de début et de fin pour l’analyse et entrez la durée de chaque trace à analyser (Figure 9).
  6. Avant de commencer l’analyse, cochez les cases d’activation pour Enregistrer le battement par minute et Enregistrer l’intervalle d’interspike (Figure 10B).
  7. Entrez le nom de fichier souhaité dans la zone Modificateur de nom de fichier (Figure 10B). Les données analysées pour la fréquence de battement et l’intervalle interspike seront enregistrées sous forme de format ASCII (texte).
    REMARQUE: Pour analyser différentes conditions (telles que la réponse initiale et médicamenteuse), l’analyse doit être effectuée séparément pour chaque condition.
  8. Cliquez sur le bouton Lire et enregistrer dans la barre d’onglets supérieure pour lancer l’analyse.
  9. Pour exporter les données pour d’autres applications, cochez les cases Enregistrer le battement par minute et Enregistrer l’intervalle entre les broches (Figure 10B). Entrez le nom de fichier souhaité dans la zone Modificateur de nom de fichier (Figure 10B) et cliquez sur Enregistrer pour enregistrer les données analysées au format texte ASCII dans le dossier sélectionné.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Après avoir permis au tissu de s’acclimater dans le plat pendant 15 min, 10 traces d’une minute sont enregistrées. Notre protocole actuel enregistre l’activité pendant plus d’une heure, mais nous avons enregistré des modèles de tir stables pendant ≥4 h dans des données non publiées non montrées ici. Si une préparation expérimentale est bonne pour la collecte de données, chaque canal d’enregistrement doit présenter des formes d’onde récurrentes cohérentes et uniformément espacées (c.-à-d. des pointes) de forme uniforme pour un canal donné(Figure 11D). Ces formes d’onde correspondent à des battements cardiaques individuels qui reflètent l’activité cardiaque intrinsèque de la prise de rythme. Les intervalles entre les canaux doivent être les mêmes pour tous les canaux, même s’ils peuvent ne pas être parfaitement alignés entre les canaux en raison de petites différences dans leur emplacement par rapport au site d’initiation de la dépolarisation(figure 8). Bien que la forme des formes d’onde pour un canal donné doive être cohérente, la forme des formes d’onde varie d’un canal à l’autre en fonction de l’emplacement de l’électrode dans le tissu (Figure 8). Le degré de contact du tissu avec l’électrode peut également influencer les caractéristiques de la forme d’onde, telles que l’amplitude. Toutefois, les maxima d’amplitude doivent être d’au moins 0,5 mV pour la majorité des canaux si la préparation est satisfaisante. Parmi les 10 traces enregistrées, les trois canaux consécutifs qui répondent le mieux aux critères de qualité décrits ci-dessus ont été choisis pour une analyse plus approfondie décrite ci-dessous. La figure 10A montre un échantillon de fréquence de battement stable (panneau supérieur) et d’intervalle inter-pointes (panneau central) pour trois traces consécutives. Les tissus qui ne répondent pas à ces critères ne doivent pas être enregistrés, car il y a probablement des lésions tissulaires qui entraveront la collecte de données précises. La figure 11 montre des exemples de modèles de pics mal extraits qui sont soit absents (A), influencés par le bruit (B), soit instables (C).

