Dissectie van de Midgut van een volwassen vlieg: een methode voor het isoleren van het spijsverteringskanaal

Overview

In deze video belichten we een dissectie van de volwassen Drosophila-darm en het verzamelen van midguts die geschikt zijn voor eencellige dissociatie en FACS om darmstamcellen te isoleren.

Protocol

Dit protocol is een uittreksel uit Tauc et al., Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging, J. Vis. Exp. (2014).

OPMERKING: Als dit protocol voor het eerst wordt gebruikt om ISC's te isoleren door FAC-sortering, zijn de volgende besturingselementen verplicht om de FACS-parameters in eerste instantie correct in te stellen: Gedissocieerde cellen van wild type (bijv. w¹¹¹⁸) Drosophila midguts zonder Sytox. Gedissocieerde cellen van wild type (bijv. w¹¹¹⁸) Drosophila midguts met Sytox (zie stap 3.6). Gedissocieerde cellen van midguts van de esg-Gal4, UAS-GFP vlieglijn zonder Sytox.

1. Voorbereiding van oplossingen en gerechten voor darmdissectie

1. Bereid 4-6 flacons met elk 40 vrouwelijke vliegen uit de esg-Gal4, UAS-GFP vlieglijn.
2. Bereid uit een 10x PBS stamoplossing 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH₂PO₄· H₂O, 8,4 mM Na₂HPO₄·2H₂O, 175 mM NaCl, pH instellen op 7,4).
3. Bereid een 3,5% agaroseoplossing in 1x PBS (3,5 g elektroforesekwaliteit agarose in 100 ml 1x PBS). Bereid dissectieplaten door deze oplossing in petrischalen (diameter 8,5 cm) te gieten om de bodem te bedekken. De agaroselaag voorkomt beschadiging van de uiteinden van de tang tijdens de dissectieprocedure. Nadat de gel gestold is, bewaar je de dissectieplaten bij 4 °C.
4. Bereid 300 ml 1x PBS + 1% BSA vers voor het ontleden en zet de fles op ijs of op 4 °C.
5. Zet de centrifuge aan en laat afkoelen tot 4 °C.
6. Vlam de uiteinden van 2 glazen Pasteur pipetten om de randen glad te strijken.
7. Reinig twee paar tangen en één scheermesje met 70% ethanol.
8. Plaats vier tot zes microcentrifugebuizen van 1,5 ml voor het verzamelen van ontlede midguts op ijs.

2. Voorbereiding van het maagdarmkanaal en dissectie van de Midgut

1. Verdoof vliegen uit één flacon (40 vliegen) met CO₂ op een standaard vliegbed, onthoofd alle vliegen met een scheermesje en breng ze over naar de dissectieschaal. Giet koude 1x PBS/1% BSA-oplossing in de dissectieschaal om de agarosegel te bedekken. De vliegen zullen drijven.
2. Pak de vliegbuik met één paar tangen, terwijl je de thorax vasthoudt met het andere paar tangen. Scheid de thorax van de buik. De darm zal zichtbaar zijn en de foregut/gewas zal hoogstwaarschijnlijk nog steeds verbonden zijn met de thorax.
3. Pak de darm en trek hem uit de thorax. Om de darm uit te vouwen, grijpt u het gewas en trekt u de darm iets voorste weg van de buik.
4. Pak het achterste uiteinde van de buik met één paar tangen en de rand van de voorste open cuticula met het andere paar tangen. Pas op dat u het uitstekende darmweefsel niet vernietigt. Trek het achterste uiteinde weg om de nagelriem te breken en blijf achterste voorzichtig trekken totdat de hele darm uit de buikholte is getrokken. Het gewas moet mogelijk van tevoren worden verwijderd als het te groot is om door de lichaamsholte te passen.
5. Verwijder de foregut, Malinese tubuli, hindgut en eierstokken en verlaat de kale midgut.
6. Breng met behulp van een glazen Pasteur pipet de partij ontlede midguts over naar een 1,5 ml microcentrifugebuis met koude 1x PBS/1% BSA-oplossing en houd de buis op ijs. De monsters moeten binnen 2 uur worden verwerkt.
7. Nadat de dissectie van een hele partij is voltooid, spoelt u de dissectieschaal af met dubbel gedestilleerd water om het overgebleven vuil af te wassen. Begin met het ontleden van de volgende batch midguts (herhaal stap 2.1–2.7). Ontleed zoveel mogelijk batches binnen 2 uur en ga vervolgens verder met stap 3.1.

3. Vertering van het darmweefsel om cellen te oogsten voor FAC-sortering

1. Verwijder de 1x PBS/1% BSA-oplossing uit de midguts en voeg 500 μl 0,5% Trypsine-EDTA-oplossing toe aan elk monster.
2. Vortex goed gedurende 20 sec en incubeer de monsters door zachtjes te schommelen / draaien bij 20 tpm bij kamertemperatuur gedurende 25-30 minuten.
3. Vortex weer na ongeveer 30 min en laat het intacte midgut weefsel zinken naar de bodem van de buis. Verwijder voorzichtig de cellen die in suspensie zijn met een gevlamde glazen Pasteur pipet en filtreer ze door een nylon gaas van 35 μm in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml.
4. Draai de cellen 5 min bij 4 °C op 100 x g naar beneden. Let op, bij het starten van de samenvatting is een celkorrel in het begin misschien niet zichtbaar, maar wordt deze zichtbaar naarmate de weefselvertering vordert.
   1. Breng de Trypsin-oplossing voorzichtig terug naar de oorspronkelijke monsterbuis met het resterende intacte midgutweefsel. Vermijd het overbrengen van te veel cellen uit de pellet.
   2. Hang de celkorrel voorzichtig opnieuw op in 400 μl koude 1x PBS/1% BSA. Houd de microcentrifugebuizen met de gedissocieerde cellen op ijs en bedek de buizen met aluminiumfolie om de cellen tegen licht te beschermen.
   3. Draai de Trypsine-oplossing met het resterende intacte midgutweefsel opnieuw en plaats de monsters nog 30 minuten op de rocker bij kamertemperatuur.
5. Herhaal stap 3.3 tot 3.4.3 totdat al het midgutweefsel is verteerd. Combineer de gedissocieerde cellen van alle microcentrifugebuizen tot één microcentrifugebuis. Dit kan een centrifugeerstap vereisen zoals in 3.4, omdat het volume van alle celsuspensingen samen meer dan 1,5 ml kan bedragen. Houd de celsuspensie op ijs en bescherm de cellen tegen licht.
6. Draai de gedissocieerde cellen gedurende 5 min bij 4 °C bij 100 x g naar beneden. Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk van het supernatant en laat ongeveer 50-100 μl van de 1x PBS/1% BSA-oplossing in de microcentrifugebuis achter. Resuspend de gedissocieerde cellen voorzichtig in 800 μl 1x PBS/1% BSA met Sytox (1:20.000).
7. Breng de celsuspensie over naar een Falcon-buis met ronde bodem van 5 ml door de cellen te filteren door een celzeef snap cap (35 μm nylon mesh). Houd celmonsters altijd op ijs en beschermd tegen licht. De cellen zijn nu klaar om gesorteerd te worden.
8. Pipet 600 μl RNAlater-oplossing in elke microcentrifugebuis waarin de cellen worden gesorteerd voor latere RNA-isolatie. Voor andere downstreamtoepassingen kunnen de cellen in een andere oplossing worden verzameld, bijvoorbeeld in steriel PBS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh)	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	15400-054	Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry	Life Technologies	S34857
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7023	Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter	Becton Dickinson		Turn on one hour prior to sorting