Denne protokol beskriver langsigtede organotypiske kulturer af voksen human cortex kombineret med ex vivo intrakortikal transplantation af inducerede pluripotente stamcelleafledte kortikale forfædre, som præsenterer en ny metode til yderligere test af stamcellebaserede terapier for humane neurodegenerative lidelser.
Neurodegenerative lidelser er almindelige og heterogene med hensyn til deres symptomer og cellulære påvirkning, hvilket gør deres undersøgelse kompliceret på grund af manglen på ordentlige dyremodeller, der fuldt ud efterligner menneskelige sygdomme og den dårlige tilgængelighed af post-mortem humant hjernevæv. Voksen menneskelig nervevævskultur giver mulighed for at studere forskellige aspekter af neurologiske lidelser. Molekylære, cellulære og biokemiske mekanismer kunne let løses i dette system, såvel som test og validering af lægemidler eller forskellige behandlinger, såsom cellebaserede terapier. Denne metode kombinerer langsigtede organotypiske kulturer af den voksne humane cortex, opnået fra epileptiske patienter, der gennemgår resektiv kirurgi, og ex vivo intrakortikal transplantation af inducerede pluripotente stamcelleafledte kortikale forfædre. Denne metode vil muliggøre undersøgelse af celleoverlevelse, neuronal differentiering, dannelse af synaptiske input og output og de elektrofysiologiske egenskaber af humane afledte celler efter transplantation i intakt voksent humant kortikalt væv. Denne tilgang er et vigtigt skridt forud for udviklingen af en 3D-platform til modellering af menneskelige sygdomme, der vil bringe grundforskning tættere på den kliniske oversættelse af stamcellebaserede terapier til patienter med forskellige neurologiske lidelser og muliggøre udvikling af nye værktøjer til rekonstruktion af beskadigede neurale kredsløb.
Neurodegenerative lidelser, såsom Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom eller iskæmisk slagtilfælde, er en gruppe sygdomme, der deler det fælles træk ved neuronal funktionsfejl eller død. De er heterogene med hensyn til hjerneområdet og den berørte neuronale befolkning. Desværre er behandlinger for disse sygdomme knappe eller af begrænset effektivitet på grund af manglen på dyremodeller, der efterligner det, der sker i den menneskelige hjerne 1,2. Stamcelleterapi er en af de mest lovende strategier for hjerneregenerering3. Genereringen af neuronale stamceller fra stamceller fra forskellige kilder er blevet stærkt udviklet i de senere år 4,5. Nylige publikationer har vist, at humane inducerede pluripotente stamceller (iPS) celleafledte langsigtede selvfornyende neuroepitellignende stamceller (lt-NES) efter en kortikal differentieringsprotokol og efter intrakortikal transplantation i en rottemodel med iskæmisk slagtilfælde, der påvirker den somatosensoriske cortex, genererer modne kortikale neuroner. Derudover modtog de graftafledte neuroner afferente og efferente synaptiske forbindelser fra værtsneuronerne, hvilket viste deres integration i rotteneuronnetværket 6,7. De graftafledte axoner blev myelinerede og fundet i forskellige områder af rottehjernen, herunder periinfarktområdet, corpus callosum og kontralateral somatosensorisk cortex. Vigtigst af alt vendte iPS-celleafledt transplantation motoriske underskud hos slagtilfældedyr 7.
Selvom dyremodeller hjælper med at studere transplantationsoverlevelse, neuronal integration og effekten af de podede celler på motoriske og kognitive funktioner, mangler information om interaktion mellem humane celler (graft-host) i dette system 8,9. Af denne grund beskrives her en kombineret metode til langsigtet organotypisk kultur i den menneskelige hjerne med ex vivo-transplantation af humane iPS-celleafledte neuronale forfædre. Menneskelige hjerneorganotypiske kulturer opnået fra neurokirurgiske resektioner er fysiologisk relevante 3D-modeller af hjernen, der giver forskere mulighed for at øge deres forståelse af det menneskelige centralnervesystems kredsløb og den mest nøjagtige måde at teste behandlinger for menneskelige hjernesygdomme. Imidlertid er der ikke foretaget nok forskning i denne sammenhæng, og i de fleste tilfælde er menneskelige hippocampale hjerneorganotypiske kulturer blevet brugt10,11. Hjernebarken påvirkes af flere neurodegenerative lidelser, såsom iskæmisk slagtilfælde12 eller Alzheimers sygdom13, så det er vigtigt at have et humant kortikalt 3D-system, der giver os mulighed for at udvide vores viden og teste og validere forskellige terapeutiske strategier. Flere undersøgelser i de sidste par år har brugt kulturer fra voksent humant kortikale (hACtx) væv til at modellere menneskelige hjernesygdomme 14,15,16,17,18,19; Der foreligger dog kun begrænsede oplysninger i forbindelse med stamcelleterapi. To undersøgelser har allerede påvist gennemførligheden af det system, der er beskrevet her. I 2018 viste humane embryonale stamceller programmeret med forskellige transkriptionsfaktorer og transplanteret i hACtx-væv at give anledning til modne kortikale neuroner, der kunne integreres i voksne humane kortikale netværk20. I 2020 afslørede transplantationen af lt-NES-celler i det humane organotypiske system deres evne til at differentiere sig til modne, lagspecifikke kortikale neuroner med de elektrofysiologiske egenskaber hos funktionelle neuroner. De podede neuroner etablerede både afferente og efferente synaptiske kontakter med de humane kortikale neuroner i de voksne hjerneskiver, som bekræftet af rabiesvirus retrograd monosynaptisk sporing, helcelle patch-clamp optagelser og immunoelektronmikroskopi21.
Opnåelse af hACtx-skiver af høj nok kvalitet er det mest kritiske trin i denne protokol. Kortikalt væv opnås fra epileptiske patienter, der gennemgår resektiv kirurgi24. Kvaliteten af det resekterede væv såvel som vævets eksponeringstid mellem resektion og kultur er kritisk; Jo hurtigere vævet overføres fra operationsrummet til laboratoriet og skæres, desto mere optimal bliver den organotypiske kultur. Ideelt set bør vævet skæres og overføres til cellekulturlaborat…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er støttet af bevillinger fra det svenske forskningsråd, den svenske hjernefond, den svenske slagtilfældefond, Region Skåne, Thorsten og Elsa Segerfalk Foundation og det svenske regeringsinitiativ for strategiske forskningsområder (StemTherapy).
Tissue Cutting and electrophysiology | |||
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
HEPES | AppliChem | A1069 | |
Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2×91 | |
Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
Plastic Petri dish | Any suitable | ||
Potassium chloride | Merck | 104936 | |
Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
Vibratome | Leica | VT1200 S | |
RINSING SOLUTION | |||
D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
HEPES | AppliChem | A1069 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
Forceps | Any suitable | ||
Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
GENERATION OF lt-NES cells | |||
2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
Paint brush | Any suitable | ||
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
Distilled water | |||
Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
Sodium citrate | |||
Distilled water | |||
Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |