Summary
פרוטוקול זה נועד לתאר מתודולוגיה חדשה למדידת קצב ירי לב מהותי באמצעות הקלטת מערך microelectrode של כל רקמת הצומת sinoatrial כדי לזהות פגמים בקצב בעכברים. סוכנים פרמקולוגיים יכולים גם להיות הציג בשיטה זו כדי ללמוד את ההשפעות שלהם על קצב מהותי.
Abstract
צומת sinoatrial (SAN), הממוקם באטריום הימני, מכיל את תאי קוצב הלב, וחוסר תפקוד של אזור זה יכול לגרום טכיקרדיה או ברדיקרדיה. זיהוי אמין של פגמים בקצב הלב דורש מדידה של קצב לב מהותי על ידי מניעת ההשפעה של מערכת העצבים האוטונומית, אשר יכול להסוות ליקויים בקצב. שיטות מסורתיות לניתוח תפקוד קוצב לב מהותי כוללות מצור אוטונומי המושרה על ידי סמים כדי למדוד את קצב הלב vivo, הקלטות לב מבודדות כדי למדוד קצב לב מהותי, ורצועת sinoatrial או הקלטות תיקון-מהדק תא יחיד של תאי קוצב לב sinoatrial כדי למדוד פעולה ספונטנית שיעורי ירי פוטנציאליים. עם זאת, טכניקות מסורתיות יותר אלה יכולות להיות מאתגרות מבחינה טכנית וקשה לביצוע. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה חדשה למדידת קצב ירי לב מהותי על ידי ביצוע מערך microelectrode (MEA) הקלטות של תכשירי צומת sinoatrial הר שלם מעכברים. MEAs מורכבים ממיקרו-ectrodes מרובים המסודרים בתבנית דמוית רשת להקלטת פוטנציאל שדה חוץ-תאי במבחנה. לשיטה המתוארת כאן יש יתרון משולב של להיות מהיר יחסית, פשוט יותר ומדויק יותר מאשר גישות קודמות להקלטת קצב לב מהותי, תוך מתן אפשרות לחקירה תרופתית קלה.
Introduction
הלב הוא איבר מורכב הנשלט על ידי השפעות מהותיות וחיצוניות כגון אלה שמקורן במוח. צומת סינוטריאל (SAN) הוא אזור מוגדר בלב המאכלס את תאי קוצב הלב (המכונים גם תאי סינוטריאליים, או תאי SA) האחראים על החניכה וההנצחה של פעימות הלב של היונקים1,2. קצב הלב המהותי הוא הקצב המונע על ידי תאי קוצב הלב ללא השפעה על השפעות לבביות או נוירו-הומוריסטיות אחרות, אך מדדים מסורתיים של קצב הלב בבני אדם ובעלי חיים חיים, כגון אלקטרוקרדיוגרמה, משקפים הן את קוצב הלב והן את ההשפעות העצביות על הלב. ההשפעה העצבית הבולטת ביותר על תאי SA היא ממערכת העצבים האוטונומית, אשר כל הזמן מווסת דפוסי ירי כדי לענות על הדרישות הפיזיולוגיות של הגוף3. תמיכה ברעיון זה, הן תחזיות אוהדות והן תחזיות parasympathetic ניתן למצוא ליד SAN4. מערכת העצבים הלב הפנימית (ICNS) היא השפעה עצבית חשובה נוספת שבה plexi גנגליוני, במיוחד atria הימני, innervate ולווסת את הפעילות של SAN5,6.
הבנת גירעונות קצב היא חשובה מבחינה קלינית, כמו תפקוד לקוי יכול לעמוד בבסיס הפרעות לב רבות, כמו גם לתרום לסיכון של סיבוכים אחרים. תסמונת סינוס חולה (SSS) היא קטגוריה של מחלות המאופיינת בתפקוד לקוי של צומת sinoatrial אשר פוגע בקצב תקין7,8. SSS יכול להציג עם סינוס ברדיקרדיה, הפסקות סינוסים, מעצר סינוס, בלוק יציאה sinoatrial, לסירוגין bradyarrythmias ו tachyarrhythmias9 והוא יכול להוביל לסיבוכים כולל סיכון מוגבר לשבץ תסחיף ומוותפתאומי 8,10. אלה עם תסמונת Brugada, הפרעת לב מסומן על ידי פרפור חדרית עם סיכון מוגבר למוות לבבי פתאומי, נמצאים בסיכון גבוה יותר לאירועים הפרעות קצב אם יש להם גם תפקוד לקוי SAN comorbid11,12. תפקוד לקוי של Sinoatrial עשוי להיות גם השלכות פיזיולוגיות מעבר ללב. לדוגמה, SSS נצפתה לעורר התקפים בחולה עקב hypoperfusion מוחי13.
כדי לזהות גירעונות קצב sinoatrial, קצב הלב המהותי צריך להיקבע על ידי מדידת הפעילות של SAN ללא ההשפעה של מערכת העצבים האוטונומית או גורמים הומוריסטיים. מבחינה קלינית, זה יכול להיות בערך על ידי מצור אוטונומי פרמקולוגי14, אבל אותה טכניקה יכולה להיות מיושמת גם במודלים יונקים כדי לחקור תפקוד לב מהותי15,16. בעוד גישה זו חוסמת חלק גדול של השפעות עצביות תורמות ומאפשרת בדיקת לב in vivo, זה לא מבטל לחלוטין את כל ההשפעות הקיצוניות על הלב. טכניקת מחקר נוספת המשמשת לחקר תפקוד הלב המהותי במודלים של בעלי חיים היא הקלטות לב מבודדות באמצעות לבבות חדורי לנגנדורף, הכוללים בדרך כלל מדידות באמצעות אלקטרוגרמות, קצב, או מערכים רב-אלקטרוניים אפיקרדיים17,18,19,20. בעוד טכניקה זו היא ספציפית יותר לתפקוד הלב שכן היא כרוכה בהסרת הלב מהגוף, המדידות עשויות עדיין להיות מושפעות ממנגנוני פיקוח אוטומטי מכני-חשמלי שיכולים להשפיע על מדידות דופק מהותיות21. הקלטות הלב המבודדות עשויות עדיין להיות מושפעות גם מרגולציה אוטונומית באמצעות ICNS5,6,22,23. יתר על כן, שמירה על טמפרטורה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית של הלב, שהיא קריטית למדידות תפקוד הלב, יכול להיות קשה בגישות לבמבודדות 20. שיטה ישירה יותר לחקר תפקוד SAN היא לבודד באופן ספציפי רקמת SAN ולמדוד את פעילותה. זה יכול להתבצע באמצעות רצועות SAN (רקמת SAN מבודדת) או תאים מבודדים SAN קוצב לב24,25. שניהם דורשים רמה גבוהה של אימון טכני, שכן SAN הוא אזור קטן מאוד ומוגדר מאוד, ובידוד תאים מהווה אתגר גדול עוד יותר כמו ניתוק יכול לפגוע בבריאות הכללית של התא אם לא מבוצע כראוי. יתר על כן, טכניקות אלה דורשות מיומנויות אלקטרופיזיולוגיות מומחים על מנת להקליט בהצלחה מן הרקמה או התאים באמצעות microelectrodes הקלטה בודדים.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקה להקלטת ה- SAN במבחנה באמצעות מערך מיקרו-ectrode (MEA) כדי להשיג מדידות דופק מהותיות. גישה זו יש את היתרון של הפיכת הקלטות אלקטרופיזיולוגיות ספציפיות מאוד נגיש לחוקרים חסר כישורים אלקטרופיזיולוגיים אינטנסיביים. MEAs שימשו בעבר לחקר תפקוד cardiomyocyte בתרביות cardiomyocyte ראשוני26,27,28,29,30,31,32, גיליונות לב33,34,35,36,37,38,39, ורקמות שלמות הרכבות40, 41,42,43,44,45,46,47. עבודה קודמת נעשתה גם כדי לבחון את פוטנציאל השדה ברקמת SAN41,42. כאן, אנו מספקים מתודולוגיה להשתמש MEA להקליט ולנתח שיעורי ירי SAN מהותי מורין. אנו מתארים גם כיצד טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבדוק השפעות פרמקולוגיות של תרופות על שיעורי ירי פנימיים SAN על ידי מתן ניסוי מדגם מראה את ההשפעות של 4-אמינופירידאין (4-AP), חוסם K+ ערוץ מגודר מתח. באמצעות ציוני דרך אנטומיים מוגדרים, אנו יכולים להקליט במדויק את SAN מבלי לבצע את ניתוחי הרקמות הנרחבים או בידודי תאים הנדרשים בשיטות אחרות. בעוד MEA יכול להיות עלות אוסרת, ההקלטות מספקות אמצעים ספציפיים ואמינים מאוד של קצב שניתן להשתמש בהם במגוון עצום של יישומי מחקר קליניים ופיזיולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הניסיוניים המתוארים כאן בוצעו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), כפי שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) באוניברסיטה המתודיסטית הדרומית.
1. ציפוי מערך ריבוי הבחירה (MEA) להקלטה
- הפוך חוצץ בוראט 25 מ"מ.
- יש להמיס 0.953 גרם של Na2B4O7·10 H2O ב-80 מ"ל של מים מזוקקים.
- כוונן את ה- pH ל- 8.4 עם HCl ולאחר מכן הוסף מים מזוקקים לנפח סופי של 100 מ"ל.
- הפוך פתרון מניות 0.1% של פוליאתילנין (PEI).
- הוסף 100 μL של 50% (w/v) PEI ל 4.9 מ"ל של מים מזוקקים כדי להפוך פתרון PEI 1%.
- לדלל את פתרון 1% PEI כדי 0.1% במאגר borate על ידי הוספת 1 מ"ל של פתרון 1% PEI ל 9 מ"ל של 25 mM borate חוצץ.
- Pipette ~ 1 מ"ל של פתרון 0.1% PEI לתוך מערך microelectrode (MEA) צלחת, כך האלקטרודות מכוסות לחלוטין(איור 1A ו 1B).
הערה: microelectrodes של MEA מורכבים בדרך כלל פלטינה שחור או פחמן צינורות מבודד עם פולימיד (או אקריליק); שני החומרים הידרופוביים. על ידי ציפוי MEA עם פולימר קטיקטי כגון PEI, משטח MEA הידרופובי נעשה הידרופילי יותר, המאפשר דגימות רקמה ליצור מגע טוב יותר עם משטח MEA (איור 1A1). - מכסים את מנת MEA בסרט תרמופלסטי כדי להפחית את האידוי ולהשאיר את MEA לילה בטמפרטורת החדר(איור 1C).
- שאפו את תמיסת PEI מצלחת MEA באמצעות פיפטה, נזהרו שלא לגעת ברשת האלקטרודה שעלולה לפגוע באלקטרודות, ולאחר מכן שטפו ≥4 פעמים במים מזוקקים(איור 1D).
- יש לאחסן את MEA מצופה PEI מתחת ל-1-2 מ"ל של מים אולטרה-תותים ואטומים בסרט תרמופלסטי ב-4 מעלות צלזיוס עד הצורך. לחלופין, אחסנו את ה-MEA המצופה על ידי טביעתה בכוב מלא במים אולטרה-תפותיים(איור 1E).
הערה: תהליך ציפוי PEI צריך להתבצע רק פעם אחת עבור MEA לפני השימוש הראשון שלה, ולאחר כל הקלטה, MEA צריך להיות מאוחסן שקוע במים אולטרה-ספיר.
2. הכנת פתרון שלם של טיירוד לפירוק רקמות
- הפוך 1,000 מ"ל של פתרון שלם של טיירוד עבור ביתור; ראשית, להוסיף 8.1816 גרם של NaCl ל 800 מ"ל של מים אולטרה-תות.
- הוסף את הכמות הבאה של כימיקלים לפתרון: 0.4025 גרם של KCl; 0.1633 גרם של KH2PO4; 1.1915 גרם של HEPES; 0.9999 גרם של גלוקוז; 0.0952 גרם של MgCl2; 0.2646 גרם של CaCl2·2H2O.
- התאימו את ה-pH ל-7.4 עם NaOH ולאחר מכן הוסיפו מים אולטרה-תפותיים עד שהנפח הכולל יהיה 1,000 מ"ל.
הערה: ההרכב הסופי של הפתרון של טיירוד השלם יהיה כדלקמן (ב mM): 140 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 KH2PO4, 5 HEPES, 5.55 גלוקוז, 1 MgCl2, 1.8 CaCl2.
3. הכנת הפתרון של טיירוד מחומצן להקלטה
- הפוך 500 מ"ל של הפתרון של טיירוד; להוסיף 4.003 גרם של NaCl ל 400 מ"ל של מים אולטרה-תותים.
- הוסף את כמויות הכימיקלים הבאות לפתרון: 0.651 גרם של NaHCO3; 0.042 גרם של NaH2PO4; 0.132 גרם של CaCl2·2H2O; 0.149 גרם של KCl; 0.0476 גרם של MgCl2; 0.999 גרם של גלוקוז.
- כוונן את ה- pH ל- 7.4 עם HCl ולאחר מכן הוסף מים אולטרה-תפותיים עד שהנפח הכולל הוא 500 מ"ל.
- לחמצן את הפתרון עם קרבוגן לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני תחילת ההקלטה.
הערה: ההרכב הסופי של הפתרון של טיירוד יהיה כדלקמן (ב mM): 137 NaCl, 15.5 NaHCO3, 0.7 NaH2PO4, 1.8 CaCl2, 4 KCl, 1 MgCl2, 11.1 גלוקוז. לפתרון של טיירוד זה יש הרכב שונה במקצת מהפתרון של טיירוד השלם המשמש לפירוק.
4. הכנת פתרון 4-אמינופירידין (4-AP) לאפנונון פרמקולוגי
- הפוך פתרון עבודה של 1 מ"מ של 4-AP; להוסיף 18.82 מ"ג של 4-AP עד 200 מ"ל של הפתרון של טיירוד מהשלב 3.
- לחמצן את פתרון 4-AP לפחות 30 דקות לפני הניסוי.
5. הכנת צלחת הפטרי לפירוק
- מערבבים רכיבי אלסטומר סיליקון ביחס של 10:1 (לפי משקל) של הבסיס לסוכן ריפוי.
- יוצקים ~ 15 מ"ל של תערובת אלסטומר סיליקון לתוך צלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ.
- אפשר לאלסטומר לרפא בטמפרטורת החדר במשך 48 שעות לפני השימוש.
הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בצלחת פטרי מסיליקון עבור ניתוחים עתידיים.
6. לנתח את צומת sinoatrial (SAN)
- הכן את הפתרון של טיירוד השלם ההפכן לפירוק SAN.
- הוסף 400 μL של הפרין (1,000 USP / mL) כדי 40 מ"ל של הפתרון של טיירוד להשלים ולהתחמם באמבט מים 37 °C.
- הזריקו לעכבר תוך-איטרא-איטרה ב-200-300 מיקרו-לן הפרין (1000 USP/מ"ל) ואפשרו לחיה לשבת במשך 10 דקות.
- המתת חסד העכבר הפריני על ידי מנת יתר איזופלוריין.
- מניחים את העכבר בתא זכוכית קטן המכיל אדי איזופלוראן שנוצרו על ידי הוספת 200-300 μL של איזופלוראן נוזלי לנייר מסנן בתוך צינור פלסטיק מחורר.
