Summary
该协议旨在描述一种新的方法,测量内在心脏发射率使用微电极阵列记录整个中天节点组织,以确定小鼠的制动缺陷。药理制剂也可以在这种方法中引入,以研究它们对内在起搏的影响。
Abstract
位于右中庭的中天节点(SAN)包含心脏的心脏起搏器细胞,该区域功能障碍可导致心动过速或心动过速。心脏起搏缺陷的可靠识别需要通过在很大程度上防止自主神经系统的影响来测量内在心率,而自主神经系统可以掩盖心率缺陷。分析内在心脏起搏器功能的传统方法包括药物诱导的自主封锁,以测量 体内 心率,分离心脏记录测量内在心率,以及中性心脏起搏器细胞的中性条带或单细胞贴片夹记录,以测量自发行动的潜在发射率。然而,这些更传统的技术在技术上可能具有挑战性,而且难以执行。在这里,我们提出了一种新的方法,通过执行微电极阵列(MEA)记录从小鼠的全安装中天节点制剂来测量内在心脏发射速率。MEA 由多个微电极组成,这些微电极以网格状模式排列,用于记录 体外 细胞外场电位。与以往记录内在心率的方法相比,此处描述的方法具有相对更快、更简单、更精确的综合优势,同时允许简单的药理学审讯。
Introduction
心脏是一个复杂的器官,由心脏内在和外在的影响,如那些起源于大脑的影响。中性节点(SAN)是心脏中一个定义区域,容纳心脏起搏器细胞(也称为中腹细胞,或SA细胞),负责启动和延续哺乳动物心跳1,2。内在心率是由心脏起搏器细胞驱动的,不受其他心脏或神经幽默的影响,但传统的心率测量在人类和活的动物,如心电图,反映了心脏起搏器和神经对心脏的影响。对SA细胞最显著的神经影响来自自主神经系统,它不断调节发射模式,以满足身体的生理要求3。支持这个想法,同情和寄生虫预测可以在SAN4附近找到。内在心脏神经系统(ICNS)是另一个重要的神经影响,其中结石丛,特别是在右侧,内侧和调节SAN5,6的活动。
了解制步缺陷在临床上很重要,因为功能障碍可能是许多心脏疾病的基础,并导致其他并发症的风险。病窦综合征(SSS)是一类疾病,其特征是鼻节点功能障碍,妨碍了适当的步调7,8。SSS可以呈现鼻窦心动过速,鼻窦暂停,鼻窦逮捕,鼻窦退出块,交替的胸膜和心动过速9,并可能导致并发症,包括增加脑卒中和突然死亡的风险8,10。那些患有布鲁加达综合征,一种以心室颤动为特征的心脏疾病,心脏骤死的风险增加,如果他们也有合并性SA功能障碍11,12,则患心律失常事件的风险更大。心房功能障碍也可能有超出心脏的生理后果。例如,由于脑溢血13,SSS被观察到会引发患者的癫痫发作。
为了识别中性起搏缺陷,需要通过测量 SAN 的活动来确定内在心率,而不受自主神经系统或幽默因素的影响。临床上,这可以通过药理自主封锁14来近似,但同样的技术也可以应用于哺乳动物模型研究内在心脏功能15,16。虽然这种方法可以阻断大部分促成的神经影响,并允许进行体内心脏检查,但它并不能完全消除对心脏的所有外在影响。另一种用于研究动物模型内在心脏功能的研究技术是使用Langendorff香灌心脏的孤立心脏记录,这通常涉及使用电图、起搏或史诗多电极阵列17、18、19、20进行测量。虽然这项技术更具体于心脏功能,因为它涉及从身体去除心脏,测量可能仍然受机械-电力自动调节机制的影响,可能会影响内在心率测量21。孤立的心脏记录也可能仍然受到自主调节的影响,通过ICNS5,6,22,23。此外,在孤立的心脏接近20时,维持与生理相关的心脏温度(对心脏功能测量至关重要)可能很困难。研究 SAN 功能的更直接的方法是专门分离 SAN 组织并测量其活性。这可以通过SAN条(孤立的SAN组织)或孤立的SAN心脏起搏器细胞24,25完成。两者都需要高度的技术培训,因为 SAN 是一个非常小且定义高度明确的区域,并且细胞隔离构成更大的挑战,因为分离如果执行不当,可能会损害细胞的整体健康。此外,这些技术需要专家的电生理技能,以便使用单个记录微电极从组织或细胞成功记录。
