Summary
このプロトコルは、マウスのペースメイキング欠陥を同定するために、サイノアノード組織全体のマイクロ電極アレイ記録を用いて、固有の心焼成率を測定する新しい方法論を記述することを目的とする。薬理学的薬剤は、本質的なペースメイキングに及ぼす影響を研究するために、この方法で導入することもできる。
Abstract
右心房に位置する心房ノード(SAN)は、心臓のペースメーカー細胞を含み、この領域の機能不全は頻脈または徐脈を引き起こす可能性がある。心臓ペースメイキング欠陥の確実な同定は、主に率の欠陥を隠すことができる自律神経系の影響を防ぐことによって、本質的な心拍数の測定を必要とする。心臓ペースメーカーの固有の機能を分析する従来の方法には、 インビボ 心拍数を測定するための薬物誘発自律神経遮断、内因性心拍数を測定するための孤立した心臓記録、およびシナウアーストリップまたは単細胞パッチクランプ記録が含まれ、自発的作用電位発射率を測定する。しかし、これらの従来の手法は、技術的に困難で実行が困難な場合があります。ここでは、マウスからの全実装サイノアオアノード製剤の微小電極アレイ(MEA)記録を行うことにより、固有の心焼成率を測定する新しい方法論を提示する。MEAは、 体外 細胞外電位を記録するためのグリッド状のパターンに配置された複数の微小電極で構成されています。本明細書に記載されている方法は、本質的な心拍数を記録するための以前のアプローチよりも比較的速く、より簡単で、より正確であるという組み合わせの利点を有する一方で、容易な薬理学的尋問を可能にする。
Introduction
心臓は、脳に由来するもののような心臓固有および外因性の両方の影響によって支配される複雑な器官である。この正気ノード(SAN)は、哺乳類の心拍の開始および永続化を担うペースメーカー細胞(シナウ細胞、またはSA細胞とも呼ばれる)を収容する心臓の定義領域である。固有の心拍数は、他の心臓や神経体液の影響を受けずにペースメーカー細胞によって駆動される速度ですが、心電図などの人間と生きている動物の心拍数の伝統的な尺度は、ペースメーカーと神経の両方の心臓への影響を反映しています。SA細胞に対する最も顕著な神経影響は自律神経系からであり、それは常に身体の生理学的要件を満たすために発火パターンを調節する3.この考えを支持して、交感神経と副交感神経の両方の投影は、SAN4の近くで見つけることができます。心内神経系(ICNS)は、神経節化された神経神経の影響、特に右心房、インナーベート、SAN5、6の活性を調節するもう一つの重要な神経影響である。
機能不全は多くの心臓疾患の根源となり、他の合併症のリスクに寄与する可能性があるため、ペースメイキングの赤字を理解することは臨床的に重要です。病気の正座症候群(SSS)は、適切なペースメイキング7、8を妨げる正属ノードの機能不全を特徴とする疾患のカテゴリーである。SSSは、正気性徐脈、正弦波休止、正弦波停止、正気出口ブロック、および交互のブラダリトミアおよび頻脈性不整脈9を呈し、塞栓症および突然死のリスクの増加を含む合併症を引き起こす可能性がある8,10。ブルガダ症候群を有する者は、突然の心臓死のリスクが高い心室細動によって特徴付けられた心疾患であり、併存SAN機能不全11、12を有する場合、不整脈性事象のリスクが高い。中房機能不全はまた、心臓を超えて生理学的な結果をもたらす可能性があります。例えば、SSSは、脳低灌流13による患者の発作を引き起こすことが観察されている。
心房ペース作りの欠損を特定するには、自律神経系や体液性因子の影響を受けずにSANの活動を測定することによって、本質的な心拍数を決定する必要があります。臨床的には、これは薬理学的自律神経遮断14によって近似することができるが、この同じ技術は、哺乳類モデルにおいても、固有の心機能15、16を研究するために適用することができる。このアプローチは、寄与する神経影響の大部分をブロックし、生体内心臓検査を可能にするが、それは完全に心臓に対するすべての外因性の影響を排除しない。動物モデルにおける固有の心臓機能を研究するために使用される別の研究技術は、ランゲンドルフ透過心臓を用いた孤立した心臓記録であり、これは典型的には、エレクトログラム、ペーシング、または外膜多電極アレイ17、18、19、20を用いた測定を含む。この技術は、心筋から心臓を除去することを含むので心機能に特異的であるが、測定値は依然として、本質的な心拍数測定21に影響を与える可能性のあるメカノ電気自動調節機構の影響を受ける可能性がある。孤立した心臓の記録は、ICNS5、6、22、23を通じた自律的な規制の影響を受ける可能性もあります。さらに、心機能測定に重要な心臓の生理学的に関連する温度を維持することは、単離された心臓アプローチ20において困難であり得る。SAN機能を研究する直接的な方法は、SAN組織を特異的に隔離し、その活性を測定することです。これは、SANストリップ(孤立したSAN組織)または孤立したSANペースメーカーセル24、25を介して達成できます。SANは非常に小さく高度に定義された領域であるため、どちらも高度な技術トレーニングが必要であり、解離が正しく実行されない場合、細胞の全体的な健康状態に損傷を与える可能性があるため、細胞分離はさらに大きな課題となります。さらに、これらの技術は、個々の記録マイクロ電極を使用して組織または細胞から正常に記録するために、専門的な電気生理学的スキルを必要とします。