הערה: מכיוון שאיזופלוראן יכול לגרום לגירוי בעור ויכול להיספג גם דרך העור, הנוזל לא צריך לפנות ישירות לעכבר. לכן, ניגוב ספוג איזופלוראן ממוקם בצינור מחורר לניהול. - לאמת את המוות על ידי הפסקת תנועה ומאמץ נשימה ועל ידי היעדר רפלקס צביטת בוהן. המוות בדרך כלל לוקח בערך 1-2 דקות לאחר מיקום לתוך החדר.
הערה: המוות מלווה בדרך כלל במתן שתן.
- מניחים את העכבר בתא זכוכית קטן המכיל אדי איזופלוראן שנוצרו על ידי הוספת 200-300 μL של איזופלוראן נוזלי לנייר מסנן בתוך צינור פלסטיק מחורר.
- הנח את העכבר בתנוחה על לוח ניתוח עם כפות מושטות ותקן את כפות הרגליים ללוח באמצעות מחטי מזרק באורך 1 אינץ ', 23 מד. לאחר מכן להסיר את הפרווה בקרבת החלק התחתון של כלוב הצלעות באמצעות מספריים כירורגיים חיתוך הפרווה בשורשים.
הערה: עבור לוח ניתוח, ניתן להשתמש במכסים קרירים יותר של פוליסטירן. - בעת החזקת העור עם hemostat, להשתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך רוחבי בעור ממש מתחת לתחתית כלוב הצלעות בערך קשת קוסטל שמאל לקשת העלות הימנית(איור 3A).
- חותכים את הצי עם מספריים כירורגיים ומפרידים בזהירות את הכבד מהסרעפת, נזהרים שלא לחתוך את הכבד, מה שיגרום לדימום מוגזם(איור 3B). יש לבלום את הסרעפת לאורך בית החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה (איור 3C-D).
- באמצעות מספריים כירורגיים, לחתוך את הקירות לרוחב של כלוב הצלעות משולי הקשתות היקרות עד הבריח כדי לחשוף את הלב, תוך הקפדה כדי למנוע פגיעה בלב(איור 3D). לאחר מכן השתמש במחט מזרק 23 מד להצמיד את כלוב הצלעות מעל הכתף, מחזיק אותו במקום ומחוץ לדרך של השדה הכירורגי.
- השתמש פיפטה העברה כדי לטפטף חם (37 °C) הפנטזה פתרון של טיירוד מלא על הלב כדי לשמור אותו לח.
הערה: אין לאפשר ללב להתייבש. - הסר את הריאות על ידי החזקתם עם מלקחי גראפה עדינים במיוחד וניתוק קנה הנשימה במספריים כירורגיים(איור 3E).
- החזק את פסגת הלב עם מלקחי גראפה עדינים במיוחד ולהסיר אותו על ידי חיתוך avae aorta ו venae עם מספריים כירורגיים. העבירו את הלב לצלחת פטרי המכילה אלסטומר סיליקון נרפא(איור 4A)והשתמשו בפפטה להעברה כדי לרחוץ את הלב עם 2-3 מ"ל של תמיסה חמה (37 מעלות צלזיוס) של טיירוד ההפרין.
הערה: היזהר לא לפגוע בקיר האחורי העדין של atria הימני, אשר מכיל את SAN, ואת ורידים ישר הימני המחובר. רחצת הלב עם הפתרון של Complete Tyrode מונעת מהלב להתייבש אך אינה שקועה לגמרי בלב בתמיסה מכיוון שהיא תפגע בנראות במהלך הניתוח. - כוון את הלב עם האטריום הימני מימין לנסיין והאטריום השמאלי משמאלו של הנסיין.
הערה: ניתוח של רקמת SAN צריך להיעשות במהירות על מנת למנוע פגיעה הקשורה לאיסכמיה. - מחברים את פסגת הלב לצלחת עם סיכת ניתוח. לאחר מכן, בעודם מחזיקים את הוועד הנבוב הנחות עם דומונט #2 מלקחיים לכריתת למינקטומיה, הכנס מחט מזרק 22 גרם דרך הוועד הנבוב הנחות והעליון כדי לאתר את מיקומם באטריום הימני, המזהה גם את המיקום המשוער של ה- SAN (הממוקם בחלקת הרקמה בין הוועד הנחות והעליון (איור 4B).
- בעזרת סיכות דיסקציה קטנות, מצמידים את נספחי האיתרים השמאליים והימנים לצלחת.
- בעוד מחזיק את התוספתן השמאלי של האיתורים עם דומונט #2 מלקחיים לכריתת למינקטומיה, הציב סיכת ניתוח דרך התוספתן השמאלי של האיתוזים כדי להחזיק אותו במקומו.
- בעוד מחזיק את התוספתן הנכון בפרוזוזים עם דומונט #55 מלקחיים, לשים סיכת ביתר דרך התוספתן האיזדונתי הנכון להחזיק אותו במקום.
הערה: אותו סוג של מלקחיים יכול לשמש כדי להחזיק את נספחי האיתורים השמאלי והיני אם תרצה.
- הסר את מחט המזרק המשתרעת על פני קווה הניר.
- כדי לשחרר דם מהלב, השתמש במספריים Castroviejo כדי להסיר את פסגת הלב (כלומר, החצי התחתון) על ידי ביצוע חתכים רוחביים על פני החדרים(איור 4C). לאחר מכן, לשטוף את הלב על ידי הוספת חם (37 °C) הפנטזה פתרון של טיירוד מלא עם פיפטה העברה.
- השתמש במספריים Castroviejo לחתוך לאורך מחיצת atrioventricular שמירה על החתך קרוב יותר לחדר מאשר אטריה. ממשיכים לחתוך לאורך מחיצת atrioventricular עד atria מופרדים מן החדרים.
- חותכים לאורך המחיצה הבין-ארצית כדי להסיר את האטריום השמאלי.
- הניחו סיכות דיסקציה בשולי האטריום הימני כדי להפוך אותו לשכב שטוח(איור 4D). הסר כל השומן הנותרים, כלי הדם או הרקמה מן האטריום באמצעות מספריים Castroviejo.
- אתר את SAN באטריום הימני, אשר בכיוון זה גובל בערך על ידי הווריד העליון (בחלק העליון), vena cava נחות (בתחתית) ו cristae terminalis (בצד שמאל) (איור 4D).
הערה: ה- crista terminalis מופיע כרכס שרירים כהה בין התוספתן הימני של האיתרים לבין ה- SAN. לעתים קרובות ניתן לראות גם את עורק SAN זורם דרך SAN(איור 4D).
7. הכנת מערכת MEA להקלטה
- הוסיפו את הפתרון של טיירוד (החל מהשלב 3) לבקבוק תמיסה לקלט(איור 5C)וחמצן אותו על ידי הפעלת זרימת גז קרבוגן(איור 5A)למערכת.
הערה: הפתרון של טיירוד המשמש להקלטה שונה במקצת בהרכבו מהפתרון של טיירוד השלם המשמש ליצירה. - אמת את זרימת הקרבוגן על ידי התבוננות בבועות בבקבוק החרוט, המשמש לחות הגז (איור 5B) ובקבוק פתרון הקלט (איור 5C).
- הכנס את צינורות זרימת המשאבה הדיסטלטית (איור 5D) לפתרון ההקלטה של טיירוד(איור 5C). לאחר מכן, הכנס את זרימת המשאבה העגמה העגבת לבקבוק האיסוף(איור 5I).
- הגדר את המשאבה peristaltic ל 25 סל"ד, אשר נותן קצב זרימה של 2 מ"ל / דקה ולהתחיל את המשאבה. בדוק אם קיימים במערכת דליפת מאגר או גלישה.
- הגדר את בקר הטמפרטורה ל-37 °C (5 °F), הטמפרטורה הפיזיולוגית של עכברים(איור 5E).
8. הצבת רקמת הלב על רשת MEA
- העבירו את רקמת SAN המנותחת בעזרת מברשת צבע (איור 6A) מצלחת הפטרי המנותחת לרשת MEA(איור 1A1).
