Summary
Denne protokollen beskriver langsiktige organotypiske kulturer av voksen human cortex kombinert med ex vivo intrakortikal transplantasjon av induserte pluripotente stamcelleavledede kortikale progenitorer, som presenterer en ny metodikk for ytterligere å teste stamcellebaserte terapier for humane nevrodegenerative lidelser.
Abstract
Neurodegenerative lidelser er vanlige og heterogene når det gjelder symptomer og cellulær påvirkning, noe som gjør studien komplisert på grunn av mangel på riktige dyremodeller som fullt ut etterligner menneskelige sykdommer og den dårlige tilgjengeligheten av menneskelig hjernevev etter døden. Voksen human nervevevskultur gir mulighet til å studere ulike aspekter av nevrologiske lidelser. Molekylære, cellulære og biokjemiske mekanismer kan lett adresseres i dette systemet, samt testing og validering av medisiner eller forskjellige behandlinger, for eksempel cellebaserte terapier. Denne metoden kombinerer langsiktige organotypiske kulturer av den voksne humane cortex, oppnådd fra epileptiske pasienter som gjennomgår resektiv kirurgi, og ex vivo intrakortikal transplantasjon av induserte pluripotente stamcelleavledede kortikale progenitorer. Denne metoden vil tillate studier av celleoverlevelse, nevrondifferensiering, dannelse av synaptiske innganger og utganger, og de elektrofysiologiske egenskapene til humanavledede celler etter transplantasjon i intakt voksent humant kortikalt vev. Denne tilnærmingen er et viktig skritt før utviklingen av en 3D-modelleringsplattform for menneskelig sykdom som vil bringe grunnforskning nærmere den kliniske oversettelsen av stamcellebaserte terapier for pasienter med forskjellige nevrologiske lidelser og tillate utvikling av nye verktøy for å rekonstruere skadede nevrale kretser.
Introduction
Neurodegenerative lidelser, som Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom eller iskemisk slag, er en gruppe sykdommer som deler fellestrekk ved nevronfeil eller død. De er heterogene når det gjelder hjerneområdet og nevronpopulasjonen som er berørt. Dessverre er behandlinger for disse sykdommene knappe eller av begrenset effekt på grunn av mangel på dyremodeller som etterligner det som skjer i den menneskelige hjerne 1,2. Stamcelleterapi er en av de mest lovende strategiene for hjernens regenerering3. Genereringen av nevronale forfedre fra stamceller fra forskjellige kilder har blitt sterkt utviklet de siste årene 4,5. Nylige publikasjoner har vist at humane induserte pluripotente stamme (iPS) celleavledede langsiktige selvfornyende neuroepithelial-lignende stammeceller (lt-NES), etter en kortikal differensieringsprotokoll og etter intrakortikal transplantasjon i en rottemodell med iskemisk hjerneslag som påvirker den somatosensoriske cortex, genererer modne kortikale nevroner. I tillegg mottok de transplantatavledede nevronene afferente og efferente synaptiske forbindelser fra vertsnevronene, som viser deres integrasjon i rotteneuronnettverket 6,7. De transplantatavledede aksonene ble myeliniserte og funnet i forskjellige områder av rottehjernen, inkludert peri-infarktområdet, corpus callosum og kontralateral somatosensorisk cortex. Viktigst av alt, iPS-celleavledet transplantasjon reverserte motoriske underskudd hos slagdyr7.
Selv om dyremodeller bidrar til å studere transplantasjonsoverlevelse, nevronintegrasjon og effekten av de transplanterte cellene på motoriske og kognitive funksjoner, mangler informasjon om interaksjon mellom humane celler (graft-host) i dette systemet 8,9. Av denne grunn er en kombinert metode for langsiktig human hjerneorganotypisk kultur med ex vivo-transplantasjon av humane iPS-celleavledede nevronale progenitorer beskrevet her. Menneskelige hjerneorganotypiske kulturer hentet fra nevrokirurgiske reseksjoner er fysiologisk relevante 3D-modeller av hjernen som tillater forskere å øke forståelsen av menneskets sentralnervesystemkretsløp og den mest nøyaktige måten å teste behandlinger for humane hjernesykdommer. Imidlertid har det ikke blitt gjort nok forskning i denne sammenhengen, og i de fleste tilfeller har menneskelige hippocampus-hjerneorganotypiske kulturer blitt brukt10,11. Hjernebarken påvirkes av flere neurodegenerative lidelser, som iskemisk slag12 eller Alzheimers sykdom13, så det er viktig å ha et humant kortikal 3D-system som gjør at vi kan utvide vår kunnskap og teste og validere ulike terapeutiske strategier. Flere studier de siste årene har brukt kulturer fra voksent humant kortikalt (hACtx) vev for å modellere menneskelige hjernesykdommer 14,15,16,17,18,19; Imidlertid er begrenset informasjon tilgjengelig i sammenheng med stamcellebehandling. To studier har allerede vist gjennomførbarheten av systemet beskrevet her. I 2018 ble humane embryonale stamceller programmert med forskjellige transkripsjonsfaktorer og transplantert i hACtx-vev vist å gi opphav til modne kortikale nevroner som kunne integreres i voksne humane kortikale nettverk20. I 2020 avslørte transplantasjonen av lt-NES-celler i det humane organotypiske systemet deres evne til å differensiere til modne, lagspesifikke kortikale nevroner med de elektrofysiologiske egenskapene til funksjonelle nevroner. De podede nevronene etablerte både afferente og efferente synaptiske kontakter med de humane kortikale nevronene i de voksne hjerneskivene, som bekreftet av rabiesvirus retrograd monosynaptisk sporing, helcellelapp-klemmeopptak og immunelektronmikroskopi21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene godkjent av regional etisk komité, Lund, Sverige (etisk tillatelsesnummer 2021-07006-01). Friskt neokortikalt vev ble innhentet fra pasienter som gjennomgikk elektiv kirurgi for temporallappsepilepsi. Informert samtykke ble innhentet fra alle pasientene.
MERK: Alle oppnådde vev ble behandlet uavhengig av størrelsen. Imidlertid vil vev mindre enn 1-1,5 mm3 i størrelse være teknisk utfordrende å håndtere og seksjonere med en vibratom.
1. Vevsinnsamling, vedlikehold, skjæring og plating
- Forberedelser dagen før vevsskiver
- Forbered 2 liter skjæreløsning (tabell 1) i en volumetrisk kolbe. Løs opp alle ingrediensene unntatt MgCl 2 og CaCl2 i ~1,800 ml avionisert vann og boble med karbogengass i 15 minutter. Tilsett deretter passende mengder 1 M MgCl 2- og CaCl2-løsninger og fortsett å boble i ytterligere 15 minutter. Til slutt fyller du kolben til 2 L-merket; Kontroller pH og osmolaritet og juster om nødvendig. Frys ned 2 x 350 ml av den tilberedte oppløsningen og oppbevar resten ved 4 °C.
MERK: pH og osmolaritet er typisk henholdsvis 7,3-7,4 og 295-300 mOsm. - Tilbered 100 ml skylleoppløsning (tabell 2). Løs opp 476 mg HEPES og 200,6 mg glukose i 100 ml HBSS supplert med 5 ml penicillin / streptomycin. Dette kan oppbevares ved 4 °C i opptil 10 dager.
- Forbered humant voksent kortikal (hACtx) kulturmedium (hACtx medium) (tabell 3) og filtrer det i cellekulturlaboratoriet under en ventilert hette. Mediet består av nevronalt medium uten fenolrødt (se materialtabellen), B27-supplement, L-glutamin (se materialtabellen) og gentamicin. Oppbevares ved 4 °C i opptil 2 uker.
- Forbered 2 liter skjæreløsning (tabell 1) i en volumetrisk kolbe. Løs opp alle ingrediensene unntatt MgCl 2 og CaCl2 i ~1,800 ml avionisert vann og boble med karbogengass i 15 minutter. Tilsett deretter passende mengder 1 M MgCl 2- og CaCl2-løsninger og fortsett å boble i ytterligere 15 minutter. Til slutt fyller du kolben til 2 L-merket; Kontroller pH og osmolaritet og juster om nødvendig. Frys ned 2 x 350 ml av den tilberedte oppløsningen og oppbevar resten ved 4 °C.
- Forberedelser på operasjonsdagen før vevsprøvene kommer
- Kontroller tilgjengeligheten av nødvendig utstyr og laboratorieplass, og rengjør grundig alle kirurgiske verktøy og vibratomen (se materialfortegnelsen), samt benkeplaten, med destillert vann (uten vaskemiddel), etterfulgt av 70% etanol. La etanolen tørke i minst 30 minutter før du bruker verktøy og utstyr.
- Knus den frosne skjæreløsningen og boble "suppen" av is og væske med karbogengass i 30 minutter. Deretter lukker du en av beholderne tett med den knuste løsningen '' suppe '' og legg den i isboksen. Dette vil bli brukt til å samle vevet fra operasjonsrommet.
- Kalibrer vibratomet og still inn skjæreparametrene: 0,05 mm/s hastighet og 1,7 mm vibrasjon. Plasser skjærekammeret på et vibratomtrinn og start kjøleren som er koblet til den, slik at kammeret har en konstant temperatur på -3 °C.
- Forbered skiveoppsamlingskammeret med innsatser for å plassere vevskivene og skjæreløsningen, bobler det hele tiden med karbogengass ved romtemperatur (RT).
- I cellekulturlaboratoriet og under en ventilert hette, plasser kulturinnsatsene i en 6-brønnsplate ved hjelp av tang. Tilsett 5 ml hACtx-medium på bunnen av innsatsen til den kommer i kontakt med membranen, unngå dannelse av bobler, og tilsett 2 ml på toppen av innsatsen. Øk vekten i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO 2 i minst2 timer før vevsskivene overføres til innsatsene.
- Vevsinnsamling og kutting prosedyrer
- Umiddelbart etter reseksjon, samle vevet fra pasienten i operasjonsrommet, om mulig, direkte inn i en beholder med frosset, boblet og knust skjæreløsning. Overfør den lukkede beholderen på is umiddelbart til skjæreområdet på laboratoriet.
- Inspiser vevet og finn den beste overflaten for å lime (se trinn 1.3.3) det til skjæretrinnet i vibratomet, med tanke på orienteringen av de kortikale lagene. Klipp om nødvendig den ujevne overflaten med en skalpell slik at det er enkelt å plassere vevet på scenen for optimal skiveorientering.
- Lim vevet til scenen med vevlim (se materialfortegnelsen), legg det i skivekammeret, og fyll kammeret umiddelbart med kaldboblet skjæreløsning. Fortsett boblen under hele skjæreprosessen.
- Skjær koronale eller sagittale skiver, avhengig av vev-til-blad-orienteringen, med en tykkelse på 300 μm for å inneholde alle kortikale lag og, om mulig, det hvite stoffet. Legg skivene i oppsamlingskammeret med boblende skjæreløsning på RT.
MERK: Kutt fra den hvite substanssiden mot overflaten av cortex. Ikke fjern meningene, da dette kan skade vevet. Skjærebladet skjærer vanligvis lett gjennom dem. - Når alt vevet er kuttet, overfør skivene til en steril petriskål med skylleløsning på RT og transporter dem til cellekulturlaboratoriet. Dette trinnet er nødvendig for å fjerne overflødig sukrose fra skivene før de overføres til kulturplaten.
NOTAT: For å overføre skivene (i dette og følgende trinn), bruk en omvendt glasspipette, bryt av den tynnere delen og legg en gummismokk for suging.
- Dyrkning og vedlikehold av hACtx vevsskiver
- Legg vevskivene individuelt på toppen av de allerede våte og nedsenkede innsatsene. Etter 24 timer, bytt medium for ytterligere å fjerne gjenværende sukrose eller andre gjenværende stoffer fra skjæreprosedyrene.
- Bytt ut kulturmediet med friskt medium hver 7. Etter 2 uker, bruk hACtx medium uten gentamicin. Kulturen kan opprettholdes i opptil 2 måneder.
MERK: Likevekter hACtx-mediet i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO 2 i minst2 timer før middels endring. Friskt medium bør tilberedes hver 2. uke. Kontroller skivene hver 2-3 dag, og hvis noe av mediet har fordampet, tilsett mer på toppen av innsatsen.
| Skjærende løsning | Konsentrasjon av aksjer | Endelig konsentrasjon [mM] | Per 1 L |
| Sukrose | Pudder | 200 | 68,46 g |
| NaHCO3 | Pudder | 21 | 1,76 g |
| KCl | Pudder | 3 | 0,22 g |
| NaH2PO4 | Pudder | 1.25 | 0,17 g |
| Glukose | Pudder | 10 | 1,80 g |
| MgSO4 | 1 M | 2 | 2 ml |
| CaCl2 | 1 M | 1.6 | 1,6 ml |
| MgCl2 | 2 M | 2 | 1 ml |
Tabell 1: Sammensetning av skjæreløsning. MgCl 2 og CaCl2 brukes som ferdigpreparerte 1 M-løsninger i avionisert vann.
| Skylling løsning | Konsentrasjon av aksjer | Endelig konsentrasjon | Per 100 ml |
| HBSS | 1x | 95 ml | |
| PenStrep | 10 000 U/ml | 500 U/ml | 5 ml |
| HEPES | Pudder | 4,76 g/l | 476 mg |
| Glukose | Pudder | 2 g/l | 200,6 mg |
Tabell 2: Sammensetning av skylleløsning.
| hACtx medium | Konsentrasjon av aksjer | Endelig konsentrasjon | Per 100 ml | |
| Nevronalt medium uten fenolrødt | 97,4 ml | se Materialfortegnelse | ||
| B27 | 50x | 1:50 | 2 ml | |
| L-glutamin | 100x | 1:200 | 500 μL | se Materialfortegnelse |
| Gentamicin | 50 mg/ml | 1:1000 | 100 μL |
Tabell 3: Sammensetning av hACtx medium.
2. Spredning og differensiering av lt-NES-celler
MERK: Lt-NES-celler genereres som tidligere beskrevet21,22 og transduceres med en lentiviral vektor som bærer grønt fluorescerende protein (GFP) under en konstitutiv promotor (GFP-lt-NES-celler). Hetteglass inneholdende 3 x 106 celler oppbevares ved −150 °C inntil bruk.
- Utarbeidelse av lagerløsninger og media
- Fortynn 100 μg basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF) i 10 ml PBS-0,1% BSA for å ha en lagerkonsentrasjon på 10 μg / ml. Forbered 100 μL alikoter.
- Fortynn 100 μg epidermal vekstfaktor (EGF) i 10 ml PBS-0,1% BSA for å ha en lagerkonsentrasjon på 10 μg / ml. Forbered 100 μL alikoter.
- Aliquot 50x B27 supplerer i et volum på 100 μL per alikot.
- Fortynn 10 mg poly-L-ornitin i 100 ml avionisert vann for å ha en lagerkonsentrasjon på 100 μg / ml. Lag 1 ml alikoter.
- Tilbered 30 μL alikoter med 1,20 mg/ml muselaminin.
- Fortynn 10 ml trypsin-EDTA (0,25 %) i 90 ml PBS til en stamkonsentrasjon på 0,025 %. Forbered 1 ml alikoter.
- Fortynn 0,025 g trypsinhemmer i 50 ml PBS til en lagerkonsentrasjon på 0,5 mg/ml. Forbered 1 ml alikoter.
- Fortynn 10 μg Wnt3a (Wingless-type MMTV integration site family member 3A) i 1 ml PBS-0.1% BSA for å ha en lagerkonsentrasjon på 10 μg / ml. Forbered BMP4 (benmorfogenetisk protein 4) på samme måte. Aliquot i et volum på 100 μL.
- Fortynn 1 mg cyklopamin i 2,5 ml DMSO til en endelig konsentrasjon på 400 μg / ml, og lag 100 μL alikoter.
- Tilbered basalmedium (tabell 4) og differensieringsdefinert medium (DDM, tabell 5), og oppbevares ved 4 °C i opptil 2 uker.
- Belegg av kulturretter
- For å forhåndsbelegge oppvasken til kultur av GFP-It-NES-cellene under spredning eller differensiering, fortynn poly-L-ornitin 1:100 i avionisert vann og tilsett 5 ml av løsningen til en T25-kolbe. Inkubere over natten på RT.
- Vask poly-L-ornitinbelagte plater 1x med avionisert vann og 1x med PBS.
- For GFP-It-NES-celler i spredning, fortynn muselaminin ved 1:500 i PBS og inkuber i minst 2 timer ved 37 °C. For GFP-It-NES-celler i differensiering, fortynn muselaminin ved 1:100 i PBS og inkuber i minst 2 timer ved 37 °C.
- Spredning av GFP-lt-NES-cellene
- Varm 5 ml (til vask) og 5 ml (til såing) basismedium i to forskjellige 15 ml rør.
- Tine ett hetteglass med GFP-lt-NES-celler raskt ved 37 °C, overfør dem til vaskerøret og sentrifuger ved 300 x g i 5 minutter.
- Aspirer mediet forsiktig uten å berøre pelleten, og resuspender cellene i 1 ml forvarmet basisk medium. Overfør cellesuspensjonen til sårøret som inneholder basisk medium supplert med proliferasjonsfaktorer: EGF (10 ng / ml), bFGF (10 ng / ml ) og B27 (10 ng / ml). Frø cellene på en poly-L-ornitin / lamininbelagt T25-kolbe.
- Fôr cellene med spredningsfaktorer hver dag. Bytt ut mediet hvis det blir gult. Pass cellene hver tredje eller fjerde dag (1 dag etter at de når 100% sammenløp).
- Splitting av GFP-lt-NES-cellene for spredning og differensiering
- Forvarm 5 ml basismedium per kolbe (for å samle cellene), pluss det totale volumet som trengs for å frø dem på nytt.
MERK: Passasjen er gjort ved en 1: 3 fortynning for å holde cellene i spredning, krever 15 ml basisk medium, og en 1: 6 fortynning for å starte differensiering, som krever 30 ml basisk medium. - Fjern mediet fra cellekulturkolben ved aspirasjon, og tilsett 500 μL forvarmet 0, 025% trypsin. Inkuber i 5-10 min ved RT. Løsningen av cellene kan bekreftes under et standard lysmikroskop ved 10x forstørrelse.
- Legg til et likt volum trypsinhemmer (0,5 mg/ml endelig konsentrasjon) etterfulgt av 5 ml varmt basisk medium. Løsne og samle cellene ved å pipettere forsiktig opp og ned. Overfør cellene til et 15 ml rør og sentrifuge i 5 minutter ved 300 x g.
- For å holde cellene i proliferasjon, replate ved en 1: 3 fortynning i fersk basisk medium supplert med proliferasjonsfaktorer, og gjenta trinn 2.3.4.
- Forvarm 5 ml basismedium per kolbe (for å samle cellene), pluss det totale volumet som trengs for å frø dem på nytt.
- Kortikal differensiering av GFP-lt-NES-cellene
- På dag 0, resuspender cellene (som skal brukes til differensiering) i 30 ml basisk medium supplert med proliferasjonsfaktorer, og plate dem i seks differensieringsbelagte T25-kolber (delt 1: 6).
- På dag 1, bytt halvparten av mediet til DDM, og legg til spredningsfaktorer ved halvparten av konsentrasjonen.
- På dag 2, endre mediet helt til DDM supplert med differensieringsfaktorer: BMP4 (10 ng / ml), Wnt3a (10 ng / ml) og cyklopamin (400 ng / ml).
- På dag 4 legger du til differensieringsfaktorene alene. Bytt ut mediet hvis det blir gult.
- På dag 6, bytt medium til DDM supplert med BMP4 og Wnt3a. Syklopaminet fjernes på dette trinnet.
- På dag 7 løsner du cellene som angitt i trinn 2.4.2 og trinn 2.4.3.
| Grunnleggende medium | Konsentrasjon av aksjer | Endelig konsentrasjon | Per 100 ml |
| DMEM/F12 med L-glutamin | 1x | 98,7 ml | |
| N-2 supplement | 100x | 1:100 | 1 ml |
| Glukose | 45% | 3,5 ml/l | 350 μL |
Tabell 4: Sammensetning av proliferasjonsmedium av lt-NES-celler (basisk medium).
| DDM medium | Konsentrasjon av aksjer | Endelig konsentrasjon | Per 100 ml |
| DMEM/F12 med L-glutamin | 96 ml | ||
| N2 | 100 x | 1:100 | 1 ml |
| NEAA | 100 x | 1:100 | 1 ml |
| Natriumpyruvat | 100 mM | 1:100 | 1 ml |
| BSA V-fraksjon | 7.5% | 6,6 ml/l | 660 μL |
| 2-merkaptoetanol | 50 nM | 7 μL/L | 0,7 μL |
| Glukose | 45% | 3,2 ml/l | 320 μL |
Tabell 5: Sammensetning av differensieringsdefinert medium (DDM) av lt-NES-celler.
3. Transplantasjon av GFP-lt-NES-cellene i organotypiske hACtx-skiver
MERK: hACtx-vevet skal dyrkes i 1 uke før celletransplantasjon. For å lette transplantasjonsprosedyren er det nødvendig å fjerne 2 ml av hACtx-mediet fra toppen av innsatsen for å forhindre at vevet flyter.
- Resuspender de kortikalt primede GFP-lt-NES-cellene (fra trinn 2.5.6) i kald, ren kjellermembranmatrise (se materialtabellen) i en konsentrasjon på 1 x 105 celler/μL og overfør oppløsningen til et mindre sterilt rør.
MERK: Under transplantasjonsprosedyren skal alle materialer (pipettespisser, rør, kapillær, etc.) forkjøles for å unngå gelstørkning. Tine matriksgelen i kjellermembranen på is i 30 minutter før bruk. - Samle cellesuspensjonen i en kald glasskapillær koblet til en gummismokk for suging. Injiser cellesuspensjonen som små dråper (ca. 1 μL hver) ved å stikke den halvtørre vevsskiven på forskjellige steder.
- Inkuber ved 37 °C i 30 minutter for at gelen skal stivne. Overfør platen fra inkubatoren tilbake til hetten, og tilsett forsiktig 2 ml hACtx-medium til toppen av innsatsen for å senke vevet helt.
- Bytt ut kulturmediet med ferskt hACtx-medium en gang i uken.
4. Godkjenning
- Farging av hACtx-skivene
- På ønsket tidspunkt, ta ut skivene fra cellekulturlaboratoriet, og fjern dem fra innsatsen ved å senke den i en petriskål med PBS. Deretter overføres skivene til farget hetteglass ved hjelp av en invertert glasspipette (se NOTE i trinn 1.3.5), og fikser dem med 4 % paraformaldehyd (PFA) over natten ved 4 °C.
- Skyll 3x med KPBS i 15 min hver gang, og inkuber over natten ved 4 °C med permeabiliseringsløsning (0,02% BSA og 1% Triton X-100 i KPBS).
- Neste dag, tilsett blokkeringsløsning (KPBS med 0,2% Triton X-100, 1% BSA, natriumazid [1:10,000] og 10% normalt eselserum), og inkuber over natten ved 4 ° C.
- Etter blokkering tilsettes de primære antistoffene (se tabell 6 for fortynning) fortynnet i blokkeringsoppløsningen og inkuberes i 48 timer ved 4 °C.
- Vask 3x med blokkerende oppløsning uten å tilsette serum i 15 min hver. Legg til de sekundære antistoffene fortynnet i blokkerende oppløsning (se tabell 6 for fortynning), og inkuber i 48 timer ved 4 °C.
- Vask 3x med blokkeringsløsning uten serum, og inkuber i 2 timer ved RT i Hoechst flekk fortynnet i permeabiliseringsløsning (1: 1,000).
- Vask 3x med KPBS, monter skivene på glassglass med en pensel, og la dem tørke. Til slutt, skyll lysbildene med avionisert vann, fjern overflødig vann, tilsett monteringsmediet og dekk til med et glassdeksel. Oppbevar lysbildene i minst 24 timer ved RT, og oppbevar dem ved 4 °C til avbildning.
MERK: For antistoffmerking av nukleære epitoper, utfør antigenuthenting før permeabilisering (trinn 4.1.2) med natriumsitrat (10 mM, pH 6,0) i 2 timer ved 65 °C.
- Helcellelapp-klemme
- På opptaksdagen klargjør du 1 l humant kunstig cerebrospinalvæske (haCSF), modifisert for å passe bedre til det menneskelige hjernemiljøet (tabell 7). I likhet med skjæreløsningen, lag ca. 900 ml av løsningen med alle ingrediensene unntatt CaCl 2 oppløst i avionisert vann, og boble den med karbogen i 15 minutter før tilsetning av riktig volum av 1 M CaCl2-løsning . Fyll opp den volumetriske kolben til 1 L-merket, og fortsett å boble på RT i ytterligere 15 minutter før du starter opptaket og gjennom hele eksperimentet.
- Overfør vevsskivene fra dyrkningsplaten til opptakskammeret på scenen i et stående mikroskop som kontinuerlig perfusjoneres med boblet haCSF ved en perfusjonshastighet på 2 ml/min og varmes opp til 34 °C ved hjelp av en badtemperaturregulator.
- Trekk glasskapillærer med pipettetrekker til en gjennomsnittlig motstand på 3-5 MΩ, og fyll igjen kapillærene med K-glukonatbasert intern løsning (tabell 8) med en nylig tilsatt 2-4 mg biocytin for post-hoc-identifisering av de registrerte cellene. PH og osmolariteten til denne interne løsningen er henholdsvis 7,2-7,3 og 285-295 mOsm.
- Når det gjelder vertscelleopptak, få en grov oversikt over stykket med et 4x-mål, og finn en sunn celle å lappe med et 40x-mål. Fortsett deretter med standard helcellelappklemme.
- Ved transplantert celleopptak, identifiser vevsområdet med de podede cellene ved hjelp av et 4x objektiv og et epifluorescensfilter i det blå området (460 nm) ved GFP-reporteruttrykk i transplantatet. Deretter zoomer du inn på det lokaliserte området med et 40x mål, og finner en podet celle som uttrykker GFP for en standard helcellelappklemme.
- Kontroller hvilemembranpotensialet (RMP) umiddelbart etter at du har brutt inn i cellen, og sørg for at kvaliteten på opptaket er god. Registrer alle parametrene av interesse (f.eks. Membranmotstand [Ri], AP-parametere, natrium- og kaliumstrømmer og synaptisk aktivitet) i helcellespenningen eller strømklemmekonfigurasjonen.
- Etter å ha samlet alle nødvendige data, trekk forsiktig opptakspipetten uten å skade cellen ytterligere, slik at den kan identifiseres med post-hoc immunfarging.
- Overfør skiven til 4 % PFA-oppløsningen for videre fiksering og farging, som beskrevet i trinn 4.1. Streptavidin brukes til å immunmerke cellene fylt med biocytin under opptakene.
| ANTISTOFFER | Fortynning | Notater |
| Primær | ||
| Kylling anti-GFP | 1:1000 | |
| Kylling anti-MAP2 | 1:1000 | |
| Geit anti-AiF1 | 1:100 | |
| Mus anti-MBP | 1:1000 | Antigen henting nødvendig |
| Mus anti-SC123 | 1:2000 | |
| Kanin anti-NeuN | 1:1000 | |
| Kanin anti-Olig2 | 1:500 | |
| Kanin anti-Tmem119 | 1:200 | |
| Sekundær | ||
| 488-konjugert AffinityPure Donkey anti-mus IgG | 1:500 | |
| 488-konjugert AffinityPure Donkey anti-kanin IgG | 1:500 | |
| 488-konjugert AffinityPure Donkey anti-kylling IgG | 1:500 | |
| Cy3-konjugert AffinityPure Donkey anti-kylling IgG | 1:500 | |
| Cy3-konjugert AffinityPure Donkey anti-geit IgG | 1:500 | |
| Cy3-konjugert AffinityPure Donkey anti-mus IgG | 1:500 | |
| Alexa fluor 647-konjugert Streptavidin | 1:500 |
Tabell 6: Liste over primære og sekundære antistoffer for immunhistokjemi.
| haCSF | Konsentrasjon av aksjer | Endelig konsentrasjon [mM] | Per 1 L |
| NaCl | Pudder | 129 | 7,54 g |
| NaHCO3 | Pudder | 21 | 1,76 g |
| Glukose | Pudder | 10 | 1,80 g |
| KCl | Pudder | 3 | 0,22 g |
| NaH2PO4 | Pudder | 1.25 | 0,17 g |
| MgSO4 | 1 M | 2 | 2 ml |
| CaCl2 | 1 M | 1.6 | 1,6 ml |
Tabell 7: Sammensetning av kunstig cerebrospinalvæske (haCSF).
| K-Gluconate intern løsning | Konsentrasjon av aksjer | Endelig konsentrasjon [mM] | Per 100 ml |
| K-glukonat | Pudder | 122.5 | 2,87 g |
| KCl | Pudder | 12.5 | 93,18 mg |
| NaCl | Pudder | 8 | 46,76 mg |
| HEPES | Pudder | 10 | 238,32 mg |
| MgATP | Pudder | 2 | 101,4 mg |
| Na3GTP | Pudder | 0.3 | 17,0 mg |
| Notat: Juster pH med KOH/HCl | |||
Tabell 8: Sammensetning av K-glukonatbasert intern løsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter den beskrevne protokollen ble hACtx-vev fra en pasient med temporallappsepilepsi samlet og behandlet, som forklart ovenfor. Noen få skiver ble fikset etter 24 timer i kultur for å studere utgangspunktet for vertsvevet. Analysen av ulike nevrale cellepopulasjoner som nevroner (som uttrykker NeuN og Map2, figur 1A), oligodendrocytter (Olig2 og MBP, figur 1B) og astrocytter (humanspesifikk GFAP, også kalt STEM123, figur 1C) viste optimal bevaring av vevet.
Det neste trinnet var å studere hvordan kulturbetingelsene påvirker nevronens levedyktighet i humant vev. Til dette formål ble fargingen av NeuN og Map2 utført etter 2 ukers kultur. Ved det studerte tidspunktet var uttrykket av begge disse nevronmarkørene fortsatt tilstede i vevet (figur 2A). I tillegg ble det gjort elektrofysiologiske registreringer for å vurdere funksjonaliteten. Registreringene ved hjelp av helcellelappklemme viste at nevronene hadde opprettholdt RMP (-70 mV i gjennomsnitt) og membraninngangsmotstand (Ri) (300 MΩ i gjennomsnitt), sammenlignbar med nevroner fra akutte preparater21,23. Samlet sett var cellene litt mindre aktive enn i ferskvev, selv om flertallet av cellene fortsatt var i stand til å skyte minst en (figur 2B-E), om ikke flere, aksjonspotensialer (APs, figur 2F-I), og raske innadgående natrium og langsomme utadgående kaliumstrømmer var tilstede ved trinnstrøminjeksjoner i spenningsklemmemodus (figur 2C-E, G-I). Samlet indikerte disse opptakene at nevronene i organotypiske kulturer var relativt sunne og viste typiske nevrofysiologiske indre egenskaper.
Videre ble effekten av dyrkning på mikrogliaaktivering vurdert ved Tmem119- og Iba1-farging i 24 timer (figur 3A) og 2 ukers dyrket (figur 3B) vev. Som forventet ble det observert noen endringer i mikroglialutseende. Etter 2 uker i kultur ble de mindre ramifiserte og fikk en mer aktivert morfologi sammenlignet med akutt vev.
Etter karakterisering av vertsvevet ble transplantasjonen av lt-NES-celleavledede progenitorer utført som følger. GFP-lt-NES-cellene ble differensiert i 7 dager og podet inn i 1 ukes dyrket hACtx-vev (figur 4A). Oversikt over transplantasjonen ble observert med immunhistokjemi med GFP (figur 4B,C). Resultatene ble sammenlignet med tidligere transplantasjoner i vev som var dårlig bevart på grunn av at det var et lengre tidsvindu mellom reseksjon og plating. Bildene viser at de podede GFP-lt-NES-cellene i det optimale systemet, 4 uker etter ex vivo-transplantasjon, viste utvidede nevritter og omfattende og komplekse arboriseringer gjennom hele den organotypiske kulturen (figur 4B). Det dårlig bevarte vevet tillot ikke vellykket transplantasjon på grunn av den dårlige vertsforbindelsen. Knapt noen podet celle overlevde; Videre ble rusk og uspesifikk merking av antistoffer på døde celler bredt observert gjennom hele den menneskelige skiven (figur 4C).
Når det gjelder de elektrofysiologiske egenskapene til de podede cellene, ble det funnet at i tilfelle vellykket transplantasjon ble cellene ikke bare morfologisk, men også funksjonelt aktive modne nevroner med repeterende og ofte spontane APer, raskt innadgående natrium og langsomme utadgående kaliumstrømmer og et visst nivå av synaptisk aktivitet, noe som indikerer funksjonell integrasjon av transplantatet med vertsvevet 4 uker etter poding (figur 4D-H).
Figur 1: Karakterisering av de ulike cellepopulasjonene i hACtx-vevet etter 24 timer i kultur. Representative konfokale bilder av hACtx-vev som viser tilstedeværelse av (A) nevroner (som uttrykker NeuN og Map2), (B) oligodendrocytter (Olig2 og MBP) og (C) astrocytter (menneskespesifikk GFAP [STEM123]). Kjernefysisk farging (Ho: Hoechst, blå) er inkludert i de enkelte og sammenslåtte panelene. Skala bar = 20 μm. De hvite pilene indikerer samlokalisering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Karakterisering og elektrofysiologiske egenskaper til hACtx-nevroner etter 2 uker i organotypisk dyrkning. (A) Representative konfokale bilder av hACtx-vev som viser NeuN- og Map2-uttrykk. (B-I) Eksempler på kortikale nevroner registrert i 2 uker gammelt hACtx-vev. (B,F) Biocytinmerking av det registrerte nevronet (rødt), sammen med kjernefysisk farging (Ho: Hoechst, blå), inkludert i et sammenslått panel. Skalastenger = 20 μm. Opptak av patch-clamp i hele cellen som viser eksempler på en celle med (C-E) enkelt, eller (G-I) flere APer. AP ble indusert enten av (C,G) et trinn på 250 pA, eller (D,H) en 0 til 300 pA ramped strøminjeksjon ved RMP. Innfeltene indikerer en forstørret visning av en av AP-ene i hvert tilfelle. (E,I) Innadgående natrium- og utadgående kaliumstrømmer ble observert i begge celleeksemplene ved spenningsdepolariseringstrinnene påført fra -70 mV i trinn på 10 mV i spenningsklemmemodus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Karakterisering av mikrogliapopulasjonen i hACtx-vevet. Konfokale bilder av hACtx-vevet som viser uttrykket av Iba1 og Tmem119 etter (A) 24 timer og (B) 2 uker i kultur. Kjernefysisk farging (Ho: Hoechst, blå) er inkludert i de enkelte og sammenslåtte panelene. Skala bar = 20 μm. De hvite pilene indikerer samlokalisering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Oversikt og elektrofysiologiske egenskaper til lt-NES-cellederiverte nevroner 4 uker etter ex vivo-transplantasjon av GFP-lt-NES-celler. (A) Eksperimentell design. Diff = differensiering. (B,C) Representative konfokale bilder av podede GFP-lt-NES-celler i (B) godt bevart og (C) dårlig bevart hACtx-vev. Skalastenger = 50 μm. (D) Eksempelspor av et transplantatavledet nevron som spontant skyter AP. Innfellingen angir en forstørret visning av ett av tilgangspunktene. Repeterende AP kan induseres av et (E) trinn (50 pA) eller (F) ramped (0 til 300 pA) injeksjon av depolariserende strøm fra potensialet på -70 mV. (G) Innadgående natrium- og utadgående kaliumstrømmer ble indusert av 10 mV depolariserende trinn i spenningsklemmemodus fra et holdepotensial på -70 mV. (H) I spenningsklemmemodus kunne spontane postsynaptiske strømmer (sPSCs) observeres i de transplantatderiverte nevronene med et holdepotensial på -70 mV. Innfeltene indikerer en forstørret visning av noen av sPSC-ene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Å skaffe hACtx-skiver av høy nok kvalitet er det mest kritiske trinnet i denne protokollen. Kortikalt vev er hentet fra epileptiske pasienter som gjennomgår resektiv kirurgi24. Kvaliteten på resektert vev, samt eksponeringstiden for vevet mellom reseksjon og kultur, er kritisk; Jo raskere vevet overføres fra operasjonsrommet til laboratoriet og kuttes, desto mer optimal blir den organotypiske kulturen. Ideelt sett bør vevet kuttes og overføres til cellekulturlaboratoriet innen de første timene etter innsamling. Oksygeneringen av vevet under denne prosessen forbedrer også kvaliteten på skivene. I denne forbindelse, jo større vevsprøven er, desto lavere er konsentrasjonen av oksygen som når kjernen, og dermed jo lavere levedyktigheten hvis vevet ikke kuttes i tide. Hvis kvaliteten på vertsvevet ikke er optimal, vil validering av stamcellebehandlinger ikke være mulig.
Når det kortikale vevet overføres fra den menneskelige hjerne til en plate, må det tas hensyn til noen begrensninger. Under skjæreprosessen dissekeres et stort antall axoner, og induserer nevronskader som vil føre til inflammatoriske prosesser som mikrogliaaktivering25. Av denne grunn, selv om vevet anses som sunt når det befinner seg i den menneskelige hjerne, kan celleadferden i kultur være forskjellig på grunn av den delvise skaden som oppstår under reseksjonen og forberedelsen av de organotypiske seksjonene26,27. Endringer i mikrogliapopulasjonen kunne overvåkes ved hjelp av forskjellige teknikker, inkludert måling av frigjorte cytokinnivåer eller vurdering av morfologiske endringer28. Det er viktig å merke seg at selv om aktivering av mikroglia ble observert ved 2 uker i kultur som et resultat av miljøendringen fra et helt organ til ex vivo-kulturforhold, var nevronene fortsatt levedyktige på dette tidspunktet, som vist ved nevronfargingen og analysen av deres elektrofysiologiske egenskaper. Tykkere vevskiver er bedre bevart; Imidlertid påvirkes penetrasjonen av næringsstoffer til den indre delen av skiven, noe som resulterer i delvis vevdød. Av denne grunn er 300 μm den optimale tykkelsen for organotypisk kultur.
Organotypiske kulturer av hACtx-vev har klare fordeler sammenlignet med andre 3D-kulturmetoder som organoider eller sfæroider. Kilden er en fullt utviklet menneskelig hjerne, noe som betyr at det cellulære og matrisemiljøet, samt modningsstatusen til de forskjellige cellepopulasjonene, er de samme som de som vanligvis finnes i den voksne menneskelige hjernen25,29,30. Organoider ligner mer på fostervev, noe som er optimalt for noen forskningsfelt som modellering av utviklingsforstyrrelser31, men ikke for eksempel for studiet av neurodegenerative sykdommer, som hovedsakelig påvirker den voksne befolkningen og har en sen begynnelse32,33. Viktigst er den organotypiske kulturen av menneskelig vev til dags dato det eneste menneskelige systemet som tillater validering av celleterapier.
Det meste av kunnskapen om stamcelletransplantasjon for nevronerstatning i nevrodegenerative lidelser er hentet fra in vivo dyremodellering. Selv om disse systemene er ekstremt verdifulle for å vurdere den modulerende effekten av transplanterte celler i de skadede vertskretsene, mislykkes dessverre terapier testet i dette oppsettet normalt når de oversettes til klinikken på grunn av de klare forskjellene mellom gnagere og mennesker34. Av denne grunn er den organotypiske kulturen av hACtx-vev en utmerket strategi for modellering av humane nevrodegenerative sykdommer som påvirker cortex på grunn av muligheten til å studere samspillet mellom menneskelige nevrale populasjoner og bevaring av den menneskelige hjernestrukturen25.
Oppsummert er denne kombinerte metodikken for langsiktige organotypiske kulturer av den voksne humane cortex og ex vivo intrakortikal transplantasjon av induserte pluripotente stamcelleavledede kortikale progenitorer en lovende strategi for validering av stamcellebaserte terapier, noe som kan lette den kliniske oversettelsen av nevronutskiftningsstrategier for å stimulere funksjonell gjenoppretting i den skadede hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av tilskudd fra Vetenskapsrådet, den svenske hjernefonden, den svenske Stroke Foundation, Region Skåne, Thorsten og Elsa Segerfalk Foundation, og den svenske regjeringens initiativ for strategiske forskningsområder (StemTherapy).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Cutting and electrophysiology | |||
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
| Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
| Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2x91 | |
| Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
| Plastic Petri dish | Any suitable | ||
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
| Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| RINSING SOLUTION | |||
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
| Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| Forceps | Any suitable | ||
| Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
| GENERATION OF lt-NES cells | |||
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
| Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
| Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
| Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
| Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
| Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
| Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
| T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
| Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
| Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
| Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
| Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
| Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
| Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
| Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
| Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
| Paint brush | Any suitable | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
| Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
| Distilled water | |||
| Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
| Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
| Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
| Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium citrate | |||
| Distilled water | |||
| Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
| Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
| Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
References
- Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).
- Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work. Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).
- Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).
- Tornero, D., et al. Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli. Brain. 140 (3), 692-706 (2017).
- Palma-Tortosa, S., et al. Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).
- Robinson, N. B., et al. The current state of animal models in research: A review. International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Delavaran, H., et al. Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke. European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).
- Sabuncu, M. R., et al. The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease. Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).
- Eugene, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
- Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
- Kalmbach, B. E., et al. Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons. Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).
- Barth, M., et al. Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54 (2021).
- Almeida, G. M., et al. Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response. Frontiers in Neuroscience. 15, 674576 (2021).
- Schwarz, N., et al. Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures. Scientific Reports. 7, 12249 (2017).
- Miskinyte, G., et al. Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 207 (2017).
- Gronning Hansen, M., et al. Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry. Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).
- Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS One. 7 (1), 29597 (2012).
- Avaliani, N., et al. Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors. Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).
- Engel, J., et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).
- Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).
- Verwer, R. W., et al. Injury response of resected human brain tissue in vitro. Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).
- Verwer, R. W., et al. Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue. Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).
- Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Schwarz, N., et al. Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease. Elife. 8, 48417 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Wang, Z., et al. Organoid technology for brain and therapeutics research. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).
- Wang, H. Modeling neurological diseases with human brain organoids. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).
- Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).
