Summary
Dieses Protokoll beschreibt langfristige organotypische Kulturen des adulten menschlichen Kortex in Kombination mit der intrakortikalen Ex-vivo-Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten kortikalen Vorläuferzellen, die eine neuartige Methodik zur weiteren Erprobung stammzellbasierter Therapien für neurodegenerative Erkrankungen beim Menschen darstellen.
Abstract
Neurodegenerative Erkrankungen sind häufig und heterogen in Bezug auf ihre Symptome und zelluläre Affektiertheit, was ihre Untersuchung aufgrund des Mangels an geeigneten Tiermodellen, die menschliche Krankheiten vollständig nachahmen, und der schlechten Verfügbarkeit von postmortalem menschlichem Hirngewebe erschwert. Die adulte menschliche Nervengewebekultur bietet die Möglichkeit, verschiedene Aspekte neurologischer Erkrankungen zu untersuchen. Molekulare, zelluläre und biochemische Mechanismen könnten in diesem System leicht angegangen werden, ebenso wie das Testen und Validieren von Medikamenten oder verschiedenen Behandlungen, wie z. B. zellbasierten Therapien. Diese Methode kombiniert organotypische Langzeitkulturen des adulten menschlichen Kortex, die von epileptischen Patienten gewonnen wurden, die sich einer resektiven Operation unterziehen, und ex vivo intrakortikale Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten kortikalen Vorläuferzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung des Zellüberlebens, der neuronalen Differenzierung, der Bildung synaptischer Ein- und Ausgänge und der elektrophysiologischen Eigenschaften menschlicher Zellen nach der Transplantation in intaktes erwachsenes menschliches kortikales Gewebe. Dieser Ansatz ist ein wichtiger Schritt auf dem Weg zur Entwicklung einer 3D-Plattform zur Modellierung menschlicher Krankheiten, die die Grundlagenforschung näher an die klinische Umsetzung stammzellbasierter Therapien für Patienten mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen heranführen und die Entwicklung neuer Werkzeuge zur Rekonstruktion geschädigter neuronaler Schaltkreise ermöglichen wird.
Introduction
Neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson, Alzheimer oder ischämischer Schlaganfall sind eine Gruppe von Krankheiten, die das gemeinsame Merkmal einer neuronalen Fehlfunktion oder des Todes aufweisen. Sie sind heterogen in Bezug auf das betroffene Gehirnareal und die neuronale Population. Leider sind Behandlungen für diese Krankheiten rar oder von begrenzter Wirksamkeit, da es keine Tiermodelle gibt, die das nachahmen, was im menschlichen Gehirn vorkommt 1,2. Die Stammzelltherapie ist eine der vielversprechendsten Strategien für die Regeneration des Gehirns3. Die Erzeugung neuronaler Vorläuferzellen aus Stammzellen aus verschiedenen Quellen hat sich in den letzten Jahren stark entwickelt 4,5. Jüngste Veröffentlichungen haben gezeigt, dass humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPS), die aus Langzeit-Selbsterneuerungs-Neuroepithel-ähnlichen Stammzellen (lt-NES) stammen, nach einem kortikalen Differenzierungsprotokoll und nach intrakortikaler Transplantation in einem Rattenmodell mit ischämischem Schlaganfall, der den somatosensorischen Kortex betrifft, reife kortikale Neuronen erzeugen. Darüber hinaus erhielten die aus dem Transplantat stammenden Neuronen afferente und efferente synaptische Verbindungen von den Wirtsneuronen, was ihre Integration in das neuronale Netzwerk der Ratte zeigte 6,7. Die aus dem Transplantat stammenden Axone wurden myelinisiert und in verschiedenen Bereichen des Rattengehirns gefunden, einschließlich des Peri-Infarktbereichs, des Corpus callosum und des kontralateralen somatosensorischen Kortex. Am wichtigsten ist, dass die aus iPS-Zellen gewonnene Transplantation motorische Defizite bei Schlaganfalltieren umkehrte7.
Auch wenn Tiermodelle helfen, das Überleben von Transplantaten, die neuronale Integration und die Wirkung der transplantierten Zellen auf motorische und kognitive Funktionen zu untersuchen, fehlen in diesem System Informationen über die Interaktion zwischen menschlichen Zellen (Graft-Host) 8,9. Aus diesem Grund wird hier eine kombinierte Methode der organotypischen Langzeitkultur des menschlichen Gehirns mit der ex vivo-Transplantation von humanen iPS-Zellen abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen beschrieben. Organotypische Kulturen des menschlichen Gehirns, die aus neurochirurgischen Resektionen gewonnen werden, sind physiologisch relevante 3D-Modelle des Gehirns, die es Forschern ermöglichen, ihr Verständnis der Schaltkreise des menschlichen Zentralnervensystems zu verbessern und die genaueste Methode zum Testen von Behandlungen für Erkrankungen des menschlichen Gehirns zu finden. In diesem Zusammenhang wurde jedoch nicht genügend Forschung betrieben, und in den meisten Fällen wurden organotypische Kulturen des menschlichen Hippocampus-Gehirns verwendet10,11. Die Großhirnrinde ist von mehreren neurodegenerativen Erkrankungen betroffen, wie z. B. dem ischämischen Schlaganfall12 oder der Alzheimer-Krankheit13, daher ist es wichtig, ein menschliches kortikales 3D-System zu haben, das es uns ermöglicht, unser Wissen zu erweitern und verschiedene therapeutische Strategien zu testen und zu validieren. Mehrere Studien in den letzten Jahren haben Kulturen aus adultem menschlichem kortikalem (hACtx) Gewebe verwendet, um menschliche Gehirnerkrankungen zu modellieren 14,15,16,17,18,19; Im Zusammenhang mit der Stammzelltherapie liegen jedoch nur begrenzte Informationen vor. Zwei Studien haben bereits die Machbarkeit des hier beschriebenen Systems nachgewiesen. Im Jahr 2018 wurde gezeigt, dass menschliche embryonale Stammzellen, die mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren programmiert und in hACtx-Gewebe transplantiert wurden, zu reifen kortikalen Neuronen führen, die sich in erwachsene menschliche kortikale Netzwerke integrieren können20. Im Jahr 2020 zeigte die Transplantation von lt-NES-Zellen in das menschliche organotypische System ihre Fähigkeit, sich in reife, schichtspezifische kortikale Neuronen mit den elektrophysiologischen Eigenschaften funktioneller Neuronen zu differenzieren. Die transplantierten Neuronen stellten sowohl afferente als auch efferente synaptische Kontakte mit den menschlichen kortikalen Neuronen in den erwachsenen Gehirnschnitten her, was durch retrograde monosynaptische Verfolgung des Tollwutvirus, Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen und Immunelektronenmikroskopiebestätigt wurde 21.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt den Richtlinien, die von der Regionalen Ethikkommission, Lund, Schweden, genehmigt wurden (Ethikgenehmigungsnummer 2021-07006-01). Gesundes neokortikales Gewebe wurde von Patienten gewonnen, die sich einer elektiven Operation wegen Temporallappenepilepsie unterzogen. Von allen Patienten wurde eine Einverständniserklärung eingeholt.
HINWEIS: Alle erhaltenen Gewebe wurden unabhängig von ihrer Größe verarbeitet. Gewebe, die kleiner als 1-1,5 mm3 sind, sind jedoch technisch schwierig zu handhaben und mit einem Vibratom zu schneiden.
1. Sammeln, Pflegen, Schneiden und Plattieren von Gewebe
- Vorbereitungen am Tag vor dem Gewebeschnitt
- 2 l Schneidlösung (Tabelle 1) werden in einem Messkolben zubereitet. Alle Zutaten außer MgCl 2 und CaCl2 in ~1.800 ml deionisiertem Wasser auflösen und 15 Minuten mit Carbogengas sprudeln. Fügen Sie dann geeignete Mengen von 1 M MgCl 2 - und CaCl2 -Lösungen hinzu und sprudeln Sie weitere 15 Minuten weiter. Zum Schluss füllen Sie den Kolben bis zur 2-Liter-Marke; Überprüfen Sie den pH-Wert und die Osmolarität und passen Sie sie bei Bedarf an. 2 x 350 ml der vorbereiteten Lösung einfrieren und den Rest bei 4 °C lagern.
HINWEIS: Der pH-Wert und die Osmolarität betragen typischerweise 7,3-7,4 bzw. 295-300 mOsm. - Bereiten Sie 100 ml Spüllösung vor (Tabelle 2). 476 mg HEPES und 200,6 mg Glucose werden in 100 ml HBSS gelöst, ergänzt mit 5 ml Penicillin/Streptomycin. Dieser kann bei 4 °C bis zu 10 Tage gelagert werden.
- Bereiten Sie das humane kortikale (hACtx) Kulturmedium (hACtx-Medium) vor (Tabelle 3) und filtern Sie es im Zellkulturlabor unter einer belüfteten Haube. Das Medium besteht aus neuronalem Medium ohne Phenolrot (siehe Materialtabelle), B27-Supplement, L-Glutamin (siehe Materialtabelle) und Gentamicin. Bei 4 °C bis zu 2 Wochen lagern.
- 2 l Schneidlösung (Tabelle 1) werden in einem Messkolben zubereitet. Alle Zutaten außer MgCl 2 und CaCl2 in ~1.800 ml deionisiertem Wasser auflösen und 15 Minuten mit Carbogengas sprudeln. Fügen Sie dann geeignete Mengen von 1 M MgCl 2 - und CaCl2 -Lösungen hinzu und sprudeln Sie weitere 15 Minuten weiter. Zum Schluss füllen Sie den Kolben bis zur 2-Liter-Marke; Überprüfen Sie den pH-Wert und die Osmolarität und passen Sie sie bei Bedarf an. 2 x 350 ml der vorbereiteten Lösung einfrieren und den Rest bei 4 °C lagern.
- Vorbereitungen am Tag der Operation vor dem Eintreffen der Gewebeproben
- Überprüfen Sie die Verfügbarkeit der erforderlichen Geräte und Laborräume und reinigen Sie alle chirurgischen Instrumente und das Vibratom (siehe Materialtabelle) sowie den Tischraum gründlich mit destilliertem Wasser (ohne Reinigungsmittel), gefolgt von 70% Ethanol. Lassen Sie das Ethanol mindestens 30 Minuten trocknen, bevor Sie die Werkzeuge und Geräte verwenden.
- Zerkleinern Sie die gefrorene Schneidlösung und blasen Sie die "Suppe" aus Eis und Flüssigkeit 30 Minuten lang mit Carbogengas auf. Verschließen Sie dann einen der Behälter fest mit der zerkleinerten Lösung "Suppe" und stellen Sie ihn in die Kühlbox. Dies wird verwendet, um das Gewebe aus dem Operationssaal zu entnehmen.
- Kalibrieren Sie das Vibratom und stellen Sie die Schnittparameter ein: 0,05 mm/s Geschwindigkeit und 1,7 mm Vibration. Stellen Sie die Schneidkammer auf eine Vibrationsstufe und starten Sie den daran angeschlossenen Kühler, so dass die Kammer eine konstante Temperatur von −3 °C hat.
- Bereiten Sie die Scheibensammelkammer mit Einsätzen vor, um die Gewebeschnitte und die Schneidlösung zu platzieren, und sprudeln Sie sie ständig mit Carbogengas bei Raumtemperatur (RT).
- Legen Sie die Kultureinsätze im Zellkulturlabor und unter einer belüfteten Haube mit einer Pinzette in eine 6-Well-Platte. Geben Sie 5 ml hACtx-Medium auf die Unterseite des Einsatzes, bis es die Membran berührt, um die Bildung von Blasen zu vermeiden, und fügen Sie 2 ml auf der Oberseite des Einsatzes hinzu. Im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO 2 für mindestens2 h ausbalancieren, bevor die Gewebeschnitte in die Einsätze übertragen werden.
- Verfahren zur Gewebeentnahme und -schneidung
- Sammeln Sie das Gewebe des Patienten unmittelbar nach der Resektion im Operationssaal, wenn möglich, direkt in einen Behälter mit gefrorener, blasenförmiger und zerkleinerter Schneidlösung. Übertragen Sie den geschlossenen Behälter auf Eis sofort in den Schneidebereich des Labors.
- Untersuchen Sie das Gewebe und suchen Sie die beste Oberfläche, um es unter Berücksichtigung der Ausrichtung der kortikalen Schichten auf die Schneidephase des Vibratoms zu kleben (siehe Schritt 1.3.3). Schneiden Sie bei Bedarf die unebene Oberfläche mit einem Skalpell ab, damit das Gewebe leicht auf den Tisch gelegt werden kann, um eine optimale Schnittausrichtung zu erreichen.