- תוך כדי התבוננות תחת מיקרוסקופ הפוך, מקם בעדינות את הרקמה באמצעות מברשת צבע רכה כך שאזור SAN יכה את רשת האלקטרודה.
- מקם מחדש את הרקמה לפי הצורך כדי להבטיח שהיא שוכבת שטוחה על רשת האלקטרודה, יצירת קשר טוב עם האלקטרודות.
הערה: מברשת צבע רכה נדרשת להזזת הרקמה כדי למנוע פגיעה ברשת האלקטרודה.
- לאחר שהרקמה ממוקמת כראוי, השתמש במלקחיים עצם (או כל מלקחיים מעוקלים) כדי למקם את הרשת מעל הרקמה (איור 6A). לאחר מכן השתמשו במלקחיים העצם כדי למקם את עוגן הנבל(איור 6A)על הרשת כדי להחזיק את הכל במקום(איור 6B).
- קח תמונה של מיקום הרקמה על MEA, כך הפעילות של אלקטרודות בודדות ניתן לתאם עם המיקום האנטומי שלהם במהלך ההקלטה. ניתן לעשות זאת על ידי החזקת טלפון חכם עד למטרת המיקרוסקופ ההפוך או באמצעות מצלמת מיקרוסקופ מחוברת.
הערה: אם כיוון ה- MEA אינו משתנה לאחר צילום התמונה, האלקטרודה השמאלית העליונה תופיע כערוץ הראשון (Ch1) במהלך ההקלטה. - מניחים את צלחת MEA על צלחת המחבר (איור 5F ו- 6C) ומניחים בזהירות את מכסה ההטמה (איור 6C) על צלחת MEA מבלי להפריע לעוגן פרוסת הנבל. ניתן לאבטח עוד יותר את מכסה ההדבקה באמצעות סרט מעבדה(איור 6C).
הערה: בנוסף לתזרים פתרונות מתכווננים וצינורות זרימה, למכסה יש גם יציאה לאספקת גז (איור 6C). בנוסף, טבעת האלקטרודה המתייחסת עוברת דרך המכסה(איור 6C). - אפשר לרקמה להתאושש מהטיפול ולהתאקלם בתא במשך 15-20 דקות לפני ההקלטה.
9. הגדרת פרוטוקול רכישת הנתונים להקלטה
הערה: השלבים הבאים מתארים את פתיחת פרוטוקול התוכנה להקלטת פעימה ספונטנית והגדרת תנאי ההקלטה. הפרטים של שלבים אלה עשויים להשתנות בהתאם לתוכנה הספציפית הנמצאת בשימוש, אך החלוקה הכללית צריכה להישאר זהה.
- הפעל את המגבר (איור 5G) והגדר זרימת עבודה להקלטה בתוכנה במחשב (איור 5H).
- פתח את התוכנה ולחץ על זרימת העבודה.
- בחר פתח תיקיה חדשה.
- פתח את התיקיה מתבניות.
- בחר 64MD1-1920X1080 (בהתאם לרזולוציה של שולחן העבודה).
- פתח את תיקיית ה- QT.
- פתח את תיקיית ההקלטה הספונטנית.
- בחרו בתבנית Beat_recording.מופלו ופתחו אותה ( איור7A).
- הגדר את פרמטרי ההקלטה כדי לציין את מספר המעקבים, משך המעקב, מרווח המעקב, מתח הכניסה, קצב הדגימה וכו ', בהתאם לתנאי ההקלטה הרצויים (איור 7B).
הערה: עבור תדירות פעימה ורכישת נתונים בין-ספייק, השתמש בדרך כלל במתח טווח כניסה של 2.9 mV, מסנן מעבר גבוה של 1 הרץ, מסנן מעבר נמוך של 1000 הרץ וקצב דגימה של 20 קילו-הרץ. - כדי לסמן שלבים או תנאים שונים של הניסוי, כגון לפני ואחרי ניהול התרופות, לחץ על הכרטיסייה ביאורים כדי להוסיף את הסימונים הרצויים (איור 7C).
- כדי לציין את יעד הקובץ לאיסוף הנתונים, בחר בתיבה הפוך אחסון לזמין והזן את שם הקובץ הרצוי בתיבה משנה שמות הקובץ.
10. ביצוע ההקלטה ואיסוף הנתונים
- לחץ על לחצן הקלט ושחק בשורת התפריטים העליונה של תוכנת הרכישה כדי להתחיל את ההקלטה. השג נתונים עבור 10 עקבות של משך של דקה אחת עם מרווחים של 2 דקות בין עקבות.
- מתוך עקבות ראשוניים אלה, ודא כי צורות הגל המוקלטות עולות בקנה אחד עם הכנת רקמות בריאה ואיכותית על ידי אישור כי רוב ערוצי ההקלטה מציגים משרעת אותות של ≥ 0.5 mV ומרווחי ספייק זהים (איור 8).
הערה: הערכה ראשונית של הפעילות וצפורמי הגל של המיקרו-ectrodes הבודדים המתאימים למיקומם האנטומי יכולה להתבצע על ידי התייחסות לתמונה שנרכשה לאחר מיקום הרקמה על ה- MEA. - כדי למדוד את ההשפעות של תרופות על הרקמה, השהה את ההקלטה לאחר רכישת נתונים בסיסיים ראשוניים על-ידי לחיצה על לחצן ההשהיה בשורת התפריטים העליונה.
הערה: ניתן לציין את שלב התגובה לתרופה של הניסוי בהקלטה על ידי לחיצה על הכרטיסייה ביאורים והוספת הציון הרצוי כמתואר לעיל (איור 7C). - השהה את המשאבה והעבר את צינורות זרימת המשאבה מפתרון ההקלטה הרגיל לפתרון של טיירוד המכיל את התרופה הרצויה לפי בחירה.
הערה: בניסוי לדוגמה, הפתרון של טיירוד שימש עם 1 mM 4-אמינופירידין (4-AP). - הפעל מחדש את המשאבה ובבטל את ההשהיה של ההקלטה כדי להתחיל שוב לאסוף נתונים.
- ברגע שהתמיסה של טיירוד חדורה בתרופה הגיעה לרקמה, תקליט 10 עקבות באותו אופן שנעשה בעבר להקלטות הבסיסיות.
הערה: העקבות ייקח קצת זמן כדי להתייצב כמו התרופה מחדירה לתוך תא ההקלטה. מנגנון הפעולה של התרופה עשוי להשפיע גם על יציבות ההקלטה. עבור תרופות שיש להם מנגנוני פעולה הפיכים, יש לרשום גם תקופת שטיפה כדי לאשר שיקום הפעילות לרמות הבסיס, המהווה אינדיקטור לרקמה בריאה. - לחץ על עצור כדי לסיים את ההקלטות.
- קח תמונה סופית של מיקום הרקמה על MEA מתחת למיקרוסקופ במקרה הרקמה השתנתה בעקבות הליך הגדרת ההקלטה הראשוני.
11. ניקוי ההתקנה לאחר ההקלטה
- תנקה את ה-MEA.
- לאחר סיום ההקלטה, הסר בעדינות את פתרון ההקלטה מצלחת MEA באמצעות מיקרופיט 1 מ"ל.
הערה: היזהר לא ליצור קשר עם אלקטרודות MEA אשר יכול לפגוע בהם. - הסר את רשת הנבל עוגן עם מלקחיים עצם (או כל מלקחיים מעוקלים). לאחר מכן השתמש במברשת צבע כדי להוציא את הרקמה מפני השטח MEA תמיד נזהר לא לגעת microelectrodes בודדים.
- בעזרת בקבוק כביסה, יש לשטוף בעדינות את צלחת MEA במים אולטרה-תפותיים בערך פי 3 עד 4.
- יש לאחסן את MEA המנוקה שקוע במים אולטרה-תפומיים ב-4 מעלות צלזיוס.