本プロトコルでは、マイクロ電極アレイ(MEA)を用いて固有の心拍数測定を得ることによって、SAN in vitroを記録する技術について述べています。このアプローチは、集中的な電気生理学的スキルセットを欠いている研究者が非常に特異的な電気生理学的記録を利用できるようにするという利点を有する。MEAは、原発性心筋細胞培養26、27、28、29、30、31、32、心臓シート33、34、35、36、37、38、39、および組織全体マウント40、および組織全体のマウントで心筋細胞機能を研究するために以前に使用されています。 41,42,43,44,45,46,47.SAN組織41,42の分野ポテンシャルを調べる前の作業も行われてきました。ここでは、MEAを使用してマウス固有SAN発火率を記録および分析する方法を提供します。また、この技術を用いて、電圧ゲートK+チャネルブロッカーである4-アミノピリジン(4-AP)の効果を示すサンプル実験を提供することにより、SAN固有の発火率に対する薬物の薬理学的効果をテストする方法についても説明します。定義された解剖学的ランドマークを使用して、我々は他の方法で必要とされる広範な組織解剖または細胞分離を行うことなく正確にSANを記録することができる。MEAはコストが非常に高い場合がありますが、記録は、臨床および生理学的研究アプリケーションの広大な配列で使用することができるペースメイキングの非常に具体的で信頼性の高い尺度を提供します。
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Protocol
ここで説明するすべての実験手順は、国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従って行われており、サザンメソジスト大学の制度動物ケア・使用委員会(IACUC)の承認を受けています。
1. 多電極アレイ(MEA)を被覆して記録する
- 25 mMのホレートバッファーを作成します。
- 80 mLの蒸留水にNa2B4O 7・10H2Oの0.953gを溶解します。
- HClでpHを8.4に調整し、蒸留水を最終体積100mLに加えます。
- ポリエチレンイミン(PEI)の0.1%ストック溶液を作ります。
- 1%のPEI溶液を作るために蒸留水の4.9 mLに50%(w/v)PEIの100 μLを加えます。
- 1%のPEI溶液を25mMのホウ酸塩バッファーの9 mLに1 mL添加して、1%のPEI溶液を0.1%のホウ酸バッファーに希釈します。
- 電極が完全に覆われるように、0.1%PEI溶液のピペットは、微小電極アレイ(MEA)皿に1mL(図1Aおよび1B)を覆う。
注:MEAの微小電極は、典型的には白金ブラックまたはカーボンナノチューブで構成され、ポリイミド(またはアクリル)で絶縁されています。両方の材料は疎水性です。MEAをPEIなどのカチオン性ポリマーでコーティングすることにより、疎水性MEA表面がより親水性になり、組織サンプルがMEA表面とよりよく接触することを可能にする(図1A1)。 - MEA皿を熱可塑性フィルムで覆い、蒸発を減らし、MEAを室温で一晩残します(図1C)。
- ピペットを用いてMEA皿からPEI溶液を吸引し、電極に損傷を与える可能性のある電極グリッドに触れないように注意し、蒸留水で≥4回リンスする(図1D)。
- PEIコーティングされたMEAを1〜2mLの超純水で保管し、必要になるまで4°Cで熱可塑性フィルムで密封します。あるいは、コーティングされたMEAを超純水で満たされたビーカーに浸して保管する(図1E)。
注:PEIコーティングプロセスは、最初の使用前にMEAのために一度だけ実行する必要があり、各記録セッションの後、MEAは超純水に沈めて保管する必要があります。
2. 組織解剖のための完全なタイローデの溶液を準備する
- 解剖のための完全なタイロードのソリューションの1,000 mLを作ります。まず、8.1816 gのNaClを800 mLの超純水に加えます。
- 溶液に次の量の化学物質を加える: 0.4025 g KCl;0.1633 G の KH2PO4;1.1915 ヘペスのグラム;0.9999 グルコースの g;0.0952 g の MgCl2;0.2646 カClのg ·2H2O.
- NaOHでpHを7.4に調整し、総体積が1,000 mLになるまで超純水を加えます。
注:完全なタイロードのソリューションの最終的な組成は次のようになります(mMで):140 NaCl、5.4 KCl、1.2 KH2PO4、5HEPES、5.55グルコース、1 MgCl 2、1.8 CaCl2。
3. 記録のための酸素タイローデのソリューションを準備します。
- タイローデのソリューションの500 mLを作ります。超純水400mLにNaClの4.003 gを加えます。
- 溶液に次の量の化学物質を加える: 0.651 g of NaHCO3;0.042 グラムの NaH2PO4;CaCl2 ·2H 2Oの0.132 g;0.149 g の KCl;0.0476 g の MgCl2;0.999 g のグルコース.
