Dieses Protokoll beschreibt langfristige organotypische Kulturen des adulten menschlichen Kortex in Kombination mit der intrakortikalen Ex-vivo-Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten kortikalen Vorläuferzellen, die eine neuartige Methodik zur weiteren Erprobung stammzellbasierter Therapien für neurodegenerative Erkrankungen beim Menschen darstellen.
Neurodegenerative Erkrankungen sind häufig und heterogen in Bezug auf ihre Symptome und zelluläre Affektiertheit, was ihre Untersuchung aufgrund des Mangels an geeigneten Tiermodellen, die menschliche Krankheiten vollständig nachahmen, und der schlechten Verfügbarkeit von postmortalem menschlichem Hirngewebe erschwert. Die adulte menschliche Nervengewebekultur bietet die Möglichkeit, verschiedene Aspekte neurologischer Erkrankungen zu untersuchen. Molekulare, zelluläre und biochemische Mechanismen könnten in diesem System leicht angegangen werden, ebenso wie das Testen und Validieren von Medikamenten oder verschiedenen Behandlungen, wie z. B. zellbasierten Therapien. Diese Methode kombiniert organotypische Langzeitkulturen des adulten menschlichen Kortex, die von epileptischen Patienten gewonnen wurden, die sich einer resektiven Operation unterziehen, und ex vivo intrakortikale Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten kortikalen Vorläuferzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung des Zellüberlebens, der neuronalen Differenzierung, der Bildung synaptischer Ein- und Ausgänge und der elektrophysiologischen Eigenschaften menschlicher Zellen nach der Transplantation in intaktes erwachsenes menschliches kortikales Gewebe. Dieser Ansatz ist ein wichtiger Schritt auf dem Weg zur Entwicklung einer 3D-Plattform zur Modellierung menschlicher Krankheiten, die die Grundlagenforschung näher an die klinische Umsetzung stammzellbasierter Therapien für Patienten mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen heranführen und die Entwicklung neuer Werkzeuge zur Rekonstruktion geschädigter neuronaler Schaltkreise ermöglichen wird.
Neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson, Alzheimer oder ischämischer Schlaganfall sind eine Gruppe von Krankheiten, die das gemeinsame Merkmal einer neuronalen Fehlfunktion oder des Todes aufweisen. Sie sind heterogen in Bezug auf das betroffene Gehirnareal und die neuronale Population. Leider sind Behandlungen für diese Krankheiten rar oder von begrenzter Wirksamkeit, da es keine Tiermodelle gibt, die das nachahmen, was im menschlichen Gehirn vorkommt 1,2. Die Stammzelltherapie ist eine der vielversprechendsten Strategien für die Regeneration des Gehirns3. Die Erzeugung neuronaler Vorläuferzellen aus Stammzellen aus verschiedenen Quellen hat sich in den letzten Jahren stark entwickelt 4,5. Jüngste Veröffentlichungen haben gezeigt, dass humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPS), die aus Langzeit-Selbsterneuerungs-Neuroepithel-ähnlichen Stammzellen (lt-NES) stammen, nach einem kortikalen Differenzierungsprotokoll und nach intrakortikaler Transplantation in einem Rattenmodell mit ischämischem Schlaganfall, der den somatosensorischen Kortex betrifft, reife kortikale Neuronen erzeugen. Darüber hinaus erhielten die aus dem Transplantat stammenden Neuronen afferente und efferente synaptische Verbindungen von den Wirtsneuronen, was ihre Integration in das neuronale Netzwerk der Ratte zeigte 6,7. Die aus dem Transplantat stammenden Axone wurden myelinisiert und in verschiedenen Bereichen des Rattengehirns gefunden, einschließlich des Peri-Infarktbereichs, des Corpus callosum und des kontralateralen somatosensorischen Kortex. Am wichtigsten ist, dass die aus iPS-Zellen gewonnene Transplantation motorische Defizite bei Schlaganfalltieren umkehrte7.
