Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الثقافات العضوية للقشرة البشرية البالغة كنموذج خارج الجسم الحي لزراعة الخلايا الجذعية البشرية والتحقق من صحتها

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64234
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Laboratory of Stem Cells and Restorative Neurology, Lund Stem Cell Center, Lund University, 2Lund Stem Cell Center, Lund University

Summary

يصف هذا البروتوكول الثقافات العضوية طويلة الأجل للقشرة البشرية البالغة جنبا إلى جنب مع الزرع داخل القشرة خارج الجسم الحي للأسلاف القشرية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، والتي تقدم منهجية جديدة لمزيد من اختبار العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية للاضطرابات التنكسية العصبية البشرية.

Abstract

الاضطرابات التنكسية العصبية شائعة وغير متجانسة من حيث أعراضها وتأثيرها الخلوي ، مما يجعل دراستهم معقدة بسبب عدم وجود نماذج حيوانية مناسبة تحاكي تماما الأمراض البشرية وضعف توافر أنسجة المخ البشرية بعد الوفاة. توفر زراعة الأنسجة العصبية البشرية للبالغين إمكانية دراسة جوانب مختلفة من الاضطرابات العصبية. يمكن معالجة الآليات الجزيئية والخلوية والكيميائية الحيوية بسهولة في هذا النظام ، بالإضافة إلى اختبار الأدوية أو العلاجات المختلفة والتحقق من صحتها ، مثل العلاجات القائمة على الخلايا. تجمع هذه الطريقة بين الثقافات العضوية طويلة الأجل للقشرة البشرية البالغة ، والتي تم الحصول عليها من مرضى الصرع الذين يخضعون لجراحة استئصالية ، والزرع داخل القشرة خارج الجسم الحي للأسلاف القشرية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية. ستسمح هذه الطريقة بدراسة بقاء الخلايا ، والتمايز العصبي ، وتشكيل المدخلات والمخرجات المشبكية ، والخصائص الكهربية للخلايا المشتقة من الإنسان بعد الزرع في الأنسجة القشرية البشرية البالغة السليمة. هذا النهج هو خطوة مهمة قبل تطوير منصة نمذجة الأمراض البشرية 3D التي من شأنها أن تجعل البحوث الأساسية أقرب إلى الترجمة السريرية للعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية للمرضى الذين يعانون من اضطرابات عصبية مختلفة والسماح بتطوير أدوات جديدة لإعادة بناء الدوائر العصبية التالفة.

Introduction

الاضطرابات التنكسية العصبية ، مثل مرض باركنسون أو مرض الزهايمر أو السكتة الدماغية الإقفارية ، هي مجموعة من الأمراض التي تشترك في السمة المشتركة لخلل الخلايا العصبية أو الموت. فهي غير متجانسة من حيث منطقة الدماغ والسكان الخلايا العصبية المتأثرة. لسوء الحظ ، فإن علاجات هذه الأمراض نادرة أو ذات فعالية محدودة بسبب عدم وجود نماذج حيوانية تحاكي ما يحدث في الدماغ البشري 1,2. العلاج بالخلايا الجذعية هو واحد من أكثر الاستراتيجيات الواعدة لتجديد الدماغ3. تم تطوير جيل السلف العصبي من الخلايا الجذعية من مصادر مختلفة بشكل كبير في السنوات الأخيرة 4,5. أظهرت المنشورات الحديثة أن الخلايا الجذعية الشبيهة بالظهارة العصبية ذاتية التجدد (lt-NES) المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPS) المستحثة من قبل الإنسان ، والتي تتبع بروتوكول التمايز القشري وبعد الزرع داخل القشرة في نموذج الفئران مع السكتة الدماغية الإقفارية التي تؤثر على القشرة الحسية الجسدية ، تولد خلايا عصبية قشرية ناضجة. بالإضافة إلى ذلك ، تلقت الخلايا العصبية المشتقة من الكسب غير المشروع اتصالات متشابكة واردة وصادرة من الخلايا العصبية المضيفة ، مما يدل على اندماجها في الشبكة العصبية للفئران 6,7. كانت المحاور المشتقة من الكسب غير المشروع ميالينية ووجدت في مناطق مختلفة من دماغ الفئران ، بما في ذلك منطقة الاحتشاء ، والجسم الثفني ، والقشرة الحسية الجسدية المقابلة. الأهم من ذلك ، أن زرع الخلايا المشتقة من iPS عكس العجز الحركي في السكتة الدماغية7.

حتى لو ساعدت النماذج الحيوانية في دراسة بقاء الزرع ، والتكامل العصبي ، وتأثير الخلايا المطعمة على الوظائف الحركية والمعرفية ، فإن المعلومات حول التفاعل بين الخلايا البشرية (مضيف الكسب غير المشروع) مفقودة في هذا النظام 8,9. لهذا السبب ، يتم وصف طريقة مشتركة لثقافة النمط العضوي للدماغ البشري على المدى الطويل مع زرع خارج الجسم الحي للأسلاف العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية هنا. الثقافات العضوية في الدماغ البشري التي تم الحصول عليها من استئصال جراحة الأعصاب هي نماذج 3D ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للدماغ التي تسمح للباحثين بزيادة فهمهم لدوائر الجهاز العصبي المركزي البشري والطريقة الأكثر دقة لاختبار العلاجات لاضطرابات الدماغ البشري. ومع ذلك ، لم يتم إجراء أبحاث كافية في هذا السياق ، وفي معظم الحالات ، تم استخدام الثقافات العضوية للدماغ الحصين البشري10,11. تتأثر القشرة الدماغية بالعديد من الاضطرابات التنكسية العصبية ، مثل السكتة الدماغية12 أو مرض الزهايمر13 ، لذلك من المهم أن يكون لدينا نظام ثلاثي الأبعاد قشري بشري يسمح لنا بتوسيع معرفتنا واختبار الاستراتيجيات العلاجية المختلفة والتحقق من صحتها. استخدمت العديد من الدراسات في السنوات القليلة الماضية مزارع من الأنسجة القشرية البشرية البالغة (hACtx) لنمذجة أمراض الدماغ البشري14،15،16،17،18،19 ؛ ومع ذلك ، تتوفر معلومات محدودة في سياق العلاج بالخلايا الجذعية. وقد أثبتت دراستان بالفعل جدوى النظام الموصوف هنا. في عام 2018 ، تبين أن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المبرمجة بعوامل نسخ مختلفة وزرعها في أنسجة hACtx تؤدي إلى ظهور خلايا عصبية قشرية ناضجة يمكن أن تندمج في الشبكات القشرية البشرية البالغة20. في عام 2020 ، كشف زرع خلايا lt-NES في نظام النمط العضوي البشري عن قدرتها على التمايز إلى خلايا عصبية قشرية ناضجة خاصة بالطبقة مع الخصائص الفيزيولوجية الكهربية للخلايا العصبية الوظيفية. أقامت الخلايا العصبية المطعمة اتصالات متشابكة واردة وصادرة مع الخلايا العصبية القشرية البشرية في شرائح الدماغ البالغة ، كما يؤكدها تتبع أحادي المشبك الرجعي لفيروس داء الكلب ، وتسجيلات المشبك التصحيحي للخلية الكاملة ، والمجهر الإلكتروني المناعي21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول الإرشادات المعتمدة من قبل اللجنة الأخلاقية الإقليمية ، لوند ، السويد (رقم التصريح الأخلاقي 2021-07006-01). تم الحصول على أنسجة القشرة المخية الحديثة السليمة من المرضى الذين يخضعون لجراحة اختيارية لصرع الفص الصدغي. تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المرضى.