- HClでpHを7.4に調整し、総体積が500 mLになるまで超純水を加えます。
- 記録を開始する前に、室温で少なくとも30分間カルボーゲンで溶液を酸素化します。
注:タイロードの溶液の最終的な組成は次のようになります(mMで):137 NaCl、15.5 NaHCO 3、0.7 NaH2PO4、1.8CaCl2、4KCl、1 MgCl2、11.1グルコース。このTyrodeのソリューションは、解剖に使用される完全なタイロードのソリューションとは少し異なる構成を持っています。
4. 薬理学的変調のための4-アミノピリジン(4-AP)溶液の調製
- 4-APの1 mMの作業ソリューションを作ります。ステップ3からタイロードの溶液の200 mLに4-APの18.82 mgを加えます。
- 実験の前に少なくとも30分間4-AP溶液を酸素化する。
5. ペトリ皿の解剖の準備
- シリコーンエラストマー成分を、塩基と硬化剤の10:1比(重量)で混合します。
- 直径60mmのペトリ皿に約15mLのシリコーンエラストマー混合物を注ぎます。
- エラストマーは、使用前に48時間室温で硬化させます。
注:シリコン化ペトリ皿は、将来の分節のために再利用することができます。
6. 正気ノード (SAN) の解剖
- SAN解剖のためのヘパリン化完全タイロードのソリューションを準備します。
- 400 μL のヘパリン (1,000 USP/mL) を 40 mL の完全タイロードの溶液に加え、37 °C の水浴で温めます。
- 200~300μLのヘパリン(1000 USP/mL)でマウスの腹腔内を注入し、動物が10分間座るようにします。
- イオブルランの過剰摂取によりヘパリン化マウスを安楽死させる。
- 200~300 μLの液体イオフルランを穿光プラスチックチューブの中のフィルター紙に加えて生成したイオブルラン蒸気を含む小さなガラス室にマウスを置きます。
注:イソフルランは皮膚刺激を引き起こす可能性があり、皮膚を通して吸収される可能性があるため、液体はマウスに直接接触してはいけません。従って、イオブルラン浸漬ワイプは、投与用に穿穿管に入れられる。 - 動きと呼吸努力の停止とつま先ピンチ反射の欠如によって死を確認する。死は通常、チャンバーへの配置後に約1〜2分かかります。
注:死は通常排尿を伴う。
- 200~300 μLの液体イオフルランを穿光プラスチックチューブの中のフィルター紙に加えて生成したイオブルラン蒸気を含む小さなガラス室にマウスを置きます。
- 足を伸ばした解剖板の上にマウスを置き、長さ1インチ、23ゲージの注射針を使用して足をボードに固定します。次に、手術用はさみを使用し、根の毛皮を切断することによって、肋骨ケージの底付近の毛皮を取り除きます。
注:解剖板のために、ポリスチレンクーラーのふたを使用することができます。 - 皮膚を止まりで保持しながら、手術用はさみを使用して、左肋骨アーチの約1から右の肋骨アーチの下にある皮膚の横切開を行う(図3A)。
- 手術用ハサミで腹膜を切り開き、肝臓を横隔膜から慎重に分離し、肝臓をニックしないように注意して、過度の出血を引き起こす(図3B)。胸郭に沿って横隔膜を切開して胸部腔を露出する(図3C-D)。
- 手術用ハサミを使用して、肋骨ケージの側面壁を肋骨のアーチの端から切り取って心臓を露出させ、心臓を損傷しないように注意する(図3D)。その後、23ゲージの注射針を使用して、肋骨ケージを肩に固定し、それを所定の位置に保持し、外科分野の邪魔をします。
- トランスファーピペットを使用して暖かく(37°C)ヘパリン化された完全なタイロードの溶液を心臓に滴下し、しっとりと保ちます。
注:心臓が乾かないようにしてください。 - 余分な細かいグレイフ鉗子でそれらを保持し、外科用ハサミで気管を切断することによって肺を取り除きます(図3E)。
- 余分な細かいグレイフ鉗子で心臓の頂点を保持し、外科用ハサミで大間と静脈カバを切断することによってそれを取り除きます。硬化したシリコーンエラストマー(図4A)を含むペトリ皿に心臓を移し、移送ピペットを使用して2〜3 mLの暖かい(37°C)ヘパリン化完全タイローデの溶液で心臓を浴びる。
メモ:SANを含む右心房の繊細な後壁と接続された右心房静脈を損傷しないように注意してください。完全なタイロードの溶液で心臓を浴びることは、心臓が乾燥するのを防ぐが、解剖中の可視性を損なうため、心臓を溶液中に完全に水没させない。 - 実験者の右心房を右心房に、実験者の左の心房を向けます。
注: 虚血に関連する損傷を防ぐために、SAN組織の解剖は迅速に行われるべきです。 - 解剖ピンで皿に心臓の頂点を取り付けます。次に、下の大静脈をデュモン#2ラミネクトミー鉗子で保持しながら、22Gシリンジ針を右心房に配置し、右心房(劣ったカバと上の静脈の間の組織のパッチに位置する)を特定します(図4B)。
- 小さな解剖ピンを使用して、皿に左右の心房の付属物をピン留めします。
- 左心房付属器をデュモン#2ラミネクトミー鉗子で保持しながら、左心房付属器に解剖ピンを入れて所定の位置に保持する。
- デュモン#55鉗子で右心房付属器を保持しながら、それを所定の位置に保持するために右心房付属器を通して解剖ピンを置きます。
注:必要に応じて、左右の心房付属物を保持するために同じタイプの鉗子を使用することができます。
- 静脈のカバエにまたがる注射針を取り除きます。
- 心臓から血液を放出するには、カストロビエホはさみを使用して、心室を横切って横断切開を行うことによって心臓の頂点(すなわち、下半分)を取り除く(図4C)。次に、トランスファーピペットで完全タイロデの溶液を暖かく(37°C)ヘパリン化して心臓を洗浄します。
- カストロビエホはさみを使用して、心房よりも心室に近い切開を維持する房室中隔に沿って切断します。心房が心室から分離されるまで房室中隔に沿って切断を続ける。
- 心房間中隔に沿って切って左心房を取り除く。
- 右心房の周囲に解剖ピンを置き、平らに配置する(図4D)。カストロビエホはさみを使用して、心房から残っている脂肪、血管、または組織を取り除きます。
- 右心房のSANを見つけ、この方向には上の大静脈(上)、下の大静脈(底部)、クリステ端子(左)にほぼ接している(図4D)。
注意:クリスタ端子は、右心房付属器とSANの間に暗い筋肉の尾根として表示されます。SAN動脈もSANを通るのもしばしば見られます(図4D)。
7. 記録のためのMEAシステムの準備
- Tyrodeの溶液(ステップ3から)を入力溶液ボトル(図5C)に加え、カルボゲンガス(図5A)のシステムへの流れをオンにして酸素化します。
注:録音に使用されるタイロードのソリューションは、解剖に使用される完全なタイロードのソリューションとは構成が若干異なります。 - ガス(図5B)と入力溶液ボトル(図5C)を加湿するために使用される円錐フラスコの気泡を観察することによって、カルボーゲンの流れを検証する。
- 蠕動ポンプ流入チューブ(図5D)をタイロードの記録溶液(図5C)に挿入します。次に、蠕動ポンプ流出チューブを回収ボトルに挿入します(図5I)。
- 蠕動ポンプを25 rpmに設定し、流量を2 mL/minにして、ポンプを始動させます。システムにバッファリークやオーバーフローがないか確認します。
- 温度制御装置を37°Cに設定し、マウスの生理温度(図5E)を設定します。
8. MEAグリッド上に心臓組織を配置する
- 解剖したSAN組織を、解剖用ペトリ皿からMEAグリッドにペイントブラシ(図6A)の助けを借りて、MEAグリッドに移します(図1A1)。
- 逆顕微鏡の下を見ながら、柔らかいペイントブラシで組織をそっと配置して、SAN領域が電極グリッドに重なるようにします。
- 必要に応じて組織を再配置して、電極グリッドに平らに配置し、電極と良好に接触させます。
メモ:電極グリッドを損傷しないように、組織を動かすには柔らかいペイントブラシが必要です。
- 組織が正しく配置されたら、骨鉗子(または任意の曲面鉗子)を使用して、メッシュを組織の上に配置します(図6A)。次に、ボーン 鉗子を使用してハープアンカー(図6A)をメッシュ上に配置し、すべてを所定の位置に保持します(図6B)。
- 個々の電極の活性が記録中に解剖学的位置と相関できるように、MEA上の組織の位置を画像に取る。これは、逆顕微鏡の目的にスマートフォンを保持するか、取り付けられた顕微鏡カメラを使用して行うことができます。
メモ:写真を撮った後にMEAの向きが変わらない場合、左上の電極は録音中に最初のチャンネル(Ch1)として表示されます。 - コネクタプレート(図5Fと6C)にMEA皿を置き、ハープスライスアンカーを邪魔することなく、慎重にMEA皿に注入キャップ(図6C)を置きます。灌流キャップは、ラボテープを使用してさらに保護することができます(図6C)。
注:調整可能なソリューションの流入および流出管に加えて、キャップにはガスの送達用のポートも備えています(図6C)。また、参照電極リングはキャップ(図6C)を通って流れる。 - 組織が取り扱いから回復し、記録する前に15〜20分間チャンバーに順応するようにします。
9. 記録のためのデータ取得プロトコルの設定
注:次の手順では、自発的なビート記録用のソフトウェアプロトコルを開き、記録条件を定義する方法について説明します。これらの手順の詳細は、使用する特定のソフトウェアによって異なる場合がありますが、一般的な概要は同じままにする必要があります。
- アンプ(図5G)をオンにし、コンピュータ上のソフトウェアでの記録のワークフローを設定します(図5H)。
- ソフトウェアを開き、 [ ワークフロー] をクリックします。
- [ 新しいフォルダを開く] を選択します。
- [テンプレートから]フォルダを開きます。
- 64MD1-1920X1080(デスクトップの解像度に応じて)を選択します。
- QTフォルダを開きます。
- [自然録音] フォルダを開きます。
- Beat_recording.mofloテンプレートを選択して開きます (図 7A)。
- 記録パラメータを設定して、目的の記録条件に応じて、トレース数、トレース期間、トレース間隔、入力電圧、サンプリングレートなどを指定します(図7B)。
注:ビート周波数とインスパイカ間データ取得には、通常、入力範囲電圧2.9mV、1Hzハイパスフィルタ、1000Hzのローパスフィルタ、サンプリングレート20kHzを使用します。 - 薬物投与の前後など、実験のさまざまな段階または条件をマークするには、[注釈]タブをクリックして目的の表記を追加します(図7C)。
- 収集するデータのファイルの保存先を指定するには、[ストレージを 有効に する]ボックスを選択し、[ ファイル名]モディファイヤ ボックスに目的のファイル名を入力します。
10. データの記録と収集を実行する
- 取得ソフトウェアの一番上のメニューバーにある[ 録音と再生 ]ボタンをクリックして、記録を開始します。トレース間の間隔が 2 分の 1 分の 10 トレースのデータを取得します。
