Summary
このプロトコルは、人工多能性幹細胞由来の皮質前駆細胞の ex vivo 皮質内移植と組み合わせた成人ヒト皮質の長期器官型培養を説明しており、ヒト神経変性疾患に対する幹細胞ベースの治療法をさらにテストするための新しい方法論を提示します。
Abstract
神経変性疾患は、その症状と細胞の影響の点で一般的で不均一であり、人間の病気を完全に模倣する適切な動物モデルがなく、死後の人間の脳組織の入手可能性が悪いため、研究が複雑になっています。成人のヒト神経組織培養は、神経障害のさまざまな側面を研究する可能性を提供します。分子、細胞、および生化学的メカニズムは、このシステムで簡単に対処できるだけでなく、薬物や細胞ベースの治療法などのさまざまな治療法をテストおよび検証することもできます。この方法は、切除手術を受けているてんかん患者から得られた成人ヒト皮質の長期器官型培養と、人工多能性幹細胞由来の皮質前駆細胞の ex vivo 皮質内移植を組み合わせたものです。この方法は、細胞の生存、神経分化、シナプス入出力の形成、および無傷の成人ヒト皮質組織への移植後のヒト由来細胞の電気生理学的特性の研究を可能にします。このアプローチは、さまざまな神経障害を持つ患者のための幹細胞ベースの治療法の臨床翻訳に基礎研究を近づけ、損傷した神経回路を再構築するための新しいツールの開発を可能にする3Dヒト疾患モデリングプラットフォームの開発前の重要なステップです。
Introduction
パーキンソン病、アルツハイマー病、虚血性脳卒中などの神経変性疾患は、神経機能不全または死の共通の特徴を共有する疾患のグループです。それらは、影響を受ける脳領域とニューロン集団の点で不均一です。残念ながら、これらの疾患の治療法は、人間の脳で起こることを模倣する動物モデルがないため、乏しいか、有効性が限られています1,2。幹細胞治療は、脳再生のための最も有望な戦略の1つです3。異なる供給源からの幹細胞からのニューロン前駆細胞の生成は、近年大きく開発されている4,5。最近の発表によると、ヒト人工多能性幹(iPS)細胞由来の長期自己複製神経上皮様幹(lt-NES)細胞は、皮質分化プロトコルに従い、体性感覚皮質に影響を与える虚血性脳卒中のラットモデルで皮質内移植後に成熟皮質ニューロンを生成します。さらに、移植片由来のニューロンは、宿主ニューロンから求心性および遠心性シナプス接続を受け取り、ラットニューロンネットワークへのそれらの統合を示す6,7。移植片由来の軸索は有髄であり、梗塞周囲領域、脳梁、および対側体性感覚皮質を含むラット脳のさまざまな領域に見られました。最も重要なことは、iPS細胞由来移植が脳卒中動物の運動障害を逆転させたことです7。
動物モデルが移植生存、神経細胞統合、および運動および認知機能に対する移植細胞の影響の研究に役立つとしても、ヒト細胞(移植片宿主)間の相互作用に関する情報はこのシステムでは欠落しています8,9。このため、ヒトiPS細胞由来神経前駆細胞のex vivo移植とヒト脳器官型培養の長期併用法について述べる。脳神経外科的切除から得られたヒト脳器官型培養は、生理学的に関連する脳の3Dモデルであり、研究者はヒトの中枢神経系回路とヒト脳障害の治療をテストする最も正確な方法の理解を深めることができます。しかし、この文脈では十分な研究が行われておらず、ほとんどの場合、ヒト海馬脳器官型培養が使用されています10,11。大脳皮質は、虚血性脳卒中12やアルツハイマー病13などのいくつかの神経変性疾患の影響を受けているため、知識を拡大し、さまざまな治療戦略をテストおよび検証できる人間の皮質3Dシステムを持つことが重要です。過去数年間のいくつかの研究では、成人のヒト皮質(hACtx)組織からの培養を使用して、ヒトの脳疾患をモデル化しています14,15,16,17,18,19;ただし、幹細胞治療のコンテキストで利用できる情報は限られています。2つの研究は、ここで説明するシステムの実現可能性をすでに実証しています。2018年、異なる転写因子でプログラムされ、hACtx組織に移植されたヒト胚性幹細胞は、成人のヒト皮質ネットワークに統合できる成熟皮質ニューロンを生じさせることが示された20。2020年、lt-NES細胞のヒト器官型システムへの移植により、機能ニューロンの電気生理学的特性を備えた成熟した層特異的皮質ニューロンに分化する能力が明らかになりました。移植されたニューロンは、狂犬病ウイルス逆行性単シナプス追跡、全細胞パッチクランプ記録、および免疫電子顕微鏡検査によって裏付けられるように、成人脳スライスのヒト皮質ニューロンとの求心性および遠心性シナプス接触の両方を確立しました21。
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Protocol
このプロトコルは、スウェーデンのルンドにある地域倫理委員会によって承認されたガイドライン(倫理許可番号2021-07006-01)に従います。健康な新皮質組織は、側頭葉てんかんの待機的手術を受けている患者から得られました。すべての患者からインフォームドコンセントが得られた。
注:得られたすべての組織は、サイズに関係なく処理されました。ただし、サイズが1〜1.5 mm3 未満の組織は、ビブラトームで取り扱いおよび切片化するのが技術的に困難です。
1.組織の収集、メンテナンス、切断、およびメッキ
- 組織スライス前日の準備
- メスフラスコに2 Lの切断液(表1)を準備します。MgCl2とCaCl2を除くすべての成分を~1,800mLの脱イオン水に溶解し、カルボゲンガスで15分間泡立てます。次に、適量の1 M MgCl 2およびCaCl2溶液を加え、さらに15分間バブリングを続けます。 最後に、フラスコを2 Lマークまで満たします。pHと浸透圧を確認し、必要に応じて調整します。調製した溶液2 x 350 mLを凍結し、残りを4°Cで保存します。
注:pHと浸透圧は通常、それぞれ7.3〜7.4および295〜300mOsmです。 - 100 mLのすすぎ液を調製します(表2)。476 mgのHEPESと200.6 mgのグルコースを、5 mLのペニシリン/ストレプトマイシンを添加した100 mLのHBSSに溶解します。.これは、4°Cで最大10日間保存できます。
- ヒト成人皮質(hACtx)培地(hACtx培地)を調製し(表3)、換気フード下の細胞培養ラボでろ過します。培地は、フェノールレッドを含まない神経培地(材料表を参照)、B27サプリメント、L-グルタミン(材料表を参照)、およびゲンタマイシンを含む。4°Cで最大2週間保存します。
- メスフラスコに2 Lの切断液(表1)を準備します。MgCl2とCaCl2を除くすべての成分を~1,800mLの脱イオン水に溶解し、カルボゲンガスで15分間泡立てます。次に、適量の1 M MgCl 2およびCaCl2溶液を加え、さらに15分間バブリングを続けます。 最後に、フラスコを2 Lマークまで満たします。pHと浸透圧を確認し、必要に応じて調整します。調製した溶液2 x 350 mLを凍結し、残りを4°Cで保存します。
- 組織サンプル到着前の手術当日の準備
- 必要な機器とラボスペースの空き状況を確認し、すべての手術器具とビブラトーム( 材料の表を参照)、およびベンチトップスペースを蒸留水(洗剤なし)とそれに続く70%エタノールで徹底的に洗浄します。ツールや機器を使用する前に、エタノールを少なくとも30分間乾燥させてください。
- 凍結した切削液を粉砕し、氷と液体の「スープ」をカルボゲンガスで30分間泡立てます。次に、粉砕した溶液「スープ」で容器の1つをしっかりと閉じて、アイスボックスに入れます。これは、手術室から組織を採取するために使用されます。
- ビブラトームを校正し、切断パラメータを設定します:0.05 mm / sの速度と1.7 mmの振動。カッティングチャンバーをビブラトームステージに置き、チャンバーが-3°Cの一定温度になるように、それに接続されたクーラーを始動します。
- 組織スライスと切断液を配置するためのインサートを備えたスライス収集チャンバーを準備し、室温(RT)でカルボゲンガスで常に泡立てます。
- 細胞培養ラボおよび換気フードの下で、鉗子を使用して培養インサートを6ウェルプレートに置きます。インサートの下部に5 mLのhACtx培地をメンブレンに接触するまで追加し、気泡の形成を回避し、インサートの上部に2 mLを追加します。インキュベーター内で37°C、5%CO2 で少なくとも2時間平衡化してから、組織スライスをインサートに移します。
- 組織の収集とスライスの手順
- 切除直後に、可能であれば、手術室の患者から組織を凍結、泡立て、粉砕した切断液の入った容器に直接集めます。氷上で密閉された容器をすぐにラボの切断領域に移します。
- 組織を検査し、皮質層の向きを考慮して、ビブラトームの切断段階に接着するのに最適な表面を見つけます(ステップ1.3.3を参照)。必要に応じて、メスで凹凸のある表面をカットして、最適なスライス方向のために組織をステージに簡単に配置できるようにします。
- ティッシュ接着剤でティッシュをステージに接着し( 材料の表を参照)、スライスチャンバーに入れ、すぐにチャンバーにコールドバブル切断液を入れます。切断手順全体を通してバブリングを続けます。
- 組織とブレードの向きに応じて、冠状または矢状スライスを300μmの厚さでカットして、すべての皮質層と、可能であれば白質を含めます。スライスをRTでバブリング切断溶液を入れた収集チャンバーに入れます。
注:白質側から皮質の表面に向かって切り取ります。髄膜は組織を損傷する可能性があるため、髄膜を取り除かないでください。切断刃は通常それらを簡単にスライスします。 - すべての組織が切断されたら、スライスをRTのすすぎ液を含む滅菌ペトリ皿に移し、細胞培養ラボに輸送します。このステップは、スライスを培養プレートに移す前にスライスから余分なスクロースを除去するために必要です。
注意: スライスを転送するには(この手順と次の手順で)、倒立ガラスピペットを使用し、薄い部分を切り離し、吸引用のゴム乳首を置きます。
- hACtx組織切片の培養と維持
- すでに濡れて水没したインサートの上にティッシュスライスを個別に置きます。24時間後、培地を交換して、切断手順から残っているスクロースまたはその他の残留物質をさらに取り除きます。
- 7日ごとに培地を新鮮な培地と交換してください。2週間後、ゲンタマイシンを含まないhACtx培地を使用します。培養は最大2ヶ月間維持することができます。
注:培地交換の前に、インキュベーター内のhACtx培地を37°Cおよび5%CO2 で少なくとも2時間平衡化します。新鮮な培地は2週間ごとに調製する必要があります。2〜3日ごとにスライスをチェックし、培地の一部が蒸発した場合は、インサートの上部にさらに追加します。
| 切断ソリューション | 在庫集中 | 最終濃度 [ミリオンM] | 1リットルあたり |
| 蔗糖 | 粉 | 200 | 68.46 グラム |
| ナトリウム塩酸3 | 粉 | 21 | 1.76 グラム |
| KCl | 粉 | 3 | 0.22 グラム |
| NaH2PO4 | 粉 | 1.25 | 0.17 グラム |
| グルコース | 粉 | 10 | 1.80 グラム |
| マグネシウムソ4 | 1メートル | 2 | 2ミリリットル |
| CaCl2 | 1メートル | 1.6 | 1.6ミリリットル |
| マグネシウムCl2 | 2メートル | 2 | 1ミリリットル |
表1:切削液の組成。 MgCl 2およびCaCl2は、脱イオン水中で予め調製された1 M溶液として使用されます。
| すすぎ液 | 在庫集中 | 最終濃度 | 100ミリリットルあたり |
| ティッカー | 1倍速 | 95ミリリットル | |
| ペンストレップ | 10,000 U/mL | 500 U/mL | 5ミリリットル |
| ヘペス | 粉 | 4.76グラム/リットル | 476ミリグラム |
| グルコース | 粉 | 2グラム/リットル | 200.6 ミリグラム |
表2:リンス液の組成。
| hACtx ミディアム | 在庫集中 | 最終濃度 | 100ミリリットルあたり | |
| フェノールレッドを含まない神経培地 | 97.4 ミリリットル | 材料表を参照 | ||
| B27 | 50倍 | 1:50 | 2ミリリットル | |
| L-グルタミン | 100倍 | 1:200 | 500 μL | 材料表を参照 |
| ゲンタマイシン | 50ミリグラム/ミリリットル | 1:1000 | 100 μL |
表3:hACtx培地の組成。
2. LT-NES細胞の増殖と分化
注:LT−NES細胞は、前述のように生成され21、22、構成的プロモーターの下で緑色蛍光タンパク質(GFP)を担持するレンチウイルスベクター(GFP-lt−NES細胞)で形質導入される。3 x 106細胞を含むバイアルは、使用するまで-150°Cで保存します。
- ストック溶液および培地の調製
- 100 μgの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を10 mLのPBS-0.1%BSAで希釈して、ストック濃度を10 μg/mLにします。100 μLのアリコートを準備します。
- 100 μgの上皮成長因子(EGF)を10 mLのPBS-0.1%BSAで希釈して、10 μg/mLのストック濃度にします。100 μLのアリコートを準備します。
- 50x B27サプリメントをアリコートあたり100 μLの容量で分注します。
- 10 mgのポリ-L-オルニチンを100 mLの脱イオン水で希釈して、100 μg/mLの原液濃度にします。1mLのアリコートを作ります。
- 1.20 mg/mL マウスラミニンを 30 μL アリコートで調製します。
- 10 mLのトリプシン-EDTA(0.25%)を90 mLのPBSでストック濃度0.025%に希釈します。1 mLのアリコートを準備します。
- 0.025 gのトリプシンインヒビターを50 mLのPBSで0.5 mg / mLのストック濃度に希釈します。1 mLのアリコートを準備します。
- 10 μgのWnt3a(ウィングレス型MMTV集積サイトファミリー3A)を1 mLのPBS-0.1%BSAで希釈し、ストック濃度を10 μg/mLにします。BMP4(骨形成タンパク質4)も同様に調製する。100μLの容量で分注する。
- 1 mgのシクロパミンを2.5 mLのDMSOで最終濃度400 μg / mLに希釈し、100 μLのアリコートを作ります。
- 基本培地(表4)および分化規定培地(DDM、 表5)を調製し、4°Cで最大2週間保存します。
- 培養皿のコーティング
- 増殖または分化中にGFP-It-NES細胞を培養するためにディッシュをプレコーティングするには、ポリ-L-オルニチンを脱イオン水で1:100に希釈し、5 mLの溶液をT25フラスコに加えます。RTで一晩インキュベートします。
- ポリ-L-オルニチンコーティングされたプレートを脱イオン水で1回、PBSで1回洗浄します。
- 増殖中のGFP-It-NES細胞の場合、マウスラミニンをPBSで1:500に希釈し、37°Cで少なくとも2時間インキュベートします。 分化中のGFP-It-NES細胞の場合、マウスラミニンをPBSで1:100に希釈し、37°Cで少なくとも2時間インキュベートします。
- GFP-lt-NES細胞の増殖
- 5 mL(洗浄用)と5 mL(播種用)の塩基性培地を2つの異なる15 mLチューブに温めます。
- GFP-lt-NES細胞のバイアル1本を37°Cで急速に解凍し、洗浄チューブに移し、300 x g で5分間遠心分離します。
- ペレットに触れずに培地を注意深く吸引し、予め温めた塩基性培地1 mLに細胞を再懸濁します。増殖因子を添加した塩基性培地(EGF(10 ng/mL)、bFGF(10 ng/mL)、およびB27(10 ng/mL)を含む播種チューブに細胞懸濁液を移します。細胞をポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングT25フラスコに播種します。
- 毎日増殖因子を細胞に与えます。メディアが黄色に変わったら交換してください。細胞を3日または4日ごと(100%コンフルエントに達した後1日)に継代する。
