Dissection du midgut d’une mouche adulte : une méthode pour isoler le tube digestif

Overview

Dans cette vidéo, nous soulignons une dissection de l’intestin adulte de Drosophila et la collecte des midguts appropriés à la dissociation de single-cell et au FACS afin d’isoler des cellules souches intestinales.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Tauc et coll., Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts par FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging, J. Vis. Exp. (2014).

REMARQUE: Si ce protocole est utilisé pour la première fois pour isoler les CCI par tri des AEC, les contrôles suivants sont obligatoires afin de définir initialement correctement les paramètres facs : cellules dissociées de type sauvage (p. ex. w¹¹¹⁸⁾midguts Drosophila sans Sytox. Cellules dissociées de type sauvage (p. ex. w¹¹¹⁸⁾ Drosophila midguts avec Sytox (voir étape 3.6). Cellules dissociées des midguts de l’esg-Gal4, ligne de vol UAS-GFP sans Sytox.

1. Préparation de solutions et de plats pour la dissection intestinale

1. Préparez 4-6 flacons contenant chacun 40 mouches femelles de la ligne de vol esg-Gal4,UAS-GFP.
2. À partir d’une solution de stock PBS 10x préparer 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH₂PO₄· H₂O, 8,4 mM Na₂HPO₄·2H₂O, 175 mM NaCl, ajuster le pH à 7,4).
3. Préparer une solution d’agarose de 3,5% en 1x PBS (3,5 g d’agarose de qualité électrophorèse en 100 ml 1x PBS). Préparer des assiettes de dissection en versant cette solution dans des boîtes de Pétri (diamètre de 8,5 cm) pour couvrir le fond. La couche d’agarose empêche d’endommager les extrémités des forceps pendant la procédure de dissection. Une fois le gel solidifié, conserver les plaques de dissection à 4 °C.
4. Préparer 300 ml de 1x PBS + 1% BSA frais avant de disséquer et placer la bouteille sur la glace ou à 4 °C.
5. Allumez la centrifugeuse et laissez-la refroidir à 4 °C.
6. Flammez les extrémités de 2 pipettes pasteur en verre pour lisser les bords.
7. Nettoyez deux paires de forceps et une lame de rasoir avec 70% d’éthanol.
8. Placer quatre à six tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml pour recueillir les midguts disséqués sur la glace.

2. Préparation du tractus gastro-intestinal et dissection du midgut

1. Anesthésier les mouches à partir d’un flacon (40 mouches) avec du CO₂ sur un lit de mouche standard, décapiter toutes les mouches à l’aide d’une lame de rasoir et les transférer dans le plat de dissection. Verser la solution froide 1x PBS/1% BSA dans le plat de dissection pour couvrir le gel d’agarose. Les mouches flotteront.
2. Prenez l’abdomen de mouche avec une paire de forceps, tout en tenant le thorax avec l’autre paire de forceps. Séparez le thorax de l’abdomen. L’intestin sera visible et le foregut/culture sera très probablement encore relié au thorax.
3. Prenez l’intestin et sortez-le du thorax. Pour déplier l’intestin, saisir la culture et tirer l’intestin légèrement antérieurement loin de l’abdomen.
4. Prenez l’extrémité postérieure de l’abdomen avec une paire de forceps et le bord de la cuticule ouverte antérieurement avec l’autre paire de forceps. Veillez à ne pas détruire le tissu intestinal saillant. Tirez l’extrémité postérieure loin pour casser la cuticule et continuer à tirer postérieurement très doucement jusqu’à ce que l’intestin entier a été retiré de la cavité abdominale. La culture peut devoir être enlevée à l’avance si elle est trop grande pour s’insérer dans la cavité du corps.
5. Retirer le foregut, les tubules malpighiens, l’hindgut et les ovaires en laissant le midgut nu.
6. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, transférer le lot de midguts disséqués dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml contenant de la solution froide 1x PBS/1% BSA et garder le tube sur la glace. Les échantillons doivent être traités dans les 2 heures.
7. Une fois la dissection d’un lot entier terminée, rincer le plat de dissection avec de l’eau distillée double pour laver les restes de débris. Commencez à disséquer le prochain lot de midguts (répéter les étapes 2.1-2.7). Disséquer autant de lots que possible dans les 2 heures, puis passer à l’étape 3.1.

3. Digestion du tissu intestinal pour récolter les cellules pour le tri fac

1. Retirez la solution BSA 1x PBS/1% des midguts et ajoutez 500 μl de solution Trypsin-EDTA à chaque échantillon.
2. Vortex bien pendant 20 sec et incuber les échantillons par basculement doux / rotation à 20 rpm à température ambiante pendant 25-30 min.
3. Vortex à nouveau après environ 30 min et laisser le tissu intact midgut couler au fond du tube. Retirez soigneusement les cellules qui sont en suspension avec une pipette pasteur en verre enflammé et filtrez-les à travers un maillage en nylon de 35 μm dans un tube de microcentrifugeuse frais de 1,5 ml.
4. Faire tourner les cellules à 100 x g pendant 5 min à 4 °C. Il convient de noter que lorsque vous commencez le digest, une pastille cellulaire peut ne pas être visible au début, mais deviendra visible au fur et à mesure que le digère tissulaire progresse.
   1. Transférez soigneusement la solution trypsine dans le tube d’échantillon d’origine contenant le reste intact du tissu midgut. Évitez de transférer trop de cellules de la pastille.
   2. Suspendez doucement la pastille cellulaire dans 400 μl de 1x PBS froid/1% BSA. Gardez les tubes de microcentrifugeuse contenant les cellules dissociées sur la glace et recouvrez les tubes de papier d’aluminium pour protéger les cellules de la lumière.
   3. Vortex la solution trypsine contenant le reste intact du tissu midgut à nouveau et placer les échantillons sur le rocker pour un autre 30 min à température ambiante.
5. Répétez les étapes 3.3 à 3.4.3 jusqu’à ce que tout le tissu midgut ait été digéré. Mélanger les cellules dissociées de tous les tubes de microcentrifugeuse en un seul tube de microcentrifugeuse. Cela peut nécessiter une étape de centrifugation comme dans 3,4, puisque le volume de toutes les suspensions cellulaires combinées peut dépasser 1,5 ml. Gardez la suspension cellulaire sur la glace et protégez les cellules de la lumière.
6. Faire tourner les cellules dissociées à 100 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez soigneusement autant de supernatant que possible en laissant environ 50-100 μl de la solution 1x PBS/1% BSA dans le tube de microcentrifugeuse. Resuspendez doucement les cellules dissociées dans 800 μl 1x PBS/1% BSA contenant Sytox (1:20,000).
7. Transférer la suspension cellulaire dans un tube Falcon rond de 5 ml en filtrant les cellules à travers un bouchon de rupture de passoire cellulaire (maille en nylon de 35 μm). Gardez toujours les échantillons de cellules sur la glace et protégez-les de la lumière. Les cellules sont maintenant prêtes à être triées.
8. Pipette 600 μl de solution RNAlater dans chaque tube de microcentrifugeuse dans lequel les cellules seront triées pour l’isolement ultérieur de l’ARN. Pour d’autres applications en aval, les cellules peuvent être collectées dans une solution différente, par exemple dans le PBS stérile.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh)	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	15400-054	Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry	Life Technologies	S34857
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7023	Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter	Becton Dickinson		Turn on one hour prior to sorting