Dissektion des Midgut von einer Erwachsenenfliege: Eine Methode zur Isolierung des Verdauungstraktes

Overview

In diesem Video zeigen wir eine Zerlegung des erwachsenen Drosophila-Darms und die Sammlung von Mittelguts, die für die einzellige Dissoziation und FACS geeignet sind, um Darmstammzellen zu isolieren.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Tauc et al., Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging, J. Vis. Exp. (2014).

HINWEIS: Wenn dieses Protokoll zum ersten Mal verwendet wird, um ISCs durch FAC-Sortierung zu isolieren, sind die folgenden Kontrollen obligatorisch, um die FACS-Parameter zunächst richtig einzustellen: Dissoziierte Zellen vom Wildtyp (z.B. w¹¹¹⁸) Drosophila midguts ohne Sytox. Dissosomierte Zellen vom Wildtyp (z.B. w¹¹¹⁸) Drosophila midguts mit Sytox (siehe Schritt 3.6). Dissoziierte Zellen aus Midguts der esg-Gal4, UAS-GFP Fliegenlinie ohne Sytox.

1. Zubereitung von Lösungen und Geschirr für die Darmsektion

1. Bereiten Sie 4-6 Fläschchen mit je 40 weiblichen Fliegen aus der esg-Gal4, UAS-GFP Fliegenlinie vor.
2. Aus einer 10x PBS-Lagerlösung 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH₂PO₄ H₂O, 8,4 mM Na₂HPO₄2H₂O, 175 mM NaCl, pH auf 7,4 einstellen).
3. Bereiten Sie eine 3,5%ige Agaroselösung in 1x PBS (3,5 g Elektrophorese-Agabarose in 100 ml 1x PBS) vor. Bereiten Sie Sezierplatten vor, indem Sie diese Lösung in Petrischalen (Durchmesser 8,5 cm) gießen, um den Boden zu bedecken. Die Agaroseschicht verhindert, dass die Spitzen der Zange während des Sezierens beschädigt werden. Nachdem das Gel erstarrt ist, lagern Sie die Sezierenplatten bei 4 °C.
4. 300 ml 1x PBS + 1% BSA frisch vor dem Sezieren vorbereiten und die Flasche auf Eis oder bei 4 °C legen.
5. Zentrifuge einschalten und auf 4 °C abkühlen lassen.
6. Brennen Sie die Spitzen von 2 Glas Pasteur Pipetten, um die Kanten zu glätten.
7. Reinigen Sie zwei Zangenpaare und eine Rasierklinge mit 70% Ethanol.
8. Legen Sie vier bis sechs 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zum Sammeln von sezierten Midguts auf Eis.

2. Vorbereitung des Magen-Darm-Traktes und Dissektion des Midgut

1. Anästhetisieren Fliegt von einer Durchstechflasche (40 Fliegen) mit CO₂ auf einem Standard-Flugbett, enthauptet alle Fliegen mit einer Rasierklinge und überträgt sie auf die Sezierschale. Gießen Sie kalte 1x PBS/1% BSA-Lösung in die Sezierschale, um das Agarose-Gel zu bedecken. Die Fliegen werden schweben.
2. Schnappen Sie sich den Fliegenbauch mit einem Paar Zangen, während Sie den Thorax mit dem anderen Zangenpaar halten. Trennen Sie den Thorax vom Bauch. Der Darm wird sichtbar sein und das Vorgut/Die Ernte wird höchstwahrscheinlich noch mit dem Thorax verbunden sein.
3. Schnappen Sie sich den Darm und ziehen Sie ihn aus dem Thorax. Um den Darm zu entfalten, greifen Sie die Ernte und ziehen Sie den Darm leicht vordem weg aus dem Bauch.
4. Schnappen Sie sich das hintere Ende des Bauches mit einem Paar Zangen und den Rand der vorderen offenen Nagelhaut mit dem anderen Zangenpaar. Achten Sie darauf, das hervorstehende Darmgewebe nicht zu zerstören. Ziehen Sie das hintere Ende weg, um die Nagelhaut zu brechen und ziehen Sie weiter nach tränglich sehr sanft, bis der gesamte Darm aus der Bauchhöhle gezogen wurde. Die Ernte muss möglicherweise vorher entfernt werden, wenn sie zu groß ist, um durch die Körperhöhle zu passen.
5. Entfernen Sie das Vorgut, Malpighian Tubuli, Hintergut und Eierstöcke verlassen das nackte Mittelgut.
6. Mit einer glasigen Pasteurpipette die Charge der sezierten Mittelguts in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit kalter 1x PBS/1% BSA-Lösung übertragen und die Röhre auf Eis halten. Die Proben müssen innerhalb von 2 Stunden verarbeitet werden.
7. Nachdem die Zerlegung einer ganzen Charge abgeschlossen ist, spülen Sie die Sezierschale mit doppelt destilliertem Wasser ab, um übrig gebliebene Reste abzuwaschen. Beginnen Sie mit der Sezieren des nächsten Stapels von Midguts (wiederholen Sie die Schritte 2.1–2.7). Sezieren Sie so viele Chargen wie möglich innerhalb von 2 Stunden, und fahren Sie dann mit Schritt 3.1 fort.

3. Verdauung des Darmgewebes zur Ernte von Zellen für die FAC-Sortierung

1. Entfernen Sie die 1x PBS/1% BSA-Lösung aus den Midguts und fügen Sie jeder Probe 500 l 0,5% Trypsin-EDTA-Lösung hinzu.
2. Vortex gut für 20 Sec und inkubieren die Proben durch sanfteschaukeln / drehen bei 20 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur für 25-30 min.
3. Nach ca. 30 min wieder Wirbel und lassen Sie das intakte Mittelgutgewebe auf den Boden des Rohres sinken. Entfernen Sie vorsichtig die Zellen, die sich in Suspension befinden, mit einer geflammten Pasteurpipetten aus Glas und filtern Sie sie durch ein 35-mm-Nylongewebe in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
4. Drehen Sie die Zellen bei 100 x g für 5 min bei 4 °C nach unten. Beachten Sie, dass beim Starten des Digests ein Zellpellet möglicherweise zunächst nicht sichtbar ist, aber im Verlauf des Gewebeverdaus sichtbar wird.
   1. Übertragen Sie die Trypsin-Lösung vorsichtig zurück in das ursprüngliche Probenröhrchen, das das verbleibende intakte Mittelgutgewebe enthält. Vermeiden Sie es, zu viele Zellen aus dem Pellet zu übertragen.
   2. Das Zellpellet vorsichtig in 400 l kalt erlegen 1x PBS/1% BSA. Bewahren Sie die Mikrozentrifugenrohre mit den dissoziierten Zellen auf Eis auf und bedecken Sie die Rohre mit Aluminiumfolie, um die Zellen vor Licht zu schützen.
   3. Die Trypsin-Lösung, die das verbleibende intakte Mittelgutgewebe enthält, enthält wieder und legen Sie die Proben weitere 30 min bei Raumtemperatur auf die Wippe.
5. Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.4.3, bis das gesamte Mittelgutgewebe verdaut ist. Kombinieren Sie die dissoziierten Zellen aus allen Mikrozentrifugenröhrchen zu einem Mikrozentrifugenrohr. Dies kann einen Zentrifugationsschritt wie in 3.4 erfordern, da das Volumen aller Zellsuspensionen zusammen 1,5 ml überschreiten kann. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis und schützen Sie die Zellen vor Licht.
6. Drehen Sie die dissoziierten Zellen bei 100 x g für 5 min bei 4 °C nach unten. Entfernen Sie vorsichtig so viel des Überstandes wie möglich und lassen Sie ca. 50-100 l der 1x PBS/1% BSA-Lösung im Mikrozentrifugenrohr zurück. Heben Sie die dissoziierten Zellen in 800 l 1x PBS/1% BSA, die Sytox (1:20,000) enthalten, vorsichtig wieder ab.
7. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 5 ml rundes Falcon-Unterrohr, indem Sie die Zellen durch eine Zellsieb-Snap-Kappe (35 m Nylongewebe) filtern. Bewahren Sie Zellproben immer auf Eis auf und schützen Sie sie vor Licht. Die Zellen können nun sortiert werden.
8. Pipette 600 l RNAlater-Lösung in jedes Mikrozentrifugenrohr, in das die Zellen für die nachfolgende RNA-Isolierung sortiert werden. Für andere nachgeschaltete Anwendungen können die Zellen in einer anderen Lösung gesammelt werden, z.B. in sterilem PBS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh)	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	15400-054	Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry	Life Technologies	S34857
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7023	Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter	Becton Dickinson		Turn on one hour prior to sorting