- לאחר סיום ההקלטה, הסר בעדינות את פתרון ההקלטה מצלחת MEA באמצעות מיקרופיט 1 מ"ל.
- לשטוף את צינורות המערכת על ידי הפעלת מים אולטרה-זרימה דרכו במשך 5 דקות לפחות באמצעות הגדרת המהירות המרבית על המשאבה peristaltic.
הערה: כדי למנוע צמיחה פטרייתית, אין להשאיר מים או תמיסה חוצץ בתוך הצינורות לאחר הניקוי.
12. ניתוח הקלטות MEA כדי למדוד את תדירות פעימת SAN
- פתח את קובץ הנתונים המוקלט שנשמר בתבנית "Beat_frequency_analysis" של תוכנת הניתוח (איור 9).
- לחץ על לחצן הפעל ואפשר להקלטה כולה לפעול כדי להציג חזותית את ערכת הנתונים ולהקצות פרמטרי ניתוח מתאימים.
- בחר את חלון ההרחבה עבור תבנית התצוגה הרצויה של הנתונים, בין אם הוא מוצג כממוצע למעקב או לממוצע לשעה (איור 10A).
- בחרו בערוצים שייכללו בניתוח והגדירו את ערכי הסף הרצויים של משרעת או משרעת מינימה לזיהוי שיא אוטומטי בצורת גל(איור 10B).
הערה: ניתן לבחור ערוץ בודד, שילוב של ערוצים או את כל 64 הערוצים לניתוח בשלב זה (איור 9). אם ערכי הסף שנבחרו קרובים מדי לערכי המקסימום והמינימה של צורת הגל, ייתכן שתוכנות הניתוח לא יזוהו פסגות מסוימות של צורת גל. - הגדר את כמות זמן טרום ספייק ו לאחר ספייק להיכלל בניתוח.
הערה: הגדרות של 50 אלפיות שני לפני ספייק ו 100 אלפיות שני לאחר ספייק בדרך כלל עובד טוב(איור 10B).
- לאחר הגדרת תנאי הניתוח, לחץ שוב על לחצן הפעל כדי להפעיל מחדש את ערכת הנתונים ולאשר כי פרמטרי הניתוח מתאימים לחילוץ ספייק.
- לצורך ניתוח, זהה את שלושת העקבות היציבים ביותר ברציפות המציגים קצב פעימות יציב עבור כל עקבות ברוב הערוצים הן במהלך תקופת הבסיס של הניסוי והן בשלושה עקבות יציבים רצופים נוספים במהלך תקופת החשיפה לתרופה (איור 10A).
- ציין את מעקבי ההתחלה והסיום לניתוח והזן את משך הזמן של כל מעקב שיש לנתח (איור 9).
- לפני תחילת הניתוח, בחר בתיבות הפוך לזמינות הן עבור שמור פעימה לדקה והן עבור שמור מרווח זמן בין-כוכבי ( איור10B).
- הזן את שם הקובץ הרצוי בתיבה משנה שמות הקובץ ( איור10B). הנתונים שנותחו עבור תדירות פעימה ומרווח זמן בין-ספייק יישמרו בצורה של תבנית ASCII (טקסט).
הערה: כדי לנתח תנאים שונים (כגון תגובה בסיסית ותרופה), יש להפעיל את הניתוח בנפרד עבור כל תנאי. - לחץ על לחצן הפעל והקלט בסרגל הטאב העליון כדי להתחיל בניתוח.
- כדי לייצא את הנתונים עבור יישומים אחרים, בחר את התיבות עבור שמור פעימה לדקה ושמור מרווח זמן בין-כוכבי (איור 10B). הזן את שם הקובץ הרצוי בתיבה משנה שמות הקובץ ( איור10B) ולחץ על שמור כדי לשמור את הנתונים המנותחים בתבנית טקסט ASCII בתיקיה שנבחרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר מתן אפשרות לרקמה להתאקלם בצלחת במשך 15 דקות, 10 עקבות של דקה אחת נרשמים. פעילות הרישום הנוכחית שלנו של הפרוטוקול במשך יותר משעה, אך רשמנו דפוסי ירי יציבים במשך ≥4 שעות בנתונים שלא פורסמו שאינם מוצגים כאן. אם הכנה ניסיונית טובה לאיסוף נתונים, כל ערוץ הקלטה צריך להציג צורות גל חוזרות עקביות ומרווחות באופן שווה (כלומר, קוצים) של צורה אחידה עבור ערוץ נתון (איור 11D). צורות גל אלה תואמות פעימות לב בודדות המשקפות פעילות עשיית קצב לבבית מהותית. מרווחי הזמן הבין-כוכביים צריכים להיות זהים עבור כל ערוץ גם אם הם לא עשויים להיות מיושרים בצורה מושלמת בין ערוצים בשל הבדלים קטנים במיקום שלהם ביחס לאתר החניכה של דה-פולאריזציה (איור 8). למרות שצורת צורות הגל עבור ערוץ נתון צריכה להיות עקבית, צורת צורות הגל תשתנה בין ערוצים בהתאם למיקום האלקטרודה ברקמה(איור 8). מידת המגע של הרקמה עם האלקטרודה עשויה להשפיע גם על מאפיינים צורת גל, כגון משרעת. עם זאת, משרעת מקסימה צריך להיות לפחות 0.5 mV עבור רוב הערוצים אם ההכנה היא משביעת רצון. מתוך 10 העקבות המוקלטות, שלושת הערוצים הרצופים העונים בצורה הטובה ביותר על קריטריוני האיכות שתוארו לעיל נבחרו לניתוח נוסף המתואר להלן. איור 10A מציג מדגם של תדירות פעימה יציבה (פאנל עליון) ומרווח זמן בין-כוכבי (פאנל אמצעי) לשלושה עקבות רצופים. רקמות שאינן עומדות בקריטריונים אלה לא צריך להיות מפורסם כמו יש נזק רקמות סביר שיעכב איסוף נתונים מדויק. איור 11 מציג דוגמאות לדפוסי ספייק גרועים שחולצו , אשר נעדרים (A), מושפעים מרעש (B), או לא יציבים (C).
הנתונים לדוגמה המוצגים בנתונים נאספו מעכבר בן 45 יום של ילד זכר שחור שוויצרי שחור (Tac:N:NIHS-BC). הליך הניתוח המתואר באיור 9 ובאיור 10 שימש לחילוץ קצב הירי המהותי ולהציג קוצים בסיסיים שניתן לראות באיור 12A. קצב הירי הוא השיעור הממוצע על פני 60,000 אלפיות השנייה מכל אחד משלושת העקבות, אך דפוס הספייק באיור 12A מראה 5 s של ייצוגים עולים מעקב אחד. באמצעות תוכנת ניתוח אוטומטית, שיעור הירי המהותי (כלומר, תדירות פעימה) של שלושת העקבות שנבחרו בכל 64 הערוצים נמצא כ-320 bpm בנתונים לדוגמה שלנו(איור 12A). באופן כללי, אנו מתבוננים במגוון ערכים של כ 290-340 bpm בהקלטות שלנו לעכברי wildtype. שיעור הירי יכול לשמש גם כשיטה משנית להערכת איכות ההכנה. תעריפים שאינם יציבים או נמוכים משמעותית מ-300 bpm נוטים פחות להיות טובים לניתוח. ערכים אלה דומים הן הקלטות לב מבודד ותא בודד המדווחות על קצב לב מהותי בטווח של כ 300-500 bpm25,48,49. לכן, טכניקת ההקלטה MEA מסוגלת לייצר מדדים אמינים ומדויקים של קצב לב מהותי.