- Kleben Sie das Gewebe mit Gewebekleber auf den Tisch (siehe Materialtabelle), legen Sie es in die Schneidekammer und füllen Sie die Kammer sofort mit kalter Schneidelösung. Setzen Sie das Sprudeln während des gesamten Schneidvorgangs fort.
- Schneiden Sie koronale oder sagittale Scheiben, je nach Ausrichtung von Gewebe zu Klinge, mit einer Dicke von 300 μm, um alle kortikalen Schichten und, wenn möglich, die weiße Substanz aufzunehmen. Legen Sie die Scheiben in die Auffangkammer mit sprudelnder Schneidlösung bei RT.
HINWEIS: Schneiden Sie von der Seite der weißen Substanz zur Oberfläche des Kortex. Entfernen Sie die Hirnhäute nicht, da dies das Gewebe schädigen kann. Die Schneidklinge schneidet sie normalerweise leicht durch. - Sobald das gesamte Gewebe geschnitten wurde, werden die Scheiben in eine sterile Petrischale mit Spüllösung bei RT überführt und in das Zellkulturlabor transportiert. Dieser Schritt ist notwendig, um überschüssige Saccharose von den Scheiben zu entfernen, bevor sie auf die Kulturplatte übertragen werden.
HINWEIS: Verwenden Sie zum Übertragen der Scheiben (in diesem und den folgenden Schritten) eine umgekehrte Glaspipette, brechen Sie den dünneren Teil ab und setzen Sie einen Gummisauger zum Absaugen ein.
- Kultivierung und Pflege von hACtx-Gewebeschnitten
- Legen Sie die Gewebeschnitte einzeln auf die bereits nassen und untergetauchten Einsätze. Wechseln Sie nach 24 h das Medium, um verbleibende Saccharose oder andere Reststoffe aus den Schneidvorgängen weiter zu entfernen.
- Ersetzen Sie das Nährmedium alle 7 Tage durch frisches Medium. Verwenden Sie nach 2 Wochen hACtx-Medium ohne Gentamicin. Die Kultur kann bis zu 2 Monate aufrechterhalten werden.
HINWEIS: Äquilibrieren Sie das hACtx-Medium im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO 2 für mindestens2 h vor dem Medienwechsel. Frisches Medium sollte alle 2 Wochen zubereitet werden. Überprüfen Sie die Scheiben alle 2-3 Tage und geben Sie, wenn ein Teil des Mediums verdunstet ist, mehr an die Oberseite des Einsatzes.
| Schneidelösung | Konzentration der Bestände | Endkonzentration [mM] | Pro 1 L |
| Saccharose | Pulver | 200 | 68,46 g |
| NaHCO3 | Pulver | 21 | 1,76 g |
| Kcl | Pulver | 3 | 0,22 g |
| NaH2PO4 | Pulver | 1.25 | 0,17 g |
| Traubenzucker | Pulver | 10 | 1,80 g |
| MgSO4 | ca. 1 m | 2 | 2 ml |
| CaCl2 | ca. 1 m | 1.6 | 1,6 ml |
| MgCl2 | ca. 2 m | 2 | 1 ml |
Tabelle 1: Zusammensetzung der Schneidlösung. MgCl2und CaCl2 werden als vorgefertigte 1 M-Lösungen in deionisiertem Wasser verwendet.
| Spüllösung | Konzentration der Bestände | Endkonzentration | Pro 100 ml |
| HBSS (Begriffsklärung) | 1x | 95 mL | |
| PenStrep | 10.000 U/ml | 500 U/ml | 5 mL |
| HEPES | Pulver | 4,76 g/L | 476 mg |
| Traubenzucker | Pulver | 2 g/L | 200,6 mg |
Tabelle 2: Zusammensetzung der Spüllösung.
| hACtx mittel | Konzentration der Bestände | Endkonzentration | Pro 100 ml | |
| Neuronales Medium ohne Phenolrot | 97,4 ml | siehe Materialtabelle | ||
| B27 | 50x | 1:50 | 2 ml | |
| L-Glutamin | 100x | 1:200 | 500 μL | siehe Materialtabelle |
| Gentamicin | 50 mg/ml | 1:1000 | 100 μL |
Tabelle 3: Zusammensetzung des hACtx-Mediums.
2. Proliferation und Differenzierung von lt-NES-Zellen
HINWEIS: Lt-NES-Zellen werden wie zuvor beschriebenerzeugt 21,22 und mit einem lentiviralen Vektor transduziert, der grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter einem konstitutiven Promotor (GFP-lt-NES-Zellen) trägt. Durchstechflaschen mit 3 x 106 Zellen werden bis zur Verwendung bei −150 °C gelagert.
- Aufbereitung der Stammlösungen und Medien
- 100 μg basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) werden in 10 ml PBS-0,1% BSA verdünnt, um eine Stammkonzentration von 10 μg/ml zu erhalten. Bereiten Sie 100 μl Aliquote vor.
- 100 μg epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) werden in 10 ml PBS-0,1 % BSA verdünnt, um eine Stammkonzentration von 10 μg/ml zu erhalten. Bereiten Sie 100 μl Aliquote vor.
- Aliquot 50x B27 Supplement in einem Volumen von 100 μL pro Aliquot.
- 10 mg Poly-L-Ornithin werden in 100 ml deionisiertem Wasser verdünnt, um eine Stammkonzentration von 100 μg/ml zu erreichen. Stellen Sie 1 ml Aliquote her.
- Bereiten Sie 30 μl Aliquote von 1,20 mg/ml Mauslaminin vor.
- 10 ml Trypsin-EDTA (0,25 %) werden in 90 ml PBS auf eine Stammkonzentration von 0,025 % verdünnt. Bereiten Sie 1 ml Aliquote vor.
- 0,025 g Trypsin-Inhibitor werden in 50 ml PBS auf eine Stammkonzentration von 0,5 mg/ml verdünnt. Bereiten Sie 1 ml Aliquote vor.
- 10 μg Wnt3a (Wingless-type MMTV integration site family member 3A) werden in 1 ml PBS-0,1 % BSA verdünnt, um eine Stammkonzentration von 10 μg/ml zu erhalten. Bereiten Sie BMP4 (Knochenmorphogenetisches Protein 4) auf die gleiche Weise vor. Aliquot in einem Volumen von 100 μL.
- 1 mg Cyclopamin wird in 2,5 ml DMSO auf eine Endkonzentration von 400 μg/ml verdünnt und 100 μl Aliquote hergestellt.
- Grundmedium (Tabelle 4) und differenzierungsdefiniertes Medium (DDM, Tabelle 5) vorbereiten und bis zu 2 Wochen bei 4 °C lagern.
- Beschichtung von Kulturschalen
- Um die Schalen vorzubeschichten, um die GFP-It-NES-Zellen während der Proliferation oder Differenzierung zu kultivieren, verdünnen Sie Poly-L-Ornithin 1:100 in deionisiertem Wasser und geben Sie 5 ml der Lösung in einen T25-Kolben. Inkubieren Sie über Nacht bei RT.
- Waschen Sie die mit Poly-L-Ornithin beschichteten Platten 1x mit deionisiertem Wasser und 1x mit PBS.
- Für GFP-It-NES-Zellen in der Proliferation wird Mauslaminin bei 1:500 in PBS verdünnt und mindestens 2 h bei 37 °C inkubiert. Für GFP-It-NES-Zellen in Differenzierung wird Mauslaminin im Verhältnis 1:100 in PBS verdünnt und mindestens 2 h bei 37 °C inkubiert.
- Proliferation der GFP-lt-NES-Zellen
- Erwärmen Sie 5 ml (zum Waschen) und 5 ml (zum Aussäen) des Grundmediums in zwei verschiedenen 15-ml-Röhrchen.
- Eine Durchstechflasche mit GFP-lt-NES-Zellen wird bei 37 °C rasch aufgetaut, in das Waschröhrchen gegeben und 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugiert.
- Saugen Sie das Medium vorsichtig ab, ohne das Pellet zu berühren, und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml vorgewärmtem Basismedium. Übertragen Sie die Zellsuspension in das Aussaatröhrchen, das das Basismedium enthält, das mit Proliferationsfaktoren angereichert ist: EGF (10 ng/ml), bFGF (10 ng/ml) und B27 (10 ng/ml). Säen Sie die Zellen auf einen mit Poly-L-Ornithin/Laminin beschichteten T25-Kolben.
- Füttern Sie die Zellen jeden Tag mit Proliferationsfaktoren. Ersetzen Sie das Medium, wenn es gelb wird. Passieren Sie die Zellen jeden dritten oder vierten Tag (1 Tag, nachdem sie 100% Konfluenz erreicht haben).
- Aufteilung der GFP-lt-NES-Zellen zur Proliferation und Differenzierung
- 5 ml Basismedium pro Kolben vorwärmen (um die Zellen zu sammeln), zuzüglich des Gesamtvolumens, das für die Wiederaussaat benötigt wird.
HINWEIS: Die Passage erfolgt mit einer Verdünnung von 1:3, um die Zellen in der Proliferation zu halten, was 15 ml Basismedium erfordert, und einer Verdünnung von 1:6, um mit der Differenzierung zu beginnen, was 30 ml Basismedium erfordert. - Nehmen Sie das Medium durch Aspiration aus dem Zellkulturkolben und fügen Sie 500 μl vorgewärmtes 0,025% Trypsin hinzu. 5-10 min bei RT inkubieren. Die Ablösung der Zellen kann unter einem Standard-Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung bestätigt werden.
- Fügen Sie ein gleiches Volumen Trypsin-Inhibitor (0,5 mg/ml Endkonzentration) hinzu, gefolgt von 5 ml warmem basischem Medium. Lösen und sammeln Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Die Zellen werden in ein 15-ml-Röhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugiert .
- Um die Zellen in der Proliferation zu halten, wird die Platte im Verhältnis 1:3 in frischem Basismedium, das mit Proliferationsfaktoren ergänzt ist, neu aufgetragen und Schritt 2.3.4 wiederholt.
- 5 ml Basismedium pro Kolben vorwärmen (um die Zellen zu sammeln), zuzüglich des Gesamtvolumens, das für die Wiederaussaat benötigt wird.
- Kortikale Differenzierung der GFP-lt-NES-Zellen
- Am Tag 0 resuspendieren die Zellen (zur Differenzierung zu verwenden) in 30 ml basischem Medium, das mit Proliferationsfaktoren angereichert ist, und plattieren Sie sie in sechs differenzierungsbeschichteten T25-Kolben (aufgeteilt 1:6).
- Ändern Sie an Tag 1 die Hälfte des Mediums auf DDM und fügen Sie Proliferationsfaktoren mit der Hälfte ihrer Konzentration hinzu.
- Ändern Sie das Medium an Tag 2 vollständig auf DDM, ergänzt mit Differenzierungsfaktoren: BMP4 (10 ng/ml), Wnt3a (10 ng/ml) und Cyclopamin (400 ng/ml).
- Fügen Sie an Tag 4 nur die Differenzierungsfaktoren hinzu. Ersetzen Sie das Medium, wenn es gelb wird.
- Ändern Sie an Tag 6 das Medium auf DDM, das mit BMP4 und Wnt3a ergänzt wird. In diesem Schritt wird das Cyclopamin entfernt.
- Trennen Sie an Tag 7 die Zellen wie in Schritt 2.4.2 und Schritt 2.4.3 beschrieben.
| Grundlegendes Medium | Konzentration der Bestände | Endkonzentration | Pro 100 ml |
| DMEM/F12 mit L-Glutamin | 1x | 98,7 ml | |
| N-2 Ergänzung | 100x | 1:100 | 1 ml |
| Traubenzucker | 45% | 3,5 ml/l | 350 μL |
Tabelle 4: Zusammensetzung des Proliferationsmediums von lt-NES-Zellen (basisches Medium).
| DDM-Mittel | Konzentration der Bestände | Endkonzentration | Pro 100 ml |
| DMEM/F12 mit L-Glutamin | 96 ml | ||
| N2 | 100 x | 1:100 | 1 ml |
| NEAA | 100 x | 1:100 | 1 ml |
| Natriumpyruvat | 100 mM | 1:100 | 1 ml |
| BSA-V-Fraktion | 7.5% | 6,6 ml/l | 660 μL |
| 2-Mercaptoethanol | 50 nM | 7 μL/L | 0,7 μL |
| Traubenzucker | 45% | 3,2 ml/l | 320 μL |
Tabelle 5: Zusammensetzung des differenzierungsdefinierten Mediums (DDM) von lt-NES-Zellen.
3. Transplantation der GFP-lt-NES-Zellen in organotypische hACtx-Schnitte
HINWEIS: Das hACtx-Gewebe sollte vor der Zelltransplantation 1 Woche lang kultiviert werden. Um das Transplantationsverfahren zu erleichtern, ist es notwendig, 2 ml des hACtx-Mediums von der Oberseite des Einsatzes zu entfernen, um zu verhindern, dass das Gewebe schwimmt.
- Die kortikal geprimten GFP-lt-NES-Zellen (aus Schritt 2.5.6) werden in kalter reiner Basalmembranmatrix (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/μl resuspendiert und die Lösung in ein kleineres steriles Röhrchen überführt.
HINWEIS: Während des Transplantationsverfahrens sollten alle Materialien (Pipettenspitzen, Röhrchen, Kapillaren usw.) vorgekühlt werden, um eine Verfestigung des Gels zu vermeiden. Tauen Sie das Basalmembran-Matrix-Gel vor seiner Verwendung 30 Minuten lang auf Eis auf. - Sammeln Sie die Zellsuspension in einer kalten Glaskapillare, die zum Absaugen mit einem Gummisauger verbunden ist. Injizieren Sie die Zellsuspension in kleinen Tropfen (je ca. 1 μl), indem Sie den halbtrockenen Gewebeschnitt an verschiedenen Stellen stechen.
- 30 Minuten bei 37 °C inkubieren, damit sich das Gel verfestigt. Übertragen Sie die Platte aus dem Inkubator zurück in die Haube und geben Sie vorsichtig 2 ml hACtx-Medium auf die Oberseite des Einsatzes, um das Gewebe vollständig einzutauchen.
- Ersetzen Sie das Nährmedium einmal pro Woche durch frisches hACtx-Medium.
4. Validierung
- Färbung der hACtx-Scheiben
- Nehmen Sie die Scheiben zum gewünschten Zeitpunkt aus dem Zellkulturlabor und entfernen Sie sie aus dem Einsatz, indem Sie sie in eine Petrischale mit PBS tauchen. Anschließend werden die Scheiben mit einer umgekehrten Glaspipette in Färbefläschchen überführt (siehe ANMERKUNG in Schritt 1.3.5) und über Nacht bei 4 °C mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert.
- Spülen Sie 3x mit KPBS für jeweils 15 Minuten und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C mit Permeabilisierungslösung (0,02% BSA und 1% Triton X-100 in KPBS).
- Am nächsten Tag wird Blockierlösung (KPBS mit 0,2 % Triton X-100, 1 % BSA, Natriumazid [1:10.000] und 10 % normalem Eselserum) hinzugefügt und über Nacht bei 4 °C inkubiert.
- Nach dem Blockieren werden die in der Blocklösung verdünnten Primärantikörper (siehe Tabelle 6 ) in die Blocklösung gegeben und 48 h bei 4 °C inkubiert.
- 3x mit Blockierlösung ohne Zugabe von Serum jeweils 15 Minuten waschen. Die in Blockierlösung verdünnten sekundären Antikörper werden zugegeben (siehe Tabelle 6 für die Verdünnungen) und 48 h bei 4 °C inkubiert.
- 3x mit Blockierlösung ohne Serum waschen und 2 h bei RT in Hoechst-Färbung inkubieren, verdünnt in Permeabilisierungslösung (1:1.000).
- 3x mit KPBS waschen, die Scheiben mit einem Pinsel auf Objektträger montieren und trocknen lassen. Zum Schluss spülen Sie die Objektträger mit deionisiertem Wasser ab, entfernen Sie überschüssiges Wasser, fügen Sie das Montagemedium hinzu und decken Sie sie mit einem Glasdeckglas ab. Bewahren Sie die Objektträger mindestens 24 Stunden bei RT auf und lagern Sie sie bis zur Bildgebung bei 4 °C.
ANMERKUNG: Bei Antikörpern, die Kernepitope markieren, ist die Antigenentnahme vor der Permeabilisierung (Schritt 4.1.2) mit Natriumcitrat (10 mM, pH 6,0) für 2 h bei 65 °C durchzuführen.
- Ganzzell-Patch-Klemme
- Bereiten Sie am Tag der Aufzeichnung 1 l künstliches Liquor cerebrospinalis (haCSF) vor, das so modifiziert ist, dass es besser an die menschliche Gehirnumgebung angepasst ist (Tabelle 7). Ähnlich wie bei der Schneidlösung werden ca. 900 ml der Lösung mit allen Zutaten außer CaCl 2 in deionisiertem Wasser gelöst und 15 Minuten lang mit Carbogen gesprudelt, bevor das entsprechende Volumen von 1 M CaCl2 -Lösung hinzugefügt wird. Füllen Sie den Messkolben bis zur 1-l-Marke auf und sprudeln Sie weitere 15 Minuten bei RT, bevor Sie mit der Aufnahme beginnen und während des gesamten Experiments.
- Übertragen Sie die Gewebeschnitte von der Kulturplatte in die Aufnahmekammer auf dem Tisch eines aufrechten Mikroskops, das ständig mit blasenförmigem haCSF mit einer Perfusionsrate von 2 ml/min perfundiert und mit einem Badtemperaturregler auf 34 °C erwärmt wird.
- Ziehen Sie die Glaskapillaren mit einem Pipettenzieher auf einen durchschnittlichen Widerstand von 3-5 MΩ und füllen Sie die Kapillaren mit einer internen Lösung auf K-Gluconatbasis (Tabelle 8) mit frisch zugegebenen 2-4 mg Biocytin auf, um die aufgezeichneten Zellen nachträglich zu identifizieren. Der pH-Wert und die Osmolarität dieser internen Lösung betragen 7,2 bis 7,3 bzw. 285 bis 295 mOsm.
- Verschaffen Sie sich im Falle der Aufzeichnung der Wirtszelle einen groben Überblick über die Scheibe mit einem 4-fachen Objektiv und finden Sie eine gesund aussehende Zelle, die Sie mit einem 40-fachen Objektiv patchen können. Fahren Sie dann mit der Standard-Ganzzellen-Patch-Klemme fort.
- Im Falle einer transplantierten Zellaufzeichnung identifizieren Sie den Gewebebereich mit den transplantierten Zellen unter Verwendung eines 4-fachen Objektivs und eines Epifluoreszenzfilters im blauen Bereich (460 nm) durch GFP-Reporterexpression im Transplantat. Zoomen Sie dann mit einem 40-fachen Objektiv in den lokalisierten Bereich und finden Sie eine transplantierte Zelle, die GFP exprimiert, für eine Standard-Ganzzell-Patch-Klemme.
- Überprüfen Sie das Ruhemembranpotential (RMP) unmittelbar nach dem Einbruch in die Zelle und stellen Sie sicher, dass die Qualität der Aufnahme gut ist. Notieren Sie alle relevanten Parameter (z. B. Membranwiderstand [Ri], AP-Parameter, Natrium- und Kaliumströme und synaptische Aktivität) in der Ganzzellenspannungs- oder Stromzangenkonfiguration.
- Nachdem Sie alle erforderlichen Daten gesammelt haben, ziehen Sie die Aufnahmepipette vorsichtig zurück, ohne die Zelle weiter zu beschädigen, damit sie mit einer Post-hoc-Immunfärbung identifiziert werden kann.
- Übertragen Sie die Scheibe zur weiteren Fixierung und Färbung in die 4%ige PFA-Lösung, wie in Schritt 4.1 beschrieben. Streptavidin wird verwendet, um die mit Biocytin gefüllten Zellen während der Aufnahmen immunoaktiv zu markieren.
| ANTIKÖRPER | Verdünnung | Notizen |
| Primär | ||
| Huhn Anti-GFP | 1:1000 | |
| Huhn Anti-MAP2 | 1:1000 | |
| Ziege Anti-AiF1 | 1:100 | |
| Maus Anti-MBP | 1:1000 | Antigen-Retrieval erforderlich |
| Maus Anti-SC123 | 1:2000 | |
| Kaninchen Anti-NeuN | 1:1000 | |
| Kaninchen Anti-Olig2 | 1:500 | |
| Kaninchen Anti-Tmem119 | 1:200 | |
| Sekundär | ||
| 488-konjugiertes AffinityPure Donkey Anti-Maus-IgG | 1:500 | |
| 488-konjugiertes AffinityPure Donkey Anti-Kaninchen-IgG | 1:500 | |
| 488-konjugiertes AffinityPure Donkey Anti-Huhn-IgG | 1:500 | |
| Cy3-konjugiertes AffinityPure Donkey Anti-Huhn-IgG | 1:500 | |
| Cy3-konjugierte AffinitätReiner Esel Anti-Ziege IgG | 1:500 | |
| Cy3-konjugiertes AffinityPure Donkey Anti-Maus-IgG | 1:500 | |
| Alexa Fluor 647-konjugiertes Streptavidin | 1:500 |
Tabelle 6: Liste der primären und sekundären Antikörper für die Immunhistochemie.
| haCSF | Konzentration der Bestände | Endkonzentration [mM] | Pro 1 L |
| NaCl | Pulver | 129 | 7,54 g |
| NaHCO3 | Pulver | 21 | 1,76 g |
| Traubenzucker | Pulver | 10 | 1,80 g |
| Kcl | Pulver | 3 | 0,22 g |
| NaH2PO4 | Pulver | 1.25 | 0,17 g |
| MgSO4 | ca. 1 m | 2 | 2 ml |
| CaCl2 | ca. 1 m | 1.6 | 1,6 ml |
Tabelle 7: Zusammensetzung der künstlichen Liquor cerebrospinalis (haCSF).
| K-Gluconat interne Lösung | Konzentration der Bestände | Endkonzentration [mM] | Pro 100 ml |
| K-Gluconat | Pulver | 122.5 | 2,87 g |
| Kcl | Pulver | 12.5 | 93,18 mg |
| NaCl | Pulver | 8 | 46,76 mg |
| HEPES | Pulver | 10 | 238,32 mg |
| MgATP | Pulver | 2 | 101,4 mg |
| Na3GTP | Pulver | 0.3 | ca. 17,0 mg |
| Anmerkung: Einstellen des pH-Werts mit KOH/HCl | |||
Tabelle 8: Zusammensetzung der internen Lösung auf K-Gluconat-Basis.
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Representative Results
Nach dem beschriebenen Protokoll wurde hACtx-Gewebe von einem Patienten mit Temporallappenepilepsie entnommen und verarbeitet, wie oben erläutert. Einige Scheiben wurden nach 24 h in Kultur fixiert, um den Ausgangspunkt des Wirtsgewebes zu untersuchen. Die Analyse verschiedener neuronaler Zellpopulationen wie Neuronen (exprimiert NeuN und Map2, Abbildung 1A), Oligodendrozyten (Olig2 und MBP, Abbildung 1B) und Astrozyten (humanspezifisches GFAP, auch STEM123 genannt, Abbildung 1C) zeigte eine optimale Erhaltung des Gewebes.
Der nächste Schritt bestand darin, zu untersuchen, wie sich die Kulturbedingungen auf die neuronale Lebensfähigkeit im menschlichen Gewebe auswirken. Zu diesem Zweck wurde die Färbung von NeuN und Map2 nach 2 Wochen Kultur durchgeführt. Zum untersuchten Zeitpunkt war die Expression dieser beiden neuronalen Marker noch im Gewebe vorhanden (Abbildung 2A). Zusätzlich wurden elektrophysiologische Ableitungen durchgeführt, um die Funktionalität zu beurteilen. Die Aufzeichnungen mit Ganzzell-Patch-Clamp zeigten, dass die Neuronen einen konstanten RMP (-70 mV im Durchschnitt) und einen Membraneingangswiderstand (Ri) (durchschnittlich 300 MΩ) aufwiesen, vergleichbar mit Neuronen aus akuten Präparaten21,23. Insgesamt waren die Zellen etwas weniger aktiv als in frischem Gewebe, obwohl die Mehrheit der Zellen immer noch in der Lage war, mindestens ein (Abbildung 2B-E), wenn nicht sogar mehrere Aktionspotentiale abzufeuern (APs, Abbildung 2F-I), und schnelle nach innen gerichtete Natrium- und langsame Kaliumströme waren bei Stufenstrominjektionen im Voltage-Clamp-Modus vorhanden (Abbildung 2C-E, G-I). Zusammengenommen zeigten diese Aufzeichnungen, dass die Neuronen in organotypischen Kulturen relativ gesund waren und typische neurophysiologische intrinsische Eigenschaften aufwiesen.
Darüber hinaus wurde die Wirkung der Kultur auf die Mikroglia-Aktivierung durch Tmem119- und Iba1-Färbung in 24 h (Abbildung 3A) und 2 Wochen kultiviertem (Abbildung 3B) Gewebe bewertet. Wie erwartet, wurden einige Veränderungen im Erscheinungsbild der Mikroglia beobachtet. Nach 2 Wochen in Kultur wurden sie weniger verzweigt und erhielten im Vergleich zu akutem Gewebe eine aktivere Morphologie.
Nach der Charakterisierung des Wirtsgewebes wurde die Transplantation der von lt-NES-Zellen abgeleiteten Vorläuferzellen wie folgt durchgeführt. Die GFP-lt-NES-Zellen wurden 7 Tage lang differenziert und in 1 Woche kultiviertes hACtx-Gewebe transplantiert (Abbildung 4A). Ein Überblick über die Transplantation wurde mittels Immunhistochemie mit GFP beobachtet (Abbildung 4B,C). Die Ergebnisse wurden mit denen früherer Transplantationen in Gewebe verglichen, das aufgrund eines längeren Zeitfensters zwischen Resektion und Beschichtung schlecht erhalten war. Die Bilder zeigen, dass die transplantierten GFP-lt-NES-Zellen im optimalen System 4 Wochen nach der Ex-vivo-Transplantation ausgedehnte Neuriten und ausgedehnte und komplexe Arborisierungen in der gesamten organotypischen Kultur aufwiesen (Abbildung 4B). Das schlecht erhaltene Gewebe ermöglichte aufgrund der schlechten Wirtskonnektivität keine erfolgreiche Transplantation. Kaum eine transplantierte Zelle überlebte; Darüber hinaus wurden Trümmer und unspezifische Markierungen von Antikörpern auf toten Zellen im gesamten menschlichen Schnitt beobachtet (Abbildung 4C).
In Bezug auf die elektrophysiologischen Eigenschaften der transplantierten Zellen wurde festgestellt, dass die Zellen im Falle einer erfolgreichen Transplantation nicht nur morphologisch, sondern auch funktionell aktive reife Neuronen mit repetitiven und oft spontanen APs, schnellen nach innen gerichteten Natrium- und langsamen Kaliumströmen nach außen und einem bestimmten Maß an synaptischer Aktivität wurden, was auf eine funktionelle Integration des Transplantats mit dem Wirtsgewebe 4 Wochen nach der Transplantation hinweist (Abbildung 4D-H).
Abbildung 1: Charakterisierung der verschiedenen Zellpopulationen im hACtx-Gewebe nach 24 h in Kultur. Repräsentative konfokale Bilder von hACtx-Gewebe, die das Vorhandensein von (A) Neuronen (die NeuN und Map2 exprimieren), (B) Oligodendrozyten (Olig2 und MBP) und (C) Astrozyten (humanspezifisches GFAP [STEM123]) zeigen. Die Kernfärbung (Ho: Hoechst, blau) ist in den einzelnen und zusammengeführten Panels enthalten. Maßstabsbalken = 20 μm. Die weißen Pfeile zeigen die Kolokalisierung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Charakterisierung und elektrophysiologische Eigenschaften von hACtx-Neuronen nach 2 Wochen in organotypischer Kultur. (A) Repräsentative konfokale Bilder von hACtx-Gewebe mit NeuN- und Map2-Expression. (B-I) Beispiele für kortikale Neuronen, die in 2 Wochen altem hACtx-Gewebe aufgezeichnet wurden. (B,F) Die Biocytin-Markierung des aufgezeichneten Neurons (rot) zusammen mit der Kernfärbung (Ho: Hoechst, blau) ist in einem zusammengeführten Panel enthalten. Maßstabsbalken = 20 μm. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungsspuren, die Beispiele für eine Zelle mit (C-E) einzelnen oder (GI) mehreren APs zeigen. APs wurden entweder durch (C,G) einen 250-pA-Schritt oder (D,H) eine Rampenstrominjektion von 0 bis 300 pA bei RMP induziert. Die Einschübe zeigen jeweils eine vergrößerte Ansicht eines der APs an. (E,I) In beiden Zellbeispielen wurden nach innen gerichtete Natrium- und nach außen gerichtete Kaliumströme bei den Spannungsdepolarisationsschritten beobachtet, die von −70 mV in 10-mV-Schritten im Voltage-Clamp-Modus angelegt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Charakterisierung der Mikroglia-Population im hACtx-Gewebe. Konfokale Bilder des hACtx-Gewebes, die die Expression von Iba1 und Tmem119 nach (A) 24 h und (B) 2 Wochen in Kultur zeigen. Die Kernfärbung (Ho: Hoechst, blau) ist in den einzelnen und zusammengeführten Panels enthalten. Maßstabsbalken = 20 μm. Die weißen Pfeile zeigen die Kolokalisierung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Übersicht und elektrophysiologische Eigenschaften von Neuronen aus lt-NES-Zellen 4 Wochen nach der Ex-vivo-Transplantation von GFP-lt-NES-Zellen. (A) Versuchsplanung. Diff = Differenzierung. (B,C) Repräsentative konfokale Bilder von transplantierten GFP-lt-NES-Zellen in (B) gut erhaltenem und (C) schlecht erhaltenem hACtx-Gewebe. Maßstabsbalken = 50 μm. (D) Beispielspur eines aus dem Transplantat stammenden Neurons, das spontan APs abfeuert. Der Einschub zeigt eine vergrößerte Ansicht eines der APs an. Repetitive APs könnten durch eine (E) schrittweise (50 pA) oder (F) Injektion von depolarisierendem Strom aus dem Potential von -70 mV induziert werden. (G) Einströmende Natrium- und nach außen gerichtete Kaliumströme wurden durch 10 mV-Depolarisationsschritte im Spannungszangenmodus aus einem Haltepotential von -70 mV induziert. (H) Im Voltage-Clamp-Modus konnten spontane postsynaptische Ströme (sPSCs) in den transplantatabgeleiteten Neuronen bei einem Haltepotential von -70 mV beobachtet werden. Die Einschübe zeigen eine vergrößerte Ansicht einiger sPSCs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Das Erhalten von hACtx-Scheiben von ausreichender Qualität ist der kritischste Schritt in diesem Protokoll. Kortikales Gewebe wird von Epilepsiepatienten gewonnen, die sich einer resektiven Operation unterziehen24. Die Qualität des resezierten Gewebes sowie die Expositionszeit des Gewebes zwischen Resektion und Kultur sind entscheidend; Je schneller das Gewebe vom Operationssaal ins Labor gebracht und geschnitten wird, desto optimaler ist die organotypische Kultur. Idealerweise sollte das Gewebe innerhalb der ersten Stunden nach der Entnahme geschnitten und in das Zellkulturlabor überführt werden. Die Sauerstoffversorgung des Gewebes während dieses Prozesses verbessert auch die Qualität der Schnitte. In dieser Hinsicht gilt: Je größer die Gewebeprobe, desto geringer ist die Sauerstoffkonzentration, die den Kern erreicht, und desto geringer ist die Lebensfähigkeit, wenn das Gewebe nicht rechtzeitig geschnitten wird. Wenn die Qualität des Wirtsgewebes nicht optimal ist, ist die Validierung von Stammzelltherapien nicht möglich.
Wenn das kortikale Gewebe vom menschlichen Gehirn auf eine Platte übertragen wird, müssen einige Einschränkungen berücksichtigt werden. Während des Schneidevorgangs wird eine große Anzahl von Axonen präpariert, wodurch neuronale Schäden induziert werden, die zu entzündlichen Prozessen wie der Aktivierung von Mikroglia führen25. Aus diesem Grund kann das Zellverhalten in Kultur, selbst wenn das Gewebe als gesund angesehen wird, wenn es im menschlichen Gehirn lokalisiert ist, aufgrund der partiellen Schädigung, die während der Resektion und Vorbereitung der organotypischen Abschnitte26,27 erlitten wurde, unterschiedlich sein. Veränderungen in der Mikroglia-Population könnten mit verschiedenen Techniken überwacht werden, einschließlich der Messung der freigesetzten Zytokinspiegel oder der Bewertung morphologischer Veränderungen28. Wichtig ist, dass, obwohl die Aktivierung der Mikroglia nach 2 Wochen in Kultur als Folge der Veränderung der Umgebung von einem ganzen Organ zu Ex-vivo-Kulturbedingungen beobachtet wurde, die Neuronen zu diesem Zeitpunkt noch lebensfähig waren, wie die neuronale Färbung und die Analyse ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften zeigten. Dickere Gewebeschnitte bleiben besser erhalten; Das Eindringen von Nährstoffen in den inneren Teil der Scheibe ist jedoch beeinträchtigt, was zu einem teilweisen Gewebetod führt. Aus diesem Grund ist 300 μm die optimale Dicke für die organotypische Kultur.
Organotypische Kulturen von hACtx-Gewebe haben deutliche Vorteile gegenüber anderen 3D-Kulturmethoden wie Organoiden oder Sphäroiden. Die Quelle ist ein voll entwickeltes menschliches Gehirn, was bedeutet, dass die Zell- und Matrixumgebung sowie der Reifestatus der verschiedenen Zellpopulationen die gleichen sind wie im erwachsenen menschlichen Gehirn25,29,30. Organoide ähneln eher fetalen Geweben, was für einige Forschungsbereiche wie die Modellierung von Entwicklungsstörungenoptimal ist 31, aber nicht beispielsweise für die Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen, die hauptsächlich die erwachsene Bevölkerung betreffen und spät einsetzen32,33. Am wichtigsten ist, dass die organotypische Kultur von menschlichem Gewebe bis heute das einzige menschliche System ist, das die Validierung von Zelltherapien ermöglicht.
Der größte Teil des Wissens über die Stammzelltransplantation zum neuronalen Ersatz bei neurodegenerativen Erkrankungen stammt aus der In-vivo-Tiermodellierung . Obwohl diese Systeme äußerst wertvoll sind, um die modulatorische Wirkung transplantierter Zellen in den beschädigten Wirtsschaltkreisen zu beurteilen, scheitern die in diesem Aufbau getesteten Therapien aufgrund der deutlichen Unterschiede zwischen Nagetieren und Menschen in der Regel bei der Übertragung in die Klinik34. Aus diesem Grund ist die organotypische Kultur von hACtx-Gewebe eine hervorragende Strategie zur Modellierung menschlicher neurodegenerativer Erkrankungen, die den Kortex betreffen, da die Wechselwirkungen zwischen menschlichen neuronalen Populationen und der Erhaltung der menschlichen Gehirnstruktur untersucht werdenkönnen 25.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese kombinierte Methodik aus organotypischen Langzeitkulturen des adulten menschlichen Kortex und der intrakortikalen ex vivo-Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten kortikalen Vorläuferzellen eine vielversprechende Strategie für die Validierung stammzellbasierter Therapien ist, die die klinische Umsetzung neuronaler Ersatzstrategien zur Stimulierung der funktionellen Erholung im geschädigten Gehirn erleichtern können.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch Zuschüsse des Schwedischen Forschungsrats, der Schwedischen Gehirnstiftung, der Schwedischen Schlaganfallstiftung, der Region Skåne, der Thorsten und Elsa Segerfalk-Stiftung und der Initiative der schwedischen Regierung für strategische Forschungsbereiche (StemTherapy) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Cutting and electrophysiology | |||
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
| Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
| Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2x91 | |
| Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
| Plastic Petri dish | Any suitable | ||
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
| Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| RINSING SOLUTION | |||
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
| Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| Forceps | Any suitable | ||
| Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
| GENERATION OF lt-NES cells | |||
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
| Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
| Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
| Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
| Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
| Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
| Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
| T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
| Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
| Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
| Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
| Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
| Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
| Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
| Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
| Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
| Paint brush | Any suitable | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
| Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
| Distilled water | |||
| Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
| Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
| Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
| Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium citrate | |||
| Distilled water | |||
| Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
| Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
| Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
References
- Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).
- Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work. Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).
- Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).
- Tornero, D., et al. Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli. Brain. 140 (3), 692-706 (2017).
- Palma-Tortosa, S., et al. Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).
- Robinson, N. B., et al. The current state of animal models in research: A review. International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Delavaran, H., et al. Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke. European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).
- Sabuncu, M. R., et al. The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease. Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).
- Eugene, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
- Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
- Kalmbach, B. E., et al. Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons. Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).
- Barth, M., et al. Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54 (2021).
- Almeida, G. M., et al. Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response. Frontiers in Neuroscience. 15, 674576 (2021).
- Schwarz, N., et al. Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures. Scientific Reports. 7, 12249 (2017).
- Miskinyte, G., et al. Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 207 (2017).
- Gronning Hansen, M., et al. Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry. Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).
- Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS One. 7 (1), 29597 (2012).
- Avaliani, N., et al. Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors. Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).
- Engel, J., et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).
- Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).
- Verwer, R. W., et al. Injury response of resected human brain tissue in vitro. Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).
- Verwer, R. W., et al. Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue. Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).
- Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Schwarz, N., et al. Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease. Elife. 8, 48417 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Wang, Z., et al. Organoid technology for brain and therapeutics research. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).
- Wang, H. Modeling neurological diseases with human brain organoids. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).
- Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).