ملاحظة: تمت معالجة جميع الأنسجة التي تم الحصول عليها بغض النظر عن حجمها. ومع ذلك ، فإن الأنسجة الأصغر من 1-1.5 مم3 في الحجم ستكون صعبة تقنيا للتعامل معها وتقسيمها باستخدام اهتزاز.

1. جمع الأنسجة وصيانتها وقطعها وطلائها

  1. الاستعدادات في اليوم السابق لتقطيع الأنسجة
    1. تحضير 2 لتر من محلول القطع (الجدول 1) في قارورة حجمية. قم بإذابة جميع المكونات باستثناء MgCl 2 و CaCl2 في ~ 1800 مل من الماء منزوع الأيونات والفقاعات بغاز الكربوجين لمدة 15 دقيقة. ثم أضف كميات مناسبة من 1 M MgCl2 و CaCl2 واستمر في الفقاعات لمدة 15 دقيقة أخرى. أخيرا ، املأ القارورة بعلامة 2 لتر ؛ تحقق من درجة الحموضة والتناضح واضبطها إذا لزم الأمر. تجمد 2 × 350 مل من المحلول المحضر وتخزن الباقي على حرارة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: عادة ما يكون الرقم الهيدروجيني والتناضح 7.3-7.4 و 295-300 mOsm على التوالي.
    2. تحضير 100 مل من محلول الشطف (الجدول 2). قم بإذابة 476 مجم من HEPES و 200.6 مجم من الجلوكوز في 100 مل من HBSS مع 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين. يمكن تخزين هذا في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 10 أيام.
    3. تحضير وسط الثقافة القشرية البشرية البالغة (hACtx) (وسط hACtx) (الجدول 3) وترشيحه في مختبر زراعة الخلايا تحت غطاء محرك السيارة جيد التهوية. يتكون الوسط من وسط عصبي بدون الفينول الأحمر (انظر جدول المواد) ، ومكمل B27 ، و L-glutamine (انظر جدول المواد) ، والجنتاميسين. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  2. الاستعدادات في يوم العملية قبل وصول عينات الأنسجة
    1. تحقق من توفر المعدات اللازمة ومساحة المختبر ، وقم بتنظيف جميع الأدوات الجراحية والاهتزاز تماما (انظر جدول المواد) ، وكذلك مساحة الطاولة ، بالماء المقطر (بدون منظف) ، متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول. اترك الإيثانول يجف لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل استخدام الأدوات والمعدات.
    2. سحق محلول القطع المجمد وفقاعة "حساء" الثلج والسائل بغاز الكربوجين لمدة 30 دقيقة. ثم أغلق إحدى الحاويات بإحكام بالمحلول المسحوق "الحساء" وضعه في صندوق الثلج. سيتم استخدام هذا لجمع الأنسجة من غرفة العمليات.
    3. قم بمعايرة الاهتزاز واضبط معلمات القطع: سرعة 0.05 مم / ثانية واهتزاز 1.7 مم. ضع حجرة القطع على مرحلة اهتزازية وابدأ المبرد المتصل بها بحيث تكون الحجرة عند درجة حرارة ثابتة تبلغ -3 درجة مئوية.
    4. قم بإعداد غرفة جمع الشرائح بإدخالات لوضع شرائح الأنسجة ومحلول القطع ، مع غليها باستمرار بغاز الكربوجين في درجة حرارة الغرفة (RT).
    5. في مختبر زراعة الخلايا وتحت غطاء التهوية ، ضع إدخالات المزرعة في لوحة ذات 6 آبار باستخدام ملقط. أضف 5 مل من وسط hACtx في الجزء السفلي من الملحق حتى يلامس الغشاء ، وتجنب تكوين الفقاعات ، وأضف 2 مل في الجزء العلوي من الملحق. التوازن في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة2 ساعة على الأقل قبل نقل شرائح الأنسجة إلى الحشوات.
  3. إجراءات جمع الأنسجة وتقطيعها
    1. مباشرة بعد الاستئصال ، اجمع الأنسجة من المريض في غرفة العمليات ، إن أمكن ، مباشرة في وعاء به محلول قطع مجمد وفقاعات وسحق. انقل الحاوية المغلقة على الثلج على الفور إلى منطقة القطع في المختبر.
    2. افحص الأنسجة وحدد أفضل سطح للغراء (انظر الخطوة 1.3.3) إلى مرحلة قطع الاهتزاز ، مع مراعاة اتجاه الطبقات القشرية. إذا لزم الأمر ، قم بقص السطح غير المستوي بمشرط بحيث يسهل وضع الأنسجة على المسرح لتوجيه الشريحة الأمثل.
    3. قم بلصق الأنسجة على المسرح باستخدام مادة لاصقة للأنسجة (انظر جدول المواد) ، وضعها في غرفة التقطيع ، واملأ الحجرة على الفور بمحلول قطع فقاعات بارد. استمر في الفقاعات أثناء إجراء القطع بالكامل.
    4. قطع شرائح إكليلية أو سهمية ، اعتمادا على اتجاه الأنسجة إلى الشفرة ، بسمك 300 ميكرومتر لاحتواء جميع الطبقات القشرية ، وإذا أمكن ، المادة البيضاء. ضع الشرائح في غرفة التجميع بمحلول قطع الفقاعات في RT.
      ملاحظة: قطع من جانب المادة البيضاء باتجاه سطح القشرة. لا تقم بإزالة السحايا ، لأن هذا قد يتلف الأنسجة. عادة ما تقطع شفرة القطع من خلالها بسهولة.
    5. بمجرد قطع جميع الأنسجة ، انقل الشرائح إلى طبق بتري معقم بمحلول شطف في RT وانقلها إلى مختبر زراعة الخلايا. هذه الخطوة ضرورية لإزالة السكروز الزائد من الشرائح قبل نقلها إلى لوحة الثقافة.
      ملاحظة: لنقل الشرائح (في هذه الخطوة والخطوات التالية) ، استخدم ماصة زجاجية مقلوبة ، واقطع الجزء الأرق ، وضع حلمة مطاطية للشفط.
  4. زراعة وصيانة شرائح الأنسجة hACtx
    1. ضع شرائح الأنسجة بشكل فردي فوق الإدخالات المبللة والمغمورة بالفعل. بعد 24 ساعة ، قم بتغيير الوسط لإزالة أي سكروز متبقي أو مواد متبقية أخرى من إجراءات القطع.
    2. استبدل وسط الاستزراع بوسط جديد كل 7 أيام. بعد 2 أسابيع ، استخدم hACtx المتوسطة دون جنتاميسين. يمكن الحفاظ على الثقافة لمدة تصل إلى 2 أشهر.
      ملاحظة: قم بموازنة وسط hACtx في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ساعتين على الأقل قبل تغيير الوسط. يجب إعداد وسيط جديد كل 2 أسابيع. تحقق من الشرائح كل 2-3 أيام ، وإذا تبخر بعض الوسط ، أضف المزيد إلى الجزء العلوي من الإدخال.
حل القطع تركيز المخزون التركيز النهائي [mM] لكل 1 لتر
سكروز ذرور 200 68.46 غ
هيدروكسي الصوديوم 3 ذرور 21 1.76 غ
ككل ذرور 3 0.22 غ
NaH2PO4 ذرور 1.25 0.17 غ
الجلوكوز ذرور 10 1.80 غ
مغسو 4 1 م 2 2 مل
CaCl2 1 م 1.6 1.6 مل
إم جي سي إل2 2 م 2 1 مل

