Summary
Denne protokol beskriver langsigtede organotypiske kulturer af voksen human cortex kombineret med ex vivo intrakortikal transplantation af inducerede pluripotente stamcelleafledte kortikale forfædre, som præsenterer en ny metode til yderligere test af stamcellebaserede terapier for humane neurodegenerative lidelser.
Abstract
Neurodegenerative lidelser er almindelige og heterogene med hensyn til deres symptomer og cellulære påvirkning, hvilket gør deres undersøgelse kompliceret på grund af manglen på ordentlige dyremodeller, der fuldt ud efterligner menneskelige sygdomme og den dårlige tilgængelighed af post-mortem humant hjernevæv. Voksen menneskelig nervevævskultur giver mulighed for at studere forskellige aspekter af neurologiske lidelser. Molekylære, cellulære og biokemiske mekanismer kunne let løses i dette system, såvel som test og validering af lægemidler eller forskellige behandlinger, såsom cellebaserede terapier. Denne metode kombinerer langsigtede organotypiske kulturer af den voksne humane cortex, opnået fra epileptiske patienter, der gennemgår resektiv kirurgi, og ex vivo intrakortikal transplantation af inducerede pluripotente stamcelleafledte kortikale forfædre. Denne metode vil muliggøre undersøgelse af celleoverlevelse, neuronal differentiering, dannelse af synaptiske input og output og de elektrofysiologiske egenskaber af humane afledte celler efter transplantation i intakt voksent humant kortikalt væv. Denne tilgang er et vigtigt skridt forud for udviklingen af en 3D-platform til modellering af menneskelige sygdomme, der vil bringe grundforskning tættere på den kliniske oversættelse af stamcellebaserede terapier til patienter med forskellige neurologiske lidelser og muliggøre udvikling af nye værktøjer til rekonstruktion af beskadigede neurale kredsløb.
Introduction
Neurodegenerative lidelser, såsom Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom eller iskæmisk slagtilfælde, er en gruppe sygdomme, der deler det fælles træk ved neuronal funktionsfejl eller død. De er heterogene med hensyn til hjerneområdet og den berørte neuronale befolkning. Desværre er behandlinger for disse sygdomme knappe eller af begrænset effektivitet på grund af manglen på dyremodeller, der efterligner det, der sker i den menneskelige hjerne 1,2. Stamcelleterapi er en af de mest lovende strategier for hjerneregenerering3. Genereringen af neuronale stamceller fra stamceller fra forskellige kilder er blevet stærkt udviklet i de senere år 4,5. Nylige publikationer har vist, at humane inducerede pluripotente stamceller (iPS) celleafledte langsigtede selvfornyende neuroepitellignende stamceller (lt-NES) efter en kortikal differentieringsprotokol og efter intrakortikal transplantation i en rottemodel med iskæmisk slagtilfælde, der påvirker den somatosensoriske cortex, genererer modne kortikale neuroner. Derudover modtog de graftafledte neuroner afferente og efferente synaptiske forbindelser fra værtsneuronerne, hvilket viste deres integration i rotteneuronnetværket 6,7. De graftafledte axoner blev myelinerede og fundet i forskellige områder af rottehjernen, herunder periinfarktområdet, corpus callosum og kontralateral somatosensorisk cortex. Vigtigst af alt vendte iPS-celleafledt transplantation motoriske underskud hos slagtilfældedyr 7.
Selvom dyremodeller hjælper med at studere transplantationsoverlevelse, neuronal integration og effekten af de podede celler på motoriske og kognitive funktioner, mangler information om interaktion mellem humane celler (graft-host) i dette system 8,9. Af denne grund beskrives her en kombineret metode til langsigtet organotypisk kultur i den menneskelige hjerne med ex vivo-transplantation af humane iPS-celleafledte neuronale forfædre. Menneskelige hjerneorganotypiske kulturer opnået fra neurokirurgiske resektioner er fysiologisk relevante 3D-modeller af hjernen, der giver forskere mulighed for at øge deres forståelse af det menneskelige centralnervesystems kredsløb og den mest nøjagtige måde at teste behandlinger for menneskelige hjernesygdomme. Imidlertid er der ikke foretaget nok forskning i denne sammenhæng, og i de fleste tilfælde er menneskelige hippocampale hjerneorganotypiske kulturer blevet brugt10,11. Hjernebarken påvirkes af flere neurodegenerative lidelser, såsom iskæmisk slagtilfælde12 eller Alzheimers sygdom13, så det er vigtigt at have et humant kortikalt 3D-system, der giver os mulighed for at udvide vores viden og teste og validere forskellige terapeutiske strategier. Flere undersøgelser i de sidste par år har brugt kulturer fra voksent humant kortikale (hACtx) væv til at modellere menneskelige hjernesygdomme 14,15,16,17,18,19; Der foreligger dog kun begrænsede oplysninger i forbindelse med stamcelleterapi. To undersøgelser har allerede påvist gennemførligheden af det system, der er beskrevet her. I 2018 viste humane embryonale stamceller programmeret med forskellige transkriptionsfaktorer og transplanteret i hACtx-væv at give anledning til modne kortikale neuroner, der kunne integreres i voksne humane kortikale netværk20. I 2020 afslørede transplantationen af lt-NES-celler i det humane organotypiske system deres evne til at differentiere sig til modne, lagspecifikke kortikale neuroner med de elektrofysiologiske egenskaber hos funktionelle neuroner. De podede neuroner etablerede både afferente og efferente synaptiske kontakter med de humane kortikale neuroner i de voksne hjerneskiver, som bekræftet af rabiesvirus retrograd monosynaptisk sporing, helcelle patch-clamp optagelser og immunoelektronmikroskopi21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger de retningslinjer, der er godkendt af det regionale etiske udvalg, Lund, Sverige (etisk tilladelsesnummer 2021-07006-01). Sundt neokortikalt væv blev opnået fra patienter, der gennemgik elektiv kirurgi for temporal lobe epilepsi. Der blev indhentet informeret samtykke fra alle patienter.
BEMÆRK: Alle de opnåede væv blev behandlet uanset deres størrelse. Imidlertid vil væv mindre end 1-1,5 mm3 i størrelse være teknisk udfordrende at håndtere og sektionere med et vibraatom.
1. Opsamling, vedligeholdelse, skæring og plettering af væv
- Forberedelser dagen før vævsskæring
- Der fremstilles 2 l skæreopløsning (tabel 1) i en målekolbe. Opløs alle ingredienserne undtagen MgCl2 ogCaCl2 i ~1.800 ml deioniseret vand og boble med carbogengas i 15 min. Derefter tilsættes passende mængder 1 M MgCl2- ogCaCl2-opløsninger, og boblen fortsættes i yderligere 15 minutter. Til sidst fyldes kolben til 2 L-mærket; Kontroller pH og osmolaritet, og juster om nødvendigt. 2 x 350 ml af den tilberedte opløsning fryses ned og resten opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: PH og osmolaritet er typisk henholdsvis 7,3-7,4 og 295-300 mOsm. - Forbered 100 ml skylleopløsning (tabel 2). 476 mg HEPES og 200,6 mg glucose opløses i 100 ml HBSS suppleret med 5 ml penicillin/streptomycin. Dette kan opbevares ved 4 °C i op til 10 dage.
- Forbered humant voksent kortikalt (hACtx) kulturmedium (hACtx-medium) (tabel 3) og filtrer det i cellekulturlaboratoriet under en ventileret hætte. Mediet består af neuronalt medium uden phenolrød (se materialetabellen), B27-tilskud, L-glutamin (se materialetabellen) og gentamicin. Opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
- Der fremstilles 2 l skæreopløsning (tabel 1) i en målekolbe. Opløs alle ingredienserne undtagen MgCl2 ogCaCl2 i ~1.800 ml deioniseret vand og boble med carbogengas i 15 min. Derefter tilsættes passende mængder 1 M MgCl2- ogCaCl2-opløsninger, og boblen fortsættes i yderligere 15 minutter. Til sidst fyldes kolben til 2 L-mærket; Kontroller pH og osmolaritet, og juster om nødvendigt. 2 x 350 ml af den tilberedte opløsning fryses ned og resten opbevares ved 4 °C.
- Forberedelser på operationsdagen inden ankomsten af vævsprøverne
- Kontroller tilgængeligheden af det nødvendige udstyr og laboratorieplads, og rengør alle kirurgiske værktøjer og vibratomet grundigt (se materialetabellen) samt bordpladsen med destilleret vand (uden vaskemiddel) efterfulgt af 70% ethanol. Lad ethanolen tørre i mindst 30 minutter, før du bruger værktøjet og udstyret.
- Knus den frosne skæreopløsning og boble "suppen" af is og væske med carbogengas i 30 min. Luk derefter en af beholderne tæt med den knuste opløsning '' suppe '' og læg den i isboksen. Dette vil blive brugt til at opsamle vævet fra operationsrummet.
- Kalibrer vibratomet, og indstil skæreparametrene: 0,05 mm/s hastighed og 1,7 mm vibration. Placer skærekammeret på et vibratomtrin, og start den køler, der er tilsluttet det, så kammeret har en konstant temperatur på -3 °C.
- Forbered skiveopsamlingskammeret med indsatser for at placere vævsskiverne og skæreopløsningen, boble det konstant med carbogengas ved stuetemperatur (RT).
- I cellekulturlaboratoriet og under en ventileret hætte placeres kulturindsatserne i en 6-brøndplade ved hjælp af tang. Tilsæt 5 ml hACtx-medium i bunden af indsatsen, indtil den kommer i kontakt med membranen, undgå dannelse af bobler, og tilsæt 2 ml på toppen af indsatsen. Der er ligevægt i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO 2 i mindst2 timer, før vævsskiverne overføres til indskæringerne.
- Procedurer for indsamling og udskæring af væv
- Umiddelbart efter resektion samles vævet fra patienten i operationsrummet, hvis det er muligt, direkte i en beholder med frossen, boblet og knust skæreopløsning. Overfør straks den lukkede beholder på is til laboratoriets skæreområde.
- Undersøg vævet, og find den bedste overflade til limning (se trin 1.3.3) til vibratumets skæretrin under hensyntagen til orienteringen af de kortikale lag. Skær om nødvendigt den ujævne overflade med en skalpel, så det er let at placere vævet på scenen for optimal skiveorientering.
- Lim vævet til scenen med vævslim (se materialetabellen), læg det i skærekammeret, og fyld straks kammeret med kold bobleskåret opløsning. Fortsæt boblen under hele skæreproceduren.
- Skær koronale eller sagittale skiver, afhængigt af væv-til-blad-orienteringen, i en tykkelse på 300 μm for at indeholde alle de kortikale lag og om muligt det hvide stof. Anbring skiverne i opsamlingskammeret med boblende skæreopløsning ved RT.
BEMÆRK: Skær fra den hvide substansside mod overfladen af cortex. Fjern ikke meninges, da dette kan beskadige vævet. Skærebladet skærer normalt let igennem dem. - Når alt vævet er skåret, overføres skiverne til en steril petriskål med skylleopløsning ved RT og transporteres til cellekulturlaboratoriet. Dette trin er nødvendigt for at fjerne overskydende saccharose fra skiverne, før de overføres til kulturpladen.
BEMÆRK: For at overføre skiverne (i dette og de følgende trin) skal du bruge en omvendt glaspipette, afbryde den tyndere del og placere en gummisut til sugning.
- Dyrkning og vedligeholdelse af hACtx-vævsskiver
- Placer vævsskiverne individuelt oven på de allerede våde og nedsænkede indsatser. Efter 24 timer skiftes substratet for yderligere at fjerne resterende saccharose eller andre reststoffer fra opskæringsprocedurerne.
- Udskift kulturmediet med frisk medium hver 7. dag. Efter 2 uger skal du bruge hACtx-medium uden gentamicin. Kulturen kan opretholdes i op til 2 måneder.
BEMÆRK: HACtx-substratet i inkubatoren afbalanceres ved 37 °C og 5 % CO 2 i mindst2 timer før medieændringen. Frisk medium skal fremstilles hver 2. uge. Kontroller skiverne hver 2-3 dage, og hvis noget af mediet er fordampet, tilsættes mere til toppen af indsatsen.
| Skæring løsning | Lagerkoncentration | Endelig koncentration [mM] | Pr. 1 L |
| Saccharose | Pulver | 200 | 68,46 g |
| NaHCO3 | Pulver | 21 | 1,76 g |
| KCl | Pulver | 3 | 0,22 g |
| NaH2PO4 | Pulver | 1.25 | 0,17 g |
| Glukose | Pulver | 10 | 1,80 g |
| MgSO4 | 1 m | 2 | 2 ml |
| CaCl2 | 1 m | 1.6 | 1,6 ml |
| MgCl2 | 2 m | 2 | 1 ml |
Tabel 1: Sammensætning af skæreopløsning. MgCl2 ogCaCl2 anvendes som præparerede 1 M-opløsninger i deioniseret vand.
| Skylleopløsning | Lagerkoncentration | Endelig koncentration | Pr. 100 ml |
| HBSS | 1x | 95 ml | |
| PenStrep | 10.000 E/ml | 500 U/ml | 5 ml |
| HEPES | Pulver | 4,76 g/l | 476 mg |
| Glukose | Pulver | 2 g/l | 200,6 mg |
Tabel 2: Sammensætning af skylleopløsning.
| hACtx medium | Lagerkoncentration | Endelig koncentration | Pr. 100 ml | |
| Neuronalt medium uden phenolrød | 97,4 ml | se Tabel over materialer | ||
| B27 | 50x | 1:50 | 2 ml | |
| L-glutamin | 100x | 1:200 | 500 μL | se Tabel over materialer |
| Gentamicin | 50 mg/ml | 1:1000 | 100 μL |
Tabel 3: Sammensætning af hACtx-mediet.
2. Spredning og differentiering af lt-NES-celler
BEMÆRK: Lt-NES-celler genereres som tidligere beskrevet21,22 og transduceres med en lentiviral vektor, der bærer grønt fluorescerende protein (GFP) under en konstitutiv promotor (GFP-lt-NES-celler). Hætteglas indeholdende 3 x 106 celler opbevares ved -150 °C indtil brug.
- Fremstilling af stamopløsninger og medier
- 100 μg basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) fortyndes i 10 ml PBS-0,1% BSA for at opnå en stamkoncentration på 10 μg/ml. Der fremstilles 100 μL alikvoter.
- 100 μg epidermal vækstfaktor (EGF) fortyndes i 10 ml PBS-0,1 % BSA for at opnå en stamkoncentration på 10 μg/ml. Der fremstilles 100 μL alikvoter.
- Aliquot 50x B27 supplement i et volumen på 100 μL pr. alikvote.
- 10 mg poly-L-ornithin fortyndes i 100 ml deioniseret vand for at opnå en stamkoncentration på 100 μg/ml. Lav 1 ml alikvoter.
- Forbered 30 μL alikvoter af 1,20 mg/ml muselaminin.
- Fortynd 10 ml trypsin-EDTA (0,25%) i 90 ml PBS til en lagerkoncentration på 0,025%. Forbered 1 ml alikvoter.
- 0,025 g trypsinhæmmer fortyndes i 50 ml PBS til en stamkoncentration på 0,5 mg/ml. Forbered 1 ml alikvoter.
- Fortynd 10 μg Wnt3a (Wingless-type MMTV integration site family member 3A) i 1 ml PBS-0,1% BSA for at få en stamkoncentration på 10 μg / ml. Forbered BMP4 (knoglemorfogenetisk protein 4) på samme måde. Aliquot i et volumen på 100 μL.
- 1 mg cyclopamine fortyndes i 2,5 ml DMSO til en slutkoncentration på 400 μg/ml, og der fremstilles 100 μL alikvoter.
- Forbered basissubstrat (tabel 4) og differentieringsdefineret substrat (DDM, tabel 5), og opbevar ved 4 °C i op til 2 uger.
- Belægning af kulturretter
- For at fortrække opvasken til dyrkning af GFP-It-NES-cellerne under spredning eller differentiering fortyndes poly-L-ornithin 1:100 i deioniseret vand og tilsættes 5 ml af opløsningen til en T25-kolbe. Inkuber natten over på RT.
- De poly-L-ornithinbelagte plader vaskes 1x med deioniseret vand og 1x med PBS.
- For GFP-It-NES-celler i proliferation fortyndes muselaminin ved 1:500 i PBS og inkuberes i mindst 2 timer ved 37 °C. For GFP-It-NES-celler i differentiering fortyndes muselaminin ved 1:100 i PBS og inkuberes i mindst 2 timer ved 37 °C.
- Spredning af GFP-lt-NES-cellerne
- Varm 5 ml (til vask) og 5 ml (til såning) basisk medium i to forskellige 15 ml rør.
- Et hætteglas med GFP-lt-NES-celler optøs hurtigt ved 37 °C, overfører dem til vaskeslangen og centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter.
- Opsug mediet forsigtigt uden at røre pelleten, og resuspender cellerne i 1 ml forvarmet basisk medium. Overfør cellesuspensionen til sårøret, der indeholder basisk medium suppleret med spredningsfaktorer: EGF (10 ng/ml), bFGF (10 ng/ml) og B27 (10 ng/ml). Seed cellerne på en poly-L-ornithin/laminin-coated T25 kolbe.
- Foder cellerne med spredningsfaktorer hver dag. Udskift mediet, hvis det bliver gult. Passage cellerne hver tredje eller fjerde dag (1 dag efter at de når 100% sammenløb).
- Opdeling af GFP-lt-NES-cellerne til spredning og differentiering
- Forvarm 5 ml basisk substrat pr. kolbe (til opsamling af cellerne) plus det samlede volumen, der er nødvendigt for at så dem igen.
BEMÆRK: Passagen udføres ved en 1: 3 fortynding for at holde cellerne i spredning, hvilket kræver 15 ml basisk medium og en 1: 6 fortynding for at starte differentiering, hvilket kræver 30 ml basisk medium. - Substratet fjernes fra cellekulturkolben ved aspiration, og der tilsættes 500 μL forvarmet 0,025% trypsin. Inkuber i 5-10 minutter ved RT. Frigørelsen af cellerne kan bekræftes under et standard lysmikroskop ved 10x forstørrelse.
- Tilsæt et tilsvarende volumen trypsinhæmmer (0,5 mg/ml slutkoncentration) efterfulgt af 5 ml varmt basisk medium. Fjern og saml cellerne ved forsigtigt at pipettere op og ned. Overfør cellerne til et 15 ml rør og centrifuger i 5 minutter ved 300 x g.
- For at holde cellerne i proliferation omlægges de ved en 1:3 fortynding i frisk basisk substrat suppleret med spredningsfaktorer, og trin 2.3.4 gentages.
- Forvarm 5 ml basisk substrat pr. kolbe (til opsamling af cellerne) plus det samlede volumen, der er nødvendigt for at så dem igen.
- Kortikal differentiering af GFP-lt-NES-cellerne
- På dag 0 resuspenderes cellerne (der skal anvendes til differentiering) i 30 ml basisk substrat suppleret med spredningsfaktorer, og pladerne dem i seks differentieringsbelagte T25-kolber (delt 1:6).
- På dag 1 ændres halvdelen af mediet til DDM, og der tilsættes spredningsfaktorer ved halvdelen af deres koncentration.
- På dag 2 ændres mediet fuldstændigt til DDM suppleret med differentieringsfaktorer: BMP4 (10 ng/ml), Wnt3a (10 ng/ml) og cyclopamine (400 ng/ml).
- På dag 4 tilføjes differentieringsfaktorerne alene. Udskift mediet, hvis det bliver gult.
- På dag 6 ændres mediet til DDM suppleret med BMP4 og Wnt3a. Cyclopamin fjernes på dette trin.
- På dag 7 afmonteres cellerne som angivet i trin 2.4.2 og trin 2.4.3.
| Grundlæggende medium | Lagerkoncentration | Endelig koncentration | Pr. 100 ml |
| DMEM/F12 med L-glutamin | 1x | 98,7 ml | |
| N-2 supplement | 100x | 1:100 | 1 ml |
| Glukose | 45% | 3,5 ml/l | 350 μL |
Tabel 4: Sammensætning af proliferationsmedium af lt-NES-celler (basisk medium).
| DDM medium | Lagerkoncentration | Endelig koncentration | Pr. 100 ml |
| DMEM/F12 med L-glutamin | 96 ml | ||
| N2 | 100 x | 1:100 | 1 ml |
| NEAA | 100 x | 1:100 | 1 ml |
| Natriumpyruvat | 100 mM | 1:100 | 1 ml |
| BSA V fraktion | 7.5% | 6,6 ml/l | 660 μL |
| 2-mercaptoethanol | 50 nM | 7 μL/L | 0,7 μL |
| Glukose | 45% | 3,2 ml/l | 320 μL |
Tabel 5: Sammensætning af differentieringsdefineret medium (DDM) af lt-NES-celler.
3. Transplantation af GFP-lt-NES-cellerne i organotypiske hACtx-skiver
BEMÆRK: HACtx-vævet skal dyrkes i 1 uge før celletransplantation. For at lette transplantationsproceduren er det nødvendigt at fjerne 2 ml hACtx-mediet fra toppen af indsatsen for at forhindre vævet i at flyde.
- De kortikalt primede GFP-lt-NES-celler (fra trin 2.5.6) resuspenderes i kold ren kældermembranmatrix (se materialetabellen) i en koncentration på 1 x 105 celler/μL, og opløsningen overføres til et mindre sterilt rør.
BEMÆRK: Under transplantationsproceduren skal alle materialer (pipettespidser, rør, kapillær osv.) forkøles for at undgå gelstørkning. Optø kældermembranmatrixgelen på is i 30 minutter før brug. - Opsaml cellesuspensionen i en kold glaskapillær forbundet med en gummisut til sugning. Injicer cellesuspensionen som små dråber (ca. 1 μL hver) ved at stikke den halvtørre vævsskive forskellige steder.
- Der inkuberes ved 37 °C i 30 minutter, så gelen størkner. Overfør pladen fra inkubatoren tilbage til emhætten, og tilsæt forsigtigt 2 ml hACtx-medium til toppen af indsatsen for at nedsænke vævet helt.
- Udskift dyrkningsmediet med frisk hACtx-medium en gang om ugen.
4. Validering
- Farvning af hACtx-skiverne
- På det ønskede tidspunkt skal du tage skiverne ud af cellekulturlaboratoriet og fjerne dem fra indsatsen ved at nedsænke den i en petriskål med PBS. Derefter overføres skiverne til hætteglas med farvning ved hjælp af en omvendt glaspipette (se bemærkningen i trin 1.3.5), og fastgør dem med 4 % paraformaldehyd (PFA) natten over ved 4 °C.
- Skyl 3x med KPBS i 15 minutter hver gang, og inkuber natten over ved 4 °C med permeabiliseringsopløsning (0,02% BSA og 1% Triton X-100 i KPBS).
- Næste dag tilsættes blokeringsopløsning (KPBS med 0,2% Triton X-100, 1% BSA, natriumazid [1:10.000] og 10% normalt æsesrum) og inkuberes natten over ved 4 °C.
- Efter blokering tilsættes de primære antistoffer (fortyndingerne i tabel 6 ), der er fortyndet i den blokerende opløsning, og inkuberes i 48 timer ved 4 °C.
- Vask 3x med blokerende opløsning uden tilsætning af serum i 15 minutter hver. Der tilsættes sekundære antistoffer fortyndet i blokerende opløsning (fortyndingerne findes i tabel 6 ), og der inkuberes i 48 timer ved 4 °C.
- Der udvaskes 3x med blokeringsopløsning uden serum og inkuberes i 2 timer ved RT i Hoechst-plet fortyndet i permeabiliseringsopløsning (1:1.000).
- Vask 3x med KPBS, monter skiverne på glasskinner med en pensel, og lad dem tørre. Skyl til sidst diasene med deioniseret vand, fjern overskydende vand, tilsæt monteringsmediet og dæk med et glasdæksel. Opbevar diasbillederne i mindst 24 timer ved RT, og opbevar dem ved 4 °C indtil billeddannelse.
BEMÆRK: For antistofmærkning af nukleare epitoper udføres antigenudtagning før permeabilisering (trin 4.1.2) med natriumcitrat (10 mM, pH 6,0) i 2 timer ved 65 °C.
- Plasterklemme med hele celler
- På optagelsesdagen fremstilles 1 liter humant kunstigt cerebrospinalvæske (haCSF), modificeret for bedre at matche det menneskelige hjernemiljø (tabel 7). I lighed med skæreopløsningen fremstilles ca. 900 ml af opløsningen med alle ingredienserne undtagen CaCl2 opløst i deioniseret vand og bobles med carbogen i 15 minutter, før der tilsættes et passende volumen af 1 MCaCl2-opløsning. Fyld den volumetriske kolbe op til 1 L-mærket, og fortsæt med at boble ved RT i yderligere 15 minutter, før du starter optagelsen og under hele eksperimentet.
- Vævsskiverne overføres fra dyrkningspladen til optagekammeret på scenen i et opretstående mikroskop, der konstant perfuseres med boblet haCSF med en perfusionshastighed på 2 ml / min og opvarmes til 34 ° C ved hjælp af en badtemperaturregulator.
- Træk glaskapillærer med en pipettetrækker til en gennemsnitlig modstand på 3-5 MΩ, og fyld kapillærerne tilbage med K-gluconatbaseret intern opløsning (tabel 8) med en frisk tilsat 2-4 mg biocytin til post-hoc identifikation af de registrerede celler. PH og osmolariteten af denne interne opløsning er henholdsvis 7,2-7,3 og 285-295 mOsm.
- I tilfælde af værtscelleoptagelse skal du få et groft overblik over skiven med et 4x mål og finde en sund celle til patch med et 40x mål. Fortsæt derefter med standard helcelleplasterklemmen.
- I tilfælde af podet celleoptagelse identificeres vævsområdet med de podede celler ved hjælp af et 4x mål og et epifluorescensfilter i det blå område (460 nm) ved GFP-reporterekspression i transplantatet. Zoom derefter ind på det lokaliserede område med et 40x mål, og find en podet celle, der udtrykker GFP til en standard helcelleplasterklemme.
- Kontroller hvilemembranpotentialet (RMP) umiddelbart efter brud i cellen, og sørg for, at kvaliteten af optagelsen er god. Optag alle parametre af interesse (f.eks. membranmodstand [Ri], AP-parametre, natrium- og kaliumstrømme og synaptisk aktivitet) i helcellespændingen eller strømklemmekonfigurationen.
- Efter indsamling af alle de nødvendige data skal du forsigtigt trække optagepipetten tilbage uden yderligere at beskadige cellen, så den kan identificeres med post-hoc immunfarvning.
- Skiven overføres til 4 % PFA-opløsningen for yderligere fiksering og farvning som beskrevet i trin 4.1. Streptavidin bruges til at immunmærke cellerne fyldt med biocytin under optagelserne.
| ANTISTOFFER | Fortynding | Noter |
| Primær | ||
| Kylling anti-GFP | 1:1000 | |
| Kylling anti-MAP2 | 1:1000 | |
| Geder anti-AiF1 | 1:100 | |
| Mus anti-MBP | 1:1000 | Antigen hentning nødvendig |
| Mus anti-SC123 | 1:2000 | |
| Kanin anti-NeuN | 1:1000 | |
| Kanin anti-Olig2 | 1:500 | |
| Kanin anti-Tmem119 | 1:200 | |
| Sekundær | ||
| 488-konjugeret AffinityPure Donkey anti-mus IgG | 1:500 | |
| 488-konjugeret AffinityPure Donkey anti-kanin IgG | 1:500 | |
| 488-konjugeret AffinityPure Donkey anti-kylling IgG | 1:500 | |
| Cy3-konjugeret AffinityPure Donkey anti-kylling IgG | 1:500 | |
| Cy3-konjugeret AffinityPure Donkey anti-ged IgG | 1:500 | |
| Cy3-konjugeret AffinityPure Donkey anti-mus IgG | 1:500 | |
| Alexa fluor 647-konjugeret streptavidin | 1:500 |
Tabel 6: Liste over primære og sekundære antistoffer mod immunhistokemi.
| haCSF | Lagerkoncentration | Endelig koncentration [mM] | Pr. 1 L |
| NaCl | Pulver | 129 | 7,54 g |
| NaHCO3 | Pulver | 21 | 1,76 g |
| Glukose | Pulver | 10 | 1,80 g |
| KCl | Pulver | 3 | 0,22 g |
| NaH2PO4 | Pulver | 1.25 | 0,17 g |
| MgSO4 | 1 m | 2 | 2 ml |
| CaCl2 | 1 m | 1.6 | 1,6 ml |
Tabel 7: Sammensætning af kunstig cerebrospinalvæske (haCSF).
| K-gluconat intern opløsning | Lagerkoncentration | Endelig koncentration [mM] | Pr. 100 ml |
| K-gluconat | Pulver | 122.5 | 2,87 g |
| KCl | Pulver | 12.5 | 93,18 mg |
| NaCl | Pulver | 8 | 46.76 mg |
| HEPES | Pulver | 10 | 238,32 mg |
| MgATP | Pulver | 2 | 101,4 mg |
| Na3GTP | Pulver | 0.3 | 17,0 mg |
| Seddel: Juster pH med KOH/HCl | |||
Tabel 8: Sammensætning af K-gluconatbaseret intern opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter den beskrevne protokol blev hACtx-væv fra en patient med temporal lobe epilepsi opsamlet og behandlet som forklaret ovenfor. Et par skiver blev fastgjort efter 24 timer i kultur for at studere udgangspunktet for værtsvævet. Analysen af forskellige neurale cellepopulationer såsom neuroner (der udtrykker NeuN og Map2, figur 1A), oligodendrocytter (Olig2 og MBP, figur 1B) og astrocytter (menneskespecifik GFAP, også kaldet STEM123, figur 1C) viste optimal bevarelse af vævet.
Det næste skridt var at undersøge, hvordan dyrkningsbetingelserne påvirker neuronal levedygtighed i humant væv. Til dette formål blev farvningen af NeuN og Map2 udført efter 2 ugers kultur. På det undersøgte tidspunkt var ekspressionen af begge disse neuronale markører stadig til stede i vævet (figur 2A). Derudover blev elektrofysiologiske optagelser udført for at vurdere funktionaliteten. Optagelserne ved hjælp af helcelleplasterklemme viste, at neuronerne havde opretholdt RMP (-70 mV i gennemsnit) og membranindgangsmodstand (Ri) (300 MΩ i gennemsnit), sammenlignelig med neuroner fra akutte præparater21,23. Samlet set var cellerne lidt mindre aktive end i frisk væv, selvom størstedelen af cellerne stadig var i stand til at affyre mindst en (figur 2B-E), hvis ikke flere, handlingspotentialer (AP'er, figur 2F-I), og hurtige indadgående natrium- og langsomme udadgående kaliumstrømme var til stede ved trinstrømsinjektioner i spændingsklemmetilstand (figur 2C-E, G-I). Samlet set indikerede disse optagelser, at neuronerne i organotypiske kulturer var relativt sunde og udviste typiske neurofysiologiske iboende egenskaber.
Desuden blev effekten af kultur på mikrogliaaktivering vurderet ved Tmem119 og Iba1 farvning i 24 timer (figur 3A) og 2 ugers dyrket (figur 3B) væv. Som forventet blev der observeret nogle ændringer i mikroglialt udseende. Efter 2 uger i kultur blev de mindre forgrenede og erhvervede en mere aktiveret morfologi sammenlignet med akut væv.
Efter karakterisering af værtsvævet blev transplantationen af lt-NES-celleafledte forfædre udført som følger. GFP-lt-NES-cellerne blev differentieret i 7 dage og podet i 1 uges dyrket hACtx-væv (figur 4A). En oversigt over transplantationen blev observeret ved anvendelse af immunhistokemi med GFP (figur 4B,C). Resultaterne blev sammenlignet med resultaterne af tidligere transplantationer i væv, der var dårligt bevaret, fordi der var et længere tidsvindue mellem resektion og plettering. Billederne viser, at de podede GFP-lt-NES-celler i det optimale system 4 uger efter ex vivo-transplantation udviste udvidede neuritter og omfattende og komplekse arboriseringer gennem hele den organotypiske kultur (figur 4B). Det dårligt bevarede væv tillod ikke vellykket transplantation på grund af den dårlige værtsforbindelse. Næsten ingen podet celle overlevede; desuden blev snavs og uspecifik mærkning af antistoffer på døde celler bredt observeret i hele den humane skive (figur 4C).
Med hensyn til de podede cellers elektrofysiologiske egenskaber blev det konstateret, at cellerne i tilfælde af vellykket transplantation ikke kun blev morfologiske, men også funktionelt aktive modne neuroner med gentagne og ofte spontane AP'er, hurtigt indadgående natrium og langsomme udadgående kaliumstrømme og et vist niveau af synaptisk aktivitet, hvilket indikerer funktionel integration af transplantatet med værtsvævet 4 uger efter podning (figur 4D-H).
Figur 1: Karakterisering af de forskellige cellepopulationer i hACtx-vævet efter 24 timer i kultur. Repræsentative konfokale billeder af hACtx-væv, der viser tilstedeværelsen af (A) neuroner (udtrykker NeuN og Map2), (B) oligodendrocytter (Olig2 og MBP) og (C) astrocytter (menneskespecifik GFAP [STEM123]). Kernefarvning (Ho: Hoechst, blå) indgår i de enkelte og fusionerede paneler. Skalabjælke = 20 μm. De hvide pile angiver samlokalisering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Karakterisering og elektrofysiologiske egenskaber af hACtx-neuroner efter 2 uger i organotypisk kultur. (A) Repræsentative konfokale billeder af hACtx-væv, der viser NeuN- og Map2-ekspression. (B-I) Eksempler på kortikale neuroner registreret i 2 uger gammelt hACtx-væv. (B,F) Biocytinmærkning af den registrerede neuron (rød) sammen med nuklear farvning (Ho: Hoechst, blå), inkluderet i et fusioneret panel. Skalastænger = 20 μm. Spor til optagelse af patchklemme i hele celler, der viser eksempler på en celle med (C-E) enkelt eller (G-I) flere AP'er. AP'er blev induceret enten ved (C, G) et 250 pA trin eller (D, H) en 0 til 300 pA rampet strømindsprøjtning ved RMP. Indsatserne angiver en forstørret visning af et af adgangspunkterne i hvert tilfælde. (E,I) Indadgående natrium- og udadgående kaliumstrømme blev observeret i begge celleeksempler ved spændingsdepolariseringstrinnene anvendt fra -70 mV i trin på 10 mV i spændingsklemmetilstand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Karakterisering af mikrogliapopulationen i hACtx-vævet. Konfokale billeder af hACtx-vævet, der viser ekspressionen af Iba1 og Tmem119 efter (A) 24 timer og (B) 2 uger i kultur. Kernefarvning (Ho: Hoechst, blå) indgår i de enkelte og fusionerede paneler. Skalabjælke = 20 μm. De hvide pile angiver samlokalisering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Oversigt og elektrofysiologiske egenskaber af lt-NES-celleafledte neuroner 4 uger efter ex vivo-transplantation af GFP-lt-NES-celler. (A) Eksperimentelt design. Diff = differentiering. (B,C) Repræsentative konfokale billeder af podede GFP-lt-NES-celler i (B) velbevaret og (C) dårligt bevaret hACtx-væv. Skalastænger = 50 μm. (D) Eksempel på spor af en graftafledt neuron, der spontant affyrer AP'er. Justeringen angiver en forstørret visning af et af adgangspunkterne. Gentagne AP'er kan induceres ved et (E) trin (50 pA) eller (F) ramped (0 til 300 pA) injektion af depolariserende strøm fra potentialet på -70 mV. (G) Indadgående natrium- og udadgående kaliumstrømme blev induceret ved 10 mV depolariserende trin i spændingsklemmetilstand fra et holdepotentiale på -70 mV. (H) I spændingsklemmetilstand kunne spontane postsynaptiske strømme (sPSC'er) observeres i de transplantatafledte neuroner ved et holdepotentiale på -70 mV. Justeringerne angiver en forstørret visning af nogle af sPSC'erne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Opnåelse af hACtx-skiver af høj nok kvalitet er det mest kritiske trin i denne protokol. Kortikalt væv opnås fra epileptiske patienter, der gennemgår resektiv kirurgi24. Kvaliteten af det resekterede væv såvel som vævets eksponeringstid mellem resektion og kultur er kritisk; Jo hurtigere vævet overføres fra operationsrummet til laboratoriet og skæres, desto mere optimal bliver den organotypiske kultur. Ideelt set bør vævet skæres og overføres til cellekulturlaboratoriet inden for de første par timer efter indsamling. Oxygeneringen af vævet under denne proces forbedrer også skivernes kvalitet. I denne henseende, jo større vævsprøven er, jo lavere er koncentrationen af ilt, der når kernen, og dermed jo lavere er levedygtigheden, hvis vævet ikke skæres i tide. Hvis kvaliteten af værtsvævet ikke er optimal, vil validering af stamcelleterapier ikke være mulig.
Når det kortikale væv overføres fra den menneskelige hjerne til en plade, skal der tages højde for nogle begrænsninger. Under skæreprocessen dissekeres et stort antal axoner, hvilket inducerer neuronal skade, der vil føre til inflammatoriske processer såsom mikrogliaaktivering25. Af denne grund, selvom vævet betragtes som sundt, når det er placeret i den menneskelige hjerne, kan celleadfærden i kultur være anderledes på grund af den delvise skade, der er lidt under resektion og forberedelse af de organotypiske afsnit26,27. Ændringer i mikrogliapopulationen kunne overvåges ved hjælp af forskellige teknikker, herunder måling af de frigivne cytokinniveauer eller vurdering af morfologiske ændringer28. Det er vigtigt, at selvom mikrogliaaktivering blev observeret efter 2 uger i kultur som et resultat af ændringen i miljøet fra et helt organ til ex vivo-kulturbetingelser, var neuronerne stadig levedygtige på dette tidspunkt, som det fremgår af neuronal farvning og analysen af deres elektrofysiologiske egenskaber. Tykkere vævsskiver bevares bedre; Imidlertid påvirkes penetrationen af næringsstoffer til den indre del af skiven, hvilket resulterer i delvis vævsdød. Af denne grund er 300 μm den optimale tykkelse for organotypisk kultur.
Organotypiske kulturer af hACtx-væv har klare fordele sammenlignet med andre 3D-kulturmetoder såsom organoider eller sfæroider. Kilden er en fuldt udviklet menneskelig hjerne, hvilket betyder, at det cellulære og matrixmiljø samt modningsstatus for de forskellige cellepopulationer er de samme som dem, der generelt findes i den voksne menneskelige hjerne25,29,30. Organoider ligner mere føtalt væv, hvilket er optimalt for nogle forskningsområder såsom modellering af udviklingsforstyrrelser31, men ikke for eksempel til undersøgelse af neurodegenerative sygdomme, som hovedsageligt påvirker den voksne befolkning og har en sen begyndelse32,33. Vigtigst er det, at den organotypiske kultur af humant væv til dato er det eneste menneskelige system, der tillader validering af celleterapier.
Det meste af viden om stamcelletransplantation til neuronal udskiftning i neurodegenerative lidelser stammer fra in vivo dyremodellering. Selvom disse systemer er yderst værdifulde til vurdering af den modulerende virkning af transplanterede celler i det beskadigede værtskredsløb, mislykkes terapier, der testes i denne opsætning, desværre normalt, når de oversættes til klinikken på grund af de klare forskelle mellem gnavere og mennesker34. Af denne grund er den organotypiske kultur af hACtx-væv en fremragende strategi til modellering af humane neurodegenerative sygdomme, der påvirker cortex på grund af muligheden for at studere interaktionerne mellem menneskelige neurale populationer og bevarelsen af den menneskelige hjernestruktur25.
Sammenfattende er denne kombinerede metode til langsigtede organotypiske kulturer af den voksne humane cortex og ex vivo intrakortikal transplantation af inducerede pluripotente stamcelleafledte kortikale forfædre en lovende strategi for validering af stamcellebaserede terapier, som kan lette den kliniske oversættelse af neuronale udskiftningsstrategier til stimulering af funktionel genopretning i den beskadigede hjerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af bevillinger fra det svenske forskningsråd, den svenske hjernefond, den svenske slagtilfældefond, Region Skåne, Thorsten og Elsa Segerfalk Foundation og det svenske regeringsinitiativ for strategiske forskningsområder (StemTherapy).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Cutting and electrophysiology | |||
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
| Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
| Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2x91 | |
| Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
| Plastic Petri dish | Any suitable | ||
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
| Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| RINSING SOLUTION | |||
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
| Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| Forceps | Any suitable | ||
| Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
| GENERATION OF lt-NES cells | |||
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
| Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
| Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
| Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
| Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
| Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
| Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
| T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
| Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
| Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
| Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
| Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
| Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
| Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
| Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
| Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
| Paint brush | Any suitable | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
| Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
| Distilled water | |||
| Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
| Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
| Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
| Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium citrate | |||
| Distilled water | |||
| Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
| Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
| Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
References
- Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).
- Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work. Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).
- Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).
- Tornero, D., et al. Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli. Brain. 140 (3), 692-706 (2017).
- Palma-Tortosa, S., et al. Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).
- Robinson, N. B., et al. The current state of animal models in research: A review. International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Delavaran, H., et al. Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke. European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).
- Sabuncu, M. R., et al. The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease. Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).
- Eugene, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
- Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
- Kalmbach, B. E., et al. Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons. Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).
- Barth, M., et al. Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54 (2021).
- Almeida, G. M., et al. Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response. Frontiers in Neuroscience. 15, 674576 (2021).
- Schwarz, N., et al. Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures. Scientific Reports. 7, 12249 (2017).
- Miskinyte, G., et al. Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 207 (2017).
- Gronning Hansen, M., et al. Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry. Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).
- Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS One. 7 (1), 29597 (2012).
- Avaliani, N., et al. Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors. Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).
- Engel, J., et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).
- Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).
- Verwer, R. W., et al. Injury response of resected human brain tissue in vitro. Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).
- Verwer, R. W., et al. Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue. Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).
- Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Schwarz, N., et al. Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease. Elife. 8, 48417 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Wang, Z., et al. Organoid technology for brain and therapeutics research. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).
- Wang, H. Modeling neurological diseases with human brain organoids. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).
- Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).