- これらの初期トレースから、記録された波形が健全で高品質の組織の調製と一致していることを確認するには、記録チャネルの大部分が≥0.5mVと同一のスパイク間間隔の信号振幅を示していることを確認します(図8)。
注:解剖学的位置に対応する個々の微小電極の活性と波形の初期評価は、MEA上に組織を配置した後に取得した画像を参照することによって行うことができます。 - 組織に対する薬物の影響を測定するには、一番上のメニューバーの一時停止ボタンをクリックして、初期ベースラインデータを取得した後、記録を一時停止します。
注: 実験の薬物応答段階は、記録で注釈タブをクリックし、上記のとおりに目的の表記を追加することで示すことができます(図7C)。 - ポンプを一時停止し、ポンプの流入チューブを通常の記録溶液から、目的の薬剤を含むTyrodeの溶液に切り替えます。
注:実験例では、タイロードの溶液を1 mM 4-アミノピリジン(4-AP)と一緒に使用しました。 - ポンプを再起動し、記録を一時停止解除して、データの収集を再開します。
- 薬物注入タイロードの溶液が組織に達したら、ベースライン記録のために以前に行われたのと同じ方法で10の痕跡を記録する。
注:薬物が記録室に注入するにつれて、トレースは安定するのにしばらく時間がかかります。薬物の作用機序はまた、記録安定性に影響を与える可能性があります。可逆的な作用機序を有する薬物の場合、正常な組織の指標であるベースラインレベルへの活性の回復を確認するために、ウォッシュアウト期間も記録する必要があります。 - [ 停止 ] をクリックして、録音を終了します。
- 初期記録設定手順に従って組織がずれた場合に備えて、顕微鏡下でMEA上の組織の位置を最終的に撮影します。
11. 録音後のセットアップのクリーニング
- MEA をクリーニングします。
- 録音が終了したら、1 mLマイクロピペットを使用してMEA皿から記録溶液を静かに取り外します。
メモ:損傷を受ける可能性のあるMEA電極に接触しないように注意してください。 - メッシュとハープ アンカーをボーン 鉗子(または湾曲した鉗子)で取り除きます。その後、塗料ブラシを使用して、個々の微小電極に触れないように常にMEA表面から組織を取り除きます。
- 洗浄ボトルを使用して、約3〜4回超純水でMEA皿をそっと洗い流します。
- 洗浄したMEAを超純水に浸して4°Cで保管してください。
- 録音が終了したら、1 mLマイクロピペットを使用してMEA皿から記録溶液を静かに取り外します。
- 蠕動ポンプの最大速度設定を使用して、超純水を5分間以上流してシステムチューブをリンスします。
注:真菌の成長を防ぐために、洗浄後に水や緩衝液をチューブ内に放置しないでください。
12. MEA録音を分析してSANのビート周波数を測定する
- 保存された記録データファイルを、解析ソフトウェアの「Beat_frequency_analysis」テンプレートで開きます (図 9)。
- [再生] ボタンをクリックし、データ セットを視覚化して適切な分析パラメーターを割り当てる記録全体を実行できるようにします。
- データの表示形式に使用するビニングウィンドウを選択します( 図 10A ) は、トレースあたりの平均値または時間ごとの平均値のどちらで表示するかを指定します(図 10A)。
- 解析に含めるチャンネルを選択し、自動波形のピーク識別に必要な振幅最大または振幅の最小値のしきい値を設定します(図10B)。
注: この手順では、個々のチャネル、チャネルの組み合わせ、または 64 チャネルすべてを選択して解析できます (図 9)。選択した閾値が波形の最大値と最小値に近すぎる場合、解析ソフトウェアによって波形のピークが特定されないことがあります。 - 分析に含める事前スパイク時間とポストスパイク時間の量を設定します。
注:50 msのプレスパイクと100 msポストスパイクの設定は、通常、うまく動作します(図10B)。
- 解析条件を設定した後、もう一度再生ボタンをクリックしてデータセットを再実行し、分析パラメータがスパイク抽出に適していることを確認します。
- 分析のために、実験のベースライン期間中および薬物暴露期間中の他の3つの連続した安定したトレースの両方で、大多数のチャネルにわたって各トレースに対して安定した拍動率を示す3つの最も安定した連続したトレースを特定する(図10A)。
- 分析の開始トレースと終了トレースを指定し、分析する各トレースの時間の長さを入力します (図 9)。
- 分析を開始する前に、[1 分あたりのビートを保存]と [挿入間隔を保存]の両方の有効ボックスを選択します (図 10B)。
- [ファイル名] 修飾子ボックスに必要な ファイル名 を入力します (図 10B)。ビート周波数とインタースパイク間隔の解析データは、ASCII(テキスト)形式で保存されます。
注: 異なる条件(ベースラインや薬物応答など)を分析するには、各条件ごとに個別に分析を実行する必要があります。 - 上部のタブバーにある 再生と記録 ボタンをクリックして、分析を開始します。
- 他のアプリケーションのデータをエクスポートするには、[1 分あたりの保存ビート]と [挿入間隔を保存]のボックスを選択します (図 10B)。[ファイル名の変更]ボックスに目的のファイル名を入力し(図 10B)、[保存]をクリックして、解析したデータを ASCII テキスト形式で選択したフォルダに保存します。