- 増殖および分化のためのGFP-lt-NES細胞の分裂
- フラスコあたり5 mLの基本培地(細胞を収集するため)と、それらを再播種するために必要な総容量を事前に温めます。
注:継代は、細胞の増殖を維持するために1:3希釈で行われ、15 mLの塩基性培地が必要で、分化を開始するには1:6希釈で30 mLの塩基性培地が必要です。 - 吸引により細胞培養フラスコから培地を取り出し、予め温めた0.025%トリプシン500 μLを加えます。RTで5〜10分間インキュベートします。細胞の剥離は、標準的な光学顕微鏡で10倍の倍率で確認することができます。
- 等量のトリプシン阻害剤(最終濃度0.5 mg/mL)を加え、続いて5 mLの温かい塩基性培地を加えます。穏やかに上下にピペッティングして細胞を分離して集めます。細胞を15 mLチューブに移し、300 x gで5分間遠心分離します 。
- 細胞の増殖を維持するには、増殖因子を添加した新鮮な塩基性培地に1:3希釈で再プレートし、ステップ2.3.4を繰り返します。
- フラスコあたり5 mLの基本培地(細胞を収集するため)と、それらを再播種するために必要な総容量を事前に温めます。
- GFP-lt-NES細胞の皮質分化
- 0日目に、増殖因子を添加した30 mLの基本培地に細胞(分化に使用する)を再懸濁し、6つの分化コーティングT25フラスコ(分割1:6)にプレートします。
- 1日目に、培地の半分をDDMに変更し、増殖因子をそれらの濃度の半分で加えます。
- 2日目に、分化因子を添加したDDMに培地を完全に交換します:BMP4(10 ng / mL)、Wnt3a(10 ng / mL)、およびシクロパミン(400 ng / mL)。
- 4日目に、分化因子のみを追加します。メディアが黄色に変わったら交換してください。
- 6日目に、培地をBMP4とWnt3aを添加したDDMに変更します。シクロパミンはこのステップで除去されます。
- 7日目に、ステップ2.4.2およびステップ2.4.3に記載されているようにセルを切り離します。
| 基本メディア | 在庫集中 | 最終濃度 | 100ミリリットルあたり |
| DMEM/F12 と L-グルタミン | 1倍速 | 98.7 ミリリットル | |
| N-2サプリメント | 100倍 | 1:100 | 1ミリリットル |
| グルコース | 45% | 3.5ミリリットル/リットル | 350 μL |
表4:lt-NES細胞の増殖培地(基本培地)の組成。
| DDM メディア | 在庫集中 | 最終濃度 | 100ミリリットルあたり |
| DMEM/F12 と L-グルタミン | 96ミリリットル | ||
| N2 | 100× | 1:100 | 1ミリリットル |
| ティッカー | 100× | 1:100 | 1ミリリットル |
| ピルビン酸ナトリウム | 100ミリメートル | 1:100 | 1ミリリットル |
| BSA V フラクション | 7.5% | 6.6 ミリリットル/リットル | 660 μL |
| 2-メルカプトエタノール | 50ナノメートル | 7 μL/L | 0.7 μL |
| グルコース | 45% | 3.2 ミリリットル/リットル | 320 μL |
表5:lt-NES細胞の分化規定培地(DDM)の組成。
3. GFP-lt-NES細胞の有機型hACtxスライスへの移植
注:hACtx組織は、細胞移植の前に1週間培養する必要があります。移植手順を容易にするために、組織が浮くのを防ぐために、インサートの上部から2 mLのhACtx培地を除去する必要があります。
- 皮質プライミングされたGFP-lt-NES細胞(ステップ2.5.6から)を冷たい純粋な基底膜マトリックス( 材料表を参照)に1 x 105 細胞/μLの濃度で再懸濁し、溶液をより小さな滅菌チューブに移します。
注:移植手順中は、ゲルの固化を防ぐために、すべての材料(ピペットチップ、チューブ、キャピラリーなど)を予冷する必要があります。基底膜マトリックスゲルを氷上で30分間解凍してから使用してください。 - 細胞懸濁液を吸引用のゴム乳首に接続された冷たいガラス毛細管に集める。半乾燥組織スライスをさまざまな部位に刺して、細胞懸濁液を小滴(各約1 μL)として注入します。
- ゲルが固まるまで37°Cで30分間インキュベートします。プレートをインキュベーターからフードに戻し、2 mLのhACtx培地をインサートの上部に注意深く加えて、組織を完全に沈めます。
- 培養液を週に一度、新鮮なhACtx培地と交換します。
4. バリデーション
- hACtxスライスの染色
- 希望の時点で、細胞培養ラボからスライスを取り出し、PBSを含むペトリ皿に浸してインサートから取り出します。次に、倒立ガラスピペットを使用してスライスを染色バイアルに移し(ステップ1.3.5のNOTEを参照)、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で4°Cで一晩固定します。
- 毎回KPBSで3回15分間すすぎ、透過処理溶液(KPBS中の0.02%BSAおよび1%Triton X-100)で4°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、ブロッキング溶液(0.2%トリトンX-100、1%BSA、アジ化ナトリウム[1:10,000]、および10%正常ロバ血清を含むKPBS)を加え、4°Cで一晩インキュベートします。