Les données de l’échantillon affichées dans les figures ont été recueillies auprès d’une souris noire suisse (Tac:N:NIHS-BC) mâle de 45 jours. La procédure d’analyse illustrée à la figure 9 et à la figure 10 a été utilisée pour extraire la cadence de tir intrinsèque et afficher les pics de référence qui peuvent être vus à la figure 12A. La cadence de tir est la vitesse moyenne sur 60 000 ms à partir de chacune des trois traces, mais le schéma de pointe de la figure 12A montre 5 s de pic représentatif à partir d’une seule trace. À l’aide d’un logiciel d’analyse automatisé, la vitesse de tir intrinsèque (c.-à-d. la fréquence de battement) des trois traces sélectionnées sur les 64 canaux s’est avérée être d’environ 320 bpm dans nos données d’échantillon(figure 12A). En général, nous observons une plage de valeurs d’environ 290-340 bpm dans nos enregistrements pour les souris de type sauvage. La cadence de cuisson peut également être utilisée comme méthode secondaire pour évaluer la qualité de la préparation. Les taux qui sont instables ou significativement inférieurs à 300 bpm sont moins susceptibles d’être bons pour l’analyse. Ces valeurs sont comparables aux enregistrements cardiaques isolés et à cellules uniques qui rapportent des fréquences cardiaques intrinsèques comprises entre environ 300 et 500 bpm25,48,49. Par conséquent, la technique d’enregistrement MEA est capable de générer des mesures fiables et précises de la fréquence cardiaque intrinsèque.

Un avantage du système MEA est qu’il permet une application facile des agents médicamenteux pour tester les effets pharmacologiques. Dans l’expérience de l’échantillon, nous avons testé les effets de 1 mM 4-AP sur la cadence de tir, ce qui devrait ralentir l’activité san puisque le blocage des canaux K+ voltage-dépendants est connu pour nuire à la repolarisation du potentiel d’action dans les cellules SA24,50. La figure 12B montre que l’introduction du 4-AP a augmenté les intervalles entre les points d’interspike comme prévu. Cet intervalle de pointe prolongé correspondait à une diminution de la fréquence de battement de 320 bpm à 210 bpm. Cette vitesse de tir après l’administration de 4-AP est similaire à une étude précédente qui a examiné les effets du 4-AP sur la vitesse de tir SAN en utilisant des enregistrements à électrode unique de tissus isolés. Cette étude a mesuré une cadence de tir d’environ 190 bpm en présence de 4-AP50. Ainsi, le système MEA peut être utilisé comme un outil pratique et précieux pour tester les effets pharmacologiques des interventions médicamenteuses sur la fonction cardiaque intrinsèque.

Figure 1
Figure 1: Revêtement du réseau demicroélectrodes (MEA) avant utilisation. (A) Le MEA est composé d’une petite boîte en plastique avec un réseau de grille de 64 microélectrodes au centre (comme indiqué dans le panneau A1) et de quatre électrodes de référence autour de la périphérie dans un motif carré. (B) Ajout de 1 mL de tampon de l’Île-du-Prince-Édouard pour recouvrir l’AE ME. (C) Couvrir la cabole MEA d’un film thermoplastique pour incubation pendant la nuit à température ambiante. (D) Aspiration du tampon PEI de la boîte MEA, suivie d’au moins quatre rinçages à l’eau distillée. (E) Stockage de la sonde MEA revêtue sous de l’eau ultrapure pour l’empêcher de se dessécher. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Outils utilisés pour la dissection de nœuds sino-auriculaires (SAN). Les outils suivants sont utilisés pendant la partie dissection du protocole: (i) boîte de Petri avec élastomère de silicone et petites broches de dissection; ii) Pipette de transfert en plastique; iii) Ciseaux Castroviejo, taille 4 »; iv) Ciseaux chirurgicaux (droits) pour les procédures de coupe; v) Dumont #2 pinces à laminectomie; vi) Dumont #55 forceps; vii) Pinces Graefe extra fines; viii) Hémostats (courbes). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Ablation du cœur. (A) Incision transversale dans la peau juste en dessous du bas de la cage thoracique d’environ l’arc costal gauche à l’arc costal droit. (B) Incision péritonéale. (C,D) Incision du diaphragme le long du thorax pour exposer la cavité thoracique. (E) Ablation du cœur après excision des poumons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Dissection du nœud sino-auriculaire (SAN). (A) Apparition du cœur dans la boîte de Pétri après son retrait du corps. (B) Insertion de l’aiguille de la seringue à travers la veine cave inférieure (IVC) et la veine cave supérieure (SVC) de l’oreillette droite. L’épingle à l’apex du cœur est également montrée. (C) Excision de l’apex (c’est-à-dire la moitié inférieure) du cœur pour libérer le sang. Les broches dans les appendices auriculaires sont également montrées. (D) L’apparence finale de la région SAN de l’atrium droit à la fin de la dissection. La région encadrée correspond à l’emplacement approximatif du SAN. L’artère SAN peut également être faiblement vue traversant le SAN dans une orientation verticale. Les abréviations: AO, aorte; CT, crista terminalis; IVC, veine cave inférieure; LA, oreillette gauche; RA, atrium droit; RAA, appendice auriculaire droit; SAN, nœud sino-auriculaire ; SVC, veine cave supérieure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Schéma de la configuration du système d’enregistrement meA (microelectrode array). Les composants suivants composent le système: (A) bouteille de gaz (carbogène: 95% O2/ 5% CO2); B) fiole conique avec de l’eau distillée pour humidifier le gaz; (C) enregistrement de la bouteille de solution de Tyrode qui fournit un apport dans la boîte MEA; (D) pompe péristaltique pour pomper la solution vers et depuis la boîte MEA; E)régulateur de température; (F) Plaque de connecteur MEA qui reçoit les signaux de l’antenne MEA; (G)amplificateur; H)ordinateur; (I) bouteille de collecte pour la solution de déchets usagés de la boîte MEA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Positionnement du tissu nodal SA sur MEA. (A) Outils utilisés pour positionner le tissu: (i) Maille avec une taille de grille de 1,5 mm, (ii) ancrage de harpe, (iii) pinces osseuses, (iv) pinceau. (B) Positionnement du tissu sur l’AE MEA. La boîte jaune indique la zone approximative de la région du nœud sino-auriculaire sous le maillage et l’ancre dans la boîte MEA. C) Disposition de la boîte MEA avec du tissu enfermé sur la plaque de connexion pour l’enregistrement du potentiel de champ: i) entrée pour la solution d’enregistrement; ii) entrée de gaz (carbogène); iii) débouché pour la solution; iv) plaque de connexion à microélectrode; v) bouchon de perfusion; vi) bague d’électrode de référence fixée au capuchon; vii) du ruban adhésif pour maintenir le capuchon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7: Définition du protocole d’acquisition de données dans le logiciel. (A) Exemple de modèle d’enregistrement montrant la disposition des 64 canaux. (B) Exemple des propriétés d’entrée du logiciel pour les conditions d’enregistrement. (C) Exemple du menu Annotations montrant comment ajouter une nouvelle phase pendant l’enregistrement, par exemple pour mesurer les effets des médicaments. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8: Différentes régions des tissus présentant différentes formes d’onde d’activité. Exemple de capture d’écran montrant des formes d’onde de formes et d’amplitudes différentes dans différents canaux. Cependant, tous les canaux affichent des intervalles d’interspike et des fréquences de tir identiques. Les canaux à l’intérieur de la boîte rouge correspondent approximativement aux électrodes placées dans la région SAN du tissu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9: Modèle d’analyse de fréquence de battement. Exemple de modèle montrant la disposition des 64 canaux dans le modèle d’analyse de fréquence de battement. L’encart Rejouer le fichier de données brutes montre un exemple des propriétés d’entrée de la fenêtre d’analyse. Dans cet exemple, les traces 5 à 7 ont été sélectionnées pour l’analyse et la durée de l’analyse pour chaque trace a été désignée comme 60 000 ms. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 10