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Representative Results
15分間皿の中で組織を順応させ、10の1分間の痕跡を記録する。現在のプロトコルは1時間以上の活動を記録していますが、ここには示されていない未公開データに≥4 hの安定した発射パターンを記録しています。実験準備がデータ収集に適している場合、各記録チャンネルは、所定のチャンネルに対して一定の均一な形状の一定の間隔の繰り返し波形(すなわちスパイク)を示すべきである(図11D)。これらの波形は、心臓のペース作りの活動を反映する個々の心臓の拍動に対応します。インタースパイク間隔は、脱分極の開始部位に対する位置の小さな違いのためにチャネル間で完全に整列していない場合でも、すべてのチャネルで同じである必要があります(図8)。所定のチャネルの波形の形状は一貫している必要がありますが、波形の形状は、組織内の電極の位置によってチャネルによって異なります(図8)。電極との組織の接触の程度はまた、振幅などの波形特性に影響を与える可能性がある。しかし、準備が満足のいく場合は、振幅の最大値は、チャネルの大部分で少なくとも0.5 mVでなければなりません。記録された10のトレースから、上述の品質基準を最もよく満たす3つの連続したチャンネルを、以下に説明するさらなる分析のために選択しました。図10Aは、3つの連続したトレースの安定した拍数周波数(上パネル)とインタースパイク間隔(中央パネル)のサンプルを示す。これらの基準を満たさない組織は、正確なデータ収集を妨げる可能性のある組織損傷があるので記録されるべきではありません。図11は、ノイズ(B)または不安定(C)の影響を受けた、欠けている(A)悪い抽出されたスパイクパターンの例を示しています。
図に表示されたサンプルデータは、45日齢の雄の野生型ブラックスイス(Tac:N:NIHS-BC)マウスから収集されました。図9および図10に示す分析手順を使用して、図12Aに示すことができる固有の発射速度とベースラインスパイクを表示するために使用しました。発射率は、3つのトレースのそれぞれから60,000 msの平均レートですが、図12Aのスパイクパターンは、1つのトレースから5秒の代表的なスパイクを示しています。自動解析ソフトウェアを使用すると、64チャンネル全体で選択された3つのトレースの固有の発射速度(ビート周波数)は、サンプルデータで約320bpmであることが判明しました(図12A)。一般に、野生型マウスの記録では約290〜340bpmの値の範囲を観察します。また、焼成速度は、調製品質を評価する二次的な方法としても使用できる。不安定なレートまたは 300 bpm より大幅に低いレートは、分析に適している可能性が低くなります。これらの値は、約 300~500 bpm25,48,49の範囲で固有の心拍数を報告する、単離心臓および単一細胞記録の両方に匹敵する。したがって、MEA記録技術は、固有の心拍数の信頼性と正確な測定値を生成することができる。
MEAシステムの利点は、薬理学的効果をテストするために薬剤の容易な適用を可能にすることです。サンプル実験では、1 mM 4-APが発火率に及ぼす影響を試験した。図12Bは、4-APの導入により、予想通りに間スパイク間隔が増加したことを示す。このスパイク間隔の延長は、320 bpmから210 bpmまでの拍動周波数の減少に対応した。この4-AP投与後の焼成速度は、単離組織の単一電極記録を用いてSAN発火率に対する4-APの影響を調べた以前の研究と同様である。その研究は、4-AP50の存在下で約190 bpmの発射率を測定した。したがって、MEAシステムは、内因性心機能に対する薬物介入の薬理学的効果をテストするための便利で貴重なツールとして使用することができる。
図1:使用前に微小電極アレイ(MEA)をコーティングする(A)MEAは、中央に64個のマイクロ電極(パネルA1に示すように)のグリッドアレイを持つ小さなプラスチック皿と、周囲の4つの参照電極を正方形のパターンで構成しています。(B)MEAをコーティングするPEI緩衝液1mLの添加。(C) 室温で一晩インキュベーション用の熱可塑性フィルムでMEA皿を覆う。(D) MEAディッシュからPEIバッファーを吸引し、その後に蒸留水を含む少なくとも4つのすすがりが続く。(E)コーティングされたMEAプローブを超純水の下に保管して、乾燥を防ぐ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: 地球外ノード(SAN)解剖に使用するツール以下のツールは、プロトコルの解剖部分の間に使用されます: (i) シリコンエラストマーと小さな解剖ピンを持つペトリ皿;(ii) プラスチック転写ピペット(iii) カストロビエホはさみ, サイズ 4" ;(iv) 切断手順のための外科用はさみ(ストレート)(v) デュモン#2ラミテクトミー鉗子;(vi) デュモン#55鉗子;(vii)エクストラファイングレイフ鉗子。(viii)止まり金(湾曲)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 心臓の除去( A)肋骨の下の下にある皮膚の横切開を左肋骨アーチから右の肋骨アーチ(B)の右の肋骨の切開に向かって(C,D)胸郭に沿った横隔膜の切開は胸部腔を露出する。