- ブロッキング後、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体(希釈液については 表6 を参照)を加え、4°Cで48時間インキュベートします。
- 血清を加えずにブロッキング溶液で3回ずつ15分間洗浄します。ブロッキング溶液で希釈した二次抗体を加え(希釈については 表6 を参照)、4°Cで48時間インキュベートします。
- 血清を含まないブロッキング溶液で3回洗浄し、透過処理溶液(1:1,000)で希釈したヘキスト染色液のRTで2時間インキュベートします。
- KPBSで3回洗浄し、絵筆を使用してスライドガラスにスライスを取り付け、乾燥させます。最後に、スライドを脱イオン水ですすぎ、余分な水を取り除き、封入剤を加え、ガラスカバーガラスで覆います。スライドをRTで少なくとも24時間保持し、イメージングするまで4°Cで保存します。
注:核エピトープを標識する抗体の場合、透過処理(ステップ4.1.2)の前にクエン酸ナトリウム(10 mM、pH 6.0)で65°Cで2時間抗原賦活化を行います。
- 全細胞パッチクランプ
- 記録当日、ヒトの脳環境によりよく一致するように改変したヒト人工脳脊髄液(haCSF)を1L準備する(表7)。切削液と同様に、CaCl2 を除く全成分をイオン交換水に溶解した溶液約900mLを作り、カルボゲンで15分間バブリングしてから、適量の1MCaCl2 溶液を加える。メスフラスコを1Lマークまで満たし、記録を開始する前に実験中、RTでさらに15分間バブリングを続けます。
- 組織スライスを培養プレートから正立顕微鏡のステージ上の記録チャンバーに移し、2 mL/minの灌流速度でバブリングしたhaCSFを絶えず灌流し、バス温度コントローラーを使用して34°Cに温めます。
- ピペットプラーでガラス毛細血管を平均抵抗3〜5 MΩまで引き、記録された細胞の事後同定のために新たに添加した2〜4 mgのバイオシチンを含むK-グルコン酸塩ベースの内部溶液(表8)で毛細血管を埋め戻します。この内部溶液のpHおよび浸透圧はそれぞれ7.2〜7.3および285〜295mOsmである。
- 宿主細胞の記録の場合は、4倍の対物レンズでスライスの大まかな概要を把握し、40倍の対物レンズでパッチを適用する健全な外観の細胞を見つけます。次に、標準の全セルパッチクランプに進みます。
- 移植細胞記録の場合、移植片におけるGFPレポーター発現により青色域(460nm)の4倍対物レンズ及び落射蛍光フィルターを用いて移植細胞を有する組織領域を同定する。次に、40倍の対物レンズで配置された領域にズームインし、標準的な全細胞パッチクランプ用のGFPを発現する移植細胞を見つけます。
- 細胞に侵入した直後に静止膜電位(RMP)をチェックし、記録の品質が良好であることを確認してください。対象となるすべてのパラメータ(膜抵抗[Ri]、APパラメータ、ナトリウムおよびカリウム電流、シナプス活性など)をセル全体の電圧または電流クランプ構成で記録します。
- 必要なデータをすべて収集したら、細胞をさらに損傷することなく記録ピペットを慎重に引っ込めて、ポストホック免疫染色で識別できるようにします。
- ステップ4.1で説明されているように、スライスを4%PFA溶液に移して、さらに固定および染色します。ストレプトアビジンは、記録中にバイオシチンで満たされた細胞を免疫標識するために使用されます。
| 抗体 | 希釈 | 筆記 |
| 原発 | ||
| チキン抗GFP | 1:1000 | |
| チキンアンチMAP2 | 1:1000 | |
| ヤギアンチAiF1 | 1:100 | |
| マウスアンチMBP | 1:1000 | 抗原賦活化が必要 |
| マウスアンチSC123 | 1:2000 | |
| ウサギ抗NeuN | 1:1000 | |
| ウサギ抗オリッグ2 | 1:500 | |
| ウサギ抗Tmem119 | 1:200 | |
| 付帯 | ||
| 488-抱合体アフィニティピュアロバ抗マウスIgG | 1:500 | |
| 488-共役アフィニティピュアロバ抗ウサギIgG | 1:500 | |
| 488-コンジュゲートアフィニティピュアロバ抗チキンIgG | 1:500 | |
| Cy3-結合親和性ピュアロバ抗チキン IgG | 1:500 | |
| Cy3結合アフィニティピュアロバ抗ヤギIgG | 1:500 | |
| Cy3結合親和性純ロバ抗マウスIgG | 1:500 | |
| Alexa fluor 647-コンジュゲートストレプトアビジン | 1:500 |
表6:免疫組織化学のための一次抗体および二次抗体のリスト。
| haCSF | 在庫集中 | 最終濃度 [ミリオンM] | 1リットルあたり |
| ナトリウム | 粉 | 129 | 7.54 グラム |
| ナトリウム塩酸3 | 粉 | 21 | 1.76 グラム |
| グルコース | 粉 | 10 | 1.80 グラム |
| KCl | 粉 | 3 | 0.22 グラム |
| NaH2PO4 | 粉 | 1.25 | 0.17 グラム |
| マグネシウムソ4 | 1メートル | 2 | 2ミリリットル |
| CaCl2 | 1メートル | 1.6 | 1.6ミリリットル |
表7:人工脳脊髄液(haCSF)の組成。