Figure 10: Définition des paramètres d’analyse pour l’extraction des pointes. (A) Résultats représentatifs du modèle d’analyse pour 3 traces sélectionnées d’un seul canal. Le panneau supérieur affiche la fréquence de battement pour les trois traces sélectionnées (trois regroupements définis de points de données), et chaque point représente une moyenne de 10 s pour la fréquence de battement pendant la trace spécifique. Le panneau central affiche l’intervalle inter-pics pour les trois traces sélectionnées (trois regroupements définis de points de données), et chaque point de données représente l’intervalle inter-pics entre deux pics consécutifs. Le panneau inférieur gauche montre les pics extraits représentatifs sélectionnés pour les 5 dernières s de la troisième trace, tandis que le panneau inférieur droit montre une forme d’onde extraite dérivée du groupe 5-s de pics extraits dans le panneau inférieur gauche. (B) Vue agrandie de la fenêtre d’analyse montrant les paramètres utilisés dans l’analyse de la fréquence de battement pour les 3 traces. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11
Figure 11: Chiffre représentatif montrant une bonne et une mauvaise extraction de données pour un canal particulier. Mauvaise extraction des données: (A) Absence de pics extraits; (B) Pics extraits avec des signaux sonores; (C) Pointes extraites instables. (D) Bonnes données montrant des pics extraits stables sans signaux de bruit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 12
Figure 12: Enregistrements au départ et après administration de 1mM 4-Aminopyridine (4-AP). ( A )L’enregistrementde base à partir d’une seule microélectrographe montre des formes d’onde avec une fréquence de tir stable de 320 bpm dans un cœur WT. (B) Après l’administration de 4-AP, la fréquence de tir ralentit à un taux stable de 210 bpm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La pratique et la maîtrise du processus de dissection SAN sont impératives car le tissu est fragile et un tissu sain est nécessaire pour un enregistrement réussi. Pendant la dissection SAN, une orientation correcte est essentielle pour obtenir la bonne région de tissu. Cependant, l’orientation originale du cœur peut être facilement perdue pendant le processus de dissection, ce qui complique cette entreprise. Par conséquent, pour assurer la bonne orientation gauche-droite, les oreillettes doivent être inspectées visuellement. Typiquement, l’oreillette droite a tendance à être plus transparente, tandis que l’oreillette gauche est généralement plus sombre et plus rouge de couleur25,48. De plus, il est essentiel de ne pas étirer le tissu SAN tout en travaillant avec lui ou en le montant sur la grille d’électrodes, car le tissu est facilement endommagé mécaniquement51. Une astuce pour vérifier le tissu SAN sain et correctement disséqué est de l’examiner dans la solution de Complete Tyrode au microscope pour vérifier que le tissu bat. Une fois la technique maîtrisée, au moins 90% des préparations tissulaires doivent être bonnes pour l’enregistrement.

Plusieurs considérations peuvent améliorer la probabilité de réussite des enregistrements et de l’analyse ultérieure des données. Pour garantir les meilleurs enregistrements, les solutions doivent être soigneusement préparées et testées sur des échantillons de souris d’entraînement avant les enregistrements expérimentaux. Nous avons beaucoup travaillé pour adapter et modifier la solution d’enregistrement afin d’optimiser la santé du tissu SAN. De plus, assurez-vous que le gaz utilisé pour l’enregistrement est carbogène (c.-à-d. 95 % O2/5 % CO2). Les enregistrements unicellulaires utilisent souvent de l’oxygène pur en raison de la composition chimique spécifique de la solution de Tyrode utilisée pour cette application, mais la solution utilisée pour l’enregistrement sur le MEA nécessite un carbogène afin de maintenir un pH stable. L’utilisation d’oxygène pur avec la solution de Tyrode pour les enregistrements MEA provoquera des fluctuations du pH qui peuvent entraîner une détérioration rapide du tissu. L’évaluation des maxima d’amplitude dans les canaux décrits précédemment aidera à déterminer si le tissu est de bonne qualité d’enregistrement. Enfin, pour faciliter l’analyse après l’enregistrement, il est très utile de prendre une image du tissu SAN monté sur le réseau d’électrodes MEA une fois l’enregistrement terminé. Le tissu peut se déplacer légèrement lors de la configuration initiale de l’AE ME, ce qui fournit l’évaluation la plus précise du placement des électrodes pour l’analyse.