היתרון של מערכת MEA הוא שהיא מאפשרת יישום קל של סוכני תרופות כדי לבדוק השפעות פרמקולוגיות. בניסוי המדגם, בדקנו את ההשפעות של 1 mM 4-AP על קצב הירי, אשר אמור להאט את פעילות SAN מאז המצור של ערוצי K+ מגודר מתח ידוע לפגוע repolarization פוטנציאל פעולה בתאי SA24,50. איור 12B מראה כי כניסת 4-AP הגדילה את מרווחי הזמן הבין-כוכביים כצפוי. מרווח ספייק ממושך זה התאים לירידה בתדירות הקצב מ- 320 bpm ל- 210 bpm. שיעור ירי זה בעקבות ממשל 4-AP דומה למחקר קודם שבחן את ההשפעות של 4-AP על שיעור הירי בסן באמצעות הקלטות אלקטרודות בודדות של רקמה מבודדת. מחקר זה מדד שיעור ירי של כ 190 bpm בנוכחות 4-AP50. לכן, מערכת MEA יכול לשמש ככלי נוח ויקר לבדיקת השפעות פרמקולוגיות של התערבויות סמים על תפקוד הלב המהותי.
איור 1: ציפוי מערך המיקרו-ectrode (MEA) לפני השימוש. (A)ה- MEA מורכב מצלחת פלסטיק קטנה עם מערך רשת של 64 מיקרו-ectrodes במרכז (כפי שמוצג בפאנל A1) וארבע אלקטרודות התייחסות סביב הפריפריה בתבנית ריבועית. (B)תוספת של 1 מ"ל של חוצץ PEI כדי לצפות את MEA. (C)מכסה את צלחת MEA עם סרט תרמופלסטי לדגירה לילה בטמפרטורת החדר. (ד)שאיפה את חיץ PEI מצלחת MEA, אשר ואחריו לפחות ארבעה שטיפות עם מים מזוקקים. (ה)אחסון גשושית MEA מצופה מתחת למים אולטרה-תפומיים כדי למנוע ממנו להתייבש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כלים המשמשים לניתוח צומת סינוטריאלי (SAN). הכלים הבאים משמשים במהלך החלק של הניתוק של הפרוטוקול: (i) צלחת פטרי עם אלסטומר סיליקון וסיכות ניתוח קטנות; (ii) פיפטה להעברת פלסטיק; (iii) מספריים Castroviejo, מידה 4 "; (4) מספריים כירורגיים (ישר) להליכי חיתוך; (v) דומונט #2 מלקחיים לכריתומיה; (vi) דומונט #55 מלקחיים; (vii) מלקחיים גראפה משובחים במיוחד; (viii) Hemostats (מעוקל). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הסרת הלב. (א)חתיכה רוחבית בעור ממש מתחת לתחתית כלוב הצלעות בערך מקשת העלויותהשמאלית לקשת הקוסטל הימנית. (C,D) פירוק הסרעפת לאורך בית החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה. (ה)הסרת הלב בעקבות כריתת הריאות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח צומת סינואטרילה (SAN). (א)מראה הלב בצלחת הפטרי לאחר הסרתו מהגוף. (B)החדרת מחט המזרק דרך הוועד הנביא הנחות (IVC) והוועד העליון (SVC) של האטריום הימני. הסיכה בשיא הלב מוצגת גם היא. (ג)כריתת פסגת (כלומר, החצי התחתון) של הלב כדי לשחרר את הדם. הפינים בנספחי האיתרים מוצגים גם הם. (D)המראה הסופי של אזור SAN של האטריום הימני בסוף הניתוח. האזור בקופסה מתאים למיקום המשוער של SAN. ניתן גם לראות את עורק SAN קלוש זורם דרך SAN בכיוון אנכי. הקיצורים: AO, אבי העורקים; CT, קריסטה מסוף; IVC, וונה קאווה נחותה; לוס אנג'לס, אטריום שמאלי; רא, אטריום ימני; RAA, נספח ימין של ת.א.ק; SAN, צומת סינוטריאל; אס.וי.סי, וונה עילאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: שרטוט של מערך המיקרו-ectrode (MEA) מערך מערכת הקלטה. הרכיבים הבאים כוללים את המערכת: (A) צילינדר גז (קרבוגן: 95% O2/ 5% CO2); (B)בקבוקון חרוט עם מים מזוקקים כדי לחות את הגז; (ג)הקלטת בקבוק הפתרון של טיירוד המספק זרימה לצלחת MEA; (D)משאבה peristaltic כדי לשאוב פתרון אל וממנה צלחת MEA; (E)וסת טמפרטורה; (ו)צלחת מחבר MEA המקבלת אותות מצלחת MEA; (G) מגבר; (H) מחשב; (I)בקבוק איסוף לתמיסת פסולת משומשת מצלחת MEA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מיקום רקמת הנודל של SA על MEA. (A)כלים המשמשים למיקום הרקמה: (i) רשת עם גודל רשת של 1.5 מ"מ, (ii) עוגן נבל, (iii) מלקחיים עצם, (iv) מברשת צבע. (B)מיקום הרקמה על MEA. הקופסה הצהובה מציינת את האזור המשוער של אזור הצומת סינואטריאלי מתחת רשת העוגן בצלחת MEA. (C)סידור צלחת MEA עם רקמה סגורה על צלחת המחבר להקלטה פוטנציאלית בשדה: (i) מפרצון לפתרון ההקלטה; (ii) מפרצון לגז (קרבוגן); (iii) שקע לפתרון; (4) צלחת מחבר מיקרו-ectrode; (v) כובע זלוף; (vi) טבעת אלקטרודה התייחסות מחוברת לכובע; (vii) קלטת להחזיק את הכובע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: הגדרת פרוטוקול רכישת הנתונים בתוכנה. (A) דוגמה לתבנית הקלטה המציגה סידור של כל 64 הערוצים. (B)דוגמה למאפייני קלט התוכנה עבור תנאי ההקלטה. (C)דוגמה לתפריט ביאורים המציג כיצד להוסיף שלב חדש במהלך ההקלטה, כגון למדידת השפעות סמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: אזורים שונים של הרקמות המציגים צורות גל פעילות שונות. צילום מסך לדוגמה המציג צורות גל עם צורות ומשריעות שונות בערוצים שונים. עם זאת, כל הערוצים מציגים מרווחי זמן בין-כוכביים זהים ותדרי ירי. הערוצים בתוך הקופסה האדומה תואמים בערך לאלקטרודות הממוקמות בתוך אזור SAN של הרקמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: תבנית ניתוח תדירות מקציפים. תבנית לדוגמה המציגה סידור של כל 64 הערוצים בתבנית ניתוח תדירות פעימה. הכניסה של קובץ הנתונים הגולמיים להפעלה מחדש מציגה דוגמה למאפייני הקלט של חלון הניתוח. בדוגמה זו, עקבות 5 עד 7 נבחרו לניתוח ומשך הניתוח עבור כל מעקב הוגדר כ- 60,000 אלפיות השנייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: הגדרת פרמטרי ניתוח עבור חילוץ ספייק. (A) תוצאות תבנית ניתוח מייצג עבור 3 עקבות נבחרות של ערוץ יחיד. החלונית העליונה מציגה תדירות פעימה עבור שלושת המעקבים שנבחרו (שלוש קיבוצים מוגדרים של נקודות נתונים), וכל נקודה מייצגת ממוצע של 10-s לתדירות פעימה במהלך המעקב הספציפי. החלונית האמצעית מציגה מרווח בין-ספייק עבור שלושת המעקבים שנבחרו (שלוש קיבוצים מוגדרים של נקודות נתונים), וכל נקודת נתונים מייצגת את מרווח הזמן הבין-ספייק בין שתי קוצים רצופים. החלונית השמאלית התחתונה מציגה קוצים נבחרים שחולצו ב-5 השניים האחרונים של העקבות השלישיים, ואילו החלונית הימנית התחתונה מציגה צורת גל שחולצה נגזרת מקבוצת הקוצים המופקים ב-5 s בלוח השמאלי התחתון. (B)תצוגה מורחבת של חלון הניתוח המציגה פרמטרים המשמשים בניתוח תדירות ההכאה עבור 3 העקבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11: נתון מייצג המציג חילוץ נתונים טוב לעומת גרוע עבור ערוץ מסוים. חילוץ נתונים רעים: (A) היעדר קוצים שחולצו; (B)קוצים שחולצו עם אותות רעש; (C)קוצים לא יציבים שחולצו. (D)נתונים טובים המראים קוצים יציבים שחולצו ללא אותות רעש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 12: הקלטות בבסיס ואחרי ניהול של 1mM 4-Aminopyridine (4-AP). (A)הקלטה בסיסית ממיקרו-קטרוד יחיד מראה צורות גל עם תדר ירי יציב של 320 bpm בלב WT. (B)לאחר ניהול של 4-AP, תדירות הירי מאטה לקצב יציב של 210 bpm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תרגול ושליטה בתהליך הניתוח SAN הוא הכרחי שכן הרקמה שברירית ורקמות בריאות נחוצות להקלטה מוצלחת. במהלך ניתוח SAN, אוריינטציה נכונה חיונית כדי להשיג את האזור הנכון של הרקמה. עם זאת, האוריינטציה המקורית של הלב יכולה ללכת לאיבוד בקלות במהלך תהליך הניתוח, אשר מסבך את המאמץ הזה. לכן, כדי להבטיח את הכיוון הנכון שמאלה-ימין, atria צריך להיבדק חזותית. בדרך כלל, האטריום הימני נוטה להיות שקוף יותר, ואילו האטריום השמאלי הוא בדרך כלל כהה יותר ואדום יותר בצבע25,48. יתר על כן, זה חיוני לא למתוח את רקמת SAN תוך כדי עבודה עם זה או הרכבה על רשת האלקטרודה, כמו הרקמה ניזוקה בקלות מכנית51. טיפ כדי לאמת רקמת SAN בריאה ומנותחת כראוי הוא לבחון אותו בתמיסה של טיירוד להשלים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהרקמה פועמת. ברגע הטכניקה הוא שולט, לפחות 90% של תכשירי רקמות צריך להיות טוב להקלטה.