在此协议中,我们描述了一种使用微电极阵列 (MEA) 进行体外记录 SAN 的技术,以获得内在心率测量。这种方法的优点是使缺乏密集电生理技能的研究人员能够获得高度特定的电生理记录。MEA以前曾用于研究心肌细胞主要培养物中心肌细胞功能26、27、28、29、30、31、32、心表33、34、35、36、37、38、39和组织整体坐骑40, 41,42,43,44,45,46,47。先前的工作也已完成,以检查现场潜力在SAN组织41,42。在这里,我们提供了一种方法,使用MEA记录和分析穆林内在SAN发射率。我们还描述了如何利用这项技术来测试药物对SAN内在燃烧率的药理学影响,提供一个样本实验,显示4-氨基苯丙胺(4-AP)的效果,一种电压门K+通道阻滞剂。使用定义的解剖地标,我们可以准确地记录 SAN,而无需执行其他方法所需的广泛组织解剖或细胞隔离。虽然 MEA 的成本高得令人望而却步,但录音提供了非常具体和可靠的制进度度,可用于大量的临床和生理研究应用。
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Protocol
这里描述的所有实验程序都是根据国家卫生研究院(NIH)的指导方针进行的,该指南是经南方卫理公会大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的。
1. 涂层多电极阵列 (MEA) 用于录制
- 制作 25 mM 护套缓冲器。
- 溶解 0.953 g Na2B4O7+10 H2O 在 80 mL 蒸馏水中。
- 将 pH 值调整到 8.4 与 HCl,然后添加蒸馏水到最终体积 100 mL。
- 制作聚乙烯 (PEI) 0.1% 的库存溶液。
- 将 100 μL 的 50% (w/v) PEI 添加到 4.9 mL 的蒸馏水中,以制作 1% 的 PEI 解决方案。
- 将 1% PEI 溶液稀释到 25 mM 缓冲器的 9 mL 中,将 1% PEI 溶液中的 1 mL 添加到 1% PEI 溶液中,以将 0.1% 的玻酸盐缓冲区稀释。
- 派佩特 +1 mL 的 0.1% PEI 溶液进入微电极阵列 (MEA) 盘,使电极完全覆盖 (图 1A 和 1B)。
注:MEA 的微电极通常由铂黑色或碳纳米管组成,并绝缘聚酰胺(或丙烯酸):这两种材料都是疏水的。通过将 MEA 涂上像 PEI 这样的酸性聚合物,疏水性 MEA 表面变得更亲水,使组织样本能够更好地与 MEA 表面接触(图 1A1)。 - 用热塑胶膜盖住MEA盘,以减少蒸发,并在室温下过夜(图1C)。
- 使用移液器从 MEA 盘中吸出 PEI 溶液,小心不要触摸可能损坏电极的电极网格,然后用蒸馏水冲洗≥4 次(图 1D)。
- 将PEI涂层的MEA储存在1-2兆瓦的超纯水下,并在4°C下用热塑胶膜密封,直到需要为止。或者,将涂层的 MEA 浸入装满超纯水的烧嘴中(图 1E)。
注:PEI 涂层过程在 MEA 首次使用之前只需执行一次,每次录制会话后,MEA 应存储在超纯水中。
2. 准备完整的泰罗德组织解剖解决方案
- 制作 1,000 mL 的完整 Tyrode 解剖解决方案;首先,加入8.1816克NaCl至800ml超纯水。
- 在溶液中添加以下化学品量:0.4025 克 KCl:0.1633 克 KH2PO4:1.1915 克 HEPES;0.9999 克葡萄糖:0.0952 克 MgCl2:0.2646 g CaCl2+2H2O.
