Summary
이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 전구체의 생체 외 피질 내 이식과 결합된 성인 인간 피질의 장기 기관형 배양을 설명하며, 이는 인간 신경퇴행성 장애에 대한 줄기 세포 기반 치료법을 추가로 테스트하기 위한 새로운 방법론을 제시합니다.
Abstract
신경퇴행성 장애는 증상과 세포 영향 측면에서 흔하고 이질적이어서 인간 질병을 완전히 모방하는 적절한 동물 모델이 부족하고 사후 인간 뇌 조직의 가용성이 낮기 때문에 연구가 복잡합니다. 성인 인간 신경 조직 배양은 신경 장애의 다양한 측면을 연구할 수 있는 가능성을 제공합니다. 분자, 세포 및 생화학적 메커니즘은 이 시스템에서 쉽게 해결할 수 있을 뿐만 아니라 약물 또는 세포 기반 요법과 같은 다양한 치료법을 테스트하고 검증할 수 있습니다. 이 방법은 절제 수술을 받는 간질 환자로부터 얻은 성인 인간 피질의 장기 기관형 배양과 유도만능 줄기 세포 유래 피질 전구체의 생체 외 피질 이식을 결합합니다. 이 방법을 사용하면 세포 생존, 신경 분화, 시냅스 입력 및 출력 형성, 손상되지 않은 성인 인간 피질 조직에 이식한 후 인간 유래 세포의 전기생리학적 특성을 연구할 수 있습니다. 이 접근법은 다양한 신경 질환 환자를 위한 줄기 세포 기반 치료법의 임상 번역에 더 가까운 기초 연구를 제공하고 손상된 신경 회로를 재구성하기 위한 새로운 도구의 개발을 가능하게 하는 3D 인간 질병 모델링 플랫폼을 개발하기 전에 중요한 단계입니다.
Introduction
파킨슨병, 알츠하이머병 또는 허혈성 뇌졸중과 같은 신경퇴행성 장애는 신경 기능 장애 또는 사망의 공통된 특징을 공유하는 질병 그룹입니다. 그들은 영향을받는 뇌 영역과 신경 집단 측면에서 이질적입니다. 불행하게도, 이러한 질병에 대한 치료법은 인간의 뇌에서 일어나는 것을 모방하는 동물 모델이 없기 때문에 드물거나 효능이 제한적이다 1,2. 줄기세포 치료는 뇌 재생을 위한 가장 유망한 전략 중 하나이다3. 다른 출처의 줄기 세포에서 신경 전구 세포의 생성은 최근 몇 년 동안 크게 발전했습니다 4,5. 최근 간행물에 따르면 인간 유도 만능 줄기(iPS) 세포 유래 장기 자가 재생 신경상피 유사 줄기(lt-NES) 세포는 피질 분화 프로토콜에 따라 체성 감각 피질에 영향을 미치는 허혈성 뇌졸중이 있는 쥐 모델에서 피질 내 이식 후 성숙한 피질 뉴런을 생성합니다. 또한, 이식편 유래 뉴런은 숙주 뉴런으로부터 구 심성 및 원심성 시냅스 연결을 받아 쥐 뉴런 네트워크 6,7에 통합되었음을 보여줍니다. 이식편 유래 축삭은 수초화되어 경색 주위 영역, 뇌량 및 반대쪽 체성 감각 피질을 포함하여 쥐 뇌의 다른 영역에서 발견되었습니다. 가장 중요한 것은 iPS 세포 유래 이식이 뇌졸중 동물의 운동 장애를 역전시켰다는 것이다 7.
동물 모델이 이식 생존, 신경 통합, 이식된 세포가 운동 및 인지 기능에 미치는 영향을 연구하는 데 도움이 되더라도 인간 세포(이식편-숙주) 간의 상호 작용에 대한 정보는 이 시스템에서 누락되어 있습니다 8,9. 이러한 이유로, 인간 iPS 세포 유래 뉴런 전구체의 생체 외 이식과 함께 장기 인간 뇌 기관형 배양의 조합 방법이 여기에 기재되어 있다. 신경외과적 절제술을 통해 얻은 인간 뇌 기관형 배양은 생리학적으로 관련된 뇌의 3D 모델로, 연구자들이 인간 중추 신경계 회로에 대한 이해와 인간 뇌 질환 치료법을 테스트하는 가장 정확한 방법을 높일 수 있습니다. 그러나 이러한 맥락에서 충분한 연구가 이루어지지 않았으며, 대부분의 경우 인간 해마 뇌 기관형 배양이 사용되었습니다10,11. 대뇌 피질은 허혈성 뇌졸중12 또는 알츠하이머 병13과 같은 여러 신경 퇴행성 질환의 영향을 받기 때문에 지식을 넓히고 다양한 치료 전략을 테스트하고 검증 할 수있는 인간 피질 3D 시스템을 갖는 것이 중요합니다. 지난 몇 년 동안 여러 연구에서 성인 인간 피질(hACtx) 조직의 배양을 사용하여 인간 뇌 질환을 모델링했습니다 14,15,16,17,18,19; 그러나 줄기 세포 치료의 맥락에서 제한된 정보를 사용할 수 있습니다. 두 가지 연구가 이미 여기에 설명 된 시스템의 타당성을 입증했습니다. 2018년, 다양한 전사 인자로 프로그래밍되고 hACtx 조직에 이식된 인간 배아 줄기 세포는 성인 인간 피질 네트워크에 통합될 수 있는 성숙한 피질 뉴런을 생성하는 것으로 나타났습니다20. 2020년에 lt-NES 세포를 인간 기관형 시스템에 이식한 결과 기능적 뉴런의 전기생리학적 특성을 가진 성숙한 층별 피질 뉴런으로 분화할 수 있는 능력이 밝혀졌습니다. 이식된 뉴런은 성인 뇌 절편에서 인간 피질 뉴런과 구심성 및 원심성 시냅스 접촉을 모두 확립했으며, 이는 광견병 바이러스 역행 단시냅스 추적, 전체 세포 패치 클램프 기록 및 면역 전자 현미경에 의해 확증되었습니다21.
