एक वयस्क मक्खी से मिडगुट का विच्छेदन: पाचन तंत्र को अलग करने के लिए एक विधि

Overview

इस वीडियो में, हम आंतों की स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए वयस्क ड्रोसोफिला आंत के विच्छेदन और एकल कोशिका वियोजन और FACS के लिए उपयुक्त मिडगट्स के संग्रह को उजागर करते हैं।

Protocol

यह प्रोटोकॉल Tauc et al.,वयस्क ड्रोसोफिला मिडगट्स से आंतों स्टेम सेल को FACS द्वारा अलग करने के लिए उम्र बढ़ने के दौरान स्टेम सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए, जे विस Exp है। (2014).

नोट: यदि इस प्रोटोकॉल का उपयोग पहली बार एफएसी छंटाई द्वारा आईएससी को अलग करने के लिए किया जाता है, तो शुरू में FACS मापदंडों को ठीक से सेट करने के लिए निम्नलिखित नियंत्रण अनिवार्य हैं: जंगली प्रकार से अलग कोशिकाएं (उदाहरण के लिए डब्ल्यू¹¹¹⁸⁾सिटॉक्स के बिना ड्रोसोफिला मिडगट्स। जंगली प्रकार से अलग कोशिकाओं (जैसे w¹¹¹⁸⁾सिटॉक्स के साथ ड्रोसोफिला मिडगट्स (चरण 3.6 देखें)। सिटॉक्स के बिना ईएसजी-Gal4,यूएएस-जीएफपी फ्लाई लाइन के मिडगट्स से अलग कोशिकाएं।

1. आंत विच्छेदन के लिए समाधान और व्यंजन की तैयारी

1. 4-6 शीशियों तैयार प्रत्येक esg-Gal4,UAS-GFP मक्खी लाइन से ४० महिला मक्खियों युक्त ।
2. 10x पीबीएस स्टॉक समाधान से तैयार करें 500 मिलीलीटर 1x पीबीएस (1.8 m M NaH₂PO₄· एच₂ओ, 8.4 m M_{Na 2}HPO₄·2H₂O, 175 mM NaCl, पीएच को 7.4 में समायोजित करें।
3. 1x पीबीएस (3.5 ग्राम इलेक्ट्रोफोरेसिस ग्रेड 100 मिलीलीटर 1x पीबीएस में उत्पन्न) में 3.5% एगर उठे समाधान तैयार करें। नीचे को कवर करने के लिए पेट्री व्यंजन (व्यास 8.5 सेमी) में इस समाधान को डालकर विच्छेदन प्लेटें तैयार करें। एगर उठे परत विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान संदंश के सुझावों को नुकसान पहुंचाने से रोकती है। जेल जम जाने के बाद विच्छेदन प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
4. 1x पीबीएस + 1% बीएसए के 300 मिलीलीटर को विच्छेदन से पहले ताजा तैयार करें और बोतल को बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
5. सेंट्रलाइज चालू करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
6. किनारों को चिकना करने के लिए 2 ग्लास पाश्चर पिपेट के सुझावों को लौ करें।
7. 70% इथेनॉल के साथ दो जोड़ी संदंश और एक रेजर ब्लेड को साफ करें।
8. बर्फ पर विच्छेदित मिडगिट्स एकत्र करने के लिए चार से छह 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब रखें।

2. गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट की तैयारी और मिडगुट का विच्छेदन

1. एक शीशी (40 मक्खियों) से एक मानक फ्लाई बेड पर सीओ₂ के साथ मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें, रेजर ब्लेड का उपयोग करके सभी मक्खियों को काटना और उन्हें विच्छेदन पकवान में स्थानांतरित करें। एग्रिसेज जेल को कवर करने के लिए विच्छेदन पकवान में कोल्ड 1x पीबीएस/1% बीएसए समाधान डालें। मक्खियां तैरेंगी।
2. संदंश की अन्य जोड़ी के साथ छाती पकड़े हुए, संदंश की एक जोड़ी के साथ फ्लाई पेट पकड़ो। छाती को पेट से अलग करें। आंत दिखाई देगा और foregut/फसल सबसे अधिक संभावना अभी भी छाती से जुड़ा होगा ।
3. आंत को पकड़ो और छाती से बाहर खींचो। आंत को प्रकट करने के लिए, फसल को पकड़ें और पेट से थोड़ा पूर्वकाल में खींचें।
4. संदंश की एक जोड़ी और संदंश की अन्य जोड़ी के साथ पूर्वकाल खुले क्यूटिकल के किनारे के साथ पेट के पीछे के छोर को पकड़ो। सावधान रहें कि फैला हुआ आंत ऊतक को नष्ट न करें। पीछे के अंत को खींचने के लिए क्यूटिकल को तोड़ने के लिए और पीछे बहुत धीरे खींच जारी है जब तक पूरे पेट पेट गुहा से बाहर खींच लिया गया है । यदि शरीर गुहा के माध्यम से फिट होने के लिए बहुत बड़ा है तो फसल को पहले से हटाना पड़ सकता है।
5. नंगे मिडगुट छोड़ने वाले फोरगट, माल्पिगियन ट्यूबल्स, हिगट और अंडाशय को हटा दें।
6. एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, विच्छेदित मिडगट्स के बैच को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें कोल्ड 1x पीबीएस/1% बीएसए समाधान होता है और ट्यूब को बर्फ पर रखें। नमूनों को 2 घंटे के भीतर संसाधित किया जाना चाहिए।
7. एक पूरे बैच के विच्छेदन के बाद पूरा हो गया है, मलबे पर छोड़ दिया धोने के लिए डबल आसुत पानी के साथ विच्छेदन पकवान कुल्ला । मिडगिट के अगले बैच को विच्छेदन शुरू करें (चरण 2.1-2.7 दोहराएं)। 2 घंटे के भीतर जितना संभव हो उतने बैचों को विच्छेदन करें, फिर चरण 3.1 पर जाएं।

3. एफएसी छंटाई के लिए हार्वेस्ट कोशिकाओं के लिए आंत ऊतक का पाचन

1. मिडगिट्स से 1x पीबीएस/1% बीएसए समाधान निकालें और प्रत्येक नमूने में 0.5% ट्राइप्सिन-ईडीटीए समाधान के 500 माइक्रोन जोड़ें।
2. भंवर अच्छी तरह से 20 सेकंड के लिए और कोमल कमाल से नमूनों को इनक्यूबेट/
3. भंवर के बारे में 30 मिनट के बाद फिर से और बरकरार मिडगुट ऊतक ट्यूब के नीचे करने के लिए सिंक करते हैं । सावधानी से एक फ्लेम्ड ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ निलंबन में हैं कि कोशिकाओं को हटा दें और उन्हें एक ताजा 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 35 माइक्रोन नायलॉन जाल के माध्यम से फ़िल्टर करें।
4. कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर स्पिन करें। ध्यान दें, जब डाइजेस्ट शुरू, एक सेल गोली पहली बार में दिखाई नहीं हो सकता है, लेकिन ऊतक पचाने की प्रगति के रूप में दिखाई हो जाएगा ।
   1. शेष बरकरार मिडगुट ऊतक युक्त मूल नमूना ट्यूब में ट्राइप्सिन समाधान को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। पैलेट से बहुत अधिक कोशिकाओं को स्थानांतरित करने से बचें।
   2. धीरे से ठंड 1x PBS/1% बीएसए के ४०० माइक्रोन में सेल गोली फिर से निलंबित । बर्फ पर वियोजन कोशिकाओं से युक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब रखें और कोशिकाओं को प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूबों को कवर करें।
   3. भंवर ट्रिप्सिन समाधान शेष बरकरार मिडगुट ऊतक से युक्त फिर से और कमरे के तापमान पर एक और 30 मिनट के लिए झूली कुरसी पर नमूने जगह है ।
5. जब तक सभी मिडगुट ऊतक पच नहीं जाते तब तक चरण 3.3 से 3.4.3 दोहराएं। सभी माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब से अलग कोशिकाओं को एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में मिलाएं। इसके लिए 3.4 के रूप में एक अपकेंद्रित्र चरण की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि संयुक्त सभी सेल निलंबन की मात्रा 1.5 मिलीलीटर से अधिक हो सकती है। कोशिका निलंबन को बर्फ पर रखें और कोशिकाओं को प्रकाश से बचाएं।
6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर अलग कोशिकाओं को स्पिन करें। माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 1x पीबीएस/1% बीएसए समाधान के लगभग 50-100 माइक्रोल को छोड़ने के लिए जितना संभव हो उतना सुपरनटैंट को ध्यान से हटा दें। धीरे से 800 माइक्रोन 1x PBS/1% Sytox (1:20,000) युक्त बीएसए में अलग कोशिकाओं को फिर से खर्च करते हैं।
7. सेल छलनी स्नैप कैप (35 माइक्रोन नायलॉन जाल) के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर करके सेल निलंबन को 5 मिलीलीटर राउंड बॉटम फाल्कन ट्यूब में स्थानांतरित करें। हमेशा बर्फ पर सेल के नमूने रखें और प्रकाश से सुरक्षित रहें। अब कोशिकाओं को छांटा जाने की तैयारी है।
8. प्रत्येक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में आरएनएल्टर समाधान के पिपेट 600 माइक्रोल जिसमें कोशिकाओं को बाद में आरएनए अलगाव के लिए हल किया जाएगा। अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए कोशिकाओं को एक अलग समाधान में एकत्र किया जा सकता है, उदाहरण के लिए बाँझ पीबीएस में।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh)	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	15400-054	Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry	Life Technologies	S34857
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7023	Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter	Becton Dickinson		Turn on one hour prior to sorting