- 调整pH值到7.4与NAOH,然后添加超纯水,直到总容量为1,000ml。
注:完整 Tyrode 解决方案的最终组成如下(以 mM 形式):140 纳克、5.4 KCl、1.2 KH2PO4、5HEPES、5.55 葡萄糖、1 MgCl 2、1.8 CaCl2。
3. 准备含氧泰罗德的录音解决方案
- 使 500 mL 的 Tyrode 解决方案;加入4.003克NaCl至400ml超纯水。
- 在溶液中添加以下化学物质量:0.651 克 NaHCO3:0.042 克 NaH2PO4:0.132 克 CaCl2+2H2O;0.149 克 KCl;0.0476 克 MgCl2:0.999 克葡萄糖。
- 调整pH值到7.4与HCl,然后添加超纯水,直到总容量为500ml。
- 在开始录制之前,在室温下用卡博根将溶液氧化至少 30 分钟。
注:Tyrode 解决方案的最终组成如下(以 mM 形式):137 纳克、15.5 NaHCO 3、0.7 NaH2PO4、1.8CaCl2、4KCl、1 MgCl2、11.1葡萄糖。此 Tyrode 的解决方案与用于解剖的完整 Tyrode 解决方案的成分略有不同。
4. 准备4-氨基苯丙胺(4-AP)溶液进行药理调制
- 制作 4-AP 的 1 mM 工作解决方案;从第 3 步开始,将 18.82 毫克 4-AP 添加到 200 mL 的 Tyrode 解决方案。
- 在实验前至少30分钟给4-AP溶液氧化。
5. 准备培养皿解剖
- 将硅胶弹性体组件与固化剂的碱基成 10:1 的比例(按重量)混合。
- 将 15 mL 的硅胶弹性体混合物倒入直径为 60 mm 的培养皿中。
- 使用前,让弹性体在室温下治愈48小时。
注:硅化的培养皿可以重复用于未来的解剖。
6. 剖析中性节点(SAN)
- 准备肝化完全泰罗德的解决方案为SAN解剖。
- 加入 400 μL 肝素 (1,000 USP/mL) 到 40 mL 的完整 Tyrode 溶液,并在 37 °C 的水浴中加热。
- 在腹中注射200-300微升肝素(1000 USP/mL),让动物坐10分钟。
- 安乐死肝素化小鼠由异黄素过量。
- 将鼠标放在一个小玻璃室中,该玻璃室中含有通过在穿孔塑料管内的滤纸中添加 200-300 μL 液体异黄素产生的异氟化蒸汽。
注:由于异黄素可引起皮肤刺激,也可以通过皮肤吸收,液体不应直接与小鼠接触。因此,异黄素浸泡的湿巾被放置在穿孔管中进行管理。 - 通过停止运动和呼吸以及没有脚趾捏反射来验证死亡。死亡通常需要大约1-2分钟后,放置到房间。
注:死亡通常伴随着排尿。
- 将鼠标放在一个小玻璃室中,该玻璃室中含有通过在穿孔塑料管内的滤纸中添加 200-300 μL 液体异黄素产生的异氟化蒸汽。
- 将鼠标放在解剖板上的超前位置,爪子伸出来,用1英寸长、23口径的注射器针将爪子固定在板上。然后用手术剪刀切除肋骨笼底部附近的毛皮,并在根部切割毛皮。
注:对于解剖板,可以使用聚苯乙烯冷却盖。 - 在用血态器握住皮肤时,使用手术剪刀在肋骨笼底部的皮肤上进行横切切,从左拱门到右拱门(图3A)。
- 用手术剪刀切开腹膜,小心地将肝脏与隔膜分离,小心不要划伤肝脏,这会导致出血过多(图3B)。沿胸腔将隔膜切除,以暴露胸腔(图3C-D)。
- 使用手术剪刀,将肋骨笼的横壁从拱门边缘切至锁骨,以暴露心脏,小心避免损害心脏(图3D)。然后用23口径的注射器针将肋骨笼固定在肩部,固定到位,脱离手术场。
- 使用转移移液器将肝素化完全 Tyrode 溶液滴入心脏以保持其湿润。
注意:不要让心脏干涸。 - 用额外的细格雷夫钳子抓住肺,用手术剪刀切开气管,取出肺(图3E)。
- 用额外的细格雷夫钳子保持心脏的顶点,并通过用手术剪刀切割主动脉和静脉腔将其切除。将心脏转移到含有腌制硅胶弹性体(图4A)的培养皿中,并使用转移移液器用2-3 mL的温暖(37°C)肝素化完全Tyrode溶液给心脏洗澡。
注意:小心不要损坏右腹膜的精致后壁,其中包含 SAN 和连接的右心房静脉。用完全 Tyrode 的溶液沐浴心脏可防止心脏干燥,但不会完全淹没心脏的溶液中,因为它会在解剖过程中降低可见度。 - 将心脏定向在实验者右侧的右中庭,将实验者左中庭向左侧。
注意:应快速解剖 SAN 组织,以防止缺血相关损伤。 - 用解剖针将心脏的顶点连接到盘子上。然后,当拿着低劣的静脉卡瓦与杜蒙#2层切除钳,插入一个22G注射针通过低等和优越的静脉卡瓦定位其位置在右中庭,这也确定了SA的近似位置(位于下级和高级静脉腔之间的组织补丁(图4B)。
- 使用小解剖针,将左右心房附属物固定在盘子上。
- 当与杜蒙一起拿着左心房附属物时,#2切除钳,在左心房附属物中放置一个解剖针,使其固定到位。
- 当与杜蒙#55钳子一起持有正确的心房附属物时,通过正确的审定附属物放置一个解剖销,使其固定到位。
注:如果需要,同类型的钳子可用于容纳左右的腹房附属物。
- 取出横跨静脉腔的注射针。
- 要从心脏中释放血液,请使用 Castroviejo 剪刀通过在心室进行横切(图 4C)去除心脏的顶点(即下半部分)。然后,通过添加温暖 (37 °C) 肝素化完整的 Tyrode 解决方案与转移移液器洗净心脏。
- 使用卡斯特罗维耶霍剪刀沿着腹腔隔膜切割,使切口比心室更接近心室。继续沿着腹腔隔膜切割,直到腹腔与心室分离。
- 沿着中庭隔膜切开,以去除左中庭。
- 将解剖销放在右中庭的外围,使其平放(图4D)。使用卡斯特罗维耶霍剪刀从中庭取出剩余的脂肪、血管或组织。
- 将 SAN 定位在右中庭,在这个方向中,它大致与上等的静脉卡瓦(顶部)、劣质静脉卡瓦(底部)和克里斯泰末梢(左侧)相邻(图 4D)。
注:在右心房附属物和SAN之间,阴唇末梢以暗肌肉脊出现。通常,SAN动脉也可以看到通过SAN(图4D)的冲刷。
7. 准备 MEA 系统进行录制
- 将 Tyrode 的溶液(从第 3 步)添加到输入溶液瓶 (图 5C),并通过打开卡博根气体 (图 5A)流向系统来使其氧化。
注:用于录制的 Tyrode 解决方案在构图上与用于解剖的完整 Tyrode 解决方案略有不同。 - 通过观察锥形烧瓶中的气泡来验证卡博根的流动,这些气泡用于加湿气体(图 5B)和输入溶液瓶 (图5C)。
- 将渗透泵流入管 (图 5D)插入 Tyrode 的录制解决方案 (图5C)中。然后,将渗透泵流出管插入收集瓶(图5I)。
- 将渗透泵设置为 25 rpm,该泵的流量为 2 mL/min,并启动泵。检查系统是否有缓冲泄漏或溢出。
- 将温度控制器设置为 37 °C,小鼠的生理温度(图 5E)。
8. 将心脏组织放在 MEA 网格上
- 在油漆刷的帮助下将解剖的SAN组织(图6A)从解剖的Petri盘转移到MEA网格上(图1A1)。
- 在倒置显微镜下观察时,用柔软的油漆刷轻轻放置组织,使 SAN 区域覆盖电极网格。
- 根据需要重新定位组织,以确保其平放在电极网格上,与电极保持良好接触。
注意:移动组织需要软漆刷,以避免损坏电极网格。
- 一旦组织正确定位,使用骨钳(或任何弯曲的钳子)将网格置于组织上(图6A)。然后使用骨钳将竖琴锚(图6A)放在网格上,把所有东西都固定到位(图6B)。
- 拍摄组织在 MEA 上的定位图,以便在录制过程中单个电极的活动与其解剖位置相关联。这可以通过将智能手机保持在倒置显微镜目标上或使用附加的显微镜摄像头来实现。
注:如果拍摄照片后 MEA 的方向未更改,则左上电极将在录制过程中作为第一通道 (Ch1) 出现。 - 将 MEA 盘放在连接器板(图 5F 和 6C)上,小心地将灌注盖 (图 6C)放在 MEA 盘上,而不会干扰竖琴切片锚。灌注帽可以使用一块实验室胶带(图6C)进一步固定。
注:除了具有可调节的溶液流入和流出管道外,盖上还有一个输送气体的端口(图6C)。此外,参考电极环贯穿盖(图6C)。 - 让组织从处理中恢复,并在录制前适应腔室 15-20 分钟。
9. 设置数据采集协议进行记录
注:以下步骤描述打开自发节拍录制的软件协议并定义录制条件。这些步骤的具体细节可能因所使用的特定软件而异,但总体轮廓应保持不变。
- 打开放大器(图5G),并在计算机上的软件中设置一个记录工作流程(图5H)。
- 打开软件并单击 工作流程。
- 选择打开 的新文件夹。
- 打开 "从模板"文件夹 。
- 选择 64MD1-1920X1080( 取决于桌面的分辨率)。
- 打开 QT 文件夹。
- 打开 自发录音 文件夹。
- 选择Beat_recording.moflo模板并打开它(图7A)。
- 根据所需的记录条件(图 7B)设置记录参数,以指定痕迹数量、跟踪持续时间、跟踪间隔、输入电压、采样速率等。
注:对于节拍频率和间派克数据采集,通常使用 2.9 mV 的输入范围电压、1-Hz 高通滤器、1000-Hz 低通滤器和 20 kHz 的采样速率。 - 要标记实验的不同阶段或条件,例如药物管理前后,请单击注释选项卡添加所需的记号(图 7C)。
- 要指定要收集数据的文件目的地,请选择 启用存储 框,并在 文件名称修饰框 中输入所需的文件名称。
10. 执行记录和收集数据
- 单击收购软件最上面的菜单栏上的 "记录和播放 "按钮即可开始录制。获取 10 个 1 分钟持续时间的痕迹数据,在痕迹之间间隔 2 分钟。
- 从这些初始痕迹中,通过确认大多数记录通道显示信号振幅为≥ 0.5 mV 和相同的间穗间隔(图 8),验证记录的波形是否与健康和高质量的组织制备一致。
注:可以通过引用在MEA上定位组织后获得的图片,对与其解剖位置对应的单个微电子的活性和波形进行初步评估。 - 要测量药物对组织的影响,请单击最上面的菜单栏上的暂停按钮,在获取初始基线数据后暂停录制。
注:通过单击 注释 选项卡并添加上述所述所需的符号(图 7C),可以在记录中注明实验的药物响应阶段。 - 暂停泵并切换泵流入管从正常的记录解决方案到Tyrode的解决方案,其中包含所需的药物的选择。
注:在示例实验中,Tyrode 的解决方案与 1 mM 4 氨基苯丙胺 (4-AP) 一起使用。 - 重新启动泵并取消录制以再次开始收集数据。
- 一旦药物注入的Tyrode的溶液到达组织,记录10个痕迹的方式与之前的基线记录相同。
注:当药物注入录音室时,这些痕迹需要一些时间才能稳定下来。药物的行动机制也可能影响记录的稳定性。对于具有可逆作用机制的药物,还应记录洗涤期,以确认活性恢复到基线水平,这是健康组织的指标。 - 单击 "停止" 以结束录制。
- 在显微镜下拍摄组织在 MEA 上的定位的最后照片,以防组织在初始记录设置程序后发生转移。
11. 录音后清洁设置
- 清洁 MEA。
- 完成录制后,使用 1 mL 微管从 MEA 盘中轻轻取出录制溶液。
注意:小心不要接触可能损坏它们的 MEA 电极。 - 用骨钳(或任何弯曲的钳子)取出网状和竖琴锚。然后使用油漆刷将组织从 MEA 表面移开,始终小心不要触摸单个微电极。
- 使用洗涤瓶,用超纯水轻轻冲洗MEA盘约3至4次。
- 将浸入超纯水中的清洁 MEA 存放在 4 °C 下。
- 完成录制后,使用 1 mL 微管从 MEA 盘中轻轻取出录制溶液。
- 使用永久泵上的最高速度设置,通过超纯水将系统管子冲洗至少 5 分钟。
注意:为防止真菌生长,清洁后不应在管内留下任何水或缓冲液。
12. 分析 MEA 录音以测量 SAN 节拍频率
- 打开分析软件"Beat_frequency_analysis"模板中保存的记录数据文件(图9)。
- 单击 Play 按钮,让整个录制运行以可视化数据集并分配适当的分析参数。
- 选择垃圾箱窗口,以获得所需的数据显示格式,无论它是按每条痕迹的平均值显示还是按每次平均显示(图 10A)。
- 选择要包含在分析中的通道,并设置自动波形峰值识别所需的振幅最大值或振幅最小阈值(图 10B)。
注:在此步骤中可以选择一个单独的通道、一个频道组合或所有 64 个通道进行分析(图 9)。如果所选阈值过于接近波形的最大值和最小值,则分析软件可能无法识别某些波形峰值。 - 设置要包含在分析中的峰值前和峰值后时间的量。
注:设置为 50 ms 预尖峰和 100 ms 后尖峰通常工作良好(图 10B)。
- 设置分析条件后,再次单击 Play 按钮以重新运行数据集并确认分析参数适合峰值提取。
- 为了进行分析,确定在实验基线期间和药物暴露期(图10A)期间,在大多数通道中每个痕迹表现出稳定跳动率的三个最稳定的连续痕迹。
- 指定分析的始末轨迹,并输入要分析的每个跟踪的持续时间(图9)。
- 在开始分析之前,选择启用框,用于每分钟保存节拍和保存中间间隔(图10B)。
- 在文件名称修饰框(图 10B)中输入所需的文件名称。节拍频率和间派克间隔的分析数据将以 ASCII(文本)格式保存。
注:要分析不同的条件(如基线和药物响应),分析必须针对每个条件单独运行。 - 单击顶部选项卡栏上的 播放和录制 按钮以开始分析。
- 要导出其他应用程序的数据,请选择 每分钟保存节拍 的框并 保存中间间隔 (图 10B)。在 文件名修饰 框(图 10B)中输入所需的文件名,然后单击 "保存" 以在选定文件夹中保存 ASCII 文本格式中的分析数据。
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Representative Results
在让组织在盘子中适应15分钟后,记录了10个一分钟的痕迹。我们当前的协议记录了一个多小时的活动,但我们在未在此处未显示的未发布数据中记录了 ≥4 h 的稳定发射模式。如果实验准备对数据收集有好处,则每个录制通道应显示给定通道均匀形状的一致且均匀间隔的重复波形(即尖峰)(图 11D)。这些波形对应于反映内在心脏起搏活动的单个心跳。每个通道的间歇间隔应该是相同的,即使它们可能不能完全对齐跨通道,因为它们的位置与去极化启动点相比差别很小(图8)。虽然给定通道的波形形状应保持一致,但波形的形状会因组织中的电极位置而异(图 8)。组织与电极的接触程度也可能影响波形特征,如振幅。但是,如果准备令人满意,大多数通道的振幅最大值应至少为 0.5 mV。从10个记录的痕迹中,选择了最符合上述质量标准的连续三个通道作以下进一步分析。 图 10A 显示了连续三个痕迹的稳定节拍频率(顶部面板)和中间间隔(中间面板)的示例。不符合这些标准的组织不应被记录下来,因为可能存在组织损伤,会阻碍准确的数据收集。 图11 显示了坏提取尖峰模式的例子,这些模式要么不存在(A), 受噪音(B)的影响, 要么不稳定(C)。
数据中显示的样本数据是从一只45天大的雄性野生型黑瑞士(Tac:N:NIHS-BC)小鼠身上收集的。图9和图10中描述的分析过程用于提取图12A中可以看到的内在发射速率和显示基线尖峰。发射速率是三个痕迹中每个痕迹 60,000 ms 的平均速率,但图 12A中的峰值模式显示 5 s 的代表性尖峰从单个痕迹中喷出。使用自动分析软件,在我们的样本数据(图 12A)中发现所有 64 个通道中所选三个痕迹的内在发射速率(即节拍频率)约为 320 bpm。一般来说,我们在野生型小鼠的录音中观察到大约290-340bpm的值。发射率也可用作评估制备质量的辅助方法。不稳定或明显低于 300 bpm 的费率不太可能适合分析。这些值可与孤立的心脏和单细胞记录相媲美,后者报告内在心率在大约300-500 bpm25,48,49之间。因此,MEA 记录技术能够生成可靠、准确的内在心率测量。
MEA 系统的一个优点是,它允许药物制剂轻松应用以测试药理效果。在样品实验中,我们测试了1mM 4-AP对发射速率的影响,这应该会减缓SAN活动,因为电压门K+通道的封锁已知会损害SA细胞24,50中的行动潜在再极化。图12B显示,4-AP的引入增加了中间间隔的预期。此延长的峰值间隔相当于节拍频率从 320 bpm 降低到 210 bpm。4-AP 管理后的发射速率与之前的研究类似,该研究使用孤立组织的单电极记录检查了 4-AP 对 SAN 发射率的影响。这项研究测量了在4-AP50在场的情况下发射率约190bpm。因此,MEA系统可以作为测试药物干预对内在心脏功能的药理作用的方便和有价值的工具。
图1:使用前涂层微电极阵列(MEA)。(A)MEA由一个小塑料盘组成,中间有64个微电极的网格阵列(如面板A1所示),外围周围有4个方形图案的参考电极。(B) 增加 1 mL 的 PEI 缓冲器,以涂覆 MEA。(C) 用热塑胶膜覆盖 MEA 盘,在室温下过夜孵化。(D) 从 MEA 菜中取出 PEI 缓冲器,然后用蒸馏水至少冲洗四次。(E) 将涂层的 MEA 探头存放在超纯水中,以防止其干燥。请单击此处查看此图的较大版本。
图2:用于中天节点(SAN)解剖的工具。 在协议的解剖部分使用以下工具:(i) 带硅胶弹性体和小解剖销的培养皿:(二) 塑料转移移液器:(三) 卡斯特罗维耶霍剪刀,尺寸4":(四) 切割手术的手术剪刀(直);(五) 杜蒙#2拉米内切除钳;(六) 杜蒙#55钳子:(七) 额外精细的格雷夫钳子;(八) 赫莫斯塔茨 (弯曲) 。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3:切除心脏。(A)肋骨笼底下方皮肤的横切口,从左拱门左右到右腹弓。(C,D)沿着胸腔切口,露出胸腔。(E) 切除肺部后心脏切除。请单击此处查看此图的较大版本。
图4:从体内取出后,在培养皿中心脏的外观。(A)中腹的解剖。(B) 通过右中庭的劣质静脉卡瓦 (IVC) 和高级静脉卡瓦 (SVC) 插入注射器针。心脏顶点的针脚也显示出来。(C) 切除心脏的顶点(即下半部分)以释放血液。也显示了腹房附属物中的针脚。(D) 解剖末端右中庭的 SAN 区域的最后出现。盒装区域对应于 SAN 的大致位置。也可以隐约看到 SAN 动脉以垂直方向穿过 SAN。缩写:AO,主动脉:CT, 克里斯塔终端;IVC,劣质维纳卡瓦;洛杉矶,左中庭;RA,右中庭;RAA,右腹房附属物;SAN,中性节点;SVC,优越的维纳卡瓦。请单击此处查看此图的较大版本。
图5:微电极阵列(MEA)记录系统设置的示意图。 以下组件包括系统:(A)气瓶(卡博根:95% O2/ 5% CO2):(B) 用蒸馏水加湿气体的圆锥形烧瓶:(C) 记录泰罗德的溶液瓶,提供流入 MEA 菜:(D) 渗透泵泵溶液往返于MEA菜:(E) 温度调节器:(F) 接收来自MEA盘信号的MEA连接板:(G) 放大器:(H) 计算机:(I) 收集瓶从MEA菜废液。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6:SA节点组织在MEA上的定位。(A)用于定位组织的工具:(i) 网格大小为 1.5 mm,(ii) 竖琴锚,(iii) 骨钳,(iv) 油漆刷。(B) 组织在 MEA 上的定位。黄色框表示网格下的中天节点区域的近似区域,并锚定在 MEA 盘中。(C) 将MEA盘与封闭组织在连接器板上进行现场潜在记录的安排:(一) 用于记录溶液的入口:(二) 气体入口(卡博根):(三) 解决方案的出口:(四) 微电极连接板:(五) 灌注帽;(六) 附着在盖上的参考电极环:(七) 胶带,以保持帽。请单击此处查看此图的较大版本。
图7:在软件中设置数据采集协议。 (A) 记录模板示例,显示所有 64 个通道的排列。(B) 记录条件的软件输入属性示例。(C) 注释 菜单示例,显示如何在录制过程中 添加新阶段 ,例如用于测量药物效果。 请单击此处查看此图的较大版本。
图8:显示不同活动波形的组织不同区域。 示例屏幕截图显示不同通道中形状和振幅不同的波形。但是,所有通道都显示相同的间尖间隔和发射频率。红盒子内的通道与放置在组织 SAN 区域内的电极大致相对应。 请单击此处查看此图的较大版本。
图9: 节拍频率分析模板。 示例模板显示节拍频率分析模板中所有 64 个通道的排列。 重播原始数据文件 内嵌显示分析窗口输入属性的示例。在此示例中,已选择 5 到 7 的痕迹进行分析,每个跟踪的分析持续时间已指定为 60,000 ms。
图10:定义尖峰提取的分析参数。 (A) 代表分析模板结果为单通道的3个选定痕迹。顶部面板显示三个选定痕迹的节拍频率(数据点的三个定义分组),每个点表示特定微量期间节拍频率的平均值为 10s。中间面板显示三个选定微量(数据点的三个定义分组)的间穗间隔,每个数据点表示连续两个峰值之间的峰值间隔。左下角面板显示第三个微量的最后 5 s 中选定的代表性提取尖峰,而右下面板显示从左下面板中 5s 组提取的峰值中提取的波形。(B) 分析窗口的扩展视图,显示分析 3 个痕迹的跳动频率时使用的参数。 请单击此处查看此图的较大版本。
图11:代表数字显示特定频道的数据提取的好坏。 不良数据提取: (A) 缺少提取的峰值:(B) 带噪声信号的提取尖峰:(C) 不稳定提取的尖峰。(D) 良好的数据显示没有噪音信号的稳定提取尖峰。 请单击此处查看此图的较大版本。
图12:基线和1mM 4-氨基苯丙胺(4-AP)后的记录。(A)单个微电极的基线记录显示WT心脏中具有稳定发射频率320bpm的波形。(B) 在4-AP管理后,发射频率减慢至210bpm的稳定速度。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
练习和掌握 SAN 解剖过程势在必行,因为组织是脆弱的,健康组织是成功记录的必要条件。在 SAN 解剖过程中,正确的方向对于获得适当的组织区域至关重要。然而,心脏的原始方向很容易在解剖过程中丢失,这使这一努力复杂化。因此,为了确保正确的左右方向,应对阿丽亚进行目视检查。通常,右中庭往往更透明,而左中庭通常更暗,颜色更红25,48。此外,重要的是不要伸展SAN组织,而与它一起工作或安装到电极网格,因为组织很容易机械损坏51。验证健康且正确解剖的 SAN 组织的提示是在显微镜下以完整的 Tyrode 溶液检查它,以验证组织是否在跳动。一旦掌握了这项技术,至少90%的组织制剂应该适合录音。
若干考虑因素可以提高成功录制和后续数据分析的可能性。为确保最佳录音,在实验性录音之前,应仔细准备并测试练习鼠标样本的解决方案。我们广泛努力调整和修改录制解决方案,以优化 SAN 组织的健康。此外,确保用于录制的气体是卡博根(即 95% O2/5% CO2)。单细胞记录通常使用纯氧,因为 Tyrode 溶液用于该应用的特殊化学成分,但用于在 MEA 上录制的溶液需要卡博根来维持稳定的 pH 值。使用纯氧与Tyrode的MEA记录解决方案将导致pH值的波动,这可能导致组织的快速恶化。评估如前所述通道中的振幅最大值将有助于确定组织是否具有良好的记录质量。最后,在录制后协助分析,在录制完成后在 MEA 电极阵列上拍摄安装的 SAN 组织的图像是非常有帮助的。组织可以在 MEA 的初始设置过程中稍作移动,这为分析电极位置提供了最准确的评估。
我们建议 MEA 录音作为描述 SAN 发射率的彻底和准确的方法。MEA 技术的一个优点是,它允许实验者捕获与单个细胞记录相当的发射速率,而无需拥有广泛的电生理专业知识。MEA技术还具有消除神经幽默和机电机制的潜在混淆影响的优势,这些影响在孤立的心脏记录和体内自主封锁测量中固有。心室收缩和呼吸是主要的机电影响,可以改变SAN发射,但他们在我们的组织准备52,53消除。虽然我们的技术消除了对 SAN 的大部分自主影响,但右侧的有限数量的 ICNS 预测可能会影响 SAN 发射,在解释结果 5、6、22、23 时应牢记这一理论限制。此处描述的 MEA 技术的另一个优点是,它可以适应许多其他类型的心脏研究。例如,尽管此协议证明了 4-AP 对 SAN 活性的影响,但未来的研究可以研究几乎无限数量的药理制剂,以及基因突变对 SAN 内在激发的影响。例如,ivabradine,SAN特定Hcn4频道的特定阻滞剂,可用于研究有趣的电流对射击速率54的贡献。MEA 系统还可用于测量心脏其他区域的心脏功能,从而允许详细的、针对区域的特征。但是,从其他心脏区域进行记录需要不同的解剖方法,并且在记录之前可能需要进行薄组织分割。这种技术的一个潜在重大限制是购买MEA系统的成本高,可能令人望而却步。市场上有几种具有类似特性和功能的 MEA 系统,但成本仍然很高。但是,一旦获得初始设备和软件,维护和使用 MEA 系统的成本就相当低。另一个限制是,MEA 系统只允许记录细胞外场位位,这些电细胞外场电位不利于精确比较制剂之间的动作潜在特征(例如振幅和形状),例如可以通过单细胞细胞内记录实现。总之,本协议提供了一个有效的工作流程,以测量和分析小鼠SAN组织内在心脏发射率,并能够以高度具体的方式研究药理干预对发射率的影响。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由国家卫生研究院资助,赠款编号为R01NS100954和R01NS099188。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920x1080 | ||
Dissection Microscope | Jenco | ||
Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
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