الجدول 1: تكوين محلول القطع. يتم استخدام MgCl2 و CaCl2 كمحاليل 1 M معدة مسبقا في الماء منزوع الأيونات.

حل الشطف تركيز المخزون التركيز النهائي لكل 100 مل
هبس 1x 95 مل
بنسترب 10000 وحدة / مل 500 وحدة / مل 5 مل
هيبس ذرور 4.76 جم/لتر 476 ملغ
الجلوكوز ذرور 2 غ/لتر 200.6 مجم

الجدول 2: تكوين محلول الشطف.

hACtx المتوسطة تركيز المخزون التركيز النهائي لكل 100 مل
وسط عصبي بدون فينول أحمر 97.4 مل انظر جدول المواد
ب 27 50 ضعفا 1:50 2 مل
إل-جلوتامين 100 ضعف 1:200 500 ميكرولتر انظر جدول المواد
الجنتاميسين 50 ملغ/مل 1:1000 100 ميكرولتر

الجدول 3: تكوين وسط hACtx.

2. تكاثر وتمايز خلايا lt-NES

ملاحظة: يتم إنشاء خلايا Lt-NES كما هو موضح سابقا21،22 ويتم تحويلها باستخدام ناقل عدسي فيروسي يحمل بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) تحت محفز تأسيسي (خلايا GFP-lt-NES). يتم تخزين قوارير تحتوي على 3 × 106 خلايا في -150 درجة مئوية حتى الاستخدام.

  1. إعداد حلول الأسهم والوسائط
    1. قم بتخفيف 100 ميكروغرام من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) في 10 مل من PBS-0.1٪ BSA للحصول على تركيز مخزون يبلغ 10 ميكروغرام / مل. تحضير 100 ميكرولتر من القسامة.
    2. قم بتخفيف 100 ميكروغرام من عامل نمو البشرة (EGF) في 10 مل من PBS-0.1٪ BSA للحصول على تركيز مخزون يبلغ 10 ميكروغرام / مل. تحضير 100 ميكرولتر من القسامة.
    3. ملحق Aliquot 50x B27 بحجم 100 ميكرولتر لكل قسولة.
    4. خفف 10 ملغ من بولي-إل-أورنيثين في 100 مل من الماء منزوع الأيونات ليكون تركيز المخزون 100 ميكروغرام/مل. اصنع 1 مل من القسامة.
    5. تحضير 30 ميكرولتر من القسمة من 1.20 ملغ / مل لامينين الفأر.
    6. تمييع 10 مل من التربسين-EDTA (0.25٪) في 90 مل من PBS إلى تركيز مخزون 0.025٪. تحضير 1 مل من القسامة.
    7. خفف 0.025 غ من مثبطات التربسين في 50 مل من PBS إلى تركيز مخزون قدره 0.5 ملغم/مل. تحضير 1 مل من القسامة.
    8. قم بتخفيف 10 ميكروغرام من Wnt3a (عضو عائلة موقع تكامل MMTV من النوع بدون أجنحة 3A) في 1 مل من PBS-0.1٪ BSA للحصول على تركيز مخزون يبلغ 10 ميكروغرام / مل. تحضير BMP4 (البروتين المورفولوجي العظمي 4) بنفس الطريقة. القسمة بحجم 100 ميكرولتر.
    9. تمييع 1 ملغ من السيكلوبامين في 2.5 مل من DMSO إلى تركيز نهائي قدره 400 ميكروغرام / مل ، وجعل 100 ميكرولتر القسامة.
    10. تحضير الوسط الأساسي (الجدول 4) والوسط المحدد بالتمايز (DDM ، الجدول 5) ، وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  2. طلاء أطباق الثقافة
    1. لطلاء الأطباق مسبقا لاستزراع خلايا GFP-It-NES أثناء الانتشار أو التمايز ، قم بتخفيف poly-L-ornithine 1: 100 في الماء منزوع الأيونات وأضف 5 مل من المحلول إلى قارورة T25. احتضان بين عشية وضحاها في RT.
    2. اغسل الألواح المطلية بالبولي L-ornithine 1x بالماء منزوع الأيونات و 1x باستخدام PBS.
    3. بالنسبة لخلايا GFP-It-NES في مرحلة التكاثر ، قم بتخفيف لامينين الفأر عند 1: 500 في PBS واحتضانه لمدة 2 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية. بالنسبة لخلايا GFP-It-NES في حالة تمايز ، قم بتخفيف لامينين الفأر عند 1: 100 في PBS واحتضانه لمدة 2 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية.
  3. تكاثر خلايا GFP-lt-NES
    1. دافئ 5 مل (للغسيل) و 5 مل (للبذر) من الوسط الأساسي في أنبوبين مختلفين سعة 15 مل.
    2. قم بإذابة قارورة واحدة من خلايا GFP-lt-NES بسرعة عند 37 درجة مئوية ، وانقلها إلى أنبوب الغسيل ، وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    3. نضح الوسط بعناية دون لمس الحبيبات ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من الوسط الأساسي الذي تم تسخينه مسبقا. انقل معلق الخلية إلى أنبوب البذر الذي يحتوي على وسط أساسي مكمل بعوامل الانتشار: EGF (10 نانوغرام / مل) ، bFGF (10 نانوغرام / مل) ، و B27 (10 نانوغرام / مل). بذر الخلايا على دورق T25 مغلف ببولي-L-ornithine / laminin.
    4. تغذية الخلايا مع عوامل الانتشار كل يوم. استبدل الوسيط إذا تحول إلى اللون الأصفر. مرور الخلايا كل يوم ثالث أو رابع (1 يوم بعد أن تصل إلى التقاء 100٪).
  4. تقسيم خلايا GFP-lt-NES للتكاثر والتمايز
    1. قم بالتسخين المسبق 5 مل من الوسط الأساسي لكل قارورة (لجمع الخلايا) ، بالإضافة إلى الحجم الإجمالي اللازم لإعادة زرعها.
      ملاحظة: يتم المرور بتخفيف 1: 3 للحفاظ على الخلايا في حالة تكاثر ، مما يتطلب 15 مل من الوسط الأساسي ، وتخفيف 1: 6 لبدء التمايز ، مما يتطلب 30 مل من الوسط الأساسي.
    2. قم بإزالة الوسط من قارورة زراعة الخلايا عن طريق الشفط ، وأضف 500 ميكرولتر من التربسين 0.025٪ المسخن مسبقا. احتضان لمدة 5-10 دقائق في RT. يمكن تأكيد انفصال الخلايا تحت مجهر ضوئي قياسي عند تكبير 10x.
    3. أضف حجما متساويا من مثبطات التربسين (0.5 ملغم / مل التركيز النهائي) متبوعا ب 5 مل من الوسط الأساسي الدافئ. افصل الخلايا واجمع عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × غرام.
    4. للحفاظ على تكاثر الخلايا ، أعد الطلاء بتخفيف 1: 3 في وسط أساسي جديد مكمل بعوامل الانتشار ، وكرر الخطوة 2.3.4.
  5. التمايز القشري لخلايا GFP-lt-NES
    1. في اليوم 0 ، أعد تعليق الخلايا (لاستخدامها في التمايز) في 30 مل من الوسط الأساسي المكمل بعوامل الانتشار ، وقم بوضعها في ست قوارير T25 مغلفة بالتمايز (انقسام 1: 6).
    2. في اليوم 1 ، قم بتغيير نصف الوسط إلى DDM ، وأضف عوامل الانتشار بنصف تركيزها.
    3. في اليوم 2 ، قم بتغيير الوسط تماما إلى DDM المكمل بعوامل التمايز: BMP4 (10 نانوغرام / مل) ، Wnt3a (10 نانوغرام / مل) ، وسيكلوبامين (400 نانوغرام / مل).
    4. في اليوم 4 ، أضف عوامل التمايز وحدها. استبدل الوسيط إذا تحول إلى اللون الأصفر.
    5. في اليوم 6 ، قم بتغيير الوسيط إلى DDM المكمل ب BMP4 و Wnt3a. تتم إزالة السيكلوبامين في هذه الخطوة.
    6. في اليوم السابع ، افصل الخلايا كما هو مذكور في الخطوة 2.4.2 والخطوة 2.4.3.
الوسط الأساسي تركيز المخزون التركيز النهائي لكل 100 مل
DMEM/F12 مع إل-جلوتامين 1x 98.7 مل
ملحق N-2 100 ضعف 1:100 1 مل
الجلوكوز 45% 3.5 مل / لتر 350 ميكرولتر