מספר שיקולים יכולים לשפר את הסבירות להקלטות מוצלחות וניתוח נתונים לאחר מכן. כדי להבטיח את ההקלטות הטובות ביותר, יש להכין ולבדוק בקפידה את הפתרונות על דגימות עכבר בפועל לפני הקלטות ניסיוניות. עבדנו בהרחבה כדי להתאים ולשנות את פתרון ההקלטה כדי לייעל את הבריאות של רקמת SAN. בנוסף, ודא כי הגז המשמש להקלטה הוא קרבוגן (כלומר, 95% O2/5% CO2). הקלטות תא יחיד לעתים קרובות להשתמש בחמצן טהור בשל ההרכב הכימי הספציפי של הפתרון של Tyrode המשמש עבור יישום זה, אבל הפתרון המשמש להקלטה על MEA דורש קרבוגן על מנת לשמור על pH יציב. שימוש בחמצן טהור עם הפתרון של טיירוד להקלטות MEA יגרום לתנודות ב- pH אשר יכול להוביל להידרדרות מהירה של הרקמה. הערכת מקסימה משרעת בערוצים כפי שתואר בעבר יעזור לקבוע אם הרקמה היא באיכות הקלטה טובה. לבסוף, כדי לסייע בניתוח לאחר ההקלטה, לוקח תמונה של רקמת SAN רכוב על מערך אלקטרודה MEA לאחר ההקלטה הסתיימה הוא מאוד מועיל. הרקמה יכולה להשתנות מעט במהלך ההקמה הראשונית של MEA, וזה מספק את ההערכה המדויקת ביותר של מיקום אלקטרודה לניתוח.
אנו מציעים הקלטות MEA כדרך יסודית ומדויקת לאפיין את קצב הירי של SAN. היתרון של טכניקת MEA הוא שהיא מאפשרת לנסיין ללכוד שיעורי ירי בדומה להקלטות תא בודד ללא צורך במומחיות אלקטרופיזיולוגית נרחבת. לטכניקת MEA יש גם את היתרון של ביטול ההשפעות המבלבלות הפוטנציאליות של מנגנונים נוירוהומוריים ומכניים-חשמליים, הטבועים בהקלטות לב מבודדות ובמדידות מצור אוטונומיות של ויוו 21. התכווצות חדרית ונשימה הן ההשפעות המכנו-חשמליות העיקריות שיכולות לשנות ירי SAN, אבל הם מסולקים בהכנת הרקמה שלנו 52,53. בעוד הטכניקה שלנו מבטלת את רוב ההשפעות האוטונומיות על SAN, מספר מוגבל של תחזיות ICNS הנותרות atria הימנית עלולה להשפיע על ירי SAN, מגבלה תיאורטית אשר יש לזכור במהלך הפרשנות של תוצאות5,6,22,23. יתרון נוסף של טכניקת MEA המתוארת כאן הוא שניתן להתאים אותה לסוגים רבים אחרים של מחקרי לב. לדוגמה, למרות פרוטוקול זה הדגים את ההשפעות של 4-AP על פעילות SAN, מחקרים עתידיים יכולים להסתכל על מספר כמעט בלתי מוגבל של סוכנים פרמקולוגיים, כמו גם את ההשפעות של מוטציות גנים על ירי מהותי SAN. לדוגמה, ivabradine, חוסם ספציפי של ערוץ Hcn4 ספציפי SAN, יכול לשמש כדי ללמוד תרומות נוכחיות מצחיקות לשיעור הירי54. מערכת MEA יכולה לשמש גם למדידת תפקוד הלב באזורים אחרים של הלב, המאפשר אפיון מפורט, ספציפי לאזור. עם זאת, הקלטה מאזורי לב אחרים תדרוש גישות ניתוח שונות ואת האפשרות של חתך רקמות דקות לפני ההקלטה. מגבלה אחת שעשויה להיות משמעותית של טכניקה זו היא העלות הגבוהה של רכישת מערכת MEA אשר יכול להיות אוסר. מספר מערכות MEA זמינות בשוק עם מאפיינים ופונקציונליות דומים, אך העלות הגבוהה נשארת זהה. עם זאת, לאחר רכישת הציוד והתוכנה הראשוניים, העלות לתחזוקה ושימוש במערכת MEA נמוכה למדי. מגבלה נוספת היא שמערכת MEA מאפשרת רק הקלטה של פוטנציאל שדה חוץ-תאי שאינם תורמים להשוואות מדויקות של מאפיינים פוטנציאליים לפעולה (למשל, משרעת וצורה) בין הכנות כגון ניתן להשיג עם הקלטות תאיות של תא יחיד. לסיכום, פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה יעילה למדוד ולנתח שיעורי ירי לב מהותיים ברקמת SAN העכבר עם היכולת לחקור את ההשפעות של התערבות פרמקולוגית על שיעור הירי באופן ספציפי מאוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, מספרי מענק R01NS100954 ו- R01NS099188.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920x1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
References
- Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
- Josea, A. D., Collison, D. The normal range and determinants of the intrinsic heart rate in man. Cardiovascular Research. (4), 160-167 (1970).
- Peters, C. H., Sharpe, E. J., Proenza, C. Annual Review of Physiology Cardiac Pacemaker Activity and Aging. Annual Review of Physiology. 82, 21-43 (2019).
- Keith, A., Flack, M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. Journal of Anatomy and Physiology. 41 (3), 172-189 (1907).
- Wake, E., Brack, K. Characterization of the intrinsic cardiac nervous system. Autonomic Neuroscience. 199, (2016).
- Fedele, L., Brand, T. The intrinsic cardiac nervous system and its role in cardiac pacemaking and conduction. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 7 (4), 1-33 (2020).
- Mangrum, J. M., DiMarco, J. P. The evaluation and management of bradycardia. New England Journal of Medicine. 342 (10), 703-709 (2000).