Auch wenn Tiermodelle helfen, das Überleben von Transplantaten, die neuronale Integration und die Wirkung der transplantierten Zellen auf motorische und kognitive Funktionen zu untersuchen, fehlen in diesem System Informationen über die Interaktion zwischen menschlichen Zellen (Graft-Host) 8,9. Aus diesem Grund wird hier eine kombinierte Methode der organotypischen Langzeitkultur des menschlichen Gehirns mit der ex vivo-Transplantation von humanen iPS-Zellen abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen beschrieben. Organotypische Kulturen des menschlichen Gehirns, die aus neurochirurgischen Resektionen gewonnen werden, sind physiologisch relevante 3D-Modelle des Gehirns, die es Forschern ermöglichen, ihr Verständnis der Schaltkreise des menschlichen Zentralnervensystems zu verbessern und die genaueste Methode zum Testen von Behandlungen für Erkrankungen des menschlichen Gehirns zu finden. In diesem Zusammenhang wurde jedoch nicht genügend Forschung betrieben, und in den meisten Fällen wurden organotypische Kulturen des menschlichen Hippocampus-Gehirns verwendet10,11. Die Großhirnrinde ist von mehreren neurodegenerativen Erkrankungen betroffen, wie z. B. dem ischämischen Schlaganfall12 oder der Alzheimer-Krankheit13, daher ist es wichtig, ein menschliches kortikales 3D-System zu haben, das es uns ermöglicht, unser Wissen zu erweitern und verschiedene therapeutische Strategien zu testen und zu validieren. Mehrere Studien in den letzten Jahren haben Kulturen aus adultem menschlichem kortikalem (hACtx) Gewebe verwendet, um menschliche Gehirnerkrankungen zu modellieren 14,15,16,17,18,19; Im Zusammenhang mit der Stammzelltherapie liegen jedoch nur begrenzte Informationen vor. Zwei Studien haben bereits die Machbarkeit des hier beschriebenen Systems nachgewiesen. Im Jahr 2018 wurde gezeigt, dass menschliche embryonale Stammzellen, die mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren programmiert und in hACtx-Gewebe transplantiert wurden, zu reifen kortikalen Neuronen führen, die sich in erwachsene menschliche kortikale Netzwerke integrieren können20. Im Jahr 2020 zeigte die Transplantation von lt-NES-Zellen in das menschliche organotypische System ihre Fähigkeit, sich in reife, schichtspezifische kortikale Neuronen mit den elektrophysiologischen Eigenschaften funktioneller Neuronen zu differenzieren. Die transplantierten Neuronen stellten sowohl afferente als auch efferente synaptische Kontakte mit den menschlichen kortikalen Neuronen in den erwachsenen Gehirnschnitten her, was durch retrograde monosynaptische Verfolgung des Tollwutvirus, Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen und Immunelektronenmikroskopiebestätigt wurde 21.
Das Erhalten von hACtx-Scheiben von ausreichender Qualität ist der kritischste Schritt in diesem Protokoll. Kortikales Gewebe wird von Epilepsiepatienten gewonnen, die sich einer resektiven Operation unterziehen24. Die Qualität des resezierten Gewebes sowie die Expositionszeit des Gewebes zwischen Resektion und Kultur sind entscheidend; Je schneller das Gewebe vom Operationssaal ins Labor gebracht und geschnitten wird, desto optimaler ist die organotypische Kultur. Idealerweise…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird durch Zuschüsse des Schwedischen Forschungsrats, der Schwedischen Gehirnstiftung, der Schwedischen Schlaganfallstiftung, der Region Skåne, der Thorsten und Elsa Segerfalk-Stiftung und der Initiative der schwedischen Regierung für strategische Forschungsbereiche (StemTherapy) unterstützt.
Tissue Cutting and electrophysiology | |||
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
HEPES | AppliChem | A1069 | |
Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2×91 | |
Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
Plastic Petri dish | Any suitable | ||
Potassium chloride | Merck | 104936 | |
Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
Vibratome | Leica | VT1200 S | |
RINSING SOLUTION | |||
D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
HEPES | AppliChem | A1069 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
Forceps | Any suitable | ||
Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
GENERATION OF lt-NES cells | |||
2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
Paint brush | Any suitable | ||
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
Distilled water | |||
Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
Sodium citrate | |||
Distilled water | |||
Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |