Dissecção do Midgut de uma mosca adulta: um método para isolar o trato digestivo

Overview

Neste vídeo, destacamos uma dissecção do intestino Drosophila adulto e coleta de midguts adequados para dissociação unicelular e FACS, a fim de isolar células-tronco intestinais.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Tauc et al., Isolando células-tronco intestinais de Drosophila Midguts adultos pela FACS para estudar o comportamento das células-tronco durante o envelhecimento, J. Vis. Exp. (2014).

NOTA: Se este protocolo for usado pela primeira vez para isolar os ISCs por classificação FAC, os seguintes controles são obrigatórios para definir inicialmente os parâmetros FACS corretamente: Células dissociadas do tipo selvagem (por exemplo, w¹¹¹⁸) Drosophila midguts sem Sytox. Células dissociadas do tipo selvagem (por exemplo, w¹¹¹⁸) Drosophila midguts com Sytox (ver Passo 3.6). Células dissociadas de midguts do esg-Gal4, UAS-GFP linha de voo sem Sytox.

1. Preparação de soluções e pratos para dissecção intestinal

1. Prepare 4-6 frascos cada um contendo 40 moscas fêmeasda linha aérea esg -Gal4, UAS-GFP.
2. A partir de uma solução de estoque PBS 10x prepare 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH₂PO₄· H₂O, 8,4 mM Na₂HPO₄·2H₂O, 175 mM NaCl, ajuste pH para 7,4).
3. Prepare uma solução de 3,5% de agarose em 1x PBS (3,5 g de eletroforese de grau agarose em 100 ml 1x PBS). Prepare as placas de dissecção despejando esta solução em placas de petri (diâmetro de 8,5 cm) para cobrir o fundo. A camada de agarose evita danificar as pontas dos fórceps durante o procedimento de dissecção. Depois que o gel tiver solidificado armazenar as placas de dissecção a 4 °C.
4. Prepare 300 ml de 1x PBS + 1% BSA fresco antes de dissecar e coloque a garrafa no gelo ou a 4 °C.
5. Ligue a centrífuga e deixe esfriar a 4 °C.
6. Flame as pontas de 2 canções pasteur de vidro para suavizar as bordas.
7. Limpe dois pares de fórceps e uma lâmina de barbear com 70% de etanol.
8. Coloque de quatro a seis tubos de microcentrifuuge de 1,5 ml para coletar meios de pó dissecados no gelo.

2. Preparação do Trato Gastrointestinal e Dissecção do Midgut

1. Anesthetize voa de um frasco (40 moscas) com CO₂ em uma cama de mosca padrão, decapita todas as moscas usando uma lâmina de barbear e transferi-las para o prato de dissecção. Despeje a solução BSA fria 1x PBS/1% no prato de dissecção para cobrir o gel de agarose. As moscas flutuarão.
2. Pegue o abdômen da mosca com um par de fórceps, enquanto segura o tórax com o outro par de fórceps. Separe o tórax do abdômen. O intestino será visível e o foregut/cultura provavelmente ainda estará conectado ao tórax.
3. Pegue o intestino e puxe-o para fora do tórax. Para desdobrar o intestino, pegue a colheita e puxe o intestino ligeiramente para longe do abdômen.
4. Pegue a extremidade posterior do abdômen com um par de fórceps e a borda da cutícula anteriormente aberta com o outro par de fórceps. Tenha cuidado para não destruir o tecido intestinal salientes. Puxe a extremidade posterior para quebrar a cutícula e continue puxando posteriormente muito suavemente até que todo o intestino tenha sido retirado da cavidade abdominal. A cultura pode ter que ser removida de antemão se for muito grande para caber através da cavidade corporal.
5. Remova o foregut, os túbulos malpighianos, o hindgut e os ovários deixando o midgut nu.
6. Usando uma pipeta Pasteur de vidro, transfira o lote de midguts dissecados para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo solução BS/1% BSA fria e mantenha o tubo no gelo. As amostras devem ser processadas dentro de 2 horas.
7. Após a dissecação de um lote inteiro estiver completa, enxágue o prato de dissecção com água destilada dupla para lavar os detritos deixados. Comece a dissecar o próximo lote de midguts (repetir passos 2.1-2.7). Disseca o máximo de lotes possível dentro de 2 horas e, em seguida, prossiga para a Etapa 3.1.

3. Digestão do tecido intestinal para colher células para classificação FAC

1. Remova a solução 1x PBS/1% BSA dos midguts e adicione 500 μl de solução Trypsin-EDTA de 0,5% a cada amostra.
2. Vórtice bem por 20 segundos e incubar as amostras por rocha suave/rotação a 20 rpm em temperatura ambiente por 25-30 min.
3. Vórtice novamente depois de cerca de 30 minutos e deixe o tecido médio intacto afundar para o fundo do tubo. Remova cuidadosamente as células que estão em suspensão com uma pipeta pasteur de vidro flamejante e filtre-as através de uma malha de nylon de 35 μm em um tubo de microcentrifuge fresco de 1,5 ml.
4. Gire as células a 100 x g por 5 min a 4 °C. Note-se que, ao iniciar o digestão, uma pelota celular pode não ser visível no início, mas se tornará visível à medida que a digestão tecidual progride.
   1. Transfira cuidadosamente a solução trypsin de volta para o tubo de amostra original contendo o tecido médio intacto restante. Evite transferir muitas células da pelota.
   2. Suspenda suavemente a pelota de célula em 400 μl de PBS/1% BSA frio. Mantenha os tubos de microcentrifuuagem contendo as células dissociadas no gelo e cubra os tubos com papel alumínio para proteger as células da luz.
   3. Vórtice a solução Trypsin contendo o tecido médio intacto restante novamente e coloque as amostras no roqueiro por mais 30 minutos à temperatura ambiente.
5. Repita as etapas 3.3 a 3.4.3 até que todo o tecido médio tenha sido digerido. Combine as células dissociadas de todos os tubos de microcentrifuuagem em um tubo de microcentrífuga. Isso pode exigir uma etapa de centrifugação como em 3.4, uma vez que o volume de todas as suspensões celulares combinadas pode exceder 1,5 ml. Mantenha a suspensão celular no gelo e proteja as células da luz.
6. Gire as células dissociadas a 100 x g por 5 min a 4 °C. Remova cuidadosamente o máximo possível do supernascer, deixando aproximadamente 50-100 μl da solução 1x PBS/1% BSA no tubo de microcentrifuuagem. Resuspenque suavemente as células dissociadas em 800 μl 1x PBS/1% BSA contendo Sytox (1:20.000).
7. Transfira a suspensão da célula para um tubo falcão de fundo redondo de 5 ml filtrando as células através de uma tampa de encaixe do filtro de célula (malha de nylon de 35 μm). Mantenha sempre amostras de células no gelo e protegidas da luz. As células estão prontas para serem classificadas.
8. Pipeta 600 μl de solução RNAlater em cada tubo de microcentrifuuge em que as células serão classificadas para o isolamento subsequente do RNA. Para outras aplicações a jusante, as células podem ser coletadas em uma solução diferente, por exemplo, em PBS estéril.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh)	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	15400-054	Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry	Life Technologies	S34857
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7023	Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter	Becton Dickinson		Turn on one hour prior to sorting