الجدول 4: تكوين وسط انتشار خلايا lt-NES (الوسط الأساسي).

DDM المتوسطة تركيز المخزون التركيز النهائي لكل 100 مل
DMEM/F12 مع إل-جلوتامين 96 مل
ن2 100 × 1:100 1 مل
نيا 100 × 1:100 1 مل
بيروفات الصوديوم 100 مللي متر 1:100 1 مل
BSA V الكسر 7.5% 6.6 مل / لتر 660 ميكرولتر
2-ميركابتوإيثانول 50 نيوتن متر 7 ميكرولتر / لتر 0.7 ميكرولتر
الجلوكوز 45% 3.2 مل / لتر 320 ميكرولتر

الجدول 5: تكوين الوسط المحدد بالتمايز (DDM) لخلايا lt-NES.

3. زرع خلايا GFP-lt-NES في شرائح hACtx ذات النمط العضوي

ملاحظة: يجب زراعة أنسجة hACtx لمدة 1 أسبوع قبل زرع الخلايا. لتسهيل إجراء عملية الزرع ، من الضروري إزالة 2 مل من وسط hACtx من أعلى الملحق لمنع الأنسجة من الطفو.

  1. أعد تعليق خلايا GFP-lt-NES المحضرة قشريا (من الخطوة 2.5.6) في مصفوفة غشاء القاعدية النقية الباردة (انظر جدول المواد) بتركيز 1 × 105 خلايا / ميكرولتر ونقل المحلول إلى أنبوب معقم أصغر.
    ملاحظة: أثناء إجراء عملية الزرع ، يجب تبريد جميع المواد (أطراف الماصة ، الأنابيب ، الشعيرات الدموية ، إلخ) مسبقا لتجنب تصلب الهلام. قم بإذابة جل مصفوفة الغشاء القاعدي على الثلج لمدة 30 دقيقة قبل استخدامه.
  2. اجمع تعليق الخلية في شعرية زجاجية باردة متصلة بحلمة مطاطية للشفط. حقن معلق الخلية كقطرات صغيرة (حوالي 1 ميكرولتر لكل منها) عن طريق طعن شريحة الأنسجة شبه الجافة في مواقع مختلفة.
  3. احتضان على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى يتماسك الجل. انقل اللوحة من الحاضنة مرة أخرى إلى الغطاء ، وأضف بعناية 2 مل من وسط hACtx إلى الجزء العلوي من الملحق لغمر الأنسجة تماما.
  4. استبدل وسط الاستزراع بوسيط hACtx جديد مرة واحدة في الأسبوع.

4. التحقق من الصحة

  1. تلطيخ شرائح hACtx
    1. في الوقت المطلوب ، أخرج الشرائح من مختبر زراعة الخلايا ، وقم بإزالتها من الإدخال عن طريق غمرها في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، انقل الشرائح إلى قوارير ملطخة باستخدام ماصة زجاجية مقلوبة (انظر الملاحظة في الخطوة 1.3.5) ، وقم بتثبيتها بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    2. شطف 3x مع KPBS لمدة 15 دقيقة في كل مرة ، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع محلول نفاذية (0.02٪ BSA و 1٪ Triton X-100 في KPBS).
    3. في اليوم التالي ، أضف محلول الحجب (KPBS مع 0.2٪ Triton X-100 ، 1٪ BSA ، أزيد الصوديوم [1: 10000] ، و 10٪ مصل حمار عادي) ، واحتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    4. بعد الحجب ، أضف الأجسام المضادة الأولية (انظر الجدول 6 للتخفيفات) المخففة في محلول الحجب ، واحتضانها لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    5. اغسل 3 مرات بمحلول مانع دون إضافة السيروم لمدة 15 دقيقة لكل منهما. تضاف الأجسام المضادة الثانوية المخففة في محلول الحجب (انظر الجدول 6 للتخفيفات) ، وتحتضن لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    6. اغسل 3 مرات بمحلول مانع بدون مصل ، واحتضن لمدة 2 ساعة في RT في صبغة Hoechst المخففة في محلول النفاذية (1: 1000).
    7. اغسل 3 مرات باستخدام KPBS ، وقم بتركيب الشرائح على شرائح زجاجية باستخدام فرشاة الرسم ، واتركها تجف. أخيرا ، اشطف الشرائح بالماء منزوع الأيونات ، وقم بإزالة الماء الزائد ، وأضف وسيط التثبيت ، وقم بتغطيته بغطاء زجاجي. احتفظ بالشرائح لمدة 24 ساعة على الأقل في RT ، وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى التصوير.
      ملاحظة: بالنسبة للأجسام المضادة التي تضع علامات على الحواتم النووية ، قم بإجراء استرجاع المستضد قبل النفاذية (الخطوة 4.1.2) مع سترات الصوديوم (10 mM ، الرقم الهيدروجيني 6.0) لمدة ساعتين عند 65 درجة مئوية.
  2. المشبك التصحيح الخلية الكاملة
    1. في يوم التسجيل ، قم بإعداد 1 لتر من السائل النخاعي الاصطناعي البشري (haCSF) ، المعدل ليتناسب بشكل أفضل مع بيئة الدماغ البشري (الجدول 7). على غرار محلول القطع ، اصنع ما يقرب من 900 مل من المحلول مع جميع المكونات باستثناء CaCl 2 المذاب في الماء منزوع الأيونات ، وقم بفقاعته بالكربوجين لمدة 15 دقيقة قبل إضافة الحجم المناسب من 1 M CaCl2 محلول. املأ القارورة الحجمية إلى علامة 1 لتر ، واستمر في الفقاعات في RT لمدة 15 دقيقة إضافية قبل بدء التسجيل وطوال التجربة.
    2. انقل شرائح الأنسجة من صفيحة المزرعة إلى غرفة التسجيل على مسرح مجهر قائم يتم تعطيره باستمرار باستخدام haCSF الفقاعي بمعدل تروية 2 مل / دقيقة ويتم تسخينه إلى 34 درجة مئوية باستخدام جهاز تحكم في درجة حرارة الحمام.
    3. اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام مجتذب ماصة إلى متوسط مقاومة 3-5 MΩ ، وردم الشعيرات الدموية بمحلول داخلي قائم على K-gluconate (الجدول 8) مع 2-4 ملغ مضاف حديثا من البيوسيتين لتحديد الخلايا المسجلة بعد التخصيص. الرقم الهيدروجيني والأسمولية لهذا الحل الداخلي هما 7.2-7.3 و 285-295 mOsm ، على التوالي.
    4. في حالة تسجيل الخلية المضيفة ، احصل على نظرة عامة تقريبية على الشريحة ذات الهدف 4x ، وابحث عن خلية ذات مظهر صحي لتصحيحها بهدف 40x. بعد ذلك ، تابع مشبك التصحيح القياسي للخلية الكاملة.
    5. في حالة تسجيل الخلايا المطعمة ، حدد منطقة الأنسجة بالخلايا المطعمة باستخدام هدف 4x ومرشح epifluorescence في النطاق الأزرق (460 نانومتر) بواسطة تعبير مراسل GFP في الكسب غير المشروع. بعد ذلك ، قم بتكبير المنطقة الموجودة بهدف 40x ، وابحث عن خلية مطعمة تعبر عن GFP لمشبك تصحيح قياسي كامل الخلية.
    6. تحقق من إمكانات غشاء الراحة (RMP) فور اقتحام الخلية ، وتأكد من أن جودة التسجيل جيدة. سجل جميع المعلمات ذات الأهمية (على سبيل المثال ، مقاومة الغشاء [Ri] ، ومعلمات AP ، وتيارات الصوديوم والبوتاسيوم ، والنشاط المشبكي) في جهد الخلية بالكامل أو تكوين المشبك الحالي.
    7. بعد جمع جميع البيانات اللازمة ، اسحب ماصة التسجيل بعناية دون إلحاق المزيد من الضرر بالخلية بحيث يمكن التعرف عليها باستخدام تلطيخ مناعي بعد التخصيص.
    8. انقل الشريحة إلى محلول PFA بنسبة 4٪ لمزيد من التثبيت والتلوين ، كما هو موضح في الخطوة 4.1. يستخدم الستربتافيدين لتسمية الخلايا المملوءة بالبوسيتين أثناء التسجيلات.
الاجسام المضاده التخفيف تلاحظ 
ابتدائي
دجاج مضاد ل GFP 1:1000
دجاج مضاد ل MAP2 1:1000
الماعز المضادة AiF1 1:100
الماوس مكافحة MBP 1:1000 مطلوب استرجاع المستضد
ماوس مضاد SC123 1:2000
أرنب مضاد للنيوين 1:1000
أرنب مضاد أوليج 2 1:500
أرنب مضاد Tmem119 1:200
ثانوي
488 مترافق AffinityPure Donkey مضاد للفأر IgG 1:500
488 مترافق تقارب حمار نقي مضاد للأرانب IgG 1:500
488 مترافق AffinityPure Donkey مضاد للدجاج IgG 1:500
Cy3-مترافق التقاربالحمار النقي مكافحة الدجاج IgG 1:500
Cy3-مترافق التقاربحمار نقي مضاد للماعز IgG 1:500
Cy3-مترافق تقارب حمار نقي مضاد للفأر IgG 1:500
أليكسا فلور 647 مترافق ستربتافيدين 1:500

الجدول 6: قائمة الأجسام المضادة الأولية والثانوية للكيمياء الهيستولوجية المناعية.

هاكف تركيز المخزون التركيز النهائي [mM] لكل 1 لتر
كلوريد الصوديوم ذرور 129 7.54 غ
هيدروكسي الصوديوم 3 ذرور 21 1.76 غ
الجلوكوز ذرور 10 1.80 غ
ككل ذرور 3 0.22 غ
NaH2PO4 ذرور 1.25 0.17 غ
مغسو 4 1 م 2 2 مل
CaCl2 1 م 1.6 1.6 مل

الجدول 7: تكوين السائل النخاعي الاصطناعي (haCSF).

محلول K-غلوكونات الداخلي تركيز المخزون التركيز النهائي [mM] لكل 100 مل
ك-غلوكونات ذرور 122.5 2.87 غ
ككل ذرور 12.5 93.18 مجم
كلوريد الصوديوم ذرور 8 46.76 مجم
هيبس ذرور 10 238.32 مجم
مغاتب ذرور 2 101.4 مجم
Na3GTP ذرور 0.3 17.0 مجم
ملاحظه: ضبط درجة الحموضة مع KOH / HCl

الجدول 8: تكوين محلول داخلي قائم على K-gluconate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باتباع البروتوكول الموصوف ، تم جمع ومعالجة أنسجة hACtx من مريض مصاب بصرع الفص الصدغي ، كما هو موضح أعلاه. تم تثبيت بضع شرائح بعد 24 ساعة في الثقافة لدراسة نقطة البداية للأنسجة المضيفة. أظهر تحليل مجموعات الخلايا العصبية المختلفة مثل الخلايا العصبية (معبرا عن NeuN و Map2 ، الشكل 1A) ، والخلايا قليلة التغصن (Olig2 و MBP ، الشكل 1B) ، والخلايا النجمية (GFAP الخاص بالإنسان ، المسمى أيضا STEM123 ، الشكل 1C) الحفاظ الأمثل على الأنسجة.

كانت الخطوة التالية هي دراسة كيفية تأثير ظروف الثقافة على صلاحية الخلايا العصبية في الأنسجة البشرية. لهذا الغرض ، تم إجراء تلطيخ NeuN و Map2 بعد أسبوعين من الثقافة. في النقطة الزمنية المدروسة ، كان التعبير عن كل من هذه العلامات العصبية لا يزال موجودا في الأنسجة (الشكل 2 أ). بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية لتقييم الوظيفة. أظهرت التسجيلات باستخدام مشبك تصحيح الخلية الكاملة أن الخلايا العصبية قد حافظت على RMP (-70 mV في المتوسط) ومقاومة مدخلات الغشاء (Ri) (300 MΩ في المتوسط) ، مقارنة بالخلايا العصبية من الاستعدادات الحادة21,23. بشكل عام ، كانت الخلايا أقل نشاطا بقليل من الأنسجة الطازجة ، على الرغم من أن غالبية الخلايا كانت لا تزال قادرة على إطلاق واحدة على الأقل (الشكل 2B-E) ، إن لم تكن متعددة ، جهود الفعل (APs ، الشكل 2F-I) ، وكان الصوديوم الداخلي السريع وتيارات البوتاسيوم البطيئة إلى الخارج موجودة عند حقن التيار التدريجي في وضع مشبك الجهد (الشكل 2C-E ، G-I). مجتمعة ، أشارت هذه التسجيلات إلى أن الخلايا العصبية في الثقافات العضوية كانت صحية نسبيا وأظهرت خصائص جوهرية فسيولوجية عصبية نموذجية.

علاوة على ذلك ، تم تقييم تأثير الثقافة على تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال تلطيخ Tmem119 و Iba1 في 24 ساعة (الشكل 3 أ) و 2 أسبوع مزروع (الشكل 3 ب). كما هو متوقع ، لوحظت بعض التغييرات في مظهر الخلايا الدبقية الصغيرة. بعد 2 أسابيع في الثقافة ، أصبحوا أقل تشعبا واكتسبوا مورفولوجيا أكثر تنشيطا مقارنة بالأنسجة الحادة.

بعد توصيف الأنسجة المضيفة ، تم إجراء عملية زرع السلف المشتقة من الخلايا lt-NES على النحو التالي. تم تمييز خلايا GFP-lt-NES لمدة 7 أيام وتطعيمها في نسيج hACtx مزروع لمدة 1 أسبوع (الشكل 4 أ). لوحظت نظرة عامة على عملية الزرع باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية مع GFP (الشكل 4B ، C). تمت مقارنة النتائج مع نتائج عمليات الزرع السابقة في الأنسجة التي تم الحفاظ عليها بشكل سيئ بسبب وجود نافذة زمنية أطول بين الاستئصال والطلاء. تظهر الصور أنه في النظام الأمثل ، بعد 4 أسابيع من الزرع خارج الجسم الحي ، أظهرت خلايا GFP-lt-NES المطعمة خلايا عصبية ممتدة وتشجيرات واسعة ومعقدة في جميع أنحاء الثقافة العضوية بأكملها (الشكل 4 ب). لم تسمح الأنسجة المحفوظة بشكل سيئ بعملية زرع ناجحة بسبب ضعف اتصال المضيف. بالكاد نجت أي خلية مطعمة. علاوة على ذلك ، لوحظ على نطاق واسع وجود حطام ووضع علامات غير محددة على الأجسام المضادة على الخلايا الميتة في جميع أنحاء الشريحة البشرية (الشكل 4C).

فيما يتعلق بالخصائص الفيزيولوجية الكهربية للخلايا المطعمة ، وجد أنه في حالة الزرع الناجح ، لم تصبح الخلايا عصبية ناضجة من الناحية الشكلية فحسب ، بل أصبحت أيضا خلايا عصبية ناضجة نشطة وظيفيا مع APs متكررة وغالبا ما تكون عفوية ، وصوديوم داخلي سريع وتيارات بوتاسيوم بطيئة إلى الخارج ، ومستوى معين من النشاط المشبكي ، مما يشير إلى التكامل الوظيفي للكسب غير المشروع مع الأنسجة المضيفة بعد 4 أسابيع من التطعيم (الشكل 4D-H).

Figure 1
الشكل 1: توصيف تجمعات الخلايا المختلفة في نسيج hACtx بعد 24 ساعة في الثقافة. صور تمثيلية متحدة البؤر لأنسجة hACtx تظهر وجود (A) الخلايا العصبية (معبرة عن NeuN و Map2) ، (B) oligodendrocytes (Olig2 و MBP) ، و (C) الخلايا النجمية (GFAP الخاص بالإنسان [STEM123]). يتم تضمين تلطيخ نووي (Ho: Hoechst ، أزرق) في الألواح الفردية والمدمجة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. تشير الأسهم البيضاء إلى التوطين المشترك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التوصيف والخصائص الكهربية للخلايا العصبية hACtx بعد أسبوعين في ثقافة النمط العضوي. (أ) صور تمثيلية متحدة البؤر لأنسجة hACtx توضح تعبير NeuN وMap2 . (ب-ط) أمثلة على الخلايا العصبية القشرية المسجلة في أنسجة hACtx البالغة من العمر 2 أسبوع. (ب ، و) وضع العلامات الحيوية للخلايا العصبية المسجلة (أحمر) ، جنبا إلى جنب مع تلطيخ نووي (Ho: Hoechst ، أزرق) ، مدرج في لوحة مدمجة. قضبان المقياس = 20 ميكرومتر. تظهر آثار تسجيل مشبك التصحيح للخلية الكاملة أمثلة لخلية بها نقاط وصول مفردة (C-E) أو (G-I) متعددة. تم تحفيز APs إما عن طريق (C ، G) خطوة 250 pA ، أو (D ، H) حقن تيار متصاعد من 0 إلى 300 pA في RMP. تشير الأجزاء الداخلية إلى عرض مكبر لأحد نقاط الوصول في كل حالة. (ه، ط) لوحظت تيارات الصوديوم الداخلية والبوتاسيوم الخارجية في كلا مثالي الخلية عند خطوات إزالة استقطاب الجهد المطبقة من -70 مللي فولت بزيادات 10 مللي فولت في وضع مشبك الجهد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: توصيف تجمعات الخلايا الدبقية الصغيرة في نسيج hACtx. صور متحدة البؤر لأنسجة hACtx تظهر تعبير Iba1 و Tmem119 بعد (A) 24 h و (B) 2 أسابيع في الثقافة. يتم تضمين تلطيخ نووي (Ho: Hoechst ، أزرق) في الألواح الفردية والمدمجة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. تشير الأسهم البيضاء إلى التوطين المشترك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: نظرة عامة والخصائص الكهربية الفسيولوجية للخلايا العصبية المشتقة من الخلايا lt-NES بعد 4 أسابيع من زرع خلايا GFP-lt-NES خارج الجسم الحي. أ: التصميم التجريبي. الفرق = التمايز. (ب، ج) صور تمثيلية متحدة البؤر لخلايا GFP-lt-NES المطعمة في (B) المحفوظة جيدا و (C) أنسجة hACtx المحفوظة بشكل سيئ. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. (د) مثال على أثر خلية عصبية مشتقة من الكسب غير المشروع تطلق نقاط الوصول تلقائيا. يشير الجزء الداخلي إلى عرض مكبر لأحد نقاط الوصول. يمكن تحفيز نقاط الوصول المتكررة عن طريق حقن (E) الخطوة (50 pA) أو (F) المنحدرة (0 إلى 300 pA) لتيار إزالة الاستقطاب من إمكانات -70 mV. (ز) تم تحفيز تيارات الصوديوم الداخلية والبوتاسيوم الخارجية بواسطة خطوات إزالة الاستقطاب 10 mV في وضع مشبك الجهد من جهد احتجاز يبلغ -70 mV. (H) في وضع مشبك الجهد ، يمكن ملاحظة التيارات التلقائية بعد المشبكية (sPSCs) في الخلايا العصبية المشتقة من الكسب غير المشروع عند جهد احتجاز يبلغ -70 مللي فولت. تشير الأجزاء الداخلية إلى عرض مكبر لبعض sPSCs. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد الحصول على شرائح hACtx ذات الجودة العالية بما يكفي الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول. يتم الحصول على الأنسجة القشرية من مرضى الصرع الذين يخضعون لجراحة استئصالية24. جودة الأنسجة المقطوعة ، وكذلك وقت تعرض الأنسجة بين الاستئصال والثقافة ، أمر بالغ الأهمية. كلما تم نقل الأنسجة بشكل أسرع من غرفة الجراحة إلى المختبر وقطعها ، كلما كانت الثقافة العضوية أكثر مثالية. من الناحية المثالية ، يجب قطع الأنسجة ونقلها إلى مختبر زراعة الخلايا خلال الساعات القليلة الأولى بعد جمعها. كما أن أكسجة الأنسجة أثناء هذه العملية يحسن جودة الشرائح. في هذا الصدد ، كلما كبرت عينة الأنسجة ، انخفض تركيز الأكسجين الذي يصل إلى القلب ، وبالتالي ، انخفضت صلاحية الأنسجة إذا لم يتم قطع الأنسجة في الوقت المناسب. إذا لم تكن جودة الأنسجة المضيفة مثالية ، فلن يكون التحقق من صحة علاجات الخلايا الجذعية ممكنا.

عندما يتم نقل الأنسجة القشرية من الدماغ البشري إلى لوحة ، يجب مراعاة بعض القيود. أثناء عملية القطع ، يتم تشريح عدد كبير من المحاور العصبية ، مما يؤدي إلى تلف الخلايا العصبية التي ستؤدي إلى عمليات التهابية مثل تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة25. لهذا السبب ، حتى لو كانت الأنسجة تعتبر صحية عند وجودها في الدماغ البشري ، فقد يكون سلوك الخلية في الثقافة مختلفا بسبب الضرر الجزئي الذي لحق بها أثناء استئصال وإعداد الأقسام العضوية26,27. يمكن رصد التغيرات في مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام تقنيات مختلفة ، بما في ذلك قياس مستويات السيتوكين المطلقة أو تقييم التغيرات المورفولوجية28. الأهم من ذلك ، على الرغم من أن تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة لوحظ في 2 أسابيع في الثقافة نتيجة للتغير في البيئة من عضو كامل إلى ظروف ثقافة خارج الجسم الحي ، كانت الخلايا العصبية لا تزال قابلة للحياة في هذه النقطة الزمنية ، كما يتضح من تلطيخ الخلايا العصبية وتحليل خصائصها الكهربية. يتم الحفاظ على شرائح الأنسجة السميكة بشكل أفضل ؛ ومع ذلك ، يتأثر تغلغل العناصر الغذائية في الجزء الداخلي من الشريحة ، مما يؤدي إلى موت الأنسجة الجزئي. لهذا السبب ، 300 ميكرومتر هو السماكة المثلى للثقافة العضوية.

الثقافات العضوية من الأنسجة hACtx لها مزايا واضحة مقارنة مع غيرها من أساليب ثقافة 3D مثل المواد العضوية أو كروية. المصدر هو دماغ بشري متطور بالكامل ، مما يعني أن البيئة الخلوية والمصفوفة ، بالإضافة إلى حالة نضج مجموعات الخلايا المختلفة ، هي نفسها الموجودة عموما في الدماغ البشري البالغ25،29،30. الكائنات العضوية هي أكثر تشابها مع أنسجة الجنين ، وهو الأمثل لبعض مجالات البحث مثل نمذجة اضطرابات النمو31 ولكن ليس ، على سبيل المثال ، لدراسة الأمراض التنكسية العصبية ، والتي تؤثر بشكل رئيسي على السكان البالغين ولها بداية متأخرة32,33. الأهم من ذلك ، أن الثقافة العضوية للأنسجة البشرية هي ، حتى الآن ، النظام البشري الوحيد الذي يسمح بالتحقق من صحة العلاجات الخلوية.

معظم المعرفة حول زرع الخلايا الجذعية لاستبدال الخلايا العصبية في الاضطرابات التنكسية العصبية مستمدة من النمذجة الحيوانية في الجسم الحي . على الرغم من أن هذه الأنظمة ذات قيمة كبيرة لتقييم التأثير التعديلي للخلايا المزروعة في الدوائر المضيفة التالفة ، لسوء الحظ ، فإن العلاجات التي تم اختبارها في هذا الإعداد تفشل عادة عند ترجمتها إلى العيادة بسبب الاختلافات الواضحة بين القوارض والبشر34. لهذا السبب ، فإن الثقافة العضوية لأنسجة hACtx هي استراتيجية ممتازة لنمذجة الأمراض التنكسية العصبية البشرية التي تؤثر على القشرة بسبب إمكانية دراسة التفاعلات بين السكان العصبيين البشريين والحفاظ على بنية الدماغ البشري25.

باختصار ، هذه المنهجية المشتركة للثقافات العضوية طويلة الأجل للقشرة البشرية البالغة والزرع داخل القشرة خارج الجسم الحي للأسلاف القشرية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات هي استراتيجية واعدة للتحقق من صحة العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية ، والتي يمكن أن تسهل الترجمة السريرية لاستراتيجيات استبدال الخلايا العصبية لتحفيز الانتعاش الوظيفي في الدماغ التالف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يتم دعم هذا العمل من خلال منح من مجلس البحوث السويدي ، ومؤسسة الدماغ السويدية ، والمؤسسة السويدية للسكتة الدماغية ، ومنطقة Skåne ، ومؤسسة Thorsten and Elsa Segerfalk ، ومبادرة الحكومة السويدية لمجالات البحث الاستراتيجي (StemTherapy).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Cutting and electrophysiology
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Bath temperature controller  Luigs & Neumann TC0511354
Calcium Chloride dihydrate Merck 102382
Carbogen gas Air Liquide NA
Cooler Julaba FL 300 9661012.03
D-(+)Glucose Sigma-Aldrich G7021
Double Patch-Clamp amplifier HEKA electronic EPC10
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt Millipore 371701
HEPES AppliChem A1069
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Magnesium Sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 230391
Patchmaster HEKA electronic Patchmaster 2x91
Pipette Puller Sutter P-2000
Plastic Petri dish Any suitable
Potassium chloride Merck 104936
Potassium D-gluconate ThermoFisher B25135
Rubber teat + glass pipette Any suitable
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 106346
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Tissue adhesive: Acryl super glue Loctite 2062278
Upright microscope Olympus BX51WI 
Vibratome  Leica VT1200 S
RINSING SOLUTION
D-(+)Glucose Sigma-Aldrich G7021
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) ThermoFisher Scientific 14175095
HEPES AppliChem A1069
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15-140-122
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE
6-well plate ThermoFisher Scientific 140675
Alvetex scaffold 6 well insert Reinnervate Ltd AVP004-96
B27 Supplement (50x) ThermoFisher Scientific 17504001
BrainPhys without Phenol Red StemCell technologies #05791 Referenced as neuronal medium in the text
Filter units 250 mL or 500 mL Corning Sigma CLS431096/97
Forceps Any suitable
Gentamicin (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 15750037
Glutamax Supplement (100x) ThermoFisher Scientific 35050061 Referenced as L-glutamine in the text
Rubber teat + Glass pipette Any suitable
GENERATION OF lt-NES cells
2-Mercaptoethanol 50 mM ThermoFisher Scientific 31350010
Animal Free Recombinant EGF Peprotech AF-100-15
B27 Suplemment (50x) Thermo Fisher Scientific 17504001
bFGF Peprotech AF-100-18B
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) ThermoFisher Scientific 15260037
Cyclopamine, V. calcifornicum Calbiochem # 239803
D (+) Glucose solution (45%) Sigma G8769
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2438-10mL
DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 11320074
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190-144 Without calcium and magnesium
Laminin Mouse Protein, Natural Thermo Fisher Scientific 23017015
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) ThermoFisher Scientific 11140050
N-2 Supplement (100 x) ThermoFisher Scientific 17502001
Poly-L-Ornithine Merk P3655
Recombinant Human BMP-4 Protein R&D Systems 314-BP-010
Recombinant Human Wnt-3a Protein R&D Systems 5036-WN
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360070
Soybean Trypsin Inhibitor, powder Thermo Fisher Scientific 17075029
Sterile deionized water MilliQ MilliQ filter system
Trypsin EDTA (0.25%) Sigma T4049-500ML
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE 
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL Eppendorf Various
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) Corning CLS354277-1EA
Centrifuge Hettich Centrifugen Rotina 420R 5% CO2, 37 °C
Incubator ThermoForma Steri-Cult CO2 HEPA Class100
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm Vitrolife 14601
Sterile tubes Sarstedt Various
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm VWR 612-1701
Sterile pipette tips 0.1-1000  µL Biotix VWR Various
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL Costar Various
T25 flasks Nunc ThermoFisher Scientific 156367
IMMUNOHISTOCHEMISTRY
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoReserach 715-545-151
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG Jackson ImmunoReserach 711-545-152
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG Jackson ImmunoReserach 703-545-155
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin Jackson ImmunoReserach 016-600-084
Bovine Serum Albumin Jackson ImmunoReserach 001-000-162
Chicken anti-GFP Merk Millipore AB16901
Chicken anti-MAP2  Abcam ab5392
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG Jackson ImmunoReserach 703-165-155
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG Jackson ImmunoReserach 705-165-147
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoReserach 715-165-151
Diazabicyclooctane (DABCO) Sigma Aldrich D27802 Mounting media
Goat anti-AIF1 (C-terminal)  Biorad AHP2024
Hoechst 33342 Molecular Probes Nuclear staining
Mouse anti-MBP  BioLegend 808402
Mouse anti-SC123  Stem Cells Inc AB-123-U-050
Normal Donkey Serum Merk Millipore S30-100
Paint brush Any suitable
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 150127
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)
     Distilled water
     Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) Merk Millipore 104873
     Potassium phospate dibasic (K2HPO4) Sigma Aldrich P3786
     Sodium chloride (NaCl) Sigma Aldrich S3014
Rabbit anti-NeuN  Abcam ab104225
Rabbit anti-Olig2  Abcam ab109186
Rabbit anti-TMEM119  Abcam ab185333
Sodium azide Sigma Aldrich S2002-5G
Sodium citrate
       Distilled water
       Tri-Sodium Citrate Sigma Aldrich S1804-500G
       Tween-20 Sigma Aldrich P1379
Triton X-100 ThermoFisher Scientific 327371000 
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY
Confocal microscope Zeiss LSM 780
Microscope Slides 76 mm x 26 mm VWR 630-1985
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm Marienfeld 107242
Microscope Software Zeiss ZEN Black edition
Rubber teat + Glass pipette Any suitable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).
  2. Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).
  3. Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work. Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).
  4. Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).
  5. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).
  6. Tornero, D., et al. Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli. Brain. 140 (3), 692-706 (2017).
  7. Palma-Tortosa, S., et al. Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).
  8. Robinson, N. B., et al. The current state of animal models in research: A review. International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).
  9. Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
  10. Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
  11. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  12. Delavaran, H., et al. Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke. European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).
  13. Sabuncu, M. R., et al. The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease. Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).
  14. Eugene, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
  15. Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
  16. Kalmbach, B. E., et al. Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons. Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).
  17. Barth, M., et al. Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54 (2021).
  18. Almeida, G. M., et al. Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response. Frontiers in Neuroscience. 15, 674576 (2021).
  19. Schwarz, N., et al. Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures. Scientific Reports. 7, 12249 (2017).
  20. Miskinyte, G., et al. Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 207 (2017).
  21. Gronning Hansen, M., et al. Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry. Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).
  22. Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS One. 7 (1), 29597 (2012).
  23. Avaliani, N., et al. Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors. Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).
  24. Engel, J., et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).
  25. Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).
  26. Verwer, R. W., et al. Injury response of resected human brain tissue in vitro. Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).
  27. Verwer, R. W., et al. Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue. Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).
  28. Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).
  29. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  30. Schwarz, N., et al. Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease. Elife. 8, 48417 (2019).
  31. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  32. Wang, Z., et al. Organoid technology for brain and therapeutics research. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).
  33. Wang, H. Modeling neurological diseases with human brain organoids. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).
  34. Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 190 ،
الثقافات العضوية للقشرة البشرية البالغة كنموذج <em>خارج الجسم</em> الحي لزراعة الخلايا الجذعية البشرية والتحقق من صحتها
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Palma-Tortosa, S.,… More

Palma-Tortosa, S., Martínez-Curiel, R., Aretio-Medina, C., Avaliani, N., Kokaia, Z. Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation. J. Vis. Exp. (190), e64234, doi:10.3791/64234 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter