Overview
Drosophila microbiota influisce sullo sviluppo, l'immunità e la fisiologia dell'animale. Questo video descrive un metodo per quantificare i batteri dalle mosche determinando le unità di formazione della colonia da preparati per tutto il corpo. Il protocollo in primo piano dimostra la tecnica con le mosche, allevate in condizioni gnotobiotiche utilizzando quattro specie batteriche.
Protocol
Questo protocollo è un estratto da Koyle et al., Allevamento della Mosca della Frutta Drosophila melanogaster Sotto condizioni axeniche e gnotobiotiche, J. Vis. Exp. (2016).
1. Dechorionate Uova e Trasferimento a Dieta Sterile
- Preparare l'armadio per la biosicurezza spruzzando l'interno (compresi i lati) con il 70% di etanolo. Pulire il fondo con un tessuto da laboratorio e sterilizzare il cappuccio con luce UV per ~ 15 minuti. Sterilizzare tutte le forniture non biologiche (tazze campione, pennello, forcep, contenitore di rifiuti, acqua sterilizzata da 400 ml e 100 ml di ipoclorito di sodio allo 0,6%) spruzzando con etanolo e mettendo immediatamente nell'armadio della biosicurezza. Sterilizzare con luce UV per 15 minuti.
- Inizia il primo di 2 lavaggi di ipoclorito di sodio posizionando la boccola con le uova in una tazza di campioni da 120 ml o in un altro contenitore sterile. Versare lentamente ~ 90 ml di soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,6% nella boccola fino a poco sotto il bordo.
- Risciacquare le uova per 2,5 minuti. Sospendere periodicamente le uova utilizzando le forcette per spostare la boccola su e giù nella soluzione di ipoclorito.
- Trasferire la boccola direttamente in una tazza di secondo campione, preriempì con candeggina da 90 ml, all'interno dell'armadio per la biosicurezza.
- Ripetere il passaggio 1.3 all'interno dell'armadio per la biosicurezza. Alla fine del secondo trattamento di candeggina, le uova dovrebbero iniziare ad aderire ai lati della boccola.
- Eseguire i passaggi 1.7-1.8 nell'armadio per la biosicurezza.
- Scartare la candeggina e lavare la boccola con acqua sterile 3 volte. Sospendere le uova più volte durante ogni lavaggio spostando la boccola con le forcep. Entro la fine del terzo lavaggio la maggior parte delle uova dovrebbe essere attaccata al lato della boccola.
- Utilizzando un pennello sterilizzato in etanolo, trasferire le uova dal lato della boccola alla dieta sterile. Trasferire le uova singolarmente o in piccoli lotti. Puntare a 30-50 uova per flaconcino. Lasciare i tappi allentati per consentire all'ossigeno di entrare nel tubo. Se le fiale devono rimanere axeniche, trasferire in un'incubatrice di insetti; in caso contrario, aggiungere batteri come di seguito.
2. Fai mosche gnotobiotiche usando 4 specie batteriche
- Preparare i batteri
- Preparare un armadio di biosicurezza sterilizzato con le forniture necessarie (pipette, scatole di punta di pipetta, tubi di centrifuga sterilizzati, brodo MRS e rack per provette) come nel passaggio 1.1. Pulire l'esterno delle provette con una salvietta da laboratorio imbevuta di etanolo prima di posizionare in un armadio per la biosicurezza.
- Pellettò i batteri trasferendo prima 500 μl di crescita notturna in un tubo di microfugo sterile. Se la densità batterica è bassa, aggiungere fino a 1,5 ml a ciascun tubo o rimuovere in sequenza il supernatante e aggiungere coltura extra allo stesso tubo. Rimuovere i campioni dall'armadio di biosicurezza e centrifugare per 10 minuti a 10.000 x g. Utilizzare le punte del filtro per evitare la contaminazione tra campioni.
- Determinare la densità di ogni coltura misurando OD600. Se si utilizza un lettore di piastre multi-pozzo, trasferire 200 μl di ogni coltura in una piastra da 96 po 'in diluizioni da 1, 2 e 4 volte.
- Determinare la quantità di mMRS in cui diluire ogni pellet di cella (2.1.2) utilizzando uno spettrofotometro di lettura della piastra e le seguenti equazioni. Pianifica di aggiungere abbastanza brodo da inoculare 50 μl a ogni fiala di mosca.
- Raccogli leletture OD 600 per una diluizione 1:1, 1:2 e 1:4 di ogni coltura batterica su uno spettrofotometro a lettura di lastre. Selezionare la diluizione per ogni ceppo batterico che produce un valore OD600 compreso tra 0,1 e 0,2 e utilizzare questo valore e il corrispondente fattore di diluizione come "O" e "D" nelle formule fornite ai punti 2.1.4.2 o 2.1.4.3.
- Se si utilizzano le 4 specie qui descritte, normalizzare le cellule con densità equivalenti di formazione di colonie (CFU)/ml (conversione da OD600 a CFU determinata in precedenza in Newell e Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) usando questa equazione:
E = ((O-B) x V x D)/C
dove E = volume per resopendire il pellet in (μl), O = batteri OD600, B = OD600 mezzi vuoti, D = diluizione piegata, V = μl coltura batterica prima della centrifugazione, C = OD600 di costante predeterminata. Per esempi di calcoli che utilizzano queste equazioni, vedere File di codice supplementare. Per gli spettrofotometri che si sbozzino automaticamente, utilizzare "O" al posto di "O-B".
NOTA: Le costanti predeterminate (unità OD600,normalizzate a 107 CFU ml-1,costanti derivate in Newell e Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)sono i seguenti: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077). - Se si utilizzano altre specie batteriche (non è disponibile alcuna costante CFU/OD600), normalizzare la densità in OD600 = 0,1 usando questa equazione:
E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD600
NOTA: Le unità sono le stesse del passaggio 2.1.4.2. Per esempi di calcoli che utilizzano queste equazioni, vedere File di codice supplementare.
- Nell'armadio di biosicurezza, rimuovere il supernatante con una punta di pipetta e rimescolare il pellet in mMRS o PBS freschi come calcolato nel passaggio 2.1.4.2.
- Inoculare i batteri
- Trasferire 50 μl dei batteri nei tubi conici con dieta sterile e uova dechorionated in armadietto di biosicurezza. Aggiungere batteri dopo il trasferimento delle uova per prevenire la contaminazione tra fiale.
- Posizionare tubi inoculati in un'incubatrice a 25 °C.
3. Misurare il carico/test CFU per la sterilità
- Per misurare il carico di CFU in omogenei di mosca per tutto il corpo, trasferire 5 mosche (5-7 giorni dopo l'esclusione) in un tubo di microfugo da 1,7 ml contenente 125 μl di perline ceramiche e 125 μl di brodo mMRS. Omogeneizzare le mosche usando un omogeneizzatore tissutale per 30 secondi a 4,0 M/sec.
- In alternativa, omettere perline e omogeneizzare a mano in tubi di microcentrifugo con pestelli di plastica per 1 minuto.
- Se si quantifica il microbiota intestinale, sterilizzare in superficie le mosche per rimuovere i microbi esogeni. Trasferire le mosche su un tubo di microcentrifugo contenente 100 μl 70% di etanolo per 1 min, aspirare l'etanolo e trasferirlo in un nuovo tubo di microcentrifugo per omogeneizzazioni. Se verrà misurato il contenuto di DNA dell'intestino, sciacquare per 1 minuto con ipoclorito di sodio allo 0,6% prima del lavaggio dell'etanolo.
- Diluire l'omogeneato con 875 μl mMRS, vortice per 5 sec e pipettare 120 μl di omogeneato nel primo pozzo di una piastra di microtitolo.
- Eseguire due diluizioni sequenziali 1:8 usando 10 μl omogeneato e 70 μl MRS nei due pozzi successivi.
- Rimuovere 10 μl dal primo pozzo e aggiungerlo al secondo pozzo contenente 70 μl MRS. Mescolare accuratamente il contenuto del secondo pozzo, trasferire 10 μl dal secondo pozzo al terzo pozzo contenente 70 μl MRS e mescolare accuratamente. Questo porta a 3 concentrazioni totali dell'omogeneato originale di 1.000 μl: non diluito, 1:8 e 1:64.
- Trasferire 10 μl di ogni diluizione su una piastra mMRS (utilizzando una pipetta multicanale se lo si desidera). Inclinare leggermente il piatto per stendere la diluizione di diversi millimetri lungo la superficie dell'agar e lasciare asciugare il liquido prima di spostare la piastra. Il liquido si asciuga rapidamente sul piatto se le piastre hanno 2 giorni, riducendo la miscelazione di due goccioline vicine.
- Incubare a 30 °C per 1-2 giorni. Rimuovere le placche dall'incubatore una volta distinte, le singole colonie sono visibili e contare da una diluizione con 10-100 colonie isolate.
- Calcolare CFU per mosca usando l'equazione E = C x D/P x V/F, dove E = CFU per mosca, C = numero di colonie contate, D = diluizione, P = μl placcate, V = volume di omogenato di mosca, e F = numero di mosche omogeneizzate.
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Representative Results
File di codice supplementare: calcoli di esempio. Clicca qui per visualizzare questo file (fai clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Brewer's Yeast | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | |
Glucose | Sigma Aldrich | 158968-3KG | |
Agar | Fisher--Lab Scientific | fly802010 | |
Welch's 100% Grape Juice Concentrate | Walmart or other grocery store | 9116196 | |
Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container | Webstaurant Store | 999L5032Y | |
Translucent Round Deli Container Lid | Webstaurant Store | 999YNL500 | |
Stock Bottles | Genesee Scientific | 32-130 | |
Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | |
Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | |
Plastic Bushing | Home Depot | 100404002 | |
Plastic Bushing Cap | Home Depot | 100153897 | |
Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | |
Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
50 ml Centrifuge Tubes | TrueLine Centrifuge Tubes | TR2003 | |
Food Boxes | USA Scientific | 2316-5001 | |
Lysing Matrix D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | |
Filter Pipette Tips, 300 µl | USA Scientific | 1120-9810 | |
Petri Dishes | Laboratory Product Sales | M089303 | |
Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | |
Paintbrush | Walmart | 5133 | |
Forceps | Fisher | 08-882 | |
Household Bleach (6-8% Hypochlorite) | Walmart | 550646751 | |
Universal Peptone | Genesee Scientific | 20-260 | |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
Dipotassium Phosphate | Sigma Aldrich | P3786-1KG | |
Ammonium Citrate | Sigma Aldrich | 25102-500g | |
Sodium Acetate | VWR | 97061-994 | |
Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | |
Manganese Sulfate | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | |
MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | |
96 Well Plate Reader | BioTek (Epoch) | NA | |
1.7 ml Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
Filter Pipette Tips, 1,000 µl | USA Scientific | 1122-1830 | |
96 Well Plates | Greiner Bio-One | 655101 | |
Ceramic Beads | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | |
Tissue Homogenizer | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | |
Class 1 BioSafety Cabinet | Thermo Scientific | Model 1395 |