Рассечение Мидгута от взрослой мухи: метод изоляции пищеварительного тракта

Overview

В этом видео мы подчеркиваем вскрытие взрослого кишечника дрозофилы и сбор мидгутов, пригодных для одноклеточной диссоциации и FACS для того, чтобы изолировать кишечные стволовые клетки.

Protocol

Этот протокол является выдержка из Tauc и др.., Изоляция кишечных стволовых клеток от взрослых Drosophila Midguts по FACS для изучения поведения стволовых клеток во время старения, J. Vis. Exp. (2014).

ПРИМЕЧАНИЕ: Если этот протокол используется впервые для изоляции ISCs путем сортировки FAC, следующие элементы управления являются обязательными для того, чтобы первоначально установить параметры FACS должным образом: Диссоциированные клетки от дикого типа ^{(например, w 1118}) Drosophila midguts без Sytox. Разобщеные клетки от дикого типа (например, w¹¹¹⁸) Drosophila midguts с Sytox (см. Шаг 3.6). Разобщеные клетки из мидгутов esg-Gal4,UAS-GFP летают без Sytox.

1. Подготовка решений и блюд для вскрытия кишки

1. Подготовь 4-6 флаконов, каждая из которых содержит 40 самок мух с линии esg-Gal4,UAS-GFP.
2. Из 10x PBS фондовый раствор подготовить 500 мл 1x PBS (1,8 мМН₂PO₄ H₂O, 8,4 мм На₂HPO₄No2H₂O, 175 мМн NaCl, отрегулируйте рН до 7,4).
3. Подготовка 3,5% агарозный раствор в 1x PBS (3,5 г электрофорез класса агарозы в 100 мл 1x PBS). Приготовьте пластины для вскрытия, заливая этот раствор в чашки Петри (диаметр 8,5 см), чтобы покрыть дно. Слой агарозы предотвращает повреждение кончиков типсов во время процедуры вскрытия. После того, как гель затвердеет, храните пластины для вскрытия при 4 градусах Цельсия.
4. Приготовьте 300 мл 1x PBS и 1% BSA свежим перед вскрытием и поместите бутылку на лед или при 4 градусах Цельсия.
5. Включите центрифугу и дайте ей остыть до 4 градусов по Цельсию.
6. Пламя кончики 2 стеклянных пипеток Пастера, чтобы сгладить края.
7. Очистите две пары типсов и одно лезвие бритвы с 70% этанола.
8. Поместите от четырех до шести 1,5 мл микроцентрифуг трубки для сбора расчлененных midguts на льду.

2. Подготовка желудочно-кишечного тракта и рассечение Мидгута

1. Обезболивать мух из одного флакона (40 мух) с CO_{2 на стандартной мухой} кровать, обезглавить всех мух с помощью лезвия бритвы и передать их в рассечение блюдо. Налейте холодный 1x PBS/1% BSA раствор в блюдо для вскрытия, чтобы покрыть гель агарозы. Мухи будут плавать.
2. Захватите живот мухи с одной парой типсов, держа грудную клетку с другой парой типсов. Отделить грудную клетку от живота. Кишечник будет виден и foregut / урожай, скорее всего, по-прежнему будет подключен к грудной клетке.
3. Хватай кишку и вытащи ее из грудной клетки. Чтобы развернуть кишечник, схватить урожай и вытащить кишечник немного передней от живота.
4. Захватите задний конец живота с одной парой типсов и края передней открытой кутикулы с другой парой типсов. Будьте осторожны, чтобы не разрушить выступающие ткани кишечника. Вытяните задний конец прочь, чтобы сломать кутикулу и продолжать потянув задней очень мягко, пока весь кишечник был вытащил из брюшной полости. Урожай, возможно, придется удалить заранее, если он слишком велик, чтобы поместиться через полость тела.
5. Удалите foregut, malpighian трубоубий, хиндгут и яичники оставляя голые midgut.
6. Используя стеклянную трубу Pasteur, перенесите партию расчлененных мидгутов в 1,5 мл микроцентрифугной трубки, содержащей холодный раствор 1x PBS/1% BSA, и держите трубку на льду. Образцы должны быть обработаны в течение 2 часов.
7. После вскрытия всей партии завершена, промыть рассечение блюдо с двойной дистиллированной водой, чтобы смыть оставшиеся обломки. Начните рассечение следующей партии мидгутов (повторите шаги 2.1-2.7). Рассекаете как можно больше партий в течение 2 часов, а затем перейти к шагу 3.1.

3. Переваривание ткани кишки для сбора клеток для сортировки FAC

1. Удалите решение 1x PBS/1% BSA из мидгутов и добавьте 500 мкл из 0,5% решения Trypsin-EDTA к каждому образцу.
2. Vortex хорошо в течение 20 сек и инкубировать образцы нежным качания / вращения при 20 об /мин при комнатной температуре в течение 25-30 мин.
3. Vortex снова примерно через 30 минут, и пусть нетронутыми середине ткани раковины на дно трубки. Тщательно удалите клетки, которые находятся в подвеске с воспаленным стеклом Пастер пипетки и фильтровать их через 35 мкм нейлоновой сетки в свежем 1,5 мл микроцентрифуг трубки.
4. Спин клетки вниз на 100 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию. Следует отметить, при запуске дайджеста, гранулы клеток не могут быть видны на первый, но станет видимым, как ткань дайджест прогрессирует.
   1. Тщательно перенесите раствор трипсина обратно в оригинальную пробную трубку, содержащую оставшуюся нетронутую ткань мидгута. Избегайте переноса слишком много клеток из гранул.
   2. Аккуратно повторно приостанавливайте гранулы клеток в 400 мкл холодного 1x PBS/1% BSA. Держите микроцентрифуговые трубки, содержащие диссоциированные клетки на льду, и накройте трубки алюминиевой фольгой, чтобы защитить клетки от света.
   3. Vortex трипсин решение, содержащее оставшиеся нетронутыми ткани midgut снова и поместить образцы на рокер еще 30 минут при комнатной температуре.
5. Повторите шаги от 3,3 до 3,4,3 до тех пор, пока все ткани мидгута не будут переварены. Объедините диссоциированные клетки из всех микроцентрифугных трубок в одну микроцентрифугную трубку. Это может потребовать шаг центрифугации, как в 3,4, так как объем всех клеточных суспензий вместе взятых может превышать 1,5 мл. Держите подвеску клетки на льду и защитите клетки от света.
6. Спин диссоциированных клеток вниз на 100 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию. Тщательно удалите как можно больше супернатанта, оставляя примерно 50-100 мкл раствора 1x PBS/1% BSA в микроцентрифуге трубки. Аккуратно resuspend диссоциированных клеток в 800 мкл 1x PBS/1% BSA, содержащий Sytox (1:20,000).
7. Перенесите подвеску клетки на 5 мл круглой нижней трубки Falcon, фильтруя клетки через крышку оснастки клеточного ситечко (35 мкм нейлоновой сетки). Всегда держите образцы клеток на льду и защищены от света. Клетки теперь готовы к сортировке.
8. Pipette 600 мкл раствора РНК-8 в каждую микроцентрифугную трубку, в которую будут отсортированы клетки для последующей изоляции РНК. Для других приложений ниже по течению клетки могут быть собраны в другом растворе, например, в стерильных PBS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh)	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	15400-054	Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry	Life Technologies	S34857
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7023	Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter	Becton Dickinson		Turn on one hour prior to sorting