פרוטוקול זה נועד לתאר מתודולוגיה חדשה למדידת קצב ירי לב מהותי באמצעות הקלטת מערך microelectrode של כל רקמת הצומת sinoatrial כדי לזהות פגמים בקצב בעכברים. סוכנים פרמקולוגיים יכולים גם להיות הציג בשיטה זו כדי ללמוד את ההשפעות שלהם על קצב מהותי.
צומת sinoatrial (SAN), הממוקם באטריום הימני, מכיל את תאי קוצב הלב, וחוסר תפקוד של אזור זה יכול לגרום טכיקרדיה או ברדיקרדיה. זיהוי אמין של פגמים בקצב הלב דורש מדידה של קצב לב מהותי על ידי מניעת ההשפעה של מערכת העצבים האוטונומית, אשר יכול להסוות ליקויים בקצב. שיטות מסורתיות לניתוח תפקוד קוצב לב מהותי כוללות מצור אוטונומי המושרה על ידי סמים כדי למדוד את קצב הלב vivo, הקלטות לב מבודדות כדי למדוד קצב לב מהותי, ורצועת sinoatrial או הקלטות תיקון-מהדק תא יחיד של תאי קוצב לב sinoatrial כדי למדוד פעולה ספונטנית שיעורי ירי פוטנציאליים. עם זאת, טכניקות מסורתיות יותר אלה יכולות להיות מאתגרות מבחינה טכנית וקשה לביצוע. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה חדשה למדידת קצב ירי לב מהותי על ידי ביצוע מערך microelectrode (MEA) הקלטות של תכשירי צומת sinoatrial הר שלם מעכברים. MEAs מורכבים ממיקרו-ectrodes מרובים המסודרים בתבנית דמוית רשת להקלטת פוטנציאל שדה חוץ-תאי במבחנה. לשיטה המתוארת כאן יש יתרון משולב של להיות מהיר יחסית, פשוט יותר ומדויק יותר מאשר גישות קודמות להקלטת קצב לב מהותי, תוך מתן אפשרות לחקירה תרופתית קלה.
הלב הוא איבר מורכב הנשלט על ידי השפעות מהותיות וחיצוניות כגון אלה שמקורן במוח. צומת סינוטריאל (SAN) הוא אזור מוגדר בלב המאכלס את תאי קוצב הלב (המכונים גם תאי סינוטריאליים, או תאי SA) האחראים על החניכה וההנצחה של פעימות הלב של היונקים1,2. קצב הלב המהותי הוא הקצב המונע על ידי תאי קוצב הלב ללא השפעה על השפעות לבביות או נוירו-הומוריסטיות אחרות, אך מדדים מסורתיים של קצב הלב בבני אדם ובעלי חיים חיים, כגון אלקטרוקרדיוגרמה, משקפים הן את קוצב הלב והן את ההשפעות העצביות על הלב. ההשפעה העצבית הבולטת ביותר על תאי SA היא ממערכת העצבים האוטונומית, אשר כל הזמן מווסת דפוסי ירי כדי לענות על הדרישות הפיזיולוגיות של הגוף3. תמיכה ברעיון זה, הן תחזיות אוהדות והן תחזיות parasympathetic ניתן למצוא ליד SAN4. מערכת העצבים הלב הפנימית (ICNS) היא השפעה עצבית חשובה נוספת שבה plexi גנגליוני, במיוחד atria הימני, innervate ולווסת את הפעילות של SAN5,6.
הבנת גירעונות קצב היא חשובה מבחינה קלינית, כמו תפקוד לקוי יכול לעמוד בבסיס הפרעות לב רבות, כמו גם לתרום לסיכון של סיבוכים אחרים. תסמונת סינוס חולה (SSS) היא קטגוריה של מחלות המאופיינת בתפקוד לקוי של צומת sinoatrial אשר פוגע בקצב תקין7,8. SSS יכול להציג עם סינוס ברדיקרדיה, הפסקות סינוסים, מעצר סינוס, בלוק יציאה sinoatrial, לסירוגין bradyarrythmias ו tachyarrhythmias9 והוא יכול להוביל לסיבוכים כולל סיכון מוגבר לשבץ תסחיף ומוותפתאומי 8,10. אלה עם תסמונת Brugada, הפרעת לב מסומן על ידי פרפור חדרית עם סיכון מוגבר למוות לבבי פתאומי, נמצאים בסיכון גבוה יותר לאירועים הפרעות קצב אם יש להם גם תפקוד לקוי SAN comorbid11,12. תפקוד לקוי של Sinoatrial עשוי להיות גם השלכות פיזיולוגיות מעבר ללב. לדוגמה, SSS נצפתה לעורר התקפים בחולה עקב hypoperfusion מוחי13.
