Bu iletişim kuralı bir dağınık şekilde detaylı Sonlu elemanlar modeli cardiomyocytes hücre içi mimarisinin elektron mikroskobu ve confocal mikroskobu görüntüler oluşturmak için yeni bir yöntem özetliyor. Bu dağınık şekilde detaylı model gücünü vaka çalışmaları kalsiyum sinyal ve bioenergetics kullanarak gösterilmiştir.
Elektron tomografi gibi üç boyutlu (3D) görüntüleme teknolojileri çıkışıyla, seri blok-surat scanning elektron mikroskobu ve confocal mikroskobu, bilimsel topluluk benzeri görülmemiş büyük veri kümeleri alt mikrometre erişebilir mimari modelleme karakterize çözünürlük sağlığı ve hastalıkları cardiomyocyte işlevindeki değişiklikler eşlik eder. Ancak, bu veri kümeleri altında-hücresel mimarisi cardiomyocyte işlevinde remodeling rolü soruşturma için kullanılan olmuştur. Bu protokolü nasıl yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu ve confocal mikroskobu görüntüleri kullanarak bir cardiomyocyte bir doğru Sonlu elemanlar modeli oluşturmak için anahat amacıdır. Hücresel mimarisinin ayrıntılı ve doğru modeli cardiomyocyte biyoloji, deneyler yalnız toplamak daha yeni görüşler sağlamak için önemli potansiyele sahiptir. Bu yöntemin gücü hesaplama açısından tek Birleşik ve ayrıntılı bir model cardiomyocyte geliştirmek için cardiomyocyte ultrastructure iki farklı görüntüleme yöntemleri üzerinden bilgi sigorta yeteneğini yatıyor. Bu iletişim kuralı elektron tomografi ve yetişkin erkek Wistar (albino sıçan belirli bir cins için ad) sıçan cardiomyocytes cardiomyocyte yarı-sarcomere Sonlu elemanlar modeli geliştirmek için confocal mikroskobu görüntüleri tümleştirmek için özet bilgiler. Yordam bir doğru yüksek çözünürlüklü tasvir içeren bir 3B Sonlu elemanlar modeli oluşturur (~ 35 sırasına nm) mitokondri, myofibrils ve cardiomyocyte için gerekli kalsiyum yayın ryanodine reseptör kümeleri dağılımı myofibril ve sitozolik bölme içine daralma sarcoplasmic Retiküler ağdan (SR). Oluşturulan modeli burada bir örnek enine tübül mimarisi veya sarcoplasmic Retiküler ağ ayrıntılarını dahil değildir ve bu nedenle cardiomyocyte en az bir modeldir. Yine de, model zaten rolü gösterilmiştir ve takip sunulmaktadır iki vaka çalışmaları kullanma ele kalsiyum sinyal ve mitokondriyal bioenergetics, hücre yapısının simülasyon tabanlı soruşturmalar uygulanabilir Detaylı iletişim kuralı.
Uyarma-kasılma kaplin (ECC) kalbinde önemli ve karmaşık cardiomyocyte membran elektrik uyarma ve hücre sonraki mekanik daralma her kalp atışı sırasında arasındaki kancası anlamına gelir. Matematiksel modeller düzenleyen aksiyon potansiyeli1,2, bioenergetics3, sinyal sitozolik kalsiyum birbirine biyokimyasal süreçler nicel bir anlayış geliştirmek önemli bir rol oynadığı ve sonraki contractile kuvvet oluşturma. Bu modeller de başarıyla ne zaman bir sinyal değişiklikleri tahmin veya birkaç bu biyokimyasal süreçlerin değişiklikler4,5tabi. Cardiomyocyte son derece organize ultrastructure giderek hücre ve tüm kalp normal contractile işlevinde önemli bir rol oynamak için kabul edilmiştir. Gerçekten de, morfoloji ve kardiyak ultrastructure bileşenlerinin organizasyonu için değişiklikler hipertrofisi6, kalp yetmezliği7ve diyabetik kardiyomiyopati8gibi hastalık koşullarında biyokimyasal değişikliklere paralel olarak gerçekleşir. Değişen küçük, adaptif veya patolojik yanıt-e doğru bu yapısal değişikliklerdir biyokimyasal koşulları olup hala büyük ölçüde bilinmeyen9. Form ve fonksiyon Biyolojide arasında doğal olarak sıkı kancası anlamına gelir deneysel çalışmalar yalnız yapısal tadilat ve cardiomyocyte fonksiyonu arasındaki ilişkiler daha derin anlayışlar sağlayamaz. Alt hücresel bileşenleri ile birlikte iyi okudu biyokimyasal süreçler, yapısal montaj dahil edebilirsiniz matematiksel modeller yeni nesil ilişki kapsamlı, nicel bir anlayış geliştirmek için gerekli olan yapısı, biyokimya ve cardiomyocytes contractile kuvvet arasında. Bu iletişim kuralı böyle araştırmalar için kullanılan cardiomyocytes yapısal olarak doğru Sonlu elemanlar modelleri oluşturmak için kullanılan yöntemleri açıklar.
Son on yılda önemli gelişmeler 3D elektron mikroskobu10, confocal11ve nano ölçekli ve mikro ölçekli Meclisi görülmemiş, yüksek çözünürlüklü içgörü sağlamak süper çözünürlük mikroskobu12 gördü cardiomyocyte alt hücresel bileşenleri. Son zamanlarda, bu veri kümeleri cardiomyocyte ultrastructure13,14,15,16Hesaplamalı modelleri oluşturmak için kullanılmaktadır. Bu modeller Sonlu elemanlar yöntemi17, olarak adlandırılan bir köklü mühendislik simülasyon yöntemi, Sonlu elemanlar Hesaplamalı kafesler kasılmalar hangi biyokimyasal süreçler ve cardiomyocyte üzerinde benzetimi yapılabilir oluşturmak için kullanın. Ancak, bu modellerin çözünürlüğü ve mikroskopi yöntemi bir görüntü veri kümesinde sağlayabilir detay tarafından sınırlıdır. Örneğin, elektron mikroskobu nanometre düzeyinde detay hücre yapısı oluşturabilirsiniz, ancak spesifik proteinlerin bir model oluşturmak için gerekli olacak görüntü içinde tespit etmek zordur. Öte yandan, süper çözünürlük optik mikroskobu yüksek kontrastlı görüntüler 50 sırasına çözünürlüklerde sağlayabilir sadece bir kaç moleküler bile■enleri hücrenin nm. Sadece tamamlayıcı bilgileri görüntüleme Bu modalities entegre ederek bir gerçekçi işlevi duyarlılığını yapısındaki değişiklikler için keşfedebilirsiniz. Bağdaşık ışık ve elektron mikroskobu değil hala rutin bir işlem ve hala bileşenleri yalnızca sınırlı sayıda olabilir ayirt görünümünde lekeli ve elektron mikroskobu görünümüyle ilişkili olduğunu sınırlama etkilenecek.
Bu protokol analiz ve hesaplama açısından iyon kanalları mekansal dağılımı üzerinde ışık mikroskobu bilgilerle diğer kardiyak elektron mikroskobu bilgi sigorta için istatistiksel yöntemler19 kullanır bir roman yaklaşım18 sunar myofibrils ve mitokondri gibi ultrastructure bileşenleri. Bu biyokimyasal süreçler biyofiziksel modelleri ile cardiomyocyte cardiomyocyte kasılma düzenleyen biyokimyasal süreçler alt hücresel kuruluştan rolü eğitim için kullanılabilir bir Sonlu elemanlar modeli üretir. Örneğin, bu iletişim kuralını modelleri sağlıklılardan oluşturmak için kullanılabilir ve yapısal tadilat diyabetik hayvan gözlenen kardiyak hücre fonksiyonları üzerine etkisi çalışmaya streptozotocin indüklenen diyabetik kardiyak miyositler8modelleri. Sunulan yöntem istatistiksel niteliği bir avantajı da iletişim kuralında gösterilmiştir: yöntem birden çok yakından hücre yapısı deneysel olarak gözlenen değişimler taklit Sonlu elemanlar geometrileri örneği oluşturabilirsiniz.
Genel, iletişim kuralı adımlar içerir: (i) kalp doku hazırlanması için yeterli çözünürlük ve kontrast; 3D görüntüler oluşturmak elektron mikroskobu (ii) yeniden yapılanma ve 3D görüntü yığınları elektron mikroskobu verilerden bir 3D elektron mikroskobu imar ve görüntü analiz yazılımı kullanarak bölümleme but20denir; (iii) kullanarak iso2mesh21 bölümlenmiş veri giriş olarak kullanarak bir Sonlu elemanlar kafes oluşturmak için; (iv) iyon kanalları Sonlu elemanlar kafes üzerine dağılımı harita için roman algoritması ve kodları kullanarak.
Her adım yaklaşmak öncül protokolde belirtilen ve temsilcisi sonuçları eşlik eden resimler sağlanır. Genel bir bakış için oluşturulan dağınık şekilde ayrıntılı modeller sırasında ECC, aynı zamanda mitokondrial bioenergetics kalsiyum kayma dinamiklerini incelemek için nasıl kullanılabileceğini belirten seviyelendirilir. Bazı iletişim kuralının geçerli sınırlamaları, yanı sıra bunların üstesinden ve daha fazla kalp sistemleri Biyoloji hücre yapısı rolü nicel bir anlayışı ilerletmek için devam etmektedir yeni gelişmeler ele alınmıştır. Nasıl bu yöntemler diğer hücre tiplerinin Sonlu elemanlar modelleri oluşturmak için Genelleştirilmiş de ele.
Önceden varolan bir elektron mikroskobu görüntü yığını erişiminiz varsa kullanıcıların bu protokol adım 1 ve adım 2 imar parçası atlayabilirsiniz. Kullanıcı kim tasarlamak-daha deneyimli elektron microscopists ile işbirliği içinde onların veri elde etmek için tartışmak ve fiksasyon ve boyama işlemleri adım 1 Alım için en uygun bir iletişim kuralını belirlemek için uzman ile karşılaştırmak isteyebilirsiniz.
Yukarıdaki Protokolü cardiomyocyte ultrastructure bir roman Sonlu elemanlar geometrik model oluşturmak için anahtar adımları özetliyor. Yöntem kayma hücre mimarisi ayrıntılarını içeren cardiomyocyte dynamics daha kapsamlı Hesaplamalı modeli geliştirmek Hesaplamalı füzyon farklı mikroskobu (veya, prensip olarak, diğer veri) yöntemleri sağlar. Şu anda diğer protokolü bir cardiomyocyte böyle bir model oluşturmak kullanılabilir.
1. adım bir protokol perfüzyon fiksasy…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser Royal Society, Yeni Zelanda Marsden hızlı başlamak Grant 11-UOA-184, insan sınır bilim programı araştırma bursu RGP0027/2013 ve Avustralya Araştırma Konseyi keşif proje Grant DP170101358 tarafından desteklenmiştir.
Materials | |||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
Equipment | |||
Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
Retort stand | Proscitech | T752 | |
Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
Software | |||
SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
spatstat | R-project | install via R program | |
rgl | R-project | install via R program | |
doparallel | R-project | install via R program | |
foreach | R-project | install via R program | |
doSNOW | R-project | install via R program | |
iterators | R-project | install via R program |