Nous proposons des enregistrements MEA comme un moyen complet et précis de caractériser la cadence de tir SAN. Un avantage de la technique MEA est qu’elle permet à l’expérimentateur de capturer des cadences de tir au même niveau que les enregistrements à cellule unique sans avoir besoin d’une expertise électrophysiologique étendue. La technique MEA présente également l’avantage d’éliminer les influences confondantes potentielles des mécanismes neurohumoraux et mécano-électriques, inhérents aux enregistrements cardiaques isolés et aux mesures de blocage autonome in vivo 21. La contraction ventriculaire et la respiration sont les principales influences mécano-électriques qui pourraient altérer la cuisson du SAN, mais elles sont éliminées dans notre préparation tissulaire 52,53. Bien que notre technique élimine la plupart des influences autonomes sur le SAN, un nombre limité de projections ICNS restantes dans les oreillettes droites pourrait potentiellement avoir un impact sur le tir SAN, une limitation théorique qui doit être gardée à l’esprit lors de l’interprétation des résultats5,6,22,23. Un autre avantage de la technique MEA décrite ici est qu’elle peut être adaptée à de nombreux autres types d’études cardiaques. Par exemple, bien que ce protocole ait démontré les effets du 4-AP sur l’activité du SAN, de futures études pourraient examiner un nombre presque illimité d’agents pharmacologiques, ainsi que les effets des mutations génétiques sur le déclenchement intrinsèque du SAN. Par exemple, l’ivabradine, un bloqueur spécifique du canal Hcn4 spécifique au SAN, pourrait être utilisé pour étudier les contributions actuelles amusantes à la cadence de tir54. Le système MEA peut également être utilisé pour mesurer la fonction cardiaque dans d’autres régions du cœur, ce qui permet une caractérisation détaillée et spécifique à la région. Cependant, l’enregistrement à partir d’autres régions cardiaques nécessiterait différentes approches de dissection et la possibilité d’une section de tissu mince avant l’enregistrement. Une limitation potentiellement importante de cette technique est le coût élevé de l’achat d’un système MEA qui peut être prohibitif. Plusieurs systèmes MEA sont disponibles sur le marché avec des caractéristiques et des fonctionnalités similaires, mais le coût élevé reste le même. Cependant, une fois l’équipement et le logiciel initiaux acquis, le coût de maintenance et d’utilisation du système MEA est assez faible. Une autre limite est que le système MEA ne permet que l’enregistrement des potentiels de champ extracellulaire qui ne sont pas propices à des comparaisons précises des caractéristiques du potentiel d’action (par exemple, l’amplitude et la forme) entre les préparations telles que celles qui peuvent être obtenues avec des enregistrements intracellulaires unicellulaires. En résumé, ce protocole fournit un flux de travail efficace pour mesurer et analyser les taux de tir cardiaques intrinsèques dans les tissus SAN de souris avec la capacité d’étudier les effets de l’intervention pharmacologique sur la vitesse de tir d’une manière très spécifique.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par les National Institutes of Health, numéros de subvention R01NS100954 et R01NS099188.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Aminopyridine Sigma A78403-25G
22 gauge syringe needle Fisher Scientific 14-826-5A Used for dissection
23 gauge syringe needle Fisher Scientific 14-826-6C Used for dissection
60mm Petri Dishes Genesee Scientific 32-105G
500mL Pyrex Bottle Fisher Scientific 06-414-1C Used to store solutions
1000 mL Pyrex Bottle Fisher Scientific 06-414-1D Used to store solutions
Bone Forceps Fine Science Tools 16060-11
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C5080-500G
Carbogen (95% O2, 5% CO2)
Castroviejo Scissors, 4" Fine Science Tools 15024-10
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021-1KG
Data Acquisition PC CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920x1080
Dissection Microscope Jenco
Dissecting Pins Fine Science Tools 26002-20
Dumont #2 Laminectomy Forceps Fine Science Tools 11223-20
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11295-51
 Extra Fine Graefe Forceps Fine Science Tools 11152-10
Glass Chamber Grainger 49WF30 Used for mouse euthanization
Harp Anchor Kit Warner Instruments  SHD-22CL/15 WI 64-0247
HCl Fisher Chemicals SA48-4 Used for pH balancing
Hemostat Fine Science Tools 13013-14
Heparin Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram NDC 63739-953-25
HEPES Sigma-Aldrich H3375-250G
Inverted Microscope Motic AE2000
Isoflurane Patterson Veterinary 07-893-1389
Lab Tape Fisher Scientific 15-950
Light for Dissection Microscope Dolan-Jenner MI150DG 660000391014
Magesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 208337-100G
MED64 Head Amplifier MED64 MED-A64HE1S
MED64 Main Amplifier MED64 MED-A64MD1A
MED64 Perfusion Cap MED64 MED-KCAP01
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit MED64 MED-KPK02
MED64 ThermoConnector MED64 MED-CP04
Mesh  Warner Instruments 640246
Microelectrode array (MEA) Alpha Med Scientific MED-R515A
Mobius Software WitWerx Inc. Specific software for the MED64
NaOH Fisher Chemicals S320-500 Used for pH balancing
Normal Saline Ultigiene NDC 50989-885-17
Paint Brush Fisher Scientific NC1751733
Parafilm Genesee Scientific PM-996
Peristaltic Pump Gilson F155009
Peristaltic Pump Tubing Fisher Scientific 14-171-298 1/8'' Interior Diameter
Polyethyleneimine Sigma P3143
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333-500G
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655-500G
Sodium Bicarbonate Sigma S6297
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-3
Sylgruard Elastomer Kit Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S6566
Sodium tetraborate Sigma S9640
Surgical Scissors Fine Science Tools 14074-09
Transfer Pipets (3mL graduated) Samco Scientific 225

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
  2. Josea, A. D., Collison, D. The normal range and determinants of the intrinsic heart rate in man. Cardiovascular Research. (4), 160-167 (1970).
  3. Peters, C. H., Sharpe, E. J., Proenza, C. Annual Review of Physiology Cardiac Pacemaker Activity and Aging. Annual Review of Physiology. 82, 21-43 (2019).
  4. Keith, A., Flack, M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. Journal of Anatomy and Physiology. 41 (3), 172-189 (1907).
  5. Wake, E., Brack, K. Characterization of the intrinsic cardiac nervous system. Autonomic Neuroscience. 199, (2016).
  6. Fedele, L., Brand, T. The intrinsic cardiac nervous system and its role in cardiac pacemaking and conduction. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 7 (4), 1-33 (2020).
  7. Mangrum, J. M., DiMarco, J. P. The evaluation and management of bradycardia. New England Journal of Medicine. 342 (10), 703-709 (2000).
  8. Adan, V., Crown, L. A. Diagnosis and treatment of Sick Sinus Syndrome. American Family Physician. 67 (8), 1725-1732 (2003).
  9. Semelka, M., Gera, J., Usman, S. Sick Sinus Syndrome: A Review. American Family Physician. 87 (10), 691-696 (2013).
  10. Zaragoza, M. V., et al. Exome sequencing identifies a novel LMNA splice-site mutation and multigenic heterozygosity of potential modifiers in a family with Sick Sinus Syndrome, dilated cardiomyopathy, and sudden cardiac death. PLoS ONE. 11 (5), 0155421 (2016).
  11. Brugada, J., Campuzano, O., Arbelo, E., Sarquella-Brugada, G., Brugada, R. Present status of Brugada Syndrome: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (9), 1046-1059 (2018).
  12. Rollin, A., et al. Prevalence, characteristics, and prognosis role of type 1 ST elevation in the peripheral ECG leads in patients with Brugada syndrome. Heart Rhythm. 10 (7), 1012-1018 (2013).
  13. Patel, N., Majeed, F., Sule, A. A. Seizure triggered by Sick Sinus Syndrome. BMJ case reports. 4, 2017222011 (2017).
  14. Knecht, S., et al. Impact of pharmacological autonomic blockade on complex fractionated atrial electrograms. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (7), 766-772 (2010).
  15. Saba, S., London, B., Ganz, L. Autonomic blockade unmasks maturational differences in rate-dependent atrioventricular nodal conduction and facilitation in the mouse. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 14 (2), 191-195 (2003).
  16. Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 51-56 (2002).
  17. Tse, G., Tse, V., Yeo, J. M., Sun, B. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts. PLoS ONE. 11 (2), 0148858 (2016).
  18. Tse, G., et al. Quantification of beat-to-beat variability of action potential durations in Langendorff-perfused mouse hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1578), 01578 (2018).
  19. Avula, U. M. R., et al. Heterogeneity of the action potential duration is required for sustained atrial fibrillation. JCI Insight. 5 (11), 128765 (2019).
  20. Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. (135), e57617 (2018).
  21. Quinn, A. T., Kohl, P. Cardiac mechano-electric coupling: Acute effects of mechanical stimulation on heart rate and rhythm. Physiological Reviews. 101 (1), 37-92 (2021).
  22. Ripplinger, C. M., Noujaim, S. F., Linz, D. The nervous heart. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 199-209 (2016).
  23. Pauza, D. H., Pauziene, N., Pakeltyte, G., Stropus, R. Comparative quantitative study of the intrinsic cardiac ganglia and neurons in the rat, guinea pig, dog and human as revealed by histochemical staining for acetylcholinesterase. Annals of Anatomy. 184, 125-136 (2002).
  24. Golovko, V., Gonotkov, M., Lebedeva, E. Effects of 4-aminopyridine on action potentials generation in mouse sinoauricular node strips. Physiological Reports. 3 (7), 12447 (2015).
  25. Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), e54555 (2016).
  26. Doi, M., Ogawa, E., Arai, T. Effect of a photosensitization reaction performed during the first 3 min after exposure of rat myocardial cells to talaporfin sodium in vitro. Lasers in Medical Science. 32 (8), 1873-1878 (2017).
  27. Takanari, H., et al. A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology. Journal of Cellular Physiology. 231 (10), 2249-2256 (2016).
  28. Nakashima, T., et al. Rapid electrical stimulation causes alterations in cardiac intercellular junction proteins of cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1324-1333 (2014).
  29. Suzuki, S., et al. Effects of aldosterone on Cx43 gap junction expression in neonatal rat cultured cardiomyocytes. Circulation Journal. 73 (8), (2009).
  30. Horiba, M., et al. T-type Ca2+ channel blockers prevent cardiac cell hypertrophy through an inhibition of calcineurin-NFAT3 activation as well as L-type Ca2+ channel blockers. Life Sciences. 82 (11-12), 554-560 (2008).
  31. Inoue, N., et al. Rapid electrical stimulation of contraction modulates gap junction protein in neonatal rat cultured cardiomyocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases and effects of angiotensin II receptor agonist. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 914-922 (2004).
  32. Aalders, J., et al. Effects of fibrillin mutations on the behavior of heart muscle cells in Marfan syndrome. Scientific Reports. 10 (16756), (2020).
  33. Matsuura, K., et al. Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets. Biomaterials. 32 (30), 7355-7362 (2011).
  34. Fujita, H., Shimizu, K., Nagamori, E. Application of a cell sheet-polymer film complex with temperature sensitivity for increased mechanical strength and cell alignment capability. Biotechnology and Bioengineering. 103 (2), 370-377 (2009).
  35. Baba, S., et al. Generation of cardiac and endothelial cells from neonatal mouse testis-derived multipotent germline stem cells. Stem Cells. 25 (6), 1375-1383 (2007).
  36. Baba, S., et al. Flk1+ cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model. Cardiovascular Research. 76 (1), 119-131 (2007).
  37. Shimizu, K., et al. Construction of multi-layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 803-809 (2007).
  38. Haraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. Electrical coupling of cardiomyocyte sheets occurs rapidly via functional gap junction formation. Biomaterials. 27 (27), 4765-4774 (2006).
  39. Miyagawa, S., et al. Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: Their integration with recipient myocardium. Transplantation. 80 (11), 1586-1595 (2005).
  40. Watts, M., et al. Decreased bioavailability of hydrogen sulfide links vascular endothelium and atrial remodeling in atrial fibrillation. Redox Biology. 38, 101817 (2021).
  41. Feng, Y., Cao, H., Zhang, Y. Prediction model of sinoatrial node field potential using high order partial least squares. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 1805-1811 (2015).
  42. Feng, Y., Cao, H., Wang, Y., Zhang, Y. Fuzzy linguistic prediction model for sinoatrial node field potential analysis in acute hyperglycemia environment. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, Suppl 1 881-887 (2015).
  43. Suzuki, K., Matsumoto, A., Nishida, H., Reien, Y., Maruyama, H., Nakaya, H. Termination of aconitine-induced atrial fibrillation by the KACh-channel blocker tertiapin: underlying electrophysiological mechanism. Journal of Pharmacological Sciences. 125 (4), 406-414 (2014).
  44. Chang, S. -L., et al. Heart failure enhances arrhythmogenesis in pulmonary veins. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 38 (10), 666-674 (2011).
  45. Wang, Y. -J., et al. Time-dependent block of ultrarapid-delayed rectifier K+ currents by aconitine, a potent cardiotoxin, in heart-derived H9c2 myoblasts and in neonatal rat ventricular myocytes. Toxicological Sciences. 106 (2), 454-463 (2008).
  46. Lai, Y. -J., Huang, E. Y. -K., Yeh, H. -I., Chen, Y. -L., Lin, J. J. -C., Lin, C. -I. On the mechanisms of arrhythmias in the myocardium of mXinα-deficient murine left atrial-pulmonary veins. Life Sciences. 83 (7-8), 272-283 (2008).
  47. Gustafson-Wagner, E. A., et al. Loss of mXinα, an intercalated disk protein, results in cardiac hypertrophy and cardiomyopathy with conduction defects. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (5), 2680-2692 (2007).
  48. Clark, R. B., et al. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, 1757-1766 (2004).
  49. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
  50. Nikmaram, M. R., et al. Characterization of the effects of Ryanodine, TTX, E-4031 and 4-AP on the sinoatrial and atrioventricular nodes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 96 (1-3), 452-464 (2008).
  51. Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
  52. Masé, M., Glass, L., Ravelli, F. A model for mechano-electrical feedback effects on atrial flutter interval variability. Bulletin of Mathematical Biology. 70 (5), 1326-1347 (2008).
  53. Franz, M. R., Bode, F. Mechano-electrical feedback underlying arrhythmias: The atrial fibrillation case. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 82 (1-3), 163-174 (2003).
  54. Bucchi, A., Tognati, A., Milanesi, R., Baruscotti, M., DiFrancesco, D. Properties of ivabradine-induced block of HCN1 and HCN4 pacemaker channels. Journal of Physiology. 572 (2), 335-346 (2006).

Tags

Médecine numéro 173 réseau de microélectrodes nœud sino-auriculaire pacemaking cadence de tir rythme cardiaque intrinsèque taux de tir intrinsèque
Enregistrement par réseau de microélectrodes de la vitesse de tir du nœud sino-auriculaire pour identifier les défauts cardiaques intrinsèques de la fabrication du rythme chez la souris
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, P., Si, M., Paulhus, K.,… More

Kumar, P., Si, M., Paulhus, K., Glasscock, E. Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice. J. Vis. Exp. (173), e62735, doi:10.3791/62735 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter