Summary
Este protocolo descreve culturas organotípicas de longo prazo do córtex humano adulto combinadas com transplante intracortical ex vivo de progenitores corticais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas, que apresentam uma nova metodologia para testar ainda mais terapias baseadas em células-tronco para distúrbios neurodegenerativos humanos.
Abstract
Os distúrbios neurodegenerativos são comuns e heterogêneos em termos de sintomas e afetação celular, tornando seu estudo complicado devido à falta de modelos animais adequados que imitam totalmente as doenças humanas e a baixa disponibilidade de tecido cerebral humano post-mortem. A cultura de tecido nervoso humano adulto oferece a possibilidade de estudar diferentes aspectos de distúrbios neurológicos. Mecanismos moleculares, celulares e bioquímicos poderiam ser facilmente abordados neste sistema, bem como testar e validar drogas ou diferentes tratamentos, como terapias baseadas em células. Este método combina culturas organotípicas de longo prazo do córtex humano adulto, obtidas de pacientes epilépticos submetidos a cirurgia ressectiva, e transplante intracortical ex vivo de progenitores corticais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas. Este método permitirá o estudo da sobrevivência celular, diferenciação neuronal, a formação de entradas e saídas sinápticas e as propriedades eletrofisiológicas de células derivadas de humanos após o transplante em tecido cortical humano adulto intacto. Essa abordagem é um passo importante antes do desenvolvimento de uma plataforma de modelagem de doenças humanas 3D que aproximará a pesquisa básica da tradução clínica de terapias baseadas em células-tronco para pacientes com diferentes distúrbios neurológicos e permitirá o desenvolvimento de novas ferramentas para a reconstrução de circuitos neurais danificados.
Introduction
Distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Parkinson, a doença de Alzheimer ou o acidente vascular cerebral isquêmico, são um grupo de doenças que compartilham a característica comum de mau funcionamento neuronal ou morte. Eles são heterogêneos em termos de área do cérebro e população neuronal afetada. Infelizmente, os tratamentos para essas doenças são escassos ou de eficácia limitada devido à falta de modelos animais que imitem o que ocorre no cérebro humano 1,2. A terapia com células-tronco é uma das estratégias mais promissoras para a regeneração cerebral3. A geração de progenitores neuronais a partir de células-tronco de diferentes fontes tem sido muito desenvolvida nos últimos anos 4,5. Publicações recentes mostraram que células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPS) derivadas de células neuroepiteliais auto-renovadoras a longo prazo (lt-NES), seguindo um protocolo de diferenciação cortical e após transplante intracortical em um modelo de rato com acidente vascular cerebral isquêmico afetando o córtex somatossensorial, geram neurônios corticais maduros. Além disso, os neurônios derivados do enxerto receberam conexões sinápticas aferentes e eferentes dos neurônios hospedeiros, mostrando sua integração na rede neuronal de ratos 6,7. Os axônios derivados do enxerto foram mielinizados e encontrados em diferentes áreas do cérebro de ratos, incluindo a área peri-infarto, corpo caloso e córtex somatossensorial contralateral. Mais importante ainda, o transplante derivado de células iPS reverteu déficits motores em animais com AVC7.
Mesmo que os modelos animais ajudem a estudar a sobrevivência do transplante, a integração neuronal e o efeito das células enxertadas nas funções motoras e cognitivas, faltam informações sobre a interação entre as células humanas (enxerto-hospedeiro) nesse sistema 8,9. Por esta razão, um método combinado de cultura organotípica do cérebro humano a longo prazo com o transplante ex vivo de progenitores neuronais derivados de células iPS humanas é descrito aqui. As culturas organotípicas do cérebro humano obtidas a partir de ressecções neurocirúrgicas são modelos 3D fisiologicamente relevantes do cérebro que permitem aos pesquisadores aumentar sua compreensão dos circuitos do sistema nervoso central humano e a maneira mais precisa de testar tratamentos para distúrbios cerebrais humanos. No entanto, não foram realizadas pesquisas suficientes nesse contexto e, na maioria dos casos, culturas organotípicas cerebrais do hipocampo humano têm sido utilizadas10,11. O córtex cerebral é afetado por diversos distúrbios neurodegenerativos, como o AVC isquêmico12 ou a doença de Alzheimer13, por isso é importante ter um sistema 3D cortical humano que nos permita expandir nossos conhecimentos e testar e validar diferentes estratégias terapêuticas. Vários estudos nos últimos anos têm utilizado culturas de tecido cortical humano adulto (hACtx) para modelar doenças cerebrais humanas 14,15,16,17,18,19; no entanto, informações limitadas estão disponíveis no contexto da terapia com células-tronco. Dois estudos já demonstraram a viabilidade do sistema aqui descrito. Em 2018, células-tronco embrionárias humanas programadas com diferentes fatores de transcrição e transplantadas para o tecido hACtx demonstraram dar origem a neurônios corticais maduros que poderiam se integrar em redes corticais humanas adultas20. Em 2020, o transplante de células lt-NES para o sistema organotípico humano revelou sua capacidade de se diferenciar em neurônios corticais maduros e específicos de camadas com as propriedades eletrofisiológicas dos neurônios funcionais. Os neurônios enxertados estabeleceram contatos sinápticos aferentes e eferentes com os neurônios corticais humanos nas fatias cerebrais adultas, corroborado pelo rastreamento monossináptico retrógrado do vírus da raiva, registros de patch-clamp de células inteiras e microscopia imunoeletrônica21.
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Protocol
Este protocolo segue as diretrizes aprovadas pelo Comitê Regional de Ética, Lund, Suécia (número de permissão ética 2021-07006-01). Tecido neocortical saudável foi obtido de pacientes submetidos a cirurgia eletiva para epilepsia do lobo temporal. O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes.
NOTA: Todos os tecidos obtidos foram processados independentemente do seu tamanho. No entanto, tecidos menores que 1-1,5 mm3 de tamanho serão tecnicamente difíceis de manusear e seccionar com um vibratome.
1. Coleta, manutenção, corte e chapeamento de tecidos
- Preparações no dia anterior ao corte de tecidos
- Preparar 2 L de solução de corte (quadro 1) num balão aferido. Dissolva todos os ingredientes, exceto MgCl 2 e CaCl2, em ~1.800 mL de água deionizada e borbulhe com gás carbógeno por 15 min. Em seguida, adicione quantidades adequadas de 1 M de soluções de MgCl 2 e CaCl2 e continue borbulhando por mais 15 min. Por último, encher o balão até à marca de 2 L; verificar o pH e a osmolaridade e ajustar, se necessário. Congelar 2 x 350 ml da solução preparada e conservar o resto a 4 °C.
NOTA: O pH e a osmolaridade são tipicamente 7,3-7,4 e 295-300 mOsm, respectivamente. - Preparar 100 mL de solução de enxágue (Tabela 2). Dissolver 476 mg de HEPES e 200,6 mg de glicose em 100 mL de HBSS suplementados com 5 mL de penicilina/estreptomicina. Este pode ser armazenado a 4 °C durante até 10 dias.
- Preparar o meio de cultura cortical adulto humano (hACtx) (meio hACtx) (Tabela 3) e filtrá-lo no laboratório de cultura celular sob um exaustor ventilado. O meio compreende meio neuronal sem vermelho de fenol (ver Tabela de Materiais), suplemento de B27, L-glutamina (ver Tabela de Materiais) e gentamicina. Conservar a 4 °C durante um período máximo de 2 semanas.
- Preparar 2 L de solução de corte (quadro 1) num balão aferido. Dissolva todos os ingredientes, exceto MgCl 2 e CaCl2, em ~1.800 mL de água deionizada e borbulhe com gás carbógeno por 15 min. Em seguida, adicione quantidades adequadas de 1 M de soluções de MgCl 2 e CaCl2 e continue borbulhando por mais 15 min. Por último, encher o balão até à marca de 2 L; verificar o pH e a osmolaridade e ajustar, se necessário. Congelar 2 x 350 ml da solução preparada e conservar o resto a 4 °C.
- Preparações no dia da operação antes da chegada das amostras de tecido
- Verifique a disponibilidade do equipamento necessário e do espaço de laboratório, e limpe minuciosamente todas as ferramentas cirúrgicas e o vibratome (ver Tabela de Materiais), bem como o espaço de bancada, com água destilada (sem detergente), seguido de etanol a 70%. Deixe o etanol secar por pelo menos 30 min antes de usar as ferramentas e equipamentos.
- Esmague a solução de corte congelada e borbulhe a "sopa" de gelo e líquido com gás carbógeno por 30 min. Em seguida, feche bem um dos recipientes com a solução triturada ''sopa'' e coloque-a na caixa de gelo. Isso será usado para coletar o tecido da sala de operação.
- Calibre o vibratome e defina os parâmetros de corte: velocidade de 0,05 mm/s e vibração de 1,7 mm. Coloque a câmara de corte em um estágio de vibratome e inicie o resfriador conectado a ela de modo que a câmara esteja a uma temperatura constante de -3 °C.
- Prepare a câmara de coleta de fatias com inserções para colocar as fatias de tecido e a solução de corte, borbulhando-a constantemente com gás carbógeno à temperatura ambiente (RT).
- No laboratório de cultura celular e sob um exaustor ventilado, coloque as inserções de cultura em uma placa de 6 poços usando pinça. Adicione 5 mL de meio hACtx na parte inferior da pastilha até entrar em contato com a membrana, evitando a formação de bolhas, e adicione 2 mL na parte superior da pastilha. Equilibrar-se na incubadora a 37 °C e 5% de CO 2 durante, pelo menos,2 h antes de transferir as fatias de tecido para as pastilhas.
- Procedimentos de coleta e fatiamento de tecidos
- Imediatamente após a ressecção, colete o tecido do paciente na sala de cirurgia, se possível, diretamente em um recipiente com solução de corte congelada, borbulhada e esmagada. Transfira o recipiente fechado no gelo imediatamente para a área de corte do laboratório.
- Inspecionar o tecido e localizar a melhor superfície para colá-lo (ver passo 1.3.3) até à fase de corte do vibratome, tendo em conta a orientação das camadas corticais. Se necessário, corte a superfície irregular com um bisturi para que seja fácil colocar o tecido no palco para uma orientação ideal da fatia.
- Cole o tecido ao palco com adesivo de tecido (consulte a Tabela de Materiais), coloque-o na câmara de corte e encha imediatamente a câmara com solução de corte borbulhada a frio. Continue o borbulhar durante todo o processo de corte.
- Corte fatias coronais ou sagitais, dependendo da orientação tecido-lâmina, a uma espessura de 300 μm para conter todas as camadas corticais e, se possível, a substância branca. Coloque as fatias na câmara de coleta com solução de corte borbulhante no RT.
NOTA: Corte do lado da substância branca em direção à superfície do córtex. Não remova as meninges, pois isso pode danificar o tecido. A lâmina de corte geralmente corta através deles facilmente. - Uma vez que todo o tecido tenha sido cortado, transfira as fatias para uma placa de Petri estéril com solução de enxágue no RT e transporte-as para o laboratório de cultura celular. Este passo é necessário para remover o excesso de sacarose das fatias antes de transferi-las para a placa de cultura.
NOTA: Para transferir as fatias (nesta e nas etapas seguintes), use uma pipeta de vidro invertida, quebre a parte mais fina e coloque uma tetina de borracha para sucção.
- Cultura e manutenção de fatias de tecido hACtx
- Coloque individualmente as fatias de tecido em cima das inserções já molhadas e submersas. Após 24 h, mudar o meio para remover ainda mais a sacarose remanescente ou outras substâncias residuais dos procedimentos de corte.
- Substitua o meio de cultura por meio fresco a cada 7 dias. Após 2 semanas, use hACtx meio sem gentamicina. A cultura pode ser mantida por até 2 meses.
NOTA: Equilibrar o meio hACtx na incubadora a 37 °C e 5% de CO 2 durante, pelo menos,2 h antes da mudança do meio. O meio fresco deve ser preparado a cada 2 semanas. Verifique as fatias a cada 2-3 dias e, se algum do meio tiver evaporado, adicione mais ao topo da pastilha.
| Solução de corte | Concentração de existências | Concentração final [mM] | Por 1 L |
| Sacarose | Pó | 200 | 68,46 gr |
| NaHCO3 | Pó | 21 | 1,76 gr |
| Kcl | Pó | 3 | 0,22 gr |
| NaH2PO4 | Pó | 1.25 | 0,17 gr |
| Glicose | Pó | 10 | 1,80 gr |
| MgSO4 | 1 milh | 2 | 2 mL |
| CaCl2 | 1 milh | 1.6 | 1,6 mL |
| MgCl2 | 2 milh | 2 | 1 mL |
Tabela 1: Composição da solução de corte. MgCl 2 e CaCl2 são usados como soluções pré-preparadas de 1 M em água deionizada.
| Solução de enxágue | Concentração de existências | Concentração final | Por 100 mL |
| HBSS | 1x | 95 mL | |
| PenStrep | 10.000 U/mL | 500 U/mL | 5 mL |
| HEPES | Pó | 4,76 g/L | magnésio 476 |
| Glicose | Pó | 2 g/L | 200,6 mg |
Tabela 2: Composição da solução de enxágue.
| hACtx médio | Concentração de existências | Concentração final | Por 100 mL | |
| Meio neuronal sem vermelho de fenol | 97,4 mL | ver Tabela de Materiais | ||
| B27 | 50x | 1:50 | 2 mL | |
| L-Glutamina | 100x | 1:200 | 500 μL | ver Tabela de Materiais |
| Gentamicina | 50 mg/mL | 1:1000 | 100 μL |
Tabela 3: Composição do meio hACtx.
2. Proliferação e diferenciação de células lt-NES
NOTA: As células Lt-NES são geradas como descrito anteriormente21,22 e transduzidas com um vetor lentiviral que transporta proteína fluorescente verde (GFP) sob um promotor constitutivo (células GFP-lt-NES). Os frascos para injetáveis contendo 3 x 106 células são armazenados a -150 °C até à sua utilização.
- Preparação das soluções de estoque e meios
- Diluir 100 μg de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) em 10 mL de PBS-0,1% BSA para ter uma concentração de estoque de 10 μg/mL. Preparar alíquotas de 100 μL.
- Diluir 100 μg de fator de crescimento epidérmico (EGF) em 10 mL de PBS-0,1% BSA para ter uma concentração estoque de 10 μg/mL. Preparar alíquotas de 100 μL.
- Aliquota 50x B27 suplemento num volume de 100 μL por alíquota.
- Diluir 10 mg de poli-L-ornitina em 100 mL de água deionizada para ter uma concentração de estoque de 100 μg/mL. Faça alíquotas de 1 mL.
- Preparar alíquotas de 30 μL de 1,20 mg/ml de laminina de rato.
- Diluir 10 mL de tripsina-EDTA (0,25%) em 90 mL de PBS até uma concentração de estoque de 0,025%. Prepare alíquotas de 1 mL.
- Diluir 0,025 g de inibidor de tripsina em 50 ml de PBS até uma concentração de reserva de 0,5 mg/ml. Prepare alíquotas de 1 mL.
- Diluir 10 μg de Wnt3a (membro da família 3A do local de integração MMTV do tipo Wingless) em 1 mL de PBS-0,1% BSA para ter uma concentração de estoque de 10 μg/mL. Prepare BMP4 (proteína morfogenética óssea 4) da mesma maneira. Alíquota num volume de 100 μL.
- Diluir 1 mg de ciclopamina em 2,5 mL de DMSO até uma concentração final de 400 μg/mL e fazer alíquotas de 100 μL.
- Preparar o meio básico (Tabela 4) e o meio definido por diferenciação (DDM, Tabela 5) e armazenar a 4 °C por até 2 semanas.
- Revestimento de pratos de cultura
- Para pré-revestir as placas para cultura das células GFP-It-NES durante a proliferação ou diferenciação, diluir a poli-L-ornitina 1:100 em água deionizada e adicionar 5 mL da solução a um frasco de T25. Incubar durante a noite no RT.
- Lave as placas revestidas de poli-L-ornitina 1x com água deionizada e 1x com PBS.
- Para as células GFP-It-NES em proliferação, diluir a laminina do rato a 1:500 em PBS e incubar durante, pelo menos, 2 h a 37 °C. Para as células GFP-It-NES em diferenciação, diluir a laminina do rato a 1:100 em PBS e incubar durante, pelo menos, 2 h a 37 °C.
- Proliferação das células GFP-lt-NES
- Aqueça 5 mL (para lavagem) e 5 mL (para semeadura) de meio básico em dois tubos diferentes de 15 mL.
- Descongelar rapidamente um frasco para injetáveis de células GFP-lt-NES a 37 °C, transferi-las para o tubo de lavagem e centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
- Aspirar o meio cuidadosamente sem tocar no pellet, e ressuspender as células em 1 mL de meio básico pré-aquecido. Transfira a suspensão celular para o tubo de semeadura contendo meio básico suplementado com fatores de proliferação: EGF (10 ng/mL), bFGF (10 ng/mL) e B27 (10 ng/mL). Semeia as células num balão T25 revestido de poli-L-ornitina/laminina.
- Alimente as células com fatores de proliferação todos os dias. Substitua o meio se ele ficar amarelo. Passagem das células a cada três ou quatro dias (1 dia depois de atingirem 100% de confluência).
- Divisão das células GFP-lt-NES para proliferação e diferenciação
- Pré-aqueça 5 mL de meio básico por frasco (para coletar as células), mais o volume total necessário para resemeá-las.
NOTA: A passagem é feita em uma diluição de 1:3 para manter as células em proliferação, necessitando de 15 mL de meio básico, e uma diluição de 1:6 para iniciar a diferenciação, necessitando de 30 mL de meio básico. - Retirar o meio do balão de cultura celular por aspiração e adicionar 500 μL de tripsina pré-aquecida a 0,025%. Incubar por 5-10 min em RT. O descolamento das células pode ser confirmado sob um microscópio de luz padrão com ampliação de 10x.
- Adicionar um volume igual de inibidor de tripsina (concentração final de 0,5 mg/mL) seguido de 5 mL de meio básico quente. Desprenda e colete as células pipetando suavemente para cima e para baixo. Transfira as células para um tubo de 15 mL e centrifugar por 5 min a 300 x g.
- Para manter as células em proliferação, repor a uma diluição de 1:3 em meio básico fresco suplementado com factores de proliferação e repetir o passo 2.3.4.
- Pré-aqueça 5 mL de meio básico por frasco (para coletar as células), mais o volume total necessário para resemeá-las.
- Diferenciação cortical das células GFP-lt-NES
- No dia 0, ressuspender as células (a serem usadas para diferenciação) em 30 mL de meio básico suplementado com fatores de proliferação e plaqueá-las em seis frascos T25 revestidos por diferenciação (split 1:6).
- No dia 1, mude metade do meio para DDM e adicione fatores de proliferação à metade de sua concentração.
- No dia 2, mude completamente o meio para DDM suplementado com fatores de diferenciação: BMP4 (10 ng/mL), Wnt3a (10 ng/mL) e ciclopamina (400 ng/mL).
- No dia 4, adicione apenas os fatores de diferenciação. Substitua o meio se ele ficar amarelo.
- No dia 6, mude o meio para DDM suplementado com BMP4 e Wnt3a. A ciclopamina é removida nesta etapa.
- No dia 7, retire as células conforme indicado nas etapas 2.4.2 e 2.4.3.
| Meio Básico | Concentração de existências | Concentração final | Por 100 mL |
| DMEM/F12 com L-Glutamina | 1x | 98,7 mL | |
| Suplemento de N-2 | 100x | 1:100 | 1 mL |
| Glicose | 45% | 3,5 mL/L | 350 μL |
Tabela 4: Composição do meio de proliferação das células lt-NES (meio básico).
| Meio DDM | Concentração de existências | Concentração final | Por 100 mL |
| DMEM/F12 com L-Glutamina | 96 mL | ||
| N2 | 100 x | 1:100 | 1 mL |
| NEAA | 100 x | 1:100 | 1 mL |
| Piruvato de sódio | 100 mM | 1:100 | 1 mL |
| Fração BSA V | 7.5% | 6,6 mL/L | 660 μL |
| 2-mercaptoetanol | 50 nM | 7 μL/L | 0,7 μL |
| Glicose | 45% | 3,2 mL/L | 320 μL |
Tabela 5: Composição do meio definido por diferenciação (DDM) de células lt-NES.
3. Transplante das células GFP-lt-NES em fatias organotípicas de hACtx
NOTA: O tecido hACtx deve ser cultivado durante 1 semana antes do transplante celular. Para facilitar o procedimento de transplante, é necessário remover 2 mL do meio hACtx da parte superior da inserção para evitar que o tecido flutue.
- Ressuspender as células GFP-lt-NES corticicamente preparadas (a partir da etapa 2.5.6) em matriz de membrana basal pura a frio (ver Tabela de Materiais) a uma concentração de 1 x 105 células/μL e transferir a solução para um tubo estéril mais pequeno.
NOTA: Durante o procedimento de transplante, todos os materiais (pontas da pipeta, tubos, capilares, etc.) devem ser pré-resfriados para evitar a solidificação do gel. Descongele o gel da matriz da membrana basal no gelo por 30 minutos antes de seu uso. - Recolher a suspensão celular num capilar de vidro frio ligado a uma tetina de borracha para sucção. Injete a suspensão celular como pequenas gotas (aprox. 1 μL cada) esfaqueando a fatia de tecido semi-seco em vários locais.
- Incubar a 37 °C durante 30 min para que o gel se solidifique. Transfira a placa da incubadora de volta para o exaustor e adicione cuidadosamente 2 mL de meio hACtx ao topo da inserção para submergir completamente o tecido.
- Substitua o meio de cultura por um meio hACtx fresco uma vez por semana.
4. Validação
- Coloração das fatias hACtx
- No ponto de tempo desejado, retire as fatias do laboratório de cultura celular e remova-as da pastilha, imergindo-a em uma placa de Petri com PBS. Em seguida, transferir as fatias para vitrais utilizando uma pipeta de vidro invertido (ver a NOTA no passo 1.3.5) e fixá-las com paraformaldeído (PFA) a 4% durante a noite a 4 °C.
- Enxaguar 3x com KPBS por 15 min de cada vez e incubar durante a noite a 4 °C com solução de permeabilização (BSA a 0,02% e Triton X-100 a 1% em KPBS).
- No dia seguinte, adicionar solução bloqueadora (KPBS com Triton X-100 a 0,2%, BSA a 1%, azida de sódio [1:10.000] e soro de burro normal a 10%) e incubar durante a noite a 4 °C.
- Após o bloqueio, adicionar os anticorpos primários (ver Tabela 6 para as diluições) diluídos na solução de bloqueio e incubar durante 48 h a 4 °C.
- Lave 3x com solução de bloqueio sem adicionar soro por 15 min cada. Adicionar os anticorpos secundários diluídos em solução bloqueadora (ver Tabela 6 para as diluições) e incubar durante 48 h a 4 °C.
- Lavar 3x com solução de bloqueio sem soro e incubar durante 2 h a RT na coloração Hoechst diluída em solução de permeabilização (1:1.000).
- Lave 3x com KPBS, monte as fatias em lâminas de vidro usando um pincel e deixe-as secar. Finalmente, lave as lâminas com água deionizada, remova o excesso de água, adicione o meio de montagem e cubra com uma tampa de vidro. Mantenha as lâminas por pelo menos 24 horas no RT e guarde-as a 4 °C até a geração de imagens.
NOTA: Para anticorpos que marcam epítopos nucleares, realizar a recuperação de antígenos antes da permeabilização (etapa 4.1.2) com citrato de sódio (10 mM, pH 6,0) por 2 h a 65 °C.
- Braçadeira de patch de célula inteira
- No dia da gravação, preparar 1 L de líquido cefalorraquidiano artificial humano (haCSF), modificado para melhor corresponder ao ambiente cerebral humano (Tabela 7). Semelhante à solução de corte, faça aproximadamente 900 mL da solução com todos os ingredientes, exceto CaCl 2 dissolvido em água deionizada, e borbulhe com carbogênio por 15 min antes de adicionar o volume apropriado de 1 M de solução de CaCl2. Encher o balão volumétrico até à marca de 1 L e continuar a borbulhar no RT durante mais 15 minutos antes de iniciar a gravação e durante toda a experiência.
- Transfira as fatias de tecido da placa de cultura para a câmara de gravação no palco de um microscópio vertical que é constantemente perfundido com haCSF borbulhado a uma taxa de perfusão de 2 mL/min e aquecido a 34 °C usando um controlador de temperatura de banho.
- Puxe os capilares de vidro com um extrator de pipeta para uma resistência média de 3-5 MΩ e encha os capilares com solução interna à base de K-gluconato (Tabela 8) com um recém-adicionado 2-4 mg de biocitina para a identificação post-hoc das células registradas. O pH e a osmolaridade desta solução interna são 7,2-7,3 e 285-295 mOsm, respectivamente.
- No caso da gravação de células hospedeiras, obtenha uma visão geral aproximada da fatia com um objetivo de 4x e encontre uma célula de aparência saudável para corrigir com um objetivo de 40x. Em seguida, prossiga com a braçadeira de remendo de célula inteira padrão.
- No caso de registro celular enxertado, identifique a área do tecido com as células enxertadas usando uma objetiva 4x e um filtro de epifluorescência na faixa azul (460 nm) pela expressão do repórter GFP no enxerto. Em seguida, amplie a área localizada com uma objetiva de 40x e encontre uma célula enxertada expressando GFP para uma braçadeira de remendo de célula inteira padrão.
- Verifique o potencial de membrana em repouso (PGR) imediatamente após a entrada na célula e certifique-se de que a qualidade da gravação é boa. Registre todos os parâmetros de interesse (por exemplo, resistência da membrana [Ri], parâmetros AP, correntes de sódio e potássio e atividade sináptica) na tensão de célula inteira ou na configuração de pinça de corrente.
- Depois de coletar todos os dados necessários, retraia cuidadosamente a pipeta de gravação sem danificar ainda mais a célula para que ela possa ser identificada com imunocoloração post-hoc.
- Transferir o corte para a solução de PFA a 4% para posterior fixação e coloração, conforme descrito no passo 4.1. A estreptavidina é usada para imunomarcar as células cheias de biocitina durante as gravações.
| ANTICORPOS | Diluição | Anotações |
| Primário | ||
| Frango anti-GFP | 1:1000 | |
| Frango anti-MAP2 | 1:1000 | |
| Cabra anti-AiF1 | 1:100 | |
| Mouse anti-MBP | 1:1000 | Recuperação de antígenos necessária |
| Rato anti-SC123 | 1:2000 | |
| Coelho anti-NeuN | 1:1000 | |
| Coelho anti-Olig2 | 1:500 | |
| Coelho anti-Tmem119 | 1:200 | |
| Secundário | ||
| 488-conjugado AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | 1:500 | |
| 488-conjugado AffinityPure Donkey anti-coelho IgG | 1:500 | |
| 488-conjugado AffinityPure Donkey anti-frango IgG | 1:500 | |
| Afinidade conjugada Cy3Pure Donkey anti-frango IgG | 1:500 | |
| Afinidade conjugada Cy3Pure Donkey anti-cabra IgG | 1:500 | |
| Afinidade conjugada Cy3Pure Donkey anti-rato IgG | 1:500 | |
| Alexa fluor 647-conjugado Streptavidin | 1:500 |
Tabela 6: Lista de anticorpos primários e secundários para imuno-histoquímica.
| haCSF | Concentração de existências | Concentração final [mM] | Por 1 L |
| NaCl | Pó | 129 | 7,54 gr |
| NaHCO3 | Pó | 21 | 1,76 gr |
| Glicose | Pó | 10 | 1,80 gr |
| Kcl | Pó | 3 | 0,22 gr |
| NaH2PO4 | Pó | 1.25 | 0,17 gr |
| MgSO4 | 1 milh | 2 | 2 mL |
| CaCl2 | 1 milh | 1.6 | 1,6 mL |
Tabela 7: Composição do líquido cefalorraquidiano artificial (haCSF).
| Solução interna de K-gluconato | Concentração de existências | Concentração final [mM] | Por 100 mL |
| K-gluconato | Pó | 122.5 | 2,87 gr |
| Kcl | Pó | 12.5 | 93,18 mg |
| NaCl | Pó | 8 | 46,76 mg |
| HEPES | Pó | 10 | 238,32 mg |
| MgATP | Pó | 2 | 101,4 mg |
| Na3GTP | Pó | 0.3 | 17,0 mg |
| Nota: Ajuste o pH com KOH/HCl | |||
Tabela 8: Composição da solução interna à base de K-gluconato.
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Representative Results
Seguindo o protocolo descrito, o tecido hACtx de um paciente com epilepsia do lobo temporal foi coletado e processado, conforme explicado acima. Alguns cortes foram fixados após 24 h em cultura para estudar o ponto de partida do tecido hospedeiro. A análise de diferentes populações de células neurais, como neurônios (expressando NeuN e Map2, Figura 1A), oligodendrócitos (Olig2 e MBP, Figura 1B) e astrócitos (GFAP humano-específico, também chamado STEM123, Figura 1C) mostrou preservação ótima do tecido.
O próximo passo foi estudar como as condições de cultura afetam a viabilidade neuronal no tecido humano. Para tanto, a coloração de NeuN e Map2 foi realizada após 2 semanas de cultura. No momento estudado, a expressão de ambos os marcadores neuronais ainda estava presente no tecido (Figura 2A). Além disso, foram realizados registros eletrofisiológicos para avaliar a funcionalidade. Os registros utilizando o grampo de remendo de células inteiras mostraram que os neurônios tinham RMP sustentada (-70 mV em média) e resistência à entrada de membrana (Ri) (300 MΩ em média), comparável aos neurônios de preparações agudas21,23. No geral, as células eram ligeiramente menos ativas do que no tecido fresco, embora a maioria das células ainda fosse capaz de disparar pelo menos um (Figura 2B-E), se não múltiplos, potenciais de ação (APs, Figura 2F-I), e correntes rápidas de sódio para dentro e lentas de potássio para fora estavam presentes após injeções de corrente de passo no modo voltagem-clamp (Figura 2C-E, G-I). Tomados em conjunto, esses registros indicaram que os neurônios em culturas organotípicas eram relativamente saudáveis e exibiam propriedades intrínsecas neurofisiológicas típicas.
Além disso, o efeito da cultura na ativação da micróglia foi avaliado pelas colorações Tmem119 e Iba1 em 24 h (Figura 3A) e 2 semanas de tecido cultivado (Figura 3B). Como esperado, algumas alterações na aparência microglial foram observadas. Após 2 semanas em cultura, eles se tornaram menos ramificados e adquiriram uma morfologia mais ativada em comparação com o tecido agudo.
Após a caracterização do tecido hospedeiro, o transplante dos progenitores derivados de células lt-NES foi realizado da seguinte forma. As células GFP-lt-NES foram diferenciadas por 7 dias e enxertadas em tecido hACtx cultivado em 1 semana (Figura 4A). Uma visão geral do transplante foi observada usando imuno-histoquímica com GFP (Figura 4B,C). Os resultados foram comparados com os de transplantes prévios em tecido mal preservado devido à maior janela de tempo entre a ressecção e o plaqueamento. As imagens mostram que, no sistema ótimo, 4 semanas após o transplante ex vivo, as células enxertadas de GFP-lt-NES apresentaram neurites estendidas e arborizações extensas e complexas em toda a cultura organotípica (Figura 4B). O tecido mal preservado não permitiu o transplante bem-sucedido devido à baixa conectividade do hospedeiro. Quase nenhuma célula enxertada sobreviveu; além disso, detritos e marcação inespecífica de anticorpos em células mortas foram amplamente observados em todo o corte humano (Figura 4C).
Em relação às propriedades eletrofisiológicas das células enxertadas, verificou-se que, no caso de transplante bem-sucedido, as células tornaram-se não apenas neurônios maduros morfologicamente, mas também funcionalmente ativos, com APs repetitivas e muitas vezes espontâneas, correntes rápidas de sódio para dentro e lentas de potássio para fora e certo nível de atividade sináptica, indicando integração funcional do enxerto com o tecido hospedeiro 4 semanas após o enxerto (Figura 4D-H).
Figura 1: Caracterização das diferentes populações celulares no tecido hACtx após 24 h em cultura. Imagens confocais representativas do tecido hACtx mostrando a presença de neurônios (A) (expressando NeuN e Map2), (B) oligodendrócitos (Olig2 e MBP) e (C) astrócitos (GFAP específica para humanos [STEM123]). A coloração nuclear (Ho: Hoechst, azul) está incluída nos painéis individuais e fundidos. Barra de escala = 20 μm. As setas brancas indicam a colocalização. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Caracterização e propriedades eletrofisiológicas dos neurônios hACtx após 2 semanas em cultura organotípica. (A) Imagens confocais representativas do tecido hACtx mostrando expressão de NeuN e Map2. (B-I) Exemplos dos neurônios corticais registrados no tecido hACtx de 2 semanas de idade. (B,F) Rotulagem de biocitotina do neurônio gravado (vermelho), juntamente com coloração nuclear (Ho: Hoechst, azul), incluída em um painel mesclado. Barras de escala = 20 μm. Traços de gravação de patch de célula inteira mostrando exemplos de uma célula com (C-E) único ou (G-I) múltiplos APs. As APs foram induzidas por (C,G) um passo de 250 pA, ou (D,H) uma injeção de corrente com rampa de 0 a 300 pA no RMP. As inserções indicam uma visão ampliada de um dos APs em cada caso. (E,I) Correntes internas de sódio e de potássio para fora foram observadas em ambos os exemplos de células nas etapas de despolarização de tensão aplicadas a partir de -70 mV em incrementos de 10 mV no modo tensão-braçadeira. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caracterização da população de micróglias no tecido hACtx. Imagens confocais do tecido hACtx mostrando a expressão de Iba1 e Tmem119 após (A) 24 h e (B) 2 semanas em cultura. A coloração nuclear (Ho: Hoechst, azul) está incluída nos painéis individuais e fundidos. Barra de escala = 20 μm. As setas brancas indicam a colocalização. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Visão geral e propriedades eletrofisiológicas de neurônios derivados de células lt-NES 4 semanas após o transplante ex vivo de células GFP-lt-NES. (A) Desenho experimental. Diff = diferenciação. (B,C) Quadros confocais representativos de células GFP-lt-NES enxertadas em (B) tecido hACtx bem preservado e (C) mal preservado. Barras de escala = 50 μm. (D) Exemplo de vestígio de um neurônio derivado do enxerto disparando espontaneamente APs. A inserção indica uma exibição ampliada de um dos APs. APs repetitivos podem ser induzidos por uma injeção de corrente despolarizante (E) passo (50 pA) ou (F) rampada, de 0 a 300 pA) do potencial de -70 mV. (G) As correntes internas de sódio e de potássio para fora foram induzidas por etapas despolarizantes de 10 mV no modo tensão-pinça a partir de um potencial de retenção de -70 mV. (H) No modo voltagem-clamp, correntes pós-sinápticas espontâneas (sPSCs) puderam ser observadas nos neurônios derivados do enxerto a um potencial de retenção de -70 mV. As inserções indicam uma visão ampliada de algumas das sPSCs. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Obter fatias hACtx de qualidade suficientemente alta é a etapa mais crítica neste protocolo. O tecido cortical é obtido de pacientes epilépticos submetidos à cirurgia ressectiva24. A qualidade do tecido ressecado, bem como o tempo de exposição do tecido entre a ressecção e a cultura, é fundamental; quanto mais rápido o tecido for transferido da sala de cirurgia para o laboratório e cortado, mais ideal será a cultura organotípica. Idealmente, o tecido deve ser cortado e transferido para o laboratório de cultura de células nas primeiras horas após a coleta. A oxigenação do tecido durante este processo também melhora a qualidade das fatias. Nesse sentido, quanto maior a amostra de tecido, menor a concentração de oxigênio que atinge o núcleo e, portanto, menor a viabilidade se o tecido não for cortado a tempo. Se a qualidade do tecido hospedeiro não for a ideal, a validação das terapias com células-tronco não será possível.
Quando o tecido cortical é transferido do cérebro humano para uma placa, algumas limitações devem ser levadas em conta. Durante o processo de corte, um grande número de axônios é dissecado, induzindo danos neuronais que levarão a processos inflamatórios, como a ativação da micróglia25. Por esse motivo, mesmo que o tecido seja considerado saudável quando localizado no cérebro humano, o comportamento celular em cultura pode ser diferente devido aos danos parciais sofridos durante a ressecção e preparo dos cortes organotípicos26,27. Alterações na população de micróglias poderiam ser monitoradas por meio de diferentes técnicas, incluindo a mensuração dos níveis de citocinas liberadas ou a avaliação de alterações morfológicas28. É importante ressaltar que, embora a ativação da micróglia tenha sido observada em 2 semanas em cultura como resultado da mudança no ambiente de um órgão inteiro para condições de cultura ex vivo, os neurônios ainda eram viáveis neste momento, como mostrado pela coloração neuronal e pela análise de suas propriedades eletrofisiológicas. Fatias de tecido mais espessas são melhor preservadas; no entanto, a penetração de nutrientes na parte interna do corte é afetada, resultando em morte parcial do tecido. Por esta razão, 300 μm é a espessura ideal para a cultura organotípica.
Culturas organotípicas de tecido hACtx têm vantagens claras em comparação com outros métodos de cultura 3D, como organoides ou esferoides. A fonte é um cérebro humano totalmente desenvolvido, o que significa que o ambiente celular e matricial, bem como o estado de maturação das diferentes populações celulares, são os mesmos geralmente encontrados no cérebro humano adulto25,29,30. Os organoides são mais semelhantes aos tecidos fetais, o que é ideal para alguns campos de pesquisa, como a modelagem de distúrbios do desenvolvimento31, mas não, por exemplo, para o estudo de doenças neurodegenerativas, que acometem principalmente a população adulta e têm início tardio32,33. Mais importante ainda, a cultura organotípica do tecido humano é, até o momento, o único sistema humano que permite a validação de terapias celulares.
A maior parte do conhecimento sobre o transplante de células-tronco para reposição neuronal em distúrbios neurodegenerativos é derivada da modelagem animal in vivo. Embora esses sistemas sejam extremamente valiosos para avaliar o efeito modulador das células transplantadas no circuito do hospedeiro danificado, infelizmente, as terapias testadas nessa configuração normalmente falham quando traduzidas para a clínica devido às claras diferenças entre roedores e humanos34. Por essa razão, a cultura organotípica do tecido hACtx é uma excelente estratégia para modelar doenças neurodegenerativas humanas que afetam o córtex devido à possibilidade de estudar as interações entre populações neurais humanas e a preservação da estrutura cerebral humana25.
Em resumo, esta metodologia combinada de culturas organotípicas de longo prazo do córtex humano adulto e transplante intracortical ex vivo de progenitores corticais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas é uma estratégia promissora para a validação de terapias baseadas em células-tronco, o que pode facilitar a tradução clínica de estratégias de substituição neuronal para estimular a recuperação funcional no cérebro danificado.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado por doações do Conselho Sueco de Pesquisa, da Fundação Sueca do Cérebro, da Fundação Sueca de AVC, da Região de Skåne, da Fundação Thorsten e Elsa Segerfalk e da Iniciativa do Governo Sueco para Áreas de Pesquisa Estratégicas (StemTherapy).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Cutting and electrophysiology | |||
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
| Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
| Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2x91 | |
| Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
| Plastic Petri dish | Any suitable | ||
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
| Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| RINSING SOLUTION | |||
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
| Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| Forceps | Any suitable | ||
| Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
| GENERATION OF lt-NES cells | |||
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
| Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
| Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
| Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
| Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
| Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
| Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
| T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
| Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
| Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
| Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
| Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
| Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
| Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
| Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
| Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
| Paint brush | Any suitable | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
| Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
| Distilled water | |||
| Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
| Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
| Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
| Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium citrate | |||
| Distilled water | |||
| Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
| Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
| Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
References
- Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).
- Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work. Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).
- Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).
- Tornero, D., et al. Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli. Brain. 140 (3), 692-706 (2017).
- Palma-Tortosa, S., et al. Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).
- Robinson, N. B., et al. The current state of animal models in research: A review. International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Delavaran, H., et al. Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke. European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).
- Sabuncu, M. R., et al. The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease. Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).
- Eugene, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
- Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
- Kalmbach, B. E., et al. Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons. Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).
- Barth, M., et al. Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54 (2021).
- Almeida, G. M., et al. Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response. Frontiers in Neuroscience. 15, 674576 (2021).
- Schwarz, N., et al. Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures. Scientific Reports. 7, 12249 (2017).
- Miskinyte, G., et al. Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 207 (2017).
- Gronning Hansen, M., et al. Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry. Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).
- Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS One. 7 (1), 29597 (2012).
- Avaliani, N., et al. Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors. Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).
- Engel, J., et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).
- Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).
- Verwer, R. W., et al. Injury response of resected human brain tissue in vitro. Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).
- Verwer, R. W., et al. Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue. Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).
- Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Schwarz, N., et al. Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease. Elife. 8, 48417 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Wang, Z., et al. Organoid technology for brain and therapeutics research. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).
- Wang, H. Modeling neurological diseases with human brain organoids. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).
- Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).