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Protocol
이 프로토콜은 스웨덴 룬드에 있는 지역 윤리 위원회(윤리 허가 번호 2021-07006-01)에서 승인한 지침을 따릅니다. 건강한 신피질 조직은 측두엽 간질에 대한 선택적 수술을 받는 환자로부터 얻었습니다. 모든 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.
참고: 얻은 모든 조직은 크기에 관계없이 처리되었습니다. 그러나 크기가 1-1.5mm3보다 작은 조직은 기술적으로 다루기가 어렵고 비브라톰으로 절편합니다.
1. 조직 수집, 유지 관리, 절단 및 도금
- 조직 슬라이싱 전날 준비
- 부피 플라스크에 2L의 절단 용액(표 1)을 준비합니다. MgCl 2 및 CaCl2를 제외한 모든 성분을 ~1,800mL의 탈이온수에 녹이고 카보겐 가스로 15분 동안 버블링합니다. 그런 다음 적절한 양의 1M MgCl 2 및 CaCl2 용액을 추가하고 15분 더 버블링을 계속합니다. 마지막으로 플라스크를 2L 표시까지 채웁니다. pH와 삼투압을 확인하고 필요한 경우 조정합니다. 제조된 용액 2 x 350 mL를 동결하고 나머지는 4°C에서 보관한다.
참고: pH와 삼투압은 일반적으로 각각 7.3-7.4 및 295-300mOsm입니다. - 100mL의 헹굼 용액을 준비합니다(표 2). 페니실린/스트렙토마이신 5mL가 보충된 HBSS 100mL에 HEPES 476mg과 포도당 200.6mg을 녹입니다. 4°C에서 최대 10일 동안 보관할 수 있습니다.
- 인간 성체 피질(hACtx) 배양액(hACtx 배지)(표 3)을 준비하고, 이를 통풍이 잘 되는 후드 하에 세포 배양 실험실에서 여과하였다. 배지는 페놀 레드가 없는 신경 배지(재료 표 참조), B27 보충제, L-글루타민(재료 표 참조) 및 겐타마이신을 포함합니다. 4 °C에서 최대 2주 동안 보관하세요.
- 부피 플라스크에 2L의 절단 용액(표 1)을 준비합니다. MgCl 2 및 CaCl2를 제외한 모든 성분을 ~1,800mL의 탈이온수에 녹이고 카보겐 가스로 15분 동안 버블링합니다. 그런 다음 적절한 양의 1M MgCl 2 및 CaCl2 용액을 추가하고 15분 더 버블링을 계속합니다. 마지막으로 플라스크를 2L 표시까지 채웁니다. pH와 삼투압을 확인하고 필요한 경우 조정합니다. 제조된 용액 2 x 350 mL를 동결하고 나머지는 4°C에서 보관한다.
- 조직 샘플이 도착하기 전에 수술 당일 준비
- 필요한 장비와 실험실 공간의 가용성을 확인하고 모든 수술 도구와 비브라톰( 재료 표 참조), 벤치탑 공간을 증류수(세제 제외)와 70% 에탄올로 철저히 청소합니다. 도구와 장비를 사용하기 전에 에탄올을 최소 30분 동안 건조시키십시오.
- 얼어붙은 절단 용액을 부수고 얼음과 액체의 "수프"에 카보겐 가스로 30분 동안 거품을 냅니다. 그런 다음 분쇄 된 용액 ''수프''로 용기 중 하나를 단단히 닫고 아이스 박스에 넣습니다. 이것은 수술실에서 조직을 수집하는 데 사용됩니다.
- 진동을 보정하고 절삭 매개변수를 설정합니다: 0.05mm/s 속도 및 1.7mm 진동. 커팅 챔버를 비브라톰 스테이지에 놓고 챔버가 -3 °C의 일정한 온도가되도록 연결된 냉각기를 시작합니다.
- 조직 조각과 절단 용액을 배치하기 위해 삽입물이 있는 슬라이스 수집 챔버를 준비하고 실온(RT)에서 카보겐 가스로 지속적으로 버블링합니다.
- 세포 배양 실험실과 통풍이 잘되는 후드 아래에서 집게를 사용하여 배양 삽입물을 6웰 플레이트에 넣습니다. 기포가 형성되지 않도록 멤브레인과 접촉할 때까지 인서트 하단에 hACtx 배지 5mL를 추가하고 인서트 상단에 2mL를 추가합니다. 조직 절편을 삽입물 내로 옮기기 전에 37°C 및 5%CO2 에서 적어도 2시간 동안 인큐베이터에서 평형을 이룬다.
- 조직 수집 및 슬라이싱 절차
- 절제 직후 수술실에 있는 환자의 조직을 가능하면 냉동, 기포 및 분쇄된 절단 용액이 담긴 용기에 직접 채취합니다. 얼음 위에 놓인 밀폐된 용기를 즉시 실험실의 절단 영역으로 옮깁니다.
- 조직을 검사하고 피질층의 방향을 고려하여 비브라톰의 절단 단계에 접착 할 최상의 표면을 찾습니다 (1.3.3 단계 참조). 필요한 경우 메스로 고르지 않은 표면을 잘라서 최적의 슬라이스 방향을 위해 조직을 스테이지에 쉽게 놓을 수 있도록 합니다.
- 티슈를 티슈 접착제로 스테이지에 붙이고( 재료 표 참조), 슬라이싱 챔버에 넣은 다음 즉시 챔버를 콜드 버블 절단 용액으로 채웁니다. 전체 절단 절차 동안 버블링을 계속합니다.
- 조직-칼날 방향에 따라 관상 또는 시상 조각을 300μm 두께로 절단하여 모든 피질층과 가능한 경우 백질을 포함합니다. RT에서 버블링 절단 용액이 있는 수집 챔버에 슬라이스를 놓습니다.
참고: 백질 쪽에서 피질 표면을 향해 자릅니다. 조직이 손상될 수 있으므로 수막을 제거하지 마십시오. 절단 날은 일반적으로 쉽게 절단됩니다. - 모든 조직이 절단되면 RT에서 헹굼 용액과 함께 멸균 페트리 접시에 슬라이스를 옮기고 세포 배양 실험실로 운반합니다. 이 단계는 배양 플레이트로 옮기기 전에 조각에서 과도한 자당을 제거하는 데 필요합니다.
알림: 슬라이스를 옮기려면(이 단계와 다음 단계에서) 거꾸로 된 유리 피펫을 사용하고 더 얇은 부분을 떼어낸 다음 흡입을 위해 고무 젖꼭지를 놓습니다.
- hACtx 조직 절편의 배양 및 유지
- 이미 젖고 물에 잠긴 인서트 위에 조직 조각을 개별적으로 놓습니다. 24시간 후, 배지를 교체하여 절단 절차에서 남아 있는 자당 또는 기타 잔류 물질을 추가로 제거합니다.
- 배양 배지를 7일마다 새로운 배지로 교체하십시오. 2주 후, 겐타마이신이 없는 hACtx 배지를 사용한다. 문화는 최대 2 개월 동안 유지 될 수 있습니다.
참고: 배지 교체 전 최소 2시간 동안 37°C 및 5% CO2 에서 배양기에서 hACtx 배지를 평형화합니다. 신선한 배지는 2 주마다 준비해야합니다. 2-3일마다 슬라이스를 확인하고 일부 매체가 증발한 경우 인서트 상단에 더 추가합니다.
| 절단 솔루션 | 재고 농도 | 최종농도 [mM] | 1L 당 |
| 자당 | 가루 | 200 | 68.46 그램 |
| 나코3 | 가루 | 21 | 1.76 그램 |
| 케이씨엘 | 가루 | 3 | 0.22 그램 |
| NaH2PO4 | 가루 | 1.25 | 0.17 그램 |
| 포도당 | 가루 | 10 | 1.80 그램 |
| 마그네슘4 | 1 미터 | 2 | 2 밀리리터 |
| CaCl2 | 1 미터 | 1.6 | 1.6 밀리리터 |
| 마그네슘2 | 2 미터 | 2 | 1 mL |
표 1: 절단 용액의 구성. MgCl2 및CaCl2는 탈이온수에서 미리 준비된 1M 용액으로 사용됩니다.
| 헹굼 용액 | 재고 농도 | 최종 농도 | 100mL당 |
| 증권 시세 표시기 | 1배 | 95 mL | |
| 펜스트렙 | 10,000 U/mL | 500 U/mL | 5 mL |
| 헤페스 | 가루 | 4.76g/리터 | 476의 mg의 |
| 포도당 | 가루 | 2g/리터 | 200.6의 mg의 |
표 2 : 헹굼 용액의 조성.
| hACtx 매체 | 재고 농도 | 최종 농도 | 100mL당 | |
| 페놀 레드가 없는 신경 배지 | 97.4 mL의 | 재료 표 참조 | ||
| 나27 | 50배 | 1:50 | 2 밀리리터 | |
| L-글루타민 | 100배 | 1:200 | 500 μL | 재료 표 참조 |
| 겐타마이신 | 50 밀리그램/mL | 1:1000 | 100 μL |
표 3: hACtx 배지의 조성.
2. lt-NES 세포의 증식 및 분화
참고: Lt-NES 세포는 앞서 설명한 바와 같이 생성되고,21,22 구성적 프로모터(GFP-lt-NES 세포) 하에 녹색 형광 단백질(GFP)을 운반하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입됩니다. 3 x 106 세포를 함유하는 바이알은 사용 전까지 -150°C에서 보관된다.
- 원액 및 배지 준비
- 100μg의 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 PBS-0.1% BSA 10mL에 희석하여 스톡 농도가 10μg/mL가 되도록 합니다. 100 μL 분취량을 준비합니다.
- PBS-0.1% BSA 10mL에 표피 성장 인자(EGF) 100μg을 희석하여 스톡 농도가 10μg/mL가 되도록 합니다. 100 μL 분취량을 준비합니다.
- 분취량 당 100 μL의 부피로 분취량 50x B27 보충.
- 100mg의 폴리-L-오르니틴을 탈이온수 100mL에 희석하여 스톡 농도가 100μg/mL가 되도록 합니다. 1mL 분취량을 만듭니다.
- 1.20mg/mL 마우스 라미닌 30μL 분취액을 준비합니다.
- 10mL의 트립신-EDTA(0.25%)를 90mL의 PBS에 0.025%의 스톡 농도로 희석합니다. 1mL 분취량을 준비합니다.
- 트립신 억제제 0.025g을 PBS 50mL에 0.5mg/mL의 스톡 농도로 희석합니다. 1mL 분취량을 준비합니다.
- 10μg의 Wnt3a(날개 없는 유형 MMTV 통합 부위 패밀리 구성원 3A)를 PBS-0.1% BSA 1mL에 희석하여 스톡 농도가 10μg/mL가 되도록 합니다. 같은 방법으로 BMP4 (뼈 형태 형성 단백질 4)를 준비하십시오. 100 μL 부피의 분취량.
- 1mg의 시클로파민을 2.5mL의 DMSO에 희석하여 최종 농도 400μg/mL로 만들고 100μL 분취량을 만듭니다.
- 염기성 배지(표 4)와 분화 정의 배지(DDM, 표 5)를 준비하고 4°C에서 최대 2주 동안 보관합니다.
- 문화 접시의 코팅
- 증식 또는 분화 중에 GFP-It-NES 세포를 배양하기 위해 접시를 미리 코팅하려면 폴리-L-오르니틴을 탈이온수에 1:100으로 희석하고 용액 5mL를 T25 플라스크에 추가합니다. RT에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 폴리-L-오르니틴 코팅 플레이트를 탈이온수로 1x, PBS로 1x로 세척합니다.
- 증식 중인 GFP-It-NES 세포의 경우 마우스 라미닌을 PBS에서 1:500으로 희석하고 37°C에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 분화 중인 GFP-It-NES 세포의 경우 마우스 라미닌을 PBS에서 1:100으로 희석하고 37°C에서 최소 2시간 동안 배양합니다.
- GFP-lt-NES 세포의 증식
- 5mL(세척용)와 5mL(파종용)의 염기성 배지를 두 개의 서로 다른 15mL 튜브에 담아 따뜻하게 합니다.
- GFP-lt-NES 세포 바이알 하나를 37°C에서 빠르게 해동하고, 세척 튜브로 옮기고, 300 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.
- 펠릿을 건드리지 않고 배지를 조심스럽게 흡인하고 예열된 기본 배지 1mL에 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 EGF(10ng/mL), bFGF(10ng/mL) 및 B27(10ng/mL)과 같은 증식 인자로 보충된 염기성 배지가 들어 있는 파종 튜브로 옮깁니다. 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅된 T25 플라스크에 세포를 시드합니다.
- 매일 세포에 증식 인자를 공급하십시오. 매체가 노란색으로 바뀌면 교체하십시오. 세포를 3일 또는 4일마다 통과시킵니다(100% 밀도에 도달한 후 1일).
- 증식 및 분화를 위한 GFP-lt-NES 세포 분할
- 플라스크당 5mL의 기본 배지(세포 수집용)와 다시 시드하는 데 필요한 총 부피를 미리 예열합니다.
참고: 계대배양은 세포의 증식을 유지하기 위해 1:3 희석으로 이루어지며, 15mL의 염기성 배지가 필요하고, 분화를 시작하기 위해 1:6 희석으로 이루어지며, 30mL의 염기성 배지가 필요합니다. - 흡인에 의해 세포 배양 플라스크로부터 배지를 제거하고, 예열된 0.025% 트립신 500 μL를 첨가한다. RT에서 5-10 분 동안 배양하십시오. 세포의 분리는 10x 배율의 표준 광학 현미경으로 확인할 수 있습니다.
- 같은 부피의 트립신 억제제(최종 농도 0.5mg/mL)를 추가한 다음 따뜻한 염기성 배지 5mL를 추가합니다. 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 분리하고 수집합니다. 세포를 15mL 튜브로 옮기고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다 .
- 세포를 증식 상태로 유지하려면 증식 인자가 보충된 새로운 염기성 배지에서 1:3 희석으로 다시 도금하고 2.3.4단계를 반복합니다.
- 플라스크당 5mL의 기본 배지(세포 수집용)와 다시 시드하는 데 필요한 총 부피를 미리 예열합니다.
- GFP-lt-NES 세포의 피질 분화
- 0일째에 증식 인자가 보충된 염기성 배지 30mL에 세포(분화에 사용됨)를 재현탁하고 분화 코팅된 T25 플라스크 6개(분할 1:6)에 플레이트합니다.
- 1일째에 배지의 절반을 DDM으로 변경하고 농도의 절반에 증식 인자를 추가합니다.
- 2일째에 배지를 분화 인자인 BMP4(10ng/mL), Wnt3a(10ng/mL) 및 시클로파민(400ng/mL)이 보충된 DDM으로 완전히 변경합니다.
- 4일차에는 미분 요인만 추가합니다. 매체가 노란색으로 바뀌면 교체하십시오.
- 6일째에 배지를 BMP4 및 Wnt3a가 보충된 DDM으로 변경합니다. 사이클로파민은 이 단계에서 제거된다.
- 7일째에 2.4.2단계와 2.4.3단계에서 설명한 대로 셀을 분리합니다.
| 베이직 미디엄 | 재고 농도 | 최종 농도 | 100mL당 |
| L-글루타민이 포함된 DMEM/F12 | 1배 | 98.7 mL의 | |
| N-2 보충제 | 100배 | 1:100 | 1 mL |
| 포도당 | 45% | 3.5mL/L | 350 μL |
표 4: lt-NES 세포의 증식 배지(염기성 배지)의 조성.
| DDM 매체 | 재고 농도 | 최종 농도 | 100mL당 |
| L-글루타민이 포함된 DMEM/F12 | 96 mL의 | ||
| N2 | 100 배 | 1:100 | 1 mL |
| 네아 | 100 배 | 1:100 | 1 mL |
| 소듐 피루브산 | 100 밀리엠 | 1:100 | 1 mL |
| BSA V 분획 | 7.5% | 6.6mL/L | 660 μL |
| 2-메르캅토에탄올 | 50 나노미터 | 7 μL/L | 0.7 μL |
| 포도당 | 45% | 3.2mL/L | 320 μL |
표 5: lt-NES 세포의 분화 정의 배지(DDM)의 조성.
3. GFP-lt-NES 세포를 기관형 hACtx 슬라이스로 이식
참고: hACtx 조직은 세포 이식 전 1주일 동안 배양해야 합니다. 이식 절차를 용이하게하기 위해, 조직이 부유하는 것을 방지하기 위해 삽입물의 상단에서 2 mL의 hACtx 배지를 제거 할 필요가있다.
- 피질로 프라이밍된 GFP-lt-NES 세포(2.5.6단계부터)를 1 x 105 cells/μL의 농도로 차가운 순수 기저막 매트릭스(재료 표 참조)에 재현탁하고 용액을 더 작은 멸균 튜브로 옮깁니다.
참고: 이식 절차 중에 모든 재료(피펫 팁, 튜브, 모세관 등)는 겔 응고를 방지하기 위해 미리 냉각되어야 합니다. 사용하기 전에 기저막 매트릭스 젤을 얼음에서 30분 동안 해동합니다. - 흡입을 위해 고무 젖꼭지에 연결된 차가운 유리 모세관에 세포 현탁액을 수집합니다. 세포 현탁액을 작은 방울(각각 약 1μL)로 주입하여 반건조 조직 조각을 다양한 부위에 찔러 넣습니다.
- 겔이 고형화될 때까지 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이터에서 후드로 플레이트를 다시 옮기고 인서트 상단에 hACtx 배지 2mL를 조심스럽게 추가하여 조직을 완전히 잠급니다.
- 일주일에 한 번 배양 배지를 신선한 hACtx 배지로 교체하십시오.
4. 검증
- hACtx 슬라이스의 염색
- 원하는 시점에서, 세포 배양 실험실에서 슬라이스를 꺼내고, PBS가 함유된 페트리 접시에 담가 삽입물로부터 제거한다. 그런 다음 반전 유리 피펫(단계 1.3.5의 참고 참조)을 사용하여 슬라이스를 염색 바이알로 옮기고 4°C에서 밤새 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정합니다.
- 매번 KPBS로 15분 동안 3x 헹구고, 투과화 용액(KPBS 중 0.02% BSA 및 1% Triton X-100)으로 4°C에서 밤새 배양합니다.
- 다음날, 블로킹 용액(0.2% 트리톤 X-100, 1% BSA, 아지드화나트륨[1:10,000] 및 10% 정상 당나귀 혈청을 함유한 KPBS)을 첨가하고 4°C에서 밤새 배양한다.
- 블로킹 후, 블로킹 용액에 희석된 1차 항체(희석에 대해서는 표 6 참조)를 추가하고, 4°C에서 48시간 동안 인큐베이션한다.
- 세럼을 첨가하지 않고 블로킹 용액으로 각각 15분 동안 3회 세척합니다. 블로킹 용액에 희석된 2차 항체를 추가하고(희석에 대해서는 표 6 참조), 4°C에서 48시간 동안 인큐베이션한다.
- 혈청 없이 블로킹 용액으로 3x 세척하고 투과화 용액(1:1,000)에 희석된 Hoechst 염색에서 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
- KPBS로 3 번 씻고 페인트 브러시를 사용하여 유리 슬라이드에 슬라이스를 장착 한 다음 건조시킵니다. 마지막으로 슬라이드를 탈이온수로 헹구고 여분의 물을 제거하고 장착 매체를 추가하고 유리 커버슬립으로 덮습니다. 슬라이드를 RT에서 최소 24시간 동안 보관하고 이미징될 때까지 4°C에서 보관합니다.
참고: 핵 에피토프를 표지하는 항체의 경우 65°C에서 2시간 동안 구연산나트륨(10mM, pH 6.0)으로 투과화(단계 4.1.2) 전에 항원 검색을 수행합니다.
- 전체 셀 패치 클램프
- 기록 당일, 인간의 뇌 환경에 더 잘 맞도록 변형된 인간 인공 뇌척수액(haCSF) 1L를 준비합니다(표 7). 절단 용액과 유사하게, CaCl 2를 제외한 모든 성분을 탈 이온수에 용해시킨 약 900mL의 용액을 만들고, 적절한 부피의 1M CaCl2 용액을 첨가하기 전에 15 분 동안 카보겐으로 버블링한다. 부피 플라스크를 1L 표시까지 채우고 기록을 시작하기 전과 실험 내내 추가로 15분 동안 RT에서 버블링을 계속합니다.
- 조직 조각을 배양 플레이트에서 2mL/분의 관류 속도로 버블링된 haCSF로 지속적으로 관류되고 수조 온도 조절기를 사용하여 34°C로 가온되는 직립 현미경의 무대에 있는 기록 챔버로 옮깁니다.
- 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 평균 저항 3-5MΩ으로 당기고, 기록된 세포의 사후 식별을 위해 새로 첨가된 2-4mg의 바이오시틴으로 K-글루코네이트 기반 내부 용액(표 8)으로 모세관을 다시 채웁니다. 이 내부 용액의 pH와 삼투압은 각각 7.2-7.3 및 285-295mOsm입니다.
- 숙주 세포 기록의 경우, 4x 대물렌즈로 슬라이스를 대략적으로 살펴보고, 40x 대물렌즈로 패치할 건강해 보이는 셀을 찾습니다. 그런 다음 표준 전체 셀 패치 클램프로 진행합니다.
- 이식 세포 기록의 경우, 이식편에서 GFP 리포터 발현에 의해 청색 범위(460 nm)의 4x 목적 및 에피형광 필터를 사용하여 이식된 세포로 조직 면적을 식별하였다. 그런 다음 40x 대물렌즈로 위치한 영역을 확대하고 표준 전체 세포 패치 클램프에 대해 GFP를 발현하는 이식된 세포를 찾습니다.
- 셀에 침입한 직후 휴지막 전위(RMP)를 확인하고 녹음 품질이 좋은지 확인하십시오. 관심 있는 모든 파라미터(예: 멤브레인 저항[Ri], AP 파라미터, 나트륨 및 칼륨 전류, 시냅스 활성)를 전체 셀 전압 또는 전류 클램프 구성으로 기록합니다.
- 필요한 모든 데이터를 수집한 후, 세포를 더 이상 손상시키지 않고 기록 피펫을 조심스럽게 집어넣어 사후 면역염색으로 식별할 수 있도록 합니다.
- 4.1 단계에 설명된 대로 추가 고정 및 염색을 위해 슬라이스를 4% PFA 용액으로 옮깁니다. 스트렙타비딘은 기록 중에 바이오시틴으로 채워진 세포를 면역표지하는 데 사용됩니다.
| 항 체 | 희석 | 노트 |
| 본래의 | ||
| 치킨 안티 GFP | 1:1000 | |
| 치킨 안티 MAP2 | 1:1000 | |
| 염소 항 -AiF1 | 1:100 | |
| 마우스 안티 MBP | 1:1000 | 항원 회수 필요 |
| 마우스 안티-SC123 | 1:2000 | |
| 토끼 안티 NeuN | 1:1000 | |
| 토끼 anti-Olig2 | 1:500 | |
| 토끼 항-TMEM119 | 1:200 | |
| 보조 | ||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | 1:500 | |
| 488 접합 AffinityPure 당나귀 항토끼 IgG | 1:500 | |
| 488 결합 AffinityPure 당나귀 안티 치킨 IgG | 1:500 | |
| Cy3 공액 친화력순수 당나귀 안티 치킨 IgG | 1:500 | |
| Cy3 결합 친화력순수 당나귀 항염소 IgG | 1:500 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | 1:500 | |
| Alexa fluor 647 복합 스트렙타비딘 | 1:500 |
표 6: 면역조직화학을 위한 1차 및 2차 항체 목록.
| haCSF | 재고 농도 | 최종농도 [mM] | 1L 당 |
| 염화나트륨(NaCl) | 가루 | 129 | 7.54 그램 |
| 나코3 | 가루 | 21 | 1.76 그램 |
| 포도당 | 가루 | 10 | 1.80 그램 |
| 케이씨엘 | 가루 | 3 | 0.22 그램 |
| NaH2PO4 | 가루 | 1.25 | 0.17 그램 |
| 마그네슘4 | 1 미터 | 2 | 2 밀리리터 |
| CaCl2 | 1 미터 | 1.6 | 1.6 밀리리터 |
표 7: 인공 뇌척수액(haCSF)의 조성.
| K-글루코네이트 내부 용액 | 재고 농도 | 최종농도 [mM] | 100mL당 |
| K-글루코네이트 | 가루 | 122.5 | 2.87 그램 |
| 케이씨엘 | 가루 | 12.5 | 93.18의 mg의 |
| 염화나트륨(NaCl) | 가루 | 8 | 46.76 밀리그램 |
| 헤페스 | 가루 | 10 | 238.32 밀리그램 |
| 마그네슘 ATP | 가루 | 2 | 101.4의 mg의 |
| Na3GTP (나3GTP) | 가루 | 0.3 | 17.0의 mg의 |
| 메모: KOH/HCl로 pH 조정 | |||
표 8: K-글루콘산계 내부 용액의 조성.
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Representative Results
기술된 프로토콜에 따라, 측두엽 간질이 있는 환자로부터의 hACtx 조직을 상기 설명된 바와 같이 수집 및 처리하였다. 몇 개의 슬라이스를 숙주 조직의 시작점을 연구하기 위해 배양 24시간 후에 고정시켰다. 뉴런(NeuN 및 Map2 발현, 그림 1A), 희소돌기아교세포(Olig2 및 MBP, 그림 1B) 및 성상교세포(인간 특이적 GFAP, STEM123이라고도 함, 그림 1C)와 같은 다양한 신경 세포 집단을 분석한 결과 조직의 최적 보존이 나타났습니다.
다음 단계는 배양 조건이 인간 조직의 신경 생존력에 어떤 영향을 미치는지 연구하는 것이었습니다. 이를 위해, 배양 2주 후에 NeuN 및 Map2의 염색을 수행하였다. 연구된 시점에서, 이들 두 뉴런 마커의 발현은 여전히 조직에 존재하였다(도 2A). 또한 기능을 평가하기 위해 전기생리학적 기록이 수행되었습니다. 전체 세포 패치 클램프를 사용한 기록은 뉴런이 급성 제제21,23의 뉴런과 비교할 수 있는 RMP(평균 -70mV) 및 막 입력 저항(Ri)(평균 300MΩ)을 유지했음을 보여주었습니다. 전반적으로, 세포는 신선한 조직에서보다 약간 덜 활동적이었지만 대부분의 세포는 여전히 적어도 하나(그림 2B-E), 다중은 아니더라도 활동 전위(AP, 그림 2F-I)를 발화할 수 있었고 전압 클램프 모드에서 스텝 전류 주입시 빠른 내부 나트륨 및 느린 외부 칼륨 전류가 존재했습니다(그림 2C-E, G-I)입니다. 종합하면, 이러한 기록은 기관형 배양의 뉴런이 비교적 건강하고 전형적인 신경생리학적 고유 특성을 나타냄을 나타냅니다.
또한, 미세아교세포 활성화에 대한 배양의 효과는 24시간(도 3A) 및 2주 배양(도 3B) 조직에서 Tmem119 및 Iba1 염색에 의해 평가되었다. 예상대로, 소교 세포 모양의 약간의 변화가 관찰되었다. 배양 2주 후, 그들은 급성 조직에 비해 덜 파쇄되고 더 활성화된 형태를 획득했습니다.
숙주조직을 특성화한 후, lt-NES 세포 유래 전구체의 이식을 다음과 같이 수행하였다. GFP-lt-NES 세포를 7일 동안 분화시키고 1주일간 배양한 hACtx 조직에 접목하였다(도 4A). GFP를 사용한 면역조직화학을 사용하여 이식의 개요를 관찰했습니다(그림 4B,C). 결과는 절제와 도금 사이의 시간이 더 길기 때문에 잘 보존되지 않은 조직의 이전 이식 결과와 비교되었습니다. 이미지는 최적의 시스템에서 생체 외 이식 4주 후 이식된 GFP-lt-NES 세포가 전체 기관형 배양에 걸쳐 확장된 신경돌기와 광범위하고 복잡한 수목화를 나타냈음을 보여줍니다(그림 4B). 잘 보존되지 않은 조직은 열악한 숙주 연결성으로 인해 성공적인 이식을 허용하지 않았습니다. 이식된 세포는 거의 살아남지 못했습니다. 또한, 죽은 세포에 대한 항체의 파편 및 비특이적 표지가 인간 절편 전체에서 광범위하게 관찰되었습니다(그림 4C).
이식된 세포의 전기생리학적 특성과 관련하여, 성공적인 이식의 경우, 세포는 형태학적으로뿐만 아니라 기능적으로 활성이 있는 성숙한 뉴런, 반복적이고 종종 자발적인 AP, 빠른 내부 나트륨 및 느린 외부 칼륨 전류, 그리고 이식 후 4주 후에 이식편과 숙주 조직의 기능적 통합을 나타내는 일정 수준의 시냅스 활성을 나타냅니다(그림 4D-H).
그림 1: 배양 24시간 후 hACtx 조직의 다양한 세포 집단 특성화. (A) 뉴런(NeuN 및 Map2 발현), (B) 희소돌기아교세포(Olig2 및 MBP) 및 (C) 성상교세포(인간 특이적 GFAP[STEM123])의 존재를 보여주는 hACtx 조직의 대표적인 공초점 이미지. 핵 염색 (Ho : Hoechst, blue)은 개별 및 병합 패널에 포함된다. 스케일 바 = 20 μm. 흰색 화살표는 colocalization을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 기관형 배양에서 2주 후 hACtx 뉴런의 특성화 및 전기생리학적 특성. (A) NeuN 및 Map2 발현을 보여주는 hACtx 조직의 대표적인 공초점 이미지. (나-I) 2주령 hACtx 조직에서 기록된 피질 뉴런의 예. (나, 에프) 병합된 패널에 포함된 핵 염색(Ho: Hoechst, 파란색)과 함께 기록된 뉴런(빨간색)의 바이오시틴 표지. 스케일 바 = 20 μm. (C-E) 단일 또는 (G-I) 다중 AP가 있는 셀의 예를 보여주는 전체 셀 패치 클램프 기록 추적. AP는 (C,G) 250pA 단계 또는 (D,H) RMP에서 0 - 300pA 램프 전류 주입에 의해 유도되었습니다. 인셋은 각 경우에 AP 중 하나의 확대 보기를 나타냅니다. (E,나) 내부 나트륨 및 외부 칼륨 전류는 전압 클램프 모드에서 10mV 단위로 -70mV에서 적용된 전압 탈분극 단계에서 두 전지 예에서 관찰되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: hACtx 조직에서 미세아교세포 집단의 특성화. (A) 24시간 및 (B) 2주 배양 후 Iba1 및 Tmem119의 발현을 보여주는 hACtx 조직의 공초점 이미지. 핵 염색 (Ho : Hoechst, blue)은 개별 및 병합 패널에 포함된다. 스케일 바 = 20 μm. 흰색 화살표는 colocalization을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: GFP-lt-NES 세포의 생체 외 이식 4주 후 lt-NES 세포 유래 뉴런의 개요 및 전기생리학적 특성 . (A) 실험 설계. 차이 = 차별화. (나,씨) (B) 잘 보존되고 (C) 잘 보존되지 않은 hACtx 조직에서 이식된 GFP-lt-NES 세포의 대표적인 공초점 사진. 스케일 바 = 50 μm. (D) 자발적으로 AP를 발사하는 이식편 유래 뉴런의 흔적 예. 삽입은 AP 중 하나의 확대 보기를 나타냅니다. 반복적인 AP는 -70mV의 전위로부터 탈분극 전류의 (E) 단계(50pA) 또는 (F) 램프(0 - 300pA) 주입에 의해 유도될 수 있습니다. (G) 내부 나트륨 및 외부 칼륨 전류는 -70mV의 유지 전위에서 전압 클램프 모드에서 10mV 탈분극 단계에 의해 유도되었습니다. (H) 전압 클램프 모드에서 -70mV의 유지 전위에서 이식편 유래 뉴런에서 자발적인 시냅스 후 전류(sPSC)가 관찰될 수 있습니다. 삽입물은 확대된 view일부 sPSC의 view. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
충분히 높은 품질의 hACtx 슬라이스를 얻는 것이 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. 피질 조직은 절제 수술을 받는 간질 환자로부터 얻어진다24. 절제된 조직의 품질과 절제와 배양 사이의 조직 노출 시간은 매우 중요합니다. 조직이 수술실에서 실험실로 더 빨리 옮겨지고 절단될수록 기관형 배양이 더 최적화됩니다. 이상적으로는 조직을 절단하여 수집 후 처음 몇 시간 이내에 세포 배양 실험실로 옮겨야 합니다. 이 과정에서 조직의 산소 공급은 또한 슬라이스의 품질을 향상시킵니다. 이와 관련하여, 조직 샘플이 클수록, 코어에 도달하는 산소의 농도가 낮아지고, 따라서 조직이 시간 내에 절단되지 않으면 생존력이 낮아진다. 숙주 조직의 품질이 최적이 아닌 경우 줄기 세포 치료의 검증이 불가능합니다.
피질 조직이 인간의 뇌에서 판으로 옮겨질 때 몇 가지 제한 사항을 고려해야 합니다. 절단 과정에서 많은 수의 축삭이 해부되어 미세아교세포(microglia) 활성화와 같은 염증 과정을 유발하는 신경 손상을 유발한다25. 이러한 이유로, 조직이 인간의 뇌에 위치할 때 건강한 것으로 간주되더라도, 기관 유형 섹션26,27의 절제 및 준비 중에 겪는 부분적인 손상으로 인해 배양 중인 세포 행동이 다를 수 있습니다. 미세아교세포 개체군의 변화는 방출된 사이토카인 수준의 측정 또는 형태학적 변화의 평가를 포함한 다양한 기술을 사용하여 모니터링할 수 있다28. 중요하게도, 전체 장기에서 생체 외 배양 조건으로의 환경 변화의 결과로 배양 2주째에 미세아교세포 활성화가 관찰되었지만, 뉴런 염색 및 전기생리학적 특성 분석에서 알 수 있듯이 뉴런은 이 시점에서 여전히 생존 가능했습니다. 두꺼운 조직 조각이 더 잘 보존됩니다. 그러나 슬라이스의 안쪽 부분으로 영양분이 침투하여 부분적인 조직 사멸을 초래합니다. 이러한 이유로 300μm는 기관형 배양을 위한 최적의 두께입니다.
hACtx 조직의 유기형 배양은 오가노이드 또는 스페로이드와 같은 다른 3D 배양 방법에 비해 분명한 이점이 있습니다. 그 근원은 완전히 발달된 인간의 뇌이며, 이는 세포 및 매트릭스 환경뿐만 아니라 상이한 세포 집단의 성숙 상태가 성인 인간의 뇌에서 일반적으로 발견되는 것과 동일하다는 것을 의미한다25,29,30. 오가노이드는 태아 조직과 더 유사하며, 이는 발달 장애 모델링과 같은 일부 연구 분야에는 최적이지만31 예를 들어 주로 성인 인구에 영향을 미치고 발병이 늦은 신경퇴행성 질환 연구에는 최적이 아니다32,33. 가장 중요한 것은 인간 조직의 기관형 배양이 현재까지 세포 치료의 검증을 허용하는 유일한 인간 시스템이라는 것입니다.
신경퇴행성 질환에서 신경세포 대체를 위한 줄기세포 이식에 대한 대부분의 지식은 생체 내 동물 모델링에서 파생됩니다. 이러한 시스템이 손상된 숙주 회로에서 이식된 세포의 조절 효과를 평가하는데 매우 유용하지만, 불행하게도, 이 설정에서 시험된 치료법은 설치류와 인간 사이의 명확한 차이로 인해 임상으로 번역될 때 일반적으로 실패한다34. 이러한 이유로, hACtx 조직의 기관형 배양은 인간 신경 집단과 인간 뇌 구조의 보존 사이의 상호 작용을 연구할 수 있는 가능성으로 인해 피질에 영향을 미치는 인간 신경퇴행성 질환을 모델링하기 위한 탁월한 전략이다25.
요약하면, 성인 인간 피질의 장기 기관형 배양과 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 전구체의 생체 외 피질 이식의 결합된 방법론은 줄기 세포 기반 치료법의 검증을 위한 유망한 전략이며, 이는 손상된 뇌의 기능 회복을 자극하기 위한 신경 대체 전략의 임상 번역을 촉진할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 스웨덴 연구 위원회(Swedish Research Council), 스웨덴 뇌 재단(Swedish Brain Foundation), 스웨덴 뇌졸중 재단(Swedish Stroke Foundation), 스코네(Skåne) 지역, 토르스텐 및 엘사 세게르팔크 재단(Thorsten and Elsa Segerfalk Foundation), 스웨덴 정부의 전략 연구 분야 이니셔티브(StemTherapy)의 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Cutting and electrophysiology | |||
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
| Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
| Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2x91 | |
| Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
| Plastic Petri dish | Any suitable | ||
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
| Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| RINSING SOLUTION | |||
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
| Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| Forceps | Any suitable | ||
| Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
| GENERATION OF lt-NES cells | |||
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
| Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
| Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
| Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
| Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
| Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
| Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
| T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
| Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
| Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
| Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
| Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
| Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
| Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
| Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
| Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
| Paint brush | Any suitable | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
| Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
| Distilled water | |||
| Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
| Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
| Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
| Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium citrate | |||
| Distilled water | |||
| Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
| Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
| Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
References
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