| K-グルコン酸内部溶液 | 在庫集中 | 最終濃度 [ミリオンM] | 100ミリリットルあたり |
| K-グルコン酸塩 | 粉 | 122.5 | 2.87 グラム |
| KCl | 粉 | 12.5 | 93.18 ミリグラム |
| ナトリウム | 粉 | 8 | 46.76 ミリグラム |
| ヘペス | 粉 | 10 | 238.32 ミリグラム |
| マグネシウムATP | 粉 | 2 | 101.4 ミリグラム |
| Na3GTP | 粉 | 0.3 | 17.0 ミリグラム |
| 手記： KOH/HClでpHを調整する | |||
表8:K-グルコン酸塩系内部液の組成。
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Representative Results
記載されたプロトコールに従って、側頭葉てんかんを有する患者からのhACtx組織を、上記で説明したように収集し、処理した。数枚のスライスを培養24時間後に固定し、宿主組織の開始点を調べた。ニューロン(NeuNおよびMap2を発現、図1A)、希突起膠細胞(Olig2およびMBP、図1B)、およびアストロサイト(ヒト特異的GFAP、STEM123とも呼ばれる、図1C)などのさまざまな神経細胞集団の分析は、組織の最適な保存を示しました。
次のステップは、培養条件がヒト組織のニューロン生存率にどのように影響するかを研究することでした。この目的のために、NeuNおよびMap2の染色を2週間の培養後に行った。研究された時点で、これら両方のニューロンマーカーの発現は依然として組織に存在していた(図2A)。さらに、機能を評価するために電気生理学的記録が行われた。全細胞パッチクランプを使用した記録は、ニューロンが急性製剤からのニューロンに匹敵するRMP(平均-70mV)および膜入力抵抗(Ri)(平均300MΩ)を維持していることを示しました21,23。全体として、細胞は新鮮組織よりもわずかに活性が低かったが、大多数の細胞は、複数ではないにしても、少なくとも1つ(図2B-E)を発火させることができ、電圧クランプモードでのステップ電流注入時に、高速内向きのナトリウム電流と低速外向きのカリウム電流が存在した(図2C-E、G-I)。まとめると、これらの記録は、器官型培養のニューロンが比較的健康であり、典型的な神経生理学的固有の特性を示したことを示しました。
さらに、ミクログリア活性化に対する培養の効果を、24時間培養(図3A)および2週間培養(図3B)におけるTmem119およびIba1染色によって評価した。予想通り、ミクログリアの外観にいくつかの変化が観察された。培養2週間後、急性組織と比較して、それらはより分岐が少なくなり、より活性化された形態を獲得した。
宿主組織を特徴付けた後、lt-NES細胞由来前駆細胞の移植を以下のように行った。GFP-lt-NES細胞を7日間分化させ、1週間培養したhACtx組織に移植した(図4A)。移植の概要は、GFPを用いた免疫組織化学を用いて観察した(図4B、C)。結果は、切除とメッキの間の時間枠が長いために保存が不十分な組織における以前の移植の結果と比較されました。画像は、最適な系において、 ex vivo 移植の4週間後に、移植されたGFP-lt-NES細胞が器官型培養全体を通して拡張神経突起および広範かつ複雑な樹状化を示したことを示しています(図4B)。保存状態が不十分な組織は、宿主の接続性が悪いため、移植を成功させることができませんでした。移植された細胞はほとんど生き残れなかった。さらに、死細胞上の抗体の破片および非特異的標識は、ヒトスライス全体で広く観察された(図4C)。
移植細胞の電気生理学的特性に関しては、移植に成功した場合、細胞は形態学的にだけでなく機能的にも活性な成熟ニューロンになり、反復的でしばしば自発的なAP、速い内向きのナトリウム電流と遅い外向きのカリウム電流、およびある程度のシナプス活性になり、移植後4週間で移植片と宿主組織の機能的統合を示すことがわかりました(図4D-H)。
図1:培養24時間後のhACtx組織における異なる細胞集団の特性評価。 (A)ニューロン(NeuNおよびMap2を発現)、(B)希突起膠細胞(Olig2およびMBP)、および(C)アストロサイト(ヒト特異的GFAP [STEM123])の存在を示すhACtx組織の代表的な共焦点画像。核染色(Ho:ヘキスト、青)は、個々のパネルおよびマージされたパネルに含まれています。スケールバー= 20μm。白い矢印は共局在を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:器官型培養における2週間後のhACtxニューロンの特性評価と電気生理学的特性。 (A)NeuNおよびMap2発現を示すhACtx組織の代表的な共焦点画像。(B-I)2週齢hACtx組織に記録された皮質ニューロンの例。(B,F)記録されたニューロンのバイオシチン標識(赤)は、核染色(Ho:Hoechst、青)とともに、マージされたパネルに含まれる。スケールバー= 20μm。(C-E)単一または(GI)複数のAPを有する細胞の例を示す全細胞パッチクランプ記録トレース。APは、(C,G)250pAステップ、または(D,H)RMPでの0〜300pAのランプ電流注入のいずれかによって誘導されました。挿入図は、いずれの場合も AP の 1 つの拡大ビューを示します。(E,I)両方のセル例で、電圧クランプモードで-70 mVから10 mV刻みで印加された電圧分極ステップで、内向きのナトリウム電流と外向きのカリウム電流が観察されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:hACtx組織におけるミクログリア集団の特性評価。 (A)培養24時間後および(B)2週間後のIba1およびTmem119の発現を示すhACtx組織の共焦点画像。核染色(Ho:ヘキスト、青)は、個々のパネルおよびマージされたパネルに含まれています。スケールバー= 20μm。白い矢印は共局在を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:GFP-lt-NES細胞のエクスビボ移植から4週間後のlt-NES細胞由来ニューロンの概要と電気生理学的特性。 (A)実験計画。差分=微分。(B,C)(B)保存状態が良好で保存状態が悪いhACtx組織に移植されたGFP-lt-NES細胞の代表的な共焦点写真。スケールバー = 50 μm。 (D)移植片由来のニューロンがAPを自発的に発火させた痕跡の例。挿入図は、AP の 1 つの拡大ビューを示します。反復APは、-70mVの電位からの脱分極電流の(E)ステップ(50pA)または(F)ランプ(0〜300pA)注入によって誘発される可能性があります。(G)内向きのナトリウム電流と外向きのカリウム電流は、-70mVの保持電位から電圧クランプモードで10mVの脱分極ステップによって誘導されました。(H)電圧クランプモードでは、-70mVの保持電位で移植片由来のニューロンに自発的なシナプス後電流(sPSC)が観察されました。挿入図は、いくつかのsPSCの拡大図を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
十分に高品質のhACtxスライスを取得することは、このプロトコルの最も重要なステップです。 皮質組織は、切除手術を受けているてんかん患者から得られる24。切除された組織の質、および切除と培養の間の組織の曝露時間は重要です。組織が手術室から実験室に移されて切断される速度が速いほど、有機型培養はより最適になります。理想的には、組織を切断し、収集後最初の数時間以内に細胞培養ラボに移す必要があります。このプロセス中の組織の酸素化もスライスの品質を向上させます。これに関して、組織サンプルが大きいほど、コアに到達する酸素濃度が低くなり、したがって、組織が時間内に切断されない場合の生存率は低くなります。宿主組織の質が最適でない場合、幹細胞治療の検証は不可能です。
皮質組織が人間の脳からプレートに移されるとき、いくつかの制限を考慮に入れなければなりません。切断プロセス中に、多数の軸索が解剖され、ミクログリア活性化などの炎症プロセスにつながるニューロン損傷を誘発します25。このため、組織がヒトの脳内にあるときに健康であると考えられる場合でも、器官型切片の切除および調製中に被った部分的な損傷のために、培養における細胞の挙動が異なる可能性があります26,27。ミクログリア集団の変化は、放出されたサイトカインレベルの測定や形態学的変化の評価など、さまざまな技術を使用して監視できます28。重要なことに、臓器全体からex vivo培養条件への環境の変化の結果として、培養2週間でミクログリアの活性化が観察されましたが、ニューロン染色とその電気生理学的特性の分析によって示されるように、ニューロンはこの時点でまだ生存可能でした。より厚い組織スライスはよりよく保存されます。しかしながら、スライスの内側部分への栄養素の浸透が影響を受け、部分的な組織死をもたらす。このため、300 μmが有機型培養に最適な厚さです。
hACtx組織のオルガノタイプ培養は、オルガノイドやスフェロイドなどの他の3D培養方法と比較して明らかな利点があります。ソースは完全に発達した人間の脳であり、細胞およびマトリックス環境、ならびに異なる細胞集団の成熟状態は、成人のヒト脳に一般的に見られるものと同じであることを意味する25,29,30。オルガノイドは胎児組織に似ており、発達障害のモデリングなどの一部の研究分野には最適ですが31、たとえば、主に成人集団に影響を及ぼし、発症が遅い神経変性疾患の研究には最適ではありません32,33。最も重要なことは、ヒト組織の器官型培養は、今日まで、細胞療法の検証を可能にする唯一のヒトシステムであるということです。
神経変性疾患における神経細胞置換のための幹細胞移植に関する知識のほとんどは、 in vivo 動物モデリングに由来しています。これらのシステムは、損傷した宿主回路に移植された細胞の調節効果を評価するために非常に価値がありますが、残念ながら、このセットアップでテストされた治療法は、げっ歯類と人間の明らかな違いのために、通常、臨床に変換されると失敗します34。このため、hACtx組織の器官型培養は、ヒト神経集団間の相互作用とヒト脳構造の保存を研究する可能性があるため、皮質に影響を与えるヒト神経変性疾患をモデル化するための優れた戦略である25。
要約すると、成人ヒト皮質の長期器官型培養と人工多能性幹細胞由来の皮質前駆細胞の ex vivo 皮質内移植のこの組み合わせ方法論は、幹細胞ベースの治療法の検証のための有望な戦略であり、損傷した脳の機能回復を刺激するためのニューロン置換戦略の臨床翻訳を促進することができます。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、スウェーデン研究評議会、スウェーデン脳財団、スウェーデン脳卒中財団、スコーネ地域、トルステンおよびエルザセゲルファルク財団、およびスウェーデン政府戦略研究分野イニシアチブ(StemTherapy)からの助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Cutting and electrophysiology | |||
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
| Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
| Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2x91 | |
| Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
| Plastic Petri dish | Any suitable | ||
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
| Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| RINSING SOLUTION | |||
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
| Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| Forceps | Any suitable | ||
| Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
| GENERATION OF lt-NES cells | |||
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
| Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
| Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
| Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
| Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
| Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
| Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
| T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
| Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
| Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
| Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
| Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
| Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
| Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
| Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
| Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
| Paint brush | Any suitable | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
| Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
| Distilled water | |||
| Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
| Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
| Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
| Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium citrate | |||
| Distilled water | |||
| Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
| Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
| Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
References
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