(E) 肺切除後の心臓の除去 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: シナ房(SAN)ノードの解剖. (A) 体外からのペトリ皿における心臓の出現(B)右心房の下の大静脈(IVC)と上の大静脈(SVC)を通して注射針の挿入。心臓の頂点にあるピンも示されています。(C)血液を放出する心臓の頂点(すなわち下半分)の切除。心房の付属物のピンも示されています。(D) 解剖終了時の右心房のSAN領域の最終的な出現。ボックス化された領域は、SAN のおおよその位置に対応します。SAN動脈は、SANを垂直方向に通してかすかに見ることもできます。略語:AO、大オルタ。CT、クリスタターミナル;IVC、下の大静脈。LA、左心房;RA、右心房;RAA、右心房付属物;SAN、シノアリアノード;SVC、優れた大静脈。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:マイクロ電極アレイ(MEA)記録システムの構成図以下のコンポーネントは、システムを構成します: (A) ガスボンベ (カルボーゲン: 95% O2/ 5% CO2);(B)ガスを湿気を与えるために蒸留水と円錐形のフラスコ;(C) MEAディッシュへの流入を提供するタイロードの溶液ボトルを記録する。(D) 蠕動ポンプは、MEAディッシュとの間で溶液をポンプで送り出す。(E) 温度調整器;(F) MEAディッシュからの信号を受信するMEAコネクタプレート;(G)アンプ;(H) コンピュータ;MEAディッシュから使用済み廃棄物溶液用の回収ボトルを使用します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6: MEA上のSA節節組織の位置付け(A)組織の配置に使用されるツール:(i)1.5mmグリッドサイズのメッシュ、(ii)ハープアンカー、(iii)骨鉗子、(iv)ペイントブラシ。(B) MEA上の組織の位置付け黄色のボックスは、メッシュの下のシナ房節領域のおおよその領域を示し、MEA皿のアンカーを示します。(C)フィールド電位記録用コネクタプレートに封入された組織を有するMEA皿の配置:(i)記録溶液用の入口;(ii) ガス(カルボーゲン)の入口。(iii) 溶液の出口;(iv) マイクロ電極コネクタプレート(v) 灌流キャップ;(vi)キャップに取り付けられた参照電極リング。(vii)テープはキャップを保持する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7: ソフトウェアにおけるデータ収集プロトコルの設定. (A) 全64チャンネルの配置を示す記録テンプレートの例(B) 記録条件のソフトウェア入力プロパティの例。(C) 記録中に新しいフェーズを追加する方法を示す注釈メニューの例(薬物効果の測定など)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:異なる活性波形を示す組織の異なる領域 異なるチャネルの異なる形状と振幅を持つ波形を示すスクリーン ショットの例。ただし、すべてのチャンネルは同一のインタースパイク間隔と発射周波数を示します。赤い箱の中のチャネルは、組織のSAN領域内に配置された電極にほぼ対応します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:ビート周波数解析テンプレート ビート周波数解析テンプレート内のすべての64チャンネルの配置を示すテンプレート例。 [生データ ファイルの再生 ] の設定は、分析ウィンドウの入力プロパティの例を示しています。この例では、トレース 5 ~ 7 が解析対象として選択されており、各トレースの解析期間が 60,000 ms に指定されています 。
図10: スパイク抽出の解析パラメータを定義する. (A) 単一チャネルの 3 つの選択されたトレースの代表的な解析テンプレート結果。上部のパネルには、選択した 3 つのトレースのビート周波数 (3 つの定義済みデータ ポイントのグループ) が表示され、各ポイントは特定のトレース中のビート周波数の 10 s 平均を表します。中央のパネルには、選択した 3 つのトレース (3 つの定義済みデータ ポイントのグループ) のスパイク間隔が表示され、各データ ポイントは 2 つの連続したスパイク間のスパイク間間隔を表します。左下のパネルには、3番目のトレースの最後の5 sに対して抽出された代表的なスパイクが選択され、右下のパネルは左下のパネルで抽出されたスパイクの5 sグループから派生した抽出された波形を示しています。(B)3つのトレースの拍動頻度の分析に使用されるパラメータを示す分析ウィンドウの拡大ビュー。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図11: 特定のチャネルの良好なデータ抽出と不良データ抽出を示す代表的な図。 不正なデータ抽出: (A) 抽出されたスパイクの欠如;(B) ノイズ信号を伴うスパイクの抽出(C) 不安定な抽出スパイク。(D) ノイズ信号のない安定した抽出スパイクを示す良好なデータ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図12:ベースラインおよび1mM4-アミノピリジン(4-AP)の投与後の記録(A)単一の微小電極からのベースライン記録は、WT心臓における安定な発火頻度320bpmの波形を示す。(B)4-APの投与後、焼成頻度は210bpmの安定した速度に減速する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
SAN解剖プロセスの練習と習得は、組織が壊れやすく、健全な組織が正常な記録のために必要であるため、不可欠です。SAN解剖の間、組織の適切な領域を得るために正しい方向が不可欠である。しかし、心臓の本来の向きは解剖プロセス中に容易に失われ、この努力を複雑にする。したがって、適切な左右方向を確保するために、アトリアを視覚的に検査する必要があります。典型的には、右心房はより透明になる傾向があるが、一方、左心房は通常、色25、48においてより暗く、より赤である。さらに、SAN組織は、それを用いて作業したり、電極グリッドに取り付けたりしながら、組織が機械的に損傷しやすい51を持ち込むので、伸ばさないのが重要である。健康で適切に解剖されたSAN組織を確認するためのヒントは、顕微鏡下の完全なタイローデの溶液でそれを調べ、組織が鼓動していることを確認することです。技術が習得されると、組織製剤の少なくとも90%が記録に適しているはずです。
いくつかの考慮事項を考慮すると、正常な記録の可能性と後続のデータ分析を改善できます。最適な録音を確実に行うためには、実験用の記録の前に、サンプルの練習用マウスサンプルでソリューションを慎重に準備し、テストする必要があります。SAN組織の健全性を最適化するために、記録ソリューションの適応と変更に幅広く取り組みました。さらに、記録に使用されるガスがカルボーゲンであることを確認してください(すなわち、95%O2/5%CO2)。単一細胞の記録は、多くの場合、そのアプリケーションに使用されるタイロードの溶液の特定の化学組成のために純粋な酸素を使用しますが、MEA上での記録に使用される溶液は、安定したpHを維持するためにカルボーゲンを必要とします。MEAの記録のためのタイロードの溶液と純粋な酸素を使用すると、組織の急速な悪化につながる可能性があり、pHの変動を引き起こす。前述のようにチャネルの振幅の最大値を評価することは、組織が良好な記録品質であるかどうかを判断するのに役立ちます。最後に、記録終了後の分析を支援するために、記録終了後にMEA電極アレイに搭載されたSAN組織の画像を撮ることは非常に有用である。MEAの初期セットアップ中に組織がわずかにシフトすることができ、これは分析のための電極配置の最も正確な評価を提供する。
SANの発射率を特徴付ける徹底的かつ正確な方法として、MEAの録音を提案します。MEA技術の利点は、実験者が広範な電気生理学的専門知識を持つ必要なしに単一細胞の記録と同等の発射率を捕捉できることである。MEA技術はまた、神経体液およびメカノ電気機構の潜在的な交交する影響を排除する利点を有し、これは、単離された心臓記録および生体内自律神経遮断測定21に内在する。心室の収縮と呼吸は、SANの発射を変える可能性のある主要なメカノ電気の影響ですが、それらは私たちの組織の準備52、53で排除されます。この技術は、SANに対する自律的な影響のほとんどを排除しますが、右側のアトリアに残っているICNS投影の数が限られていると、結果5、6、22、23の解釈中に留意すべき理論的な制限であるSAN発射に影響を与える可能性があります。ここで説明するMEA技術のもう一つの利点は、他の多くのタイプの心臓研究に適応できることである。例えば、このプロトコルはSAN活性に対する4-APの効果を実証したが、今後の研究では、ほぼ無限の数の薬理学的薬剤と、SAN固有の発火に対する遺伝子変異の影響を調べることができる。例えば、イバブラジンは、SAN固有のHcn4チャネルの特定のブロッカーで、焼成率54に対する面白い電流寄与を研究するために使用することができる。MEAシステムはまた、心臓の他の領域の心機能を測定するために使用することができ、詳細な、領域特異的特徴付けを可能にする。しかし、他の心臓領域からの記録は、異なる解剖アプローチと記録前に薄い組織切断の可能性を必要とするであろう。この技術の潜在的に重要な制限の1つは、非常に禁止することができるMEAシステムを購入する高いコストです。複数の MEA システムは、同様の特性と機能を備えた市場で利用可能ですが、高コストは変わりません。しかし、初期装置やソフトウェアを取得すると、MEAシステムの保守・使用コストはかなり低くなります。もう一つの制限は、MEAシステムが単一細胞内記録で達成できるような調製物間の作用電位特性(例えば、振幅および形状)の正確な比較に助長されない細胞外電位の記録のみを可能にするということである。要約すると、このプロトコルは、非常に特異的な方法で発火率に対する薬理学的介入の効果を研究する能力を有するマウスSAN組織における固有の心臓焼成率を測定および分析するための効率的なワークフローを提供する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所、助成金番号R01NS100954とR01NS099188によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920x1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
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