- Adan, V., Crown, L. A. Diagnosis and treatment of Sick Sinus Syndrome. American Family Physician. 67 (8), 1725-1732 (2003).
- Semelka, M., Gera, J., Usman, S. Sick Sinus Syndrome: A Review. American Family Physician. 87 (10), 691-696 (2013).
- Zaragoza, M. V., et al. Exome sequencing identifies a novel LMNA splice-site mutation and multigenic heterozygosity of potential modifiers in a family with Sick Sinus Syndrome, dilated cardiomyopathy, and sudden cardiac death. PLoS ONE. 11 (5), 0155421 (2016).
- Brugada, J., Campuzano, O., Arbelo, E., Sarquella-Brugada, G., Brugada, R. Present status of Brugada Syndrome: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (9), 1046-1059 (2018).
- Rollin, A., et al. Prevalence, characteristics, and prognosis role of type 1 ST elevation in the peripheral ECG leads in patients with Brugada syndrome. Heart Rhythm. 10 (7), 1012-1018 (2013).
- Patel, N., Majeed, F., Sule, A. A. Seizure triggered by Sick Sinus Syndrome. BMJ case reports. 4, 2017222011 (2017).
- Knecht, S., et al. Impact of pharmacological autonomic blockade on complex fractionated atrial electrograms. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (7), 766-772 (2010).
- Saba, S., London, B., Ganz, L. Autonomic blockade unmasks maturational differences in rate-dependent atrioventricular nodal conduction and facilitation in the mouse. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 14 (2), 191-195 (2003).
- Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 51-56 (2002).
- Tse, G., Tse, V., Yeo, J. M., Sun, B. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts. PLoS ONE. 11 (2), 0148858 (2016).
- Tse, G., et al. Quantification of beat-to-beat variability of action potential durations in Langendorff-perfused mouse hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1578), 01578 (2018).
- Avula, U. M. R., et al. Heterogeneity of the action potential duration is required for sustained atrial fibrillation. JCI Insight. 5 (11), 128765 (2019).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. (135), e57617 (2018).
- Quinn, A. T., Kohl, P. Cardiac mechano-electric coupling: Acute effects of mechanical stimulation on heart rate and rhythm. Physiological Reviews. 101 (1), 37-92 (2021).
- Ripplinger, C. M., Noujaim, S. F., Linz, D. The nervous heart. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 199-209 (2016).
- Pauza, D. H., Pauziene, N., Pakeltyte, G., Stropus, R. Comparative quantitative study of the intrinsic cardiac ganglia and neurons in the rat, guinea pig, dog and human as revealed by histochemical staining for acetylcholinesterase. Annals of Anatomy. 184, 125-136 (2002).
- Golovko, V., Gonotkov, M., Lebedeva, E. Effects of 4-aminopyridine on action potentials generation in mouse sinoauricular node strips. Physiological Reports. 3 (7), 12447 (2015).
- Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), e54555 (2016).
- Doi, M., Ogawa, E., Arai, T. Effect of a photosensitization reaction performed during the first 3 min after exposure of rat myocardial cells to talaporfin sodium in vitro. Lasers in Medical Science. 32 (8), 1873-1878 (2017).
- Takanari, H., et al. A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology. Journal of Cellular Physiology. 231 (10), 2249-2256 (2016).
- Nakashima, T., et al. Rapid electrical stimulation causes alterations in cardiac intercellular junction proteins of cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1324-1333 (2014).
- Suzuki, S., et al. Effects of aldosterone on Cx43 gap junction expression in neonatal rat cultured cardiomyocytes. Circulation Journal. 73 (8), (2009).
- Horiba, M., et al. T-type Ca2+ channel blockers prevent cardiac cell hypertrophy through an inhibition of calcineurin-NFAT3 activation as well as L-type Ca2+ channel blockers. Life Sciences. 82 (11-12), 554-560 (2008).
- Inoue, N., et al. Rapid electrical stimulation of contraction modulates gap junction protein in neonatal rat cultured cardiomyocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases and effects of angiotensin II receptor agonist. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 914-922 (2004).
- Aalders, J., et al. Effects of fibrillin mutations on the behavior of heart muscle cells in Marfan syndrome. Scientific Reports. 10 (16756), (2020).
- Matsuura, K., et al. Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets. Biomaterials. 32 (30), 7355-7362 (2011).
- Fujita, H., Shimizu, K., Nagamori, E. Application of a cell sheet-polymer film complex with temperature sensitivity for increased mechanical strength and cell alignment capability. Biotechnology and Bioengineering. 103 (2), 370-377 (2009).
- Baba, S., et al. Generation of cardiac and endothelial cells from neonatal mouse testis-derived multipotent germline stem cells. Stem Cells. 25 (6), 1375-1383 (2007).
- Baba, S., et al. Flk1+ cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model. Cardiovascular Research. 76 (1), 119-131 (2007).
- Shimizu, K., et al. Construction of multi-layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 803-809 (2007).
- Haraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. Electrical coupling of cardiomyocyte sheets occurs rapidly via functional gap junction formation. Biomaterials. 27 (27), 4765-4774 (2006).
- Miyagawa, S., et al. Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: Their integration with recipient myocardium. Transplantation. 80 (11), 1586-1595 (2005).
- Watts, M., et al. Decreased bioavailability of hydrogen sulfide links vascular endothelium and atrial remodeling in atrial fibrillation. Redox Biology. 38, 101817 (2021).
- Feng, Y., Cao, H., Zhang, Y. Prediction model of sinoatrial node field potential using high order partial least squares. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 1805-1811 (2015).
- Feng, Y., Cao, H., Wang, Y., Zhang, Y. Fuzzy linguistic prediction model for sinoatrial node field potential analysis in acute hyperglycemia environment. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, Suppl 1 881-887 (2015).
- Suzuki, K., Matsumoto, A., Nishida, H., Reien, Y., Maruyama, H., Nakaya, H. Termination of aconitine-induced atrial fibrillation by the KACh-channel blocker tertiapin: underlying electrophysiological mechanism. Journal of Pharmacological Sciences. 125 (4), 406-414 (2014).
- Chang, S. -L., et al. Heart failure enhances arrhythmogenesis in pulmonary veins. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 38 (10), 666-674 (2011).
- Wang, Y. -J., et al. Time-dependent block of ultrarapid-delayed rectifier K+ currents by aconitine, a potent cardiotoxin, in heart-derived H9c2 myoblasts and in neonatal rat ventricular myocytes. Toxicological Sciences. 106 (2), 454-463 (2008).
- Lai, Y. -J., Huang, E. Y. -K., Yeh, H. -I., Chen, Y. -L., Lin, J. J. -C., Lin, C. -I. On the mechanisms of arrhythmias in the myocardium of mXinα-deficient murine left atrial-pulmonary veins. Life Sciences. 83 (7-8), 272-283 (2008).
- Gustafson-Wagner, E. A., et al. Loss of mXinα, an intercalated disk protein, results in cardiac hypertrophy and cardiomyopathy with conduction defects. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (5), 2680-2692 (2007).
- Clark, R. B., et al. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, 1757-1766 (2004).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Nikmaram, M. R., et al. Characterization of the effects of Ryanodine, TTX, E-4031 and 4-AP on the sinoatrial and atrioventricular nodes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 96 (1-3), 452-464 (2008).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
- Masé, M., Glass, L., Ravelli, F. A model for mechano-electrical feedback effects on atrial flutter interval variability. Bulletin of Mathematical Biology. 70 (5), 1326-1347 (2008).
- Franz, M. R., Bode, F. Mechano-electrical feedback underlying arrhythmias: The atrial fibrillation case. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 82 (1-3), 163-174 (2003).
- Bucchi, A., Tognati, A., Milanesi, R., Baruscotti, M., DiFrancesco, D. Properties of ivabradine-induced block of HCN1 and HCN4 pacemaker channels. Journal of Physiology. 572 (2), 335-346 (2006).