כדי לזהות גירעונות קצב sinoatrial, קצב הלב המהותי צריך להיקבע על ידי מדידת הפעילות של SAN ללא ההשפעה של מערכת העצבים האוטונומית או גורמים הומוריסטיים. מבחינה קלינית, זה יכול להיות בערך על ידי מצור אוטונומי פרמקולוגי14, אבל אותה טכניקה יכולה להיות מיושמת גם במודלים יונקים כדי לחקור תפקוד לב מהותי15,16. בעוד גישה זו חוסמת חלק גדול של השפעות עצביות תורמות ומאפשרת בדיקת לב in vivo, זה לא מבטל לחלוטין את כל ההשפעות הקיצוניות על הלב. טכניקת מחקר נוספת המשמשת לחקר תפקוד הלב המהותי במודלים של בעלי חיים היא הקלטות לב מבודדות באמצעות לבבות חדורי לנגנדורף, הכוללים בדרך כלל מדידות באמצעות אלקטרוגרמות, קצב, או מערכים רב-אלקטרוניים אפיקרדיים17,18,19,20. בעוד טכניקה זו היא ספציפית יותר לתפקוד הלב שכן היא כרוכה בהסרת הלב מהגוף, המדידות עשויות עדיין להיות מושפעות ממנגנוני פיקוח אוטומטי מכני-חשמלי שיכולים להשפיע על מדידות דופק מהותיות21. הקלטות הלב המבודדות עשויות עדיין להיות מושפעות גם מרגולציה אוטונומית באמצעות ICNS5,6,22,23. יתר על כן, שמירה על טמפרטורה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית של הלב, שהיא קריטית למדידות תפקוד הלב, יכול להיות קשה בגישות לבמבודדות 20. שיטה ישירה יותר לחקר תפקוד SAN היא לבודד באופן ספציפי רקמת SAN ולמדוד את פעילותה. זה יכול להתבצע באמצעות רצועות SAN (רקמת SAN מבודדת) או תאים מבודדים SAN קוצב לב24,25. שניהם דורשים רמה גבוהה של אימון טכני, שכן SAN הוא אזור קטן מאוד ומוגדר מאוד, ובידוד תאים מהווה אתגר גדול עוד יותר כמו ניתוק יכול לפגוע בבריאות הכללית של התא אם לא מבוצע כראוי. יתר על כן, טכניקות אלה דורשות מיומנויות אלקטרופיזיולוגיות מומחים על מנת להקליט בהצלחה מן הרקמה או התאים באמצעות microelectrodes הקלטה בודדים.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקה להקלטת ה- SAN במבחנה באמצעות מערך מיקרו-ectrode (MEA) כדי להשיג מדידות דופק מהותיות. גישה זו יש את היתרון של הפיכת הקלטות אלקטרופיזיולוגיות ספציפיות מאוד נגיש לחוקרים חסר כישורים אלקטרופיזיולוגיים אינטנסיביים. MEAs שימשו בעבר לחקר תפקוד cardiomyocyte בתרביות cardiomyocyte ראשוני26,27,28,29,30,31,32, גיליונות לב33,34,35,36,37,38,39, ורקמות שלמות הרכבות40, 41,42,43,44,45,46,47. עבודה קודמת נעשתה גם כדי לבחון את פוטנציאל השדה ברקמת SAN41,42. כאן, אנו מספקים מתודולוגיה להשתמש MEA להקליט ולנתח שיעורי ירי SAN מהותי מורין. אנו מתארים גם כיצד טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבדוק השפעות פרמקולוגיות של תרופות על שיעורי ירי פנימיים SAN על ידי מתן ניסוי מדגם מראה את ההשפעות של 4-אמינופירידאין (4-AP), חוסם K+ ערוץ מגודר מתח. באמצעות ציוני דרך אנטומיים מוגדרים, אנו יכולים להקליט במדויק את SAN מבלי לבצע את ניתוחי הרקמות הנרחבים או בידודי תאים הנדרשים בשיטות אחרות. בעוד MEA יכול להיות עלות אוסרת, ההקלטות מספקות אמצעים ספציפיים ואמינים מאוד של קצב שניתן להשתמש בהם במגוון עצום של יישומי מחקר קליניים ופיזיולוגיים.
תרגול ושליטה בתהליך הניתוח SAN הוא הכרחי שכן הרקמה שברירית ורקמות בריאות נחוצות להקלטה מוצלחת. במהלך ניתוח SAN, אוריינטציה נכונה חיונית כדי להשיג את האזור הנכון של הרקמה. עם זאת, האוריינטציה המקורית של הלב יכולה ללכת לאיבוד בקלות במהלך תהליך הניתוח, אשר מסבך את המאמץ הזה. לכן, כדי להבטיח את הכ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, מספרי מענק R01NS100954 ו- R01NS099188.
4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080 | ||
Dissection Microscope | Jenco | ||
Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |