Summary
Questo protocollo descrive colture organotipiche a lungo termine di corteccia umana adulta combinate con trapianto intracorticale ex vivo di progenitori corticali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte, che presentano una nuova metodologia per testare ulteriormente terapie basate su cellule staminali per malattie neurodegenerative umane.
Abstract
Le malattie neurodegenerative sono comuni ed eterogenee in termini di sintomi e affettività cellulare, rendendo il loro studio complicato a causa della mancanza di modelli animali adeguati che imitano completamente le malattie umane e della scarsa disponibilità di tessuto cerebrale umano post-mortem. La coltura del tessuto nervoso umano adulto offre la possibilità di studiare diversi aspetti dei disturbi neurologici. I meccanismi molecolari, cellulari e biochimici potrebbero essere facilmente affrontati in questo sistema, così come testare e convalidare farmaci o trattamenti diversi, come le terapie cellulari. Questo metodo combina colture organotipiche a lungo termine della corteccia umana adulta, ottenute da pazienti epilettici sottoposti a chirurgia resettiva, e trapianto intracorticale ex vivo di progenitori corticali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte. Questo metodo consentirà lo studio della sopravvivenza cellulare, della differenziazione neuronale, della formazione di input e output sinaptici e delle proprietà elettrofisiologiche delle cellule derivate dall'uomo dopo il trapianto in tessuto corticale umano adulto intatto. Questo approccio è un passo importante prima dello sviluppo di una piattaforma 3D di modellazione delle malattie umane che avvicinerà la ricerca di base alla traduzione clinica delle terapie basate su cellule staminali per pazienti con diversi disturbi neurologici e consentirà lo sviluppo di nuovi strumenti per la ricostruzione dei circuiti neurali danneggiati.
Introduction
I disturbi neurodegenerativi, come il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer o l'ictus ischemico, sono un gruppo di malattie che condividono la caratteristica comune del malfunzionamento o della morte neuronale. Sono eterogenei in termini di area cerebrale e popolazione neuronale interessata. Sfortunatamente, i trattamenti per queste malattie sono scarsi o di efficacia limitata a causa della mancanza di modelli animali che imitano ciò che accade nel cervello umano 1,2. La terapia con cellule staminali è una delle strategie più promettenti per la rigenerazione cerebrale3. La generazione di progenitori neuronali da cellule staminali provenienti da diverse fonti è stata notevolmente sviluppata negli ultimi anni 4,5. Recenti pubblicazioni hanno dimostrato che cellule staminali pluripotenti (iPS) derivate da cellule staminali neuroepiteliali autorinnovanti (lt-NES) derivate da cellule staminali neuroepiteliali autorinnovanti umane, seguendo un protocollo di differenziazione corticale e dopo trapianto intracorticale in un modello di ratto con ictus ischemico che colpisce la corteccia somatosensoriale, generano neuroni corticali maturi. Inoltre, i neuroni derivati dall'innesto hanno ricevuto connessioni sinaptiche afferenti ed efferenti dai neuroni ospiti, mostrando la loro integrazione nella rete neuronale del ratto 6,7. Gli assoni derivati dall'innesto erano mielinizzati e trovati in diverse aree del cervello del ratto, tra cui l'area peri-infartuale, il corpo calloso e la corteccia somatosensoriale controlaterale. Ancora più importante, il trapianto derivato da cellule iPS ha invertito i deficit motori negli animali colpiti da ictus7.
Anche se i modelli animali aiutano a studiare la sopravvivenza del trapianto, l'integrazione neuronale e l'effetto delle cellule innestate sulle funzioni motorie e cognitive, inquesto sistema mancano informazioni sull'interazione tra cellule umane (graft-host) 8,9. Per questo motivo, viene descritto un metodo combinato di coltura organotipica del cervello umano a lungo termine con il trapianto ex vivo di progenitori neuronali derivati da cellule iPS umane. Le colture organotipiche del cervello umano ottenute da resezioni neurochirurgiche sono modelli 3D fisiologicamente rilevanti del cervello che consentono ai ricercatori di aumentare la loro comprensione dei circuiti del sistema nervoso centrale umano e del modo più accurato di testare i trattamenti per i disturbi cerebrali umani. Tuttavia, non sono state fatte abbastanza ricerche in questo contesto e, nella maggior parte dei casi, sono state utilizzate colture organotipiche del cervello ippocampale umano10,11. La corteccia cerebrale è affetta da diverse malattie neurodegenerative, come l'ictus ischemico12 o il morbo di Alzheimer13, quindi è importante avere un sistema 3D corticale umano che ci permetta di espandere le nostre conoscenze e di testare e convalidare diverse strategie terapeutiche. Diversi studi negli ultimi anni hanno utilizzato colture di tessuto corticale umano adulto (hACtx) per modellare le malattie del cervello umano 14,15,16,17,18,19; Tuttavia, sono disponibili informazioni limitate nel contesto della terapia con cellule staminali. Due studi hanno già dimostrato la fattibilità del sistema qui descritto. Nel 2018, le cellule staminali embrionali umane programmate con diversi fattori di trascrizione e trapiantate nel tessuto hACtx hanno dimostrato di dare origine a neuroni corticali maturi che potrebbero integrarsi nelle reti corticali umane adulte20. Nel 2020, il trapianto di cellule lt-NES nel sistema organotipico umano ha rivelato la loro capacità di differenziarsi in neuroni corticali maturi e stratificati specifici con le proprietà elettrofisiologiche dei neuroni funzionali. I neuroni innestati hanno stabilito contatti sinaptici sia afferenti che efferenti con i neuroni corticali umani nelle fette di cervello adulto, come confermato dal tracciamento monosinaptico retrogrado del virus della rabbia, dalle registrazioni di patch-clamp a cellule intere e dalla microscopia immunoelettronica21.
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Protocol
Questo protocollo segue le linee guida approvate dal Comitato etico regionale, Lund, Svezia (numero di permesso etico 2021-07006-01). Il tessuto neocorticale sano è stato ottenuto da pazienti sottoposti a chirurgia elettiva per l'epilessia del lobo temporale. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti.
NOTA: Tutti i tessuti ottenuti sono stati lavorati indipendentemente dalle loro dimensioni. Tuttavia, i tessuti di dimensioni inferiori a 1-1,5 mm3 saranno tecnicamente difficili da maneggiare e sezionare con un vibratomo.
1. Raccolta, manutenzione, taglio e placcatura dei tessuti
- Preparazioni il giorno prima dell'affettatura dei tessuti
- Preparare 2 L di soluzione di taglio (tabella 1) in un matraccio tarato. Sciogliere tutti gli ingredienti tranne MgCl 2 e CaCl2 in ~1.800 ml di acqua deionizzata e bolle con gas carbogeno per 15 minuti. Quindi aggiungere quantità appropriate di soluzioni 1 M MgCl 2 e CaCl2 e continuare a gorgogliare per altri 15 minuti. Infine, riempire il matraccio fino al segno 2 L; controllare il pH e l'osmolarità e regolare se necessario. Congelare 2 x 350 mL della soluzione preparata e conservare il resto a 4 °C.
NOTA: Il pH e l'osmolarità sono tipicamente 7,3-7,4 e 295-300 mOsm, rispettivamente. - Preparare 100 ml di soluzione di risciacquo (Tabella 2). Sciogliere 476 mg di HEPES e 200,6 mg di glucosio in 100 ml di HBSS integrati con 5 ml di penicillina / streptomicina. Questo può essere conservato a 4 °C per un massimo di 10 giorni.
- Preparare il terreno di coltura corticale adulto umano (hACtx) (hACtx medium) (Tabella 3) e filtrarlo nel laboratorio di coltura cellulare sotto una cappa ventilata. Il mezzo comprende il mezzo neuronale senza rosso fenolo (vedi la tabella dei materiali), l'integratore di B27, la L-glutammina (vedi la tabella dei materiali) e la gentamicina. Conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- Preparare 2 L di soluzione di taglio (tabella 1) in un matraccio tarato. Sciogliere tutti gli ingredienti tranne MgCl 2 e CaCl2 in ~1.800 ml di acqua deionizzata e bolle con gas carbogeno per 15 minuti. Quindi aggiungere quantità appropriate di soluzioni 1 M MgCl 2 e CaCl2 e continuare a gorgogliare per altri 15 minuti. Infine, riempire il matraccio fino al segno 2 L; controllare il pH e l'osmolarità e regolare se necessario. Congelare 2 x 350 mL della soluzione preparata e conservare il resto a 4 °C.
- Preparativi il giorno dell'operazione prima dell'arrivo dei campioni di tessuto
- Verificare la disponibilità delle attrezzature necessarie e dello spazio di laboratorio e pulire accuratamente tutti gli strumenti chirurgici e il vibratomo (vedere la tabella dei materiali), nonché lo spazio del banco, con acqua distillata (senza detergente), seguita da etanolo al 70%. Lasciare asciugare l'etanolo per almeno 30 minuti prima di utilizzare gli strumenti e le attrezzature.
- Schiacciare la soluzione di taglio congelata e far bollire la "zuppa" di ghiaccio e liquido con gas carbogen per 30 minuti. Quindi, chiudere ermeticamente uno dei contenitori con la soluzione schiacciata "zuppa" e metterlo nella ghiacciaia. Questo sarà utilizzato per raccogliere il tessuto dalla sala operatoria.
- Calibrare il vibratomo e impostare i parametri di taglio: velocità 0,05 mm/s e vibrazione 1,7 mm. Posizionare la camera di taglio su uno stadio di vibratomo e avviare il dispositivo di raffreddamento collegato ad essa in modo che la camera sia a una temperatura costante di -3 °C.
- Preparare la camera di raccolta delle fette con inserti per posizionare le fette di tessuto e la soluzione di taglio, gorgogliandola costantemente con gas carbogeno a temperatura ambiente (RT).
- Nel laboratorio di coltura cellulare e sotto un cappuccio ventilato, posizionare gli inserti di coltura in una piastra a 6 pozzetti usando una pinza. Aggiungere 5 mL di mezzo hACtx sul fondo dell'inserto fino a quando non entra in contatto con la membrana, evitando la formazione di bolle, e aggiungere 2 mL sulla parte superiore dell'inserto. Equilibrare nell'incubatore a 37 °C e 5% CO 2 per almeno2 ore prima di trasferire le fette di tessuto negli inserti.
- Procedure di raccolta e affettamento dei tessuti
- Immediatamente dopo la resezione, raccogliere il tessuto dal paziente nella sala operatoria, se possibile, direttamente in un contenitore con soluzione di taglio congelata, bollata e schiacciata. Trasferire immediatamente il contenitore chiuso sul ghiaccio nell'area di taglio del laboratorio.
- Ispezionare il tessuto e individuare la superficie migliore per incollarlo (vedi punto 1.3.3) alla fase di taglio del vibratomo, considerando l'orientamento degli strati corticali. Se necessario, tagliare la superficie irregolare con un bisturi in modo che sia facile posizionare il tessuto sul palco per un orientamento ottimale delle fette.
- Incollare il tessuto al palco con adesivo per tessuti (vedere la tabella dei materiali), posizionarlo nella camera di affettatura e riempire immediatamente la camera con una soluzione di taglio a bolle fredde. Continuare la gorgogliatura durante tutta la procedura di taglio.
- Tagliare fette coronali o sagittali, a seconda dell'orientamento tessuto-lama, ad uno spessore di 300 μm per contenere tutti gli strati corticali e, se possibile, la sostanza bianca. Posizionare le fette nella camera di raccolta con soluzione di taglio gorgogliante a RT.
NOTA: Tagliare dal lato della sostanza bianca verso la superficie della corteccia. Non rimuovere le meningi, in quanto ciò potrebbe danneggiare il tessuto. La lama da taglio di solito li taglia facilmente. - Una volta che tutto il tessuto è stato tagliato, trasferire le fette in una capsula di Petri sterile con soluzione di risciacquo a RT e trasportarle al laboratorio di coltura cellulare. Questo passaggio è necessario per rimuovere il saccarosio in eccesso dalle fette prima di trasferirle nella piastra di coltura.
NOTA: Per trasferire le fette (in questa e nei passaggi seguenti), utilizzare una pipetta di vetro rovesciata, rompere la parte più sottile e posizionare una tettarella di gomma per l'aspirazione.
- Coltura e mantenimento di fette di tessuto hACtx
- Posizionare individualmente le fette di tessuto sopra gli inserti già bagnati e sommersi. Dopo 24 ore, cambiare il mezzo per rimuovere ulteriormente eventuali residui di saccarosio o altre sostanze residue dalle procedure di taglio.
- Sostituire il terreno di coltura con terreno fresco ogni 7 giorni. Dopo 2 settimane, utilizzare hACtx medium senza gentamicina. La coltura può essere mantenuta per un massimo di 2 mesi.
NOTA: Equilibrare il mezzo hACtx nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO 2 per almeno2 ore prima del cambio del fluido. Il mezzo fresco dovrebbe essere preparato ogni 2 settimane. Controllare le fette ogni 2-3 giorni e, se parte del mezzo è evaporato, aggiungerne altro nella parte superiore dell'inserto.
| Soluzione di taglio | Concentrazione delle scorte | Concentrazione finale [mM] | Per 1 L |
| Saccarosio | Polvere | 200 | 68,46 g |
| NaHCO3 | Polvere | 21 | 1,76 g |
| Kcl | Polvere | 3 | 0,22 g |
| NaH2PO4 | Polvere | 1.25 | 0,17 g |
| Glucosio | Polvere | 10 | 1,80 g |
| MgSO4 | 1 m | 2 | 2 ml |
| CaCl2 | 1 m | 1.6 | 1,6 ml |
| MgCl2 | 2 m | 2 | 1 mL |
Tabella 1: Composizione della soluzione di taglio. MgCl 2 e CaCl2 sono usati come soluzioni 1 M prepreparate in acqua deionizzata.
| Soluzione di risciacquo | Concentrazione delle scorte | Concentrazione finale | Per 100 mL |
| HBSS | 1x | 95 ml | |
| PenStrep | 10.000 U/mL | 500 U/mL | 5 ml |
| HEPES | Polvere | 4,76 g/L | 476 mg |
| Glucosio | Polvere | 2 g/L | 200,6 mg |
Tabella 2: Composizione della soluzione di risciacquo.
| hACtx medio | Concentrazione delle scorte | Concentrazione finale | Per 100 mL | |
| Mezzo neuronale senza rosso fenolo | 97,4 ml | vedi Tabella dei Materiali | ||
| B27 | 50x | 1:50 | 2 ml | |
| L-Glutammina | 100x | 1:200 | 500 μL | vedi Tabella dei Materiali |
| Gentamicina | 50 mg/ml | 1:1000 | 100 μL |
Tabella 3: Composizione del mezzo hACtx.
2. Proliferazione e differenziamento di cellule lt-NES
NOTA: Le cellule Lt-NES sono generate come precedentemente descritto21,22 e trasdotte con un vettore lentivirale che trasporta la proteina fluorescente verde (GFP) sotto un promotore costitutivo (cellule GFP-lt-NES). I flaconcini contenenti 3 x 106 cellule vengono conservati a -150 °C fino all'uso.
- Preparazione delle soluzioni stock e dei supporti
- Diluire 100 μg di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) in 10 mL di PBS-0,1% BSA per ottenere una concentrazione stock di 10 μg/mL. Preparare 100 μL di aliquote.
- Diluire 100 μg di fattore di crescita epidermico (EGF) in 10 mL di PBS-0,1% BSA per avere una concentrazione di stock di 10 μg/mL. Preparare 100 μL di aliquote.
- Aliquot 50x B27 supplemento in un volume di 100 μL per aliquota.
- Diluire 10 mg di poli-L-ornitina in 100 mL di acqua deionizzata per ottenere una concentrazione di riserva di 100 μg/mL. Fare 1 mL di aliquote.
- Preparare 30 μL di aliquote di 1,20 mg/mL di laminina di topo.
- Diluire 10 mL di tripsina-EDTA (0,25%) in 90 mL di PBS fino a una concentrazione stock dello 0,025%. Preparare 1 mL di aliquote.
- Diluire 0,025 g di inibitore della tripsina in 50 mL di PBS ad una concentrazione stock di 0,5 mg/ml. Preparare 1 mL di aliquote.
- Diluire 10 μg di Wnt3a (membro della famiglia 3A del sito di integrazione MMTV senza ali) in 1 mL di PBS-0,1% BSA per ottenere una concentrazione di stock di 10 μg/mL. Preparare BMP4 (proteina morfogenetica ossea 4) allo stesso modo. Aliquote in volume di 100 μL.
- Diluire 1 mg di ciclopamina in 2,5 mL di DMSO ad una concentrazione finale di 400 μg/mL ed effettuare 100 μL di aliquote.
- Preparare il terreno di base (Tabella 4) e il terreno definito dalla differenziazione (DDM, Tabella 5) e conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- Rivestimento di piatti di cultura
- Per pre-rivestire i piatti per coltivare le cellule GFP-It-NES durante la proliferazione o la differenziazione, diluire la poli-L-ornitina 1:100 in acqua deionizzata e aggiungere 5 ml della soluzione in un matraccio T25. Incubare durante la notte a RT.
- Lavare le piastre rivestite di poli-L-ornitina 1x con acqua deionizzata e 1x con PBS.
- Per le cellule GFP-It-NES in proliferazione, diluire la laminina di topo a 1:500 in PBS e incubare per almeno 2 ore a 37 °C. Per le cellule GFP-It-NES in differenziamento, diluire la laminina di topo a 1:100 in PBS e incubare per almeno 2 ore a 37 °C.
- Proliferazione delle cellule GFP-lt-NES
- Riscaldare 5 mL (per il lavaggio) e 5 mL (per la semina) di terreno di base in due diverse provette da 15 mL.
- Scongelare rapidamente un flaconcino di cellule GFP-lt-NES a 37 °C, trasferirle nel tubo di lavaggio e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
- Aspirare il mezzo con attenzione senza toccare il pellet e risospendere le celle in 1 ml di terreno di base preriscaldato. Trasferire la sospensione cellulare nel tubo di semina contenente terreno di base integrato con fattori di proliferazione: EGF (10 ng / mL), bFGF (10 ng / mL) e B27 (10 ng / mL). Seminare le cellule su un matraccio T25 rivestito di poli-L-ornitina / laminina.
- Nutrire le cellule con fattori di proliferazione ogni giorno. Sostituire il mezzo se diventa giallo. Passare le cellule ogni terzo o quarto giorno (1 giorno dopo che hanno raggiunto il 100% di confluenza).
- Divisione delle cellule GFP-lt-NES per la proliferazione e la differenziazione
- Preriscaldare 5 ml di terreno di base per matraccio (per raccogliere le cellule), più il volume totale necessario per riseminarle.
NOTA: Il passaggio viene eseguito ad una diluizione 1:3 per mantenere le cellule in proliferazione, richiedendo 15 ml di terreno basico, e una diluizione 1:6 per iniziare la differenziazione, che richiede 30 mL di terreno basico. - Rimuovere il mezzo dal pallone per coltura cellulare mediante aspirazione e aggiungere 500 μL di tripsina allo 0,025% preriscaldata. Incubare per 5-10 minuti a RT. Il distacco delle cellule può essere confermato al microscopio ottico standard con un ingrandimento 10x.
- Aggiungere un volume uguale di inibitore della tripsina (concentrazione finale 0,5 mg/ml) seguito da 5 ml di terreno basico caldo. Staccare e raccogliere le cellule facendo delicatamente pipettare su e giù. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare per 5 minuti a 300 x g.
- Per mantenere le cellule in proliferazione, riplaccare ad una diluizione 1:3 in terreno di base fresco integrato con fattori di proliferazione e ripetere il punto 2.3.4.
- Preriscaldare 5 ml di terreno di base per matraccio (per raccogliere le cellule), più il volume totale necessario per riseminarle.
- Differenziazione corticale delle cellule GFP-lt-NES
- Il giorno 0, risospendere le cellule (da utilizzare per la differenziazione) in 30 ml di terreno di base integrato con fattori di proliferazione e placcarle in sei palloni T25 rivestiti di differenziazione (divisi 1:6).
- Il giorno 1, cambiare metà del terreno in DDM e aggiungere fattori di proliferazione a metà della loro concentrazione.
- Il giorno 2, cambiare completamente il terreno in DDM integrato con fattori di differenziazione: BMP4 (10 ng / mL), Wnt3a (10 ng / mL) e ciclopamina (400 ng / mL).
- Il giorno 4, aggiungi solo i fattori di differenziazione. Sostituire il mezzo se diventa giallo.
- Il giorno 6, cambia il mezzo in DDM integrato con BMP4 e Wnt3a. La ciclopamina viene rimossa in questa fase.
- Il giorno 7, staccare le celle come indicato nei punti 2.4.2 e 2.4.3.
| Medio di base | Concentrazione delle scorte | Concentrazione finale | Per 100 mL |
| DMEM/F12 con L-Glutammina | 1x | 98,7 ml | |
| Supplemento N-2 | 100x | 1:100 | 1 mL |
| Glucosio | 45% | 3,5 ml/L | 350 μL |
Tabella 4: Composizione del mezzo di proliferazione delle cellule lt-NES (terreno di base).
| DDM medio | Concentrazione delle scorte | Concentrazione finale | Per 100 mL |
| DMEM/F12 con L-Glutammina | 96 ml | ||
| N2 | 100 x | 1:100 | 1 mL |
| NEAA | 100 x | 1:100 | 1 mL |
| Piruvato di sodio | 100 mM | 1:100 | 1 mL |
| Frazione BSA V | 7.5% | 6,6 ml/L | 660 μL |
| 2-mercaptoetanolo | 50 nM | 7 μL/L | 0,7 μL |
| Glucosio | 45% | 3,2 ml/L | 320 μL |
Tabella 5: Composizione del mezzo definito dalla differenziazione (DDM) delle celle lt-NES.
3. Trapianto delle cellule GFP-lt-NES in fette organotipiche di hACtx
NOTA: Il tessuto hACtx deve essere coltivato per 1 settimana prima del trapianto di cellule. Per facilitare la procedura di trapianto, è necessario rimuovere 2 ml del mezzo hACtx dalla parte superiore dell'inserto per evitare che il tessuto fluttui.
- Risospendere le celle GFP-lt-NES innescate corticamente (dal punto 2.5.6) in una matrice basale pura fredda (vedere la Tabella dei materiali) ad una concentrazione di 1 x 105 cellule/μL e trasferire la soluzione in un tubo sterile più piccolo.
NOTA: Durante la procedura di trapianto, tutti i materiali (punte di pipette, tubi, capillari, ecc.) devono essere pre-raffreddati per evitare la solidificazione del gel. Scongelare il gel della matrice della membrana basale sul ghiaccio per 30 minuti prima del suo utilizzo. - Raccogliere la sospensione cellulare in un capillare di vetro freddo collegato a una tettarella di gomma per l'aspirazione. Iniettare la sospensione cellulare sotto forma di piccole gocce (circa 1 μL ciascuna) pugnalando la fetta di tessuto semisecco in vari siti.
- Incubare a 37 °C per 30 minuti affinché il gel si solidifichi. Trasferire la piastra dall'incubatore alla cappa e aggiungere con cautela 2 ml di terreno hACtx nella parte superiore dell'inserto per immergere completamente il tessuto.
- Sostituire il terreno di coltura con terreno hACtx fresco una volta alla settimana.
4. Convalida
- Colorazione delle fette hACtx
- Al momento desiderato, estrarre le fette dal laboratorio di coltura cellulare e rimuoverle dall'inserto immergendolo in una capsula di Petri con PBS. Quindi, trasferire le fette in flaconcini di colorazione utilizzando una pipetta di vetro rovesciata (vedere la NOTA al punto 1.3.5) e fissarle con paraformaldeide (PFA) al 4% per una notte a 4 °C.
- Risciacquare 3 volte con KPBS per 15 minuti ogni volta e incubare per una notte a 4 °C con soluzione di permeabilizzazione (0,02% BSA e 1% Triton X-100 in KPBS).
- Il giorno successivo, aggiungere la soluzione bloccante (KPBS con Triton X-100 allo 0,2%, BSA all'1%, azoturo di sodio [1:10.000] e siero d'asino normale al 10%) e incubare per una notte a 4 °C.
- Dopo il blocco, aggiungere gli anticorpi primari (vedere Tabella 6 per le diluizioni) diluiti nella soluzione bloccante e incubare per 48 ore a 4 °C.
- Lavare 3 volte con soluzione bloccante senza aggiungere siero per 15 minuti ciascuno. Aggiungere gli anticorpi secondari diluiti in soluzione bloccante (vedere tabella 6 per le diluizioni) e incubare per 48 ore a 4 °C.
- Lavare 3 volte con soluzione bloccante senza siero e incubare per 2 ore a RT in colorazione Hoechst diluita in soluzione di permeabilizzazione (1:1.000).
- Lavare 3 volte con KPBS, montare le fette su vetrini con un pennello e lasciarle asciugare. Infine, sciacquare i vetrini con acqua deionizzata, rimuovere l'acqua in eccesso, aggiungere il mezzo di montaggio e coprire con un vetrino. Conservare i vetrini per almeno 24 ore a RT e conservarli a 4 °C fino all'imaging.
NOTA: Per la marcatura degli anticorpi che marcano epitopi nucleari, eseguire il prelievo dell'antigene prima della permeabilizzazione (fase 4.1.2) con citrato di sodio (10 mM, pH 6,0) per 2 ore a 65 °C.
- Patch-clamp a cellule intere
- Il giorno della registrazione, preparare 1 L di liquido cerebrospinale artificiale umano (haCSF), modificato per adattarsi meglio all'ambiente cerebrale umano (Tabella 7). Analogamente alla soluzione di taglio, preparare circa 900 ml di soluzione con tutti gli ingredienti tranne CaCl 2 sciolto in acqua deionizzata e bollire con carbogen per 15 minuti prima di aggiungere il volume appropriato di soluzione 1 M CaCl2 . Riempire il pallone volumetrico fino al segno di 1 L e continuare a gorgogliare a RT per altri 15 minuti prima di iniziare la registrazione e durante l'esperimento.
- Trasferire le fette di tessuto dalla piastra di coltura alla camera di registrazione sul palco di un microscopio verticale che viene costantemente perfuso con haCSF a bolle ad una velocità di perfusione di 2 ml / min e riscaldato a 34 ° C utilizzando un regolatore di temperatura del bagno.
- Tirare i capillari di vetro con un estrattore di pipette ad una resistenza media di 3-5 MΩ e riempire i capillari con una soluzione interna a base di K-gluconato (Tabella 8) con 2-4 mg di biocitina appena aggiunti per l'identificazione post-hoc delle cellule registrate. Il pH e l'osmolarità di questa soluzione interna sono rispettivamente 7,2-7,3 e 285-295 mOsm.
- Nel caso della registrazione della cellula ospite, ottieni una panoramica approssimativa della fetta con un obiettivo 4x e trova una cellula dall'aspetto sano da correggere con un obiettivo 40x. Quindi, procedere con il morsetto standard per cerotti a celle intere.
- Nel caso della registrazione delle cellule innestate, identificare l'area del tessuto con le cellule innestate utilizzando un obiettivo 4x e un filtro di epifluorescenza nell'intervallo blu (460 nm) mediante l'espressione del reporter GFP nell'innesto. Quindi, ingrandisci l'area localizzata con un obiettivo 40x e trova una cellula innestata che esprime GFP per un morsetto patch a cellule intere standard.
- Controllare il potenziale di membrana a riposo (RMP) immediatamente dopo l'irruzione nella cella e assicurarsi che la qualità della registrazione sia buona. Registrare tutti i parametri di interesse (ad esempio, resistenza della membrana [Ri], parametri AP, correnti di sodio e potassio e attività sinaptica) nella configurazione della tensione dell'intera cella o della pinza di corrente.
- Dopo aver raccolto tutti i dati necessari, ritrarre con attenzione la pipetta di registrazione senza danneggiare ulteriormente la cellula in modo che possa essere identificata con immunocolorazione post-hoc.
- Trasferire la fetta nella soluzione di PFA al 4% per un'ulteriore fissazione e colorazione, come descritto al punto 4.1. La streptavidina viene utilizzata per immunomarcare le cellule piene di biocitina durante le registrazioni.
| ANTICORPI | Diluizione | Note |
| Primario | ||
| Pollo anti-GFP | 1:1000 | |
| Pollo anti-MAP2 | 1:1000 | |
| Capra anti-AiF1 | 1:100 | |
| Mouse anti-MBP | 1:1000 | Recupero dell'antigene necessario |
| Mouse anti-SC123 | 1:2000 | |
| Coniglio anti-NeuN | 1:1000 | |
| Coniglio anti-Olig2 | 1:500 | |
| Coniglio anti-Tmem119 | 1:200 | |
| Secondario | ||
| 488-coniugato AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | 1:500 | |
| 488-coniugato AffinityPure Donkey anti-coniglio IgG | 1:500 | |
| 488-coniugato AffinityPure Donkey anti-pollo IgG | 1:500 | |
| Cy3-coniugato AffinityPure Donkey anti-pollo IgG | 1:500 | |
| Cy3-coniugato AffinityPure Donkey anti-capra IgG | 1:500 | |
| Cy3-coniugato AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | 1:500 | |
| Alexa fluor 647-coniugata streptavidina | 1:500 |
Tabella 6: Elenco degli anticorpi primari e secondari per l'immunoistochimica.
| haCSF | Concentrazione delle scorte | Concentrazione finale [mM] | Per 1 L |
| NaCl | Polvere | 129 | 7,54 g |
| NaHCO3 | Polvere | 21 | 1,76 g |
| Glucosio | Polvere | 10 | 1,80 g |
| Kcl | Polvere | 3 | 0,22 g |
| NaH2PO4 | Polvere | 1.25 | 0,17 g |
| MgSO4 | 1 m | 2 | 2 ml |
| CaCl2 | 1 m | 1.6 | 1,6 ml |
Tabella 7: Composizione del liquido cerebrospinale artificiale (haCSF).
| Soluzione interna di K-gluconato | Concentrazione delle scorte | Concentrazione finale [mM] | Per 100 mL |
| K-gluconato | Polvere | 122.5 | 2,87 g |
| Kcl | Polvere | 12.5 | 93,18 mg |
| NaCl | Polvere | 8 | 46,76 mg |
| HEPES | Polvere | 10 | 238,32 mg |
| MgATP | Polvere | 2 | 101,4 mg |
| Na3GTP | Polvere | 0.3 | 17,0 mg |
| Nota: Regolare il pH con KOH/HCl | |||
Tabella 8: Composizione della soluzione interna a base di K-gluconato.
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Representative Results
Seguendo il protocollo descritto, è stato raccolto ed elaborato il tessuto hACtx di un paziente con epilessia del lobo temporale, come spiegato sopra. Alcune fette sono state fissate dopo 24 ore in coltura per studiare il punto di partenza del tessuto ospite. L'analisi di diverse popolazioni di cellule neurali come neuroni (che esprimono NeuN e Map2, Figura 1A), oligodendrociti (Olig2 e MBP, Figura 1B) e astrociti (GFAP umano-specifico, chiamato anche STEM123, Figura 1C) ha mostrato una conservazione ottimale del tessuto.
Il passo successivo è stato quello di studiare come le condizioni di coltura influenzano la vitalità neuronale nel tessuto umano. A tale scopo, la colorazione di NeuN e Map2 è stata eseguita dopo 2 settimane di coltura. Al timepoint studiato, l'espressione di entrambi questi marcatori neuronali era ancora presente nel tessuto (Figura 2A). Inoltre, sono state eseguite registrazioni elettrofisiologiche per valutare la funzionalità. Le registrazioni utilizzando patch clamp a cellule intere hanno mostrato che i neuroni avevano sostenuto RMP (-70 mV in media) e resistenza di ingresso della membrana (Ri) (300 MΩ in media), paragonabile ai neuroni di preparati acuti21,23. Nel complesso, le cellule erano leggermente meno attive rispetto al tessuto fresco, sebbene la maggior parte delle cellule fosse ancora in grado di attivarne almeno uno (Figura 2B-E), se non multipli, potenziali d'azione (APs, Figura 2F-I), e veloci correnti di sodio verso l'interno e lento di potassio verso l'esterno erano presenti su iniezioni di corrente graduale in modalità tension-clamp (Figura 2C-E, G-I). Nel loro insieme, queste registrazioni hanno indicato che i neuroni nelle colture organotipiche erano relativamente sani e mostravano proprietà intrinseche neurofisiologiche tipiche.
Inoltre, l'effetto della coltura sull'attivazione della microglia è stato valutato mediante colorazione di Tmem119 e Iba1 in 24 ore (Figura 3A) e 2 settimane di coltura (Figura 3B). Come previsto, sono stati osservati alcuni cambiamenti nell'aspetto microgliale. Dopo 2 settimane in coltura, sono diventati meno ramificati e hanno acquisito una morfologia più attivata rispetto al tessuto acuto.
Dopo aver caratterizzato il tessuto ospite, il trapianto dei progenitori derivati dalle cellule lt-NES è stato eseguito come segue. Le cellule GFP-lt-NES sono state differenziate per 7 giorni e innestate in tessuto hACtx coltivato per 1 settimana (Figura 4A). Una panoramica del trapianto è stata osservata utilizzando l'immunoistochimica con GFP (Figura 4B,C). I risultati sono stati confrontati con quelli di precedenti trapianti in tessuto che era scarsamente conservato a causa di una finestra temporale più lunga tra la resezione e la placcatura. Le immagini mostrano che, nel sistema ottimale, 4 settimane dopo il trapianto ex vivo, le cellule GFP-lt-NES innestate hanno mostrato neuriti estesi e arborizzazioni estese e complesse in tutta la coltura organotipica (Figura 4B). Il tessuto mal conservato non ha permesso il trapianto di successo a causa della scarsa connettività dell'ospite. Quasi nessuna cellula innestata è sopravvissuta; inoltre, detriti e marcature non specifiche di anticorpi sulle cellule morte sono stati ampiamente osservati in tutta la fetta umana (Figura 4C).
Per quanto riguarda le proprietà elettrofisiologiche delle cellule innestate, è stato riscontrato che, in caso di trapianto riuscito, le cellule sono diventate neuroni maturi non solo morfologicamente ma anche funzionalmente attivi con AP ripetitivi e spesso spontanei, veloci correnti di sodio verso l'interno e lento di potassio verso l'esterno e un certo livello di attività sinaptica, indicando l'integrazione funzionale dell'innesto con il tessuto ospite 4 settimane dopo l'innesto (Figura 4D-H).
Figura 1: Caratterizzazione delle diverse popolazioni cellulari nel tessuto hACtx dopo 24 ore in coltura. Immagini confocali rappresentative del tessuto hACtx che mostrano la presenza di (A) neuroni (che esprimono NeuN e Map2), (B) oligodendrociti (Olig2 e MBP) e (C) astrociti (GFAP umano-specifico [STEM123]). La colorazione nucleare (Ho: Hoechst, blu) è inclusa nei pannelli singoli e uniti. Barra della scala = 20 μm. Le frecce bianche indicano la colocalizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Caratterizzazione e proprietà elettrofisiologiche dei neuroni hACtx dopo 2 settimane in coltura organotipica. (A) Immagini confocali rappresentative del tessuto hACtx che mostrano l'espressione di NeuN e Map2. (B-I) Esempi dei neuroni corticali registrati nel tessuto hACtx di 2 settimane. (B,F) Etichettatura della biocitina del neurone registrato (rosso), insieme alla colorazione nucleare (Ho: Hoechst, blu), inclusa in un pannello unito. Barre della scala = 20 μm. Tracce di registrazione patch-clamp a cella intera che mostrano esempi di una cella con (C-E) singolo o (G-I) più AP. Gli AP sono stati indotti da (C,G) un passo di 250 pA, o (D,H) un'iniezione di corrente rampata da 0 a 300 pA a RMP. Gli inserti indicano una vista ingrandita di uno degli AP in ciascun caso. (E,I) Le correnti di sodio verso l'interno e di potassio verso l'esterno sono state osservate in entrambi gli esempi di celle alle fasi di depolarizzazione della tensione applicate da -70 mV in incrementi di 10 mV in modalità tension-clamp. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Caratterizzazione della popolazione di microglia nel tessuto hACtx. Immagini confocali del tessuto hACtx che mostrano l'espressione di Iba1 e Tmem119 dopo (A) 24 ore e (B) 2 settimane in coltura. La colorazione nucleare (Ho: Hoechst, blu) è inclusa nei pannelli singoli e uniti. Barra della scala = 20 μm. Le frecce bianche indicano la colocalizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Panoramica e proprietà elettrofisiologiche dei neuroni derivati da cellule lt-NES 4 settimane dopo il trapianto ex vivo di cellule GFP-lt-NES. (A) Disegno sperimentale. Diff = differenziazione. (B,C) Immagini confocali rappresentative di cellule GFP-lt-NES innestate in tessuto (B) ben conservato e (C) mal conservato hACtx. Barre di scala = 50 μm. (D) Esempio di traccia di un neurone derivato dall'innesto che spara spontaneamente AP. L'inserto indica una vista ingrandita di uno degli AP. Gli AP ripetitivi potrebbero essere indotti da un'iniezione (E) steped (50 pA) o (F) ramped (da 0 a 300 pA) di corrente depolarizzante dal potenziale di -70 mV. (G) Le correnti di sodio verso l'interno e di potassio verso l'esterno sono state indotte da passi di depolarizzazione di 10 mV in modalità tensionale-morsetto da un potenziale di mantenimento di -70 mV. (H) In modalità tension-clamp, le correnti postsinaptiche spontanee (sPSC) potrebbero essere osservate nei neuroni derivati dall'innesto ad un potenziale di mantenimento di -70 mV. Gli inserti indicano una vista ingrandita di alcune delle sPSC. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Ottenere fette hACtx di qualità sufficientemente elevata è il passaggio più critico in questo protocollo. Il tessuto corticale è ottenuto da pazienti epilettici sottoposti a chirurgia resettiva24. La qualità del tessuto resecato, così come il tempo di esposizione del tessuto tra la resezione e la coltura, è fondamentale; Più velocemente il tessuto viene trasferito dalla sala operatoria al laboratorio e tagliato, più ottimale sarà la coltura organotipica. Idealmente, il tessuto dovrebbe essere tagliato e trasferito al laboratorio di coltura cellulare entro le prime ore dopo la raccolta. L'ossigenazione del tessuto durante questo processo migliora anche la qualità delle fette. A questo proposito, più grande è il campione di tessuto, minore è la concentrazione di ossigeno che raggiunge il nucleo e, quindi, minore è la vitalità se il tessuto non viene tagliato in tempo. Se la qualità del tessuto ospite non è ottimale, la convalida delle terapie con cellule staminali non sarà possibile.
Quando il tessuto corticale viene trasferito dal cervello umano a una piastra, alcune limitazioni devono essere prese in considerazione. Durante il processo di taglio, un gran numero di assoni viene sezionato, inducendo danni neuronali che porteranno a processi infiammatori come l'attivazione della microglia25. Per questo motivo, anche se il tessuto è considerato sano quando si trova nel cervello umano, il comportamento cellulare in coltura potrebbe essere diverso a causa del danno parziale subito durante la resezione e la preparazione delle sezioni organotipiche26,27. I cambiamenti nella popolazione di microglia potrebbero essere monitorati utilizzando diverse tecniche, tra cui la misurazione dei livelli di citochine rilasciate o la valutazione dei cambiamenti morfologici28. È importante sottolineare che, sebbene l'attivazione della microglia sia stata osservata a 2 settimane in coltura a seguito del cambiamento nell'ambiente da un intero organo a condizioni di coltura ex vivo, i neuroni erano ancora vitali in questo momento, come dimostrato dalla colorazione neuronale e dall'analisi delle loro proprietà elettrofisiologiche. Le fette di tessuto più spesse sono meglio conservate; Tuttavia, la penetrazione dei nutrienti nella parte interna della fetta è influenzata, con conseguente morte parziale dei tessuti. Per questo motivo, 300 μm è lo spessore ottimale per la coltura organotipica.
Le colture organotipiche di tessuto hACtx hanno chiari vantaggi rispetto ad altri metodi di coltura 3D come organoidi o sferoidi. La fonte è un cervello umano completamente sviluppato, il che significa che l'ambiente cellulare e matriciale, così come lo stato di maturazione delle diverse popolazioni cellulari, sono gli stessi di quelli che si trovano generalmente nel cervello umano adulto25,29,30. Gli organoidi sono più simili ai tessuti fetali, il che è ottimale per alcuni campi di ricerca come la modellizzazione dei disturbi dello sviluppo31 ma non, ad esempio, per lo studio delle malattie neurodegenerative, che colpiscono principalmente la popolazione adulta e hanno un esordio tardivo32,33. Ancora più importante, la coltura organotipica del tessuto umano è, ad oggi, l'unico sistema umano che consente la validazione delle terapie cellulari.
La maggior parte delle conoscenze sul trapianto di cellule staminali per la sostituzione neuronale nelle malattie neurodegenerative deriva da modelli animali in vivo . Anche se questi sistemi sono estremamente preziosi per valutare l'effetto modulatorio delle cellule trapiantate nei circuiti dell'ospite danneggiato, sfortunatamente, le terapie testate in questa configurazione normalmente falliscono quando vengono tradotte in clinica a causa delle chiare differenze tra roditori e umani34. Per questo motivo, la coltura organotipica del tessuto hACtx è un'ottima strategia per modellare le malattie neurodegenerative umane che colpiscono la corteccia grazie alla possibilità di studiare le interazioni tra popolazioni neurali umane e la conservazione della struttura cerebrale umana25.
In sintesi, questa metodologia combinata di colture organotipiche a lungo termine della corteccia umana adulta e trapianto intracorticale ex vivo di progenitori corticali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte è una strategia promettente per la convalida di terapie basate su cellule staminali, che possono facilitare la traduzione clinica di strategie di sostituzione neuronale per stimolare il recupero funzionale nel cervello danneggiato.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato da sovvenzioni del Consiglio svedese per la ricerca, della Swedish Brain Foundation, della Swedish Stroke Foundation, della Region Skåne, della Thorsten and Elsa Segerfalk Foundation e dell'iniziativa del governo svedese per le aree di ricerca strategiche (StemTherapy).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Cutting and electrophysiology | |||
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
| Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
| Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2x91 | |
| Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
| Plastic Petri dish | Any suitable | ||
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
| Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| RINSING SOLUTION | |||
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
| Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| Forceps | Any suitable | ||
| Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
| GENERATION OF lt-NES cells | |||
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
| Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
| Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
| Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
| Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
| Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
| Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
| T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
| Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
| Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
| Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
| Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
| Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
| Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
| Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
| Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
| Paint brush | Any suitable | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
| Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
| Distilled water | |||
| Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
| Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
| Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
| Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium citrate | |||
| Distilled water | |||
| Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
| Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
| Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
References
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