Summary

Organotypiske kulturer af voksen human cortex som ex vivo-model for transplantation og validering af humane stamceller

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

Denne protokol beskriver langsigtede organotypiske kulturer af voksen human cortex kombineret med ex vivo intrakortikal transplantation af inducerede pluripotente stamcelleafledte kortikale forfædre, som præsenterer en ny metode til yderligere test af stamcellebaserede terapier for humane neurodegenerative lidelser.

Abstract

Neurodegenerative lidelser er almindelige og heterogene med hensyn til deres symptomer og cellulære påvirkning, hvilket gør deres undersøgelse kompliceret på grund af manglen på ordentlige dyremodeller, der fuldt ud efterligner menneskelige sygdomme og den dårlige tilgængelighed af post-mortem humant hjernevæv. Voksen menneskelig nervevævskultur giver mulighed for at studere forskellige aspekter af neurologiske lidelser. Molekylære, cellulære og biokemiske mekanismer kunne let løses i dette system, såvel som test og validering af lægemidler eller forskellige behandlinger, såsom cellebaserede terapier. Denne metode kombinerer langsigtede organotypiske kulturer af den voksne humane cortex, opnået fra epileptiske patienter, der gennemgår resektiv kirurgi, og ex vivo intrakortikal transplantation af inducerede pluripotente stamcelleafledte kortikale forfædre. Denne metode vil muliggøre undersøgelse af celleoverlevelse, neuronal differentiering, dannelse af synaptiske input og output og de elektrofysiologiske egenskaber af humane afledte celler efter transplantation i intakt voksent humant kortikalt væv. Denne tilgang er et vigtigt skridt forud for udviklingen af en 3D-platform til modellering af menneskelige sygdomme, der vil bringe grundforskning tættere på den kliniske oversættelse af stamcellebaserede terapier til patienter med forskellige neurologiske lidelser og muliggøre udvikling af nye værktøjer til rekonstruktion af beskadigede neurale kredsløb.

Introduction

Neurodegenerative lidelser, såsom Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom eller iskæmisk slagtilfælde, er en gruppe sygdomme, der deler det fælles træk ved neuronal funktionsfejl eller død. De er heterogene med hensyn til hjerneområdet og den berørte neuronale befolkning. Desværre er behandlinger for disse sygdomme knappe eller af begrænset effektivitet på grund af manglen på dyremodeller, der efterligner det, der sker i den menneskelige hjerne 1,2. Stamcelleterapi er en af de mest lovende strategier for hjerneregenerering3. Genereringen af neuronale stamceller fra stamceller fra forskellige kilder er blevet stærkt udviklet i de senere år 4,5. Nylige publikationer har vist, at humane inducerede pluripotente stamceller (iPS) celleafledte langsigtede selvfornyende neuroepitellignende stamceller (lt-NES) efter en kortikal differentieringsprotokol og efter intrakortikal transplantation i en rottemodel med iskæmisk slagtilfælde, der påvirker den somatosensoriske cortex, genererer modne kortikale neuroner. Derudover modtog de graftafledte neuroner afferente og efferente synaptiske forbindelser fra værtsneuronerne, hvilket viste deres integration i rotteneuronnetværket 6,7. De graftafledte axoner blev myelinerede og fundet i forskellige områder af rottehjernen, herunder periinfarktområdet, corpus callosum og kontralateral somatosensorisk cortex. Vigtigst af alt vendte iPS-celleafledt transplantation motoriske underskud hos slagtilfældedyr 7.

Selvom dyremodeller hjælper med at studere transplantationsoverlevelse, neuronal integration og effekten af de podede celler på motoriske og kognitive funktioner, mangler information om interaktion mellem humane celler (graft-host) i dette system 8,9. Af denne grund beskrives her en kombineret metode til langsigtet organotypisk kultur i den menneskelige hjerne med ex vivo-transplantation af humane iPS-celleafledte neuronale forfædre. Menneskelige hjerneorganotypiske kulturer opnået fra neurokirurgiske resektioner er fysiologisk relevante 3D-modeller af hjernen, der giver forskere mulighed for at øge deres forståelse af det menneskelige centralnervesystems kredsløb og den mest nøjagtige måde at teste behandlinger for menneskelige hjernesygdomme. Imidlertid er der ikke foretaget nok forskning i denne sammenhæng, og i de fleste tilfælde er menneskelige hippocampale hjerneorganotypiske kulturer blevet brugt10,11. Hjernebarken påvirkes af flere neurodegenerative lidelser, såsom iskæmisk slagtilfælde12 eller Alzheimers sygdom13, så det er vigtigt at have et humant kortikalt 3D-system, der giver os mulighed for at udvide vores viden og teste og validere forskellige terapeutiske strategier. Flere undersøgelser i de sidste par år har brugt kulturer fra voksent humant kortikale (hACtx) væv til at modellere menneskelige hjernesygdomme 14,15,16,17,18,19; Der foreligger dog kun begrænsede oplysninger i forbindelse med stamcelleterapi. To undersøgelser har allerede påvist gennemførligheden af det system, der er beskrevet her. I 2018 viste humane embryonale stamceller programmeret med forskellige transkriptionsfaktorer og transplanteret i hACtx-væv at give anledning til modne kortikale neuroner, der kunne integreres i voksne humane kortikale netværk20. I 2020 afslørede transplantationen af lt-NES-celler i det humane organotypiske system deres evne til at differentiere sig til modne, lagspecifikke kortikale neuroner med de elektrofysiologiske egenskaber hos funktionelle neuroner. De podede neuroner etablerede både afferente og efferente synaptiske kontakter med de humane kortikale neuroner i de voksne hjerneskiver, som bekræftet af rabiesvirus retrograd monosynaptisk sporing, helcelle patch-clamp optagelser og immunoelektronmikroskopi21.

Protocol

Denne protokol følger de retningslinjer, der er godkendt af det regionale etiske udvalg, Lund, Sverige (etisk tilladelsesnummer 2021-07006-01). Sundt neokortikalt væv blev opnået fra patienter, der gennemgik elektiv kirurgi for temporal lobe epilepsi. Der blev indhentet informeret samtykke fra alle patienter. BEMÆRK: Alle de opnåede væv blev behandlet uanset deres størrelse. Imidlertid vil væv mindre end 1-1,5 mm3 i størrelse være teknisk udfordrende at håndtere og sektio…

Representative Results

Efter den beskrevne protokol blev hACtx-væv fra en patient med temporal lobe epilepsi opsamlet og behandlet som forklaret ovenfor. Et par skiver blev fastgjort efter 24 timer i kultur for at studere udgangspunktet for værtsvævet. Analysen af forskellige neurale cellepopulationer såsom neuroner (der udtrykker NeuN og Map2, figur 1A), oligodendrocytter (Olig2 og MBP, figur 1B) og astrocytter (menneskespecifik GFAP, også kaldet STEM123, figur 1C) viste optimal </strong…

Discussion

Opnåelse af hACtx-skiver af høj nok kvalitet er det mest kritiske trin i denne protokol. Kortikalt væv opnås fra epileptiske patienter, der gennemgår resektiv kirurgi24. Kvaliteten af det resekterede væv såvel som vævets eksponeringstid mellem resektion og kultur er kritisk; Jo hurtigere vævet overføres fra operationsrummet til laboratoriet og skæres, desto mere optimal bliver den organotypiske kultur. Ideelt set bør vævet skæres og overføres til cellekulturlaborat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde er støttet af bevillinger fra det svenske forskningsråd, den svenske hjernefond, den svenske slagtilfældefond, Region Skåne, Thorsten og Elsa Segerfalk Foundation og det svenske regeringsinitiativ for strategiske forskningsområder (StemTherapy).

Materials

Tissue Cutting and electrophysiology
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Bath temperature controller  Luigs & Neumann TC0511354
Calcium Chloride dihydrate Merck 102382
Carbogen gas Air Liquide NA
Cooler Julaba FL 300 9661012.03
D-(+)Glucose Sigma-Aldrich G7021
Double Patch-Clamp amplifier HEKA electronic EPC10
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt Millipore 371701
HEPES AppliChem A1069
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Magnesium Sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 230391
Patchmaster HEKA electronic Patchmaster 2×91
Pipette Puller Sutter P-2000
Plastic Petri dish Any suitable
Potassium chloride Merck 104936
Potassium D-gluconate ThermoFisher B25135
Rubber teat + glass pipette Any suitable
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 106346
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Tissue adhesive: Acryl super glue Loctite 2062278
Upright microscope Olympus BX51WI 
Vibratome  Leica VT1200 S
RINSING SOLUTION
D-(+)Glucose Sigma-Aldrich G7021
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) ThermoFisher Scientific 14175095
HEPES AppliChem A1069
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15-140-122
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE
6-well plate ThermoFisher Scientific 140675
Alvetex scaffold 6 well insert Reinnervate Ltd AVP004-96
B27 Supplement (50x) ThermoFisher Scientific 17504001
BrainPhys without Phenol Red StemCell technologies #05791 Referenced as neuronal medium in the text
Filter units 250 mL or 500 mL Corning Sigma CLS431096/97
Forceps Any suitable
Gentamicin (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 15750037
Glutamax Supplement (100x) ThermoFisher Scientific 35050061 Referenced as L-glutamine in the text
Rubber teat + Glass pipette Any suitable
GENERATION OF lt-NES cells
2-Mercaptoethanol 50 mM ThermoFisher Scientific 31350010
Animal Free Recombinant EGF Peprotech AF-100-15
B27 Suplemment (50x) Thermo Fisher Scientific 17504001
bFGF Peprotech AF-100-18B
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) ThermoFisher Scientific 15260037
Cyclopamine, V. calcifornicum Calbiochem # 239803
D (+) Glucose solution (45%) Sigma G8769
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2438-10mL
DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 11320074
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190-144 Without calcium and magnesium
Laminin Mouse Protein, Natural Thermo Fisher Scientific 23017015
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) ThermoFisher Scientific 11140050
N-2 Supplement (100 x) ThermoFisher Scientific 17502001
Poly-L-Ornithine Merk P3655
Recombinant Human BMP-4 Protein R&D Systems 314-BP-010
Recombinant Human Wnt-3a Protein R&D Systems 5036-WN
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360070
Soybean Trypsin Inhibitor, powder Thermo Fisher Scientific 17075029
Sterile deionized water MilliQ MilliQ filter system
Trypsin EDTA (0.25%) Sigma T4049-500ML
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE 
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL Eppendorf Various
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) Corning CLS354277-1EA
Centrifuge Hettich Centrifugen Rotina 420R 5% CO2, 37 °C
Incubator ThermoForma Steri-Cult CO2 HEPA Class100
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm Vitrolife 14601
Sterile tubes Sarstedt Various
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm VWR 612-1701
Sterile pipette tips 0.1-1000  µL Biotix VWR Various
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL Costar Various
T25 flasks Nunc ThermoFisher Scientific 156367
IMMUNOHISTOCHEMISTRY
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoReserach 715-545-151
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG Jackson ImmunoReserach 711-545-152
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG Jackson ImmunoReserach 703-545-155
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin Jackson ImmunoReserach 016-600-084
Bovine Serum Albumin Jackson ImmunoReserach 001-000-162
Chicken anti-GFP Merk Millipore AB16901
Chicken anti-MAP2  Abcam ab5392
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG Jackson ImmunoReserach 703-165-155
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG Jackson ImmunoReserach 705-165-147
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoReserach 715-165-151
Diazabicyclooctane (DABCO) Sigma Aldrich D27802 Mounting media
Goat anti-AIF1 (C-terminal)  Biorad AHP2024
Hoechst 33342 Molecular Probes Nuclear staining
Mouse anti-MBP  BioLegend 808402
Mouse anti-SC123  Stem Cells Inc AB-123-U-050
Normal Donkey Serum Merk Millipore S30-100
Paint brush Any suitable
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 150127
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)
     Distilled water
     Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) Merk Millipore 104873
     Potassium phospate dibasic (K2HPO4) Sigma Aldrich P3786
     Sodium chloride (NaCl) Sigma Aldrich S3014
Rabbit anti-NeuN  Abcam ab104225
Rabbit anti-Olig2  Abcam ab109186
Rabbit anti-TMEM119  Abcam ab185333
Sodium azide Sigma Aldrich S2002-5G
Sodium citrate
       Distilled water
       Tri-Sodium Citrate Sigma Aldrich S1804-500G
       Tween-20 Sigma Aldrich P1379
Triton X-100 ThermoFisher Scientific 327371000 
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY
Confocal microscope Zeiss LSM 780
Microscope Slides 76 mm x 26 mm VWR 630-1985
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm Marienfeld 107242
Microscope Software Zeiss ZEN Black edition
Rubber teat + Glass pipette Any suitable

References

  1. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).
  2. Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).
  3. Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work. Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).
  4. Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).
  5. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).
  6. Tornero, D., et al. Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli. Brain. 140 (3), 692-706 (2017).
  7. Palma-Tortosa, S., et al. Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).
  8. Robinson, N. B., et al. The current state of animal models in research: A review. International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).
  9. Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
  10. Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
  11. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  12. Delavaran, H., et al. Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke. European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).
  13. Sabuncu, M. R., et al. The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease. Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).
  14. Eugene, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
  15. Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer’s disease-associated Aβ oligomers. The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
  16. Kalmbach, B. E., et al. Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons. Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).
  17. Barth, M., et al. Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54 (2021).
  18. Almeida, G. M., et al. Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response. Frontiers in Neuroscience. 15, 674576 (2021).
  19. Schwarz, N., et al. Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures. Scientific Reports. 7, 12249 (2017).
  20. Miskinyte, G., et al. Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 207 (2017).
  21. Gronning Hansen, M., et al. Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry. Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).
  22. Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS One. 7 (1), 29597 (2012).
  23. Avaliani, N., et al. Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors. Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).
  24. Engel, J., et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).
  25. Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).
  26. Verwer, R. W., et al. Injury response of resected human brain tissue in vitro. Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).
  27. Verwer, R. W., et al. Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue. Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).
  28. Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).
  29. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  30. Schwarz, N., et al. Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease. Elife. 8, 48417 (2019).
  31. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  32. Wang, Z., et al. Organoid technology for brain and therapeutics research. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).
  33. Wang, H. Modeling neurological diseases with human brain organoids. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).
  34. Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).

Play Video

Cite This Article
Palma-Tortosa, S., Martínez-Curiel, R., Aretio-Medina, C., Avaliani, N., Kokaia, Z. Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation. J. Vis. Exp. (190), e64234, doi:10.3791/64234 (2022).

View Video