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Neuroscience

मानव स्टेम सेल प्रत्यारोपण और सत्यापन के लिए एक पूर्व विवो मॉडल के रूप में वयस्क मानव कॉर्टेक्स की ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियां

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64234
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Laboratory of Stem Cells and Restorative Neurology, Lund Stem Cell Center, Lund University, 2Lund Stem Cell Center, Lund University

Summary

यह प्रोटोकॉल वयस्क मानव कॉर्टेक्स की दीर्घकालिक ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों का वर्णन करता है, जो प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कॉर्टिकल पूर्वजों के पूर्व विवो इंट्राकॉर्टिकल प्रत्यारोपण के साथ संयुक्त है, जो मानव न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के लिए स्टेम सेल-आधारित उपचारों का परीक्षण करने के लिए एक नई पद्धति प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार उनके लक्षणों और सेलुलर प्रभाव के संदर्भ में आम और विषम हैं, जिससे उचित पशु मॉडल की कमी के कारण उनका अध्ययन जटिल हो जाता है जो पूरी तरह से मानव रोगों की नकल करते हैं और पोस्टमार्टम मानव मस्तिष्क ऊतक की खराब उपलब्धता। वयस्क मानव तंत्रिका ऊतक संस्कृति न्यूरोलॉजिकल विकारों के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करती है। आणविक, सेलुलर और जैव रासायनिक तंत्र को इस प्रणाली में आसानी से संबोधित किया जा सकता है, साथ ही दवाओं या विभिन्न उपचारों, जैसे सेल-आधारित उपचारों का परीक्षण और सत्यापन किया जा सकता है। यह विधि वयस्क मानव कॉर्टेक्स के दीर्घकालिक ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों को जोड़ती है, जो रिसेक्टिव सर्जरी से गुजरने वाले मिर्गी के रोगियों से प्राप्त होती है, और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कॉर्टिकल पूर्वजों के पूर्व विवो इंट्राकॉर्टिकल प्रत्यारोपण से प्राप्त होती है। यह विधि सेल अस्तित्व, न्यूरोनल भेदभाव, सिनैप्टिक इनपुट और आउटपुट के गठन और बरकरार वयस्क मानव कॉर्टिकल ऊतक में प्रत्यारोपण के बाद मानव-व्युत्पन्न कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों के अध्ययन की अनुमति देगी। यह दृष्टिकोण 3 डी मानव रोग मॉडलिंग प्लेटफॉर्म के विकास से पहले एक महत्वपूर्ण कदम है जो विभिन्न न्यूरोलॉजिकल विकारों वाले रोगियों के लिए स्टेम सेल-आधारित उपचारों के नैदानिक अनुवाद के करीब बुनियादी शोध लाएगा और क्षतिग्रस्त तंत्रिका सर्किट के पुनर्निर्माण के लिए नए उपकरणों के विकास की अनुमति देगा।

Introduction

न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार, जैसे पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग, या इस्केमिक स्ट्रोक, बीमारियों का एक समूह है जो न्यूरोनल खराबी या मृत्यु की सामान्य विशेषता साझा करता है। वे मस्तिष्क क्षेत्र और प्रभावित न्यूरोनल आबादी के संदर्भ में विषम हैं। दुर्भाग्य से, इन बीमारियों के लिए उपचार दुर्लभ हैं या पशु मॉडल की कमी के कारण सीमित प्रभावकारिता के हैं जो मानव मस्तिष्क 1,2 में होने वाली चीजों की नकल करते हैं। स्टेम सेल थेरेपीमस्तिष्क पुनर्जनन के लिए सबसे आशाजनक रणनीतियों में से एक है। विभिन्न स्रोतों से स्टेम कोशिकाओं से न्यूरोनल पूर्वजों की पीढ़ी हाल के वर्षों में बहुत विकसित हुईहै4,5. हाल के प्रकाशनों से पता चला है कि मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम (आईपीएस) सेल-व्युत्पन्न दीर्घकालिक स्व-नवीनीकृत न्यूरोएपिथेलियल-जैसे स्टेम (एलटी-एनईएस) कोशिकाएं, एक कॉर्टिकल भेदभाव प्रोटोकॉल का पालन करते हुए और सोमैटोसेंसरी कॉर्टेक्स को प्रभावित करने वाले इस्केमिक स्ट्रोक के साथ एक चूहे के मॉडल में इंट्राकॉर्टिकल प्रत्यारोपण के बाद, परिपक्व कॉर्टिकल न्यूरॉन्स उत्पन्न करती हैं। इसके अलावा, ग्राफ्ट-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स को मेजबान न्यूरॉन्स से अभिवाही और अपवाही सिनैप्टिक कनेक्शन प्राप्त हुए, जो चूहे के न्यूरोनल नेटवर्क 6,7 में उनके एकीकरण को दर्शाते हैं। ग्राफ्ट-व्युत्पन्न अक्षतंतु माइलिनेटेड थे और चूहे के मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में पाए गए थे, जिनमें पेरी-इन्फ्रैक्ट क्षेत्र, कॉर्पस कॉलोसम और विपरीत सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स शामिल थे। सबसे महत्वपूर्ण बात, आईपीएस सेल-व्युत्पन्न प्रत्यारोपण ने स्ट्रोक जानवरों में मोटर घाटे को उलट दिया।

यहां तक कि अगर पशु मॉडल प्रत्यारोपण अस्तित्व, न्यूरोनल एकीकरण और मोटर और संज्ञानात्मक कार्यों पर ग्राफ्टेड कोशिकाओं के प्रभाव का अध्ययन करने में मदद करते हैं, तो इस प्रणाली में मानव कोशिकाओं (ग्राफ्ट-होस्ट) के बीच बातचीत के बारे में जानकारी गायब है। इस कारण से, मानव आईपीएस सेल-व्युत्पन्न न्यूरोनल पूर्वजों के पूर्व विवो प्रत्यारोपण के साथ दीर्घकालिक मानव मस्तिष्क ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृति की एक संयुक्त विधि यहां वर्णित है। न्यूरोसर्जिकल रिसेक्शन से प्राप्त मानव मस्तिष्क ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियां मस्तिष्क के शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी मॉडल हैं जो शोधकर्ताओं को मानव केंद्रीय तंत्रिका तंत्र सर्किटरी की अपनी समझ बढ़ाने और मानव मस्तिष्क विकारों के लिए उपचार के परीक्षण का सबसे सटीक तरीका है। हालांकि, इस संदर्भ में पर्याप्त शोध नहीं किया गया है, और ज्यादातर मामलों में, मानव हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों का उपयोग10,11 किया गया है। सेरेब्रल कॉर्टेक्स कई न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों से प्रभावित होता है, जैसे कि इस्केमिक स्ट्रोक12 या अल्जाइमर रोग13, इसलिए मानव कॉर्टिकल 3 डी प्रणाली होना महत्वपूर्ण है जो हमें अपने ज्ञान का विस्तार करने और विभिन्न चिकित्सीय रणनीतियों का परीक्षण और मान्य करने की अनुमति देता है। पिछले कुछ वर्षों में कई अध्ययनों ने मानव मस्तिष्क रोगों को मॉडल करने के लिए वयस्क मानव कॉर्टिकल (एचएसीटीएक्स) ऊतक से संस्कृतियों का उपयोग किया है 14,15,16,17,18,19; हालांकि, स्टेम सेल थेरेपी के संदर्भ में सीमित जानकारी उपलब्ध है। दो अध्ययनों ने पहले ही यहां वर्णित प्रणाली की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है। 2018 में, मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को विभिन्न प्रतिलेखन कारकों के साथ प्रोग्राम किया गया और एचएसीटीएक्स ऊतक में प्रत्यारोपित किया गया, जो परिपक्व कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को जन्म देने के लिए दिखाया गया था जो वयस्क मानव कॉर्टिकल नेटवर्क20 में एकीकृत हो सकते हैं। 2020 में, मानव ऑर्गेनोटाइपिक सिस्टम में एलटी-एनईएस कोशिकाओं के प्रत्यारोपण से कार्यात्मक न्यूरॉन्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों के साथ परिपक्व, परत-विशिष्ट कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में अंतर करने की उनकी क्षमता का पता चला। ग्राफ्टेड न्यूरॉन्स ने वयस्क मस्तिष्क स्लाइस में मानव कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के साथ अभिवाही और अपवाही सिनैप्टिक संपर्क दोनों स्थापित किए, जैसा कि रेबीज वायरस प्रतिगामी मोनोसिनेप्टिक ट्रेसिंग, पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग और इम्यूनो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी21 द्वारा पुष्टि की गई है।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल क्षेत्रीय नैतिक समिति, लुंड, स्वीडन (नैतिक परमिट संख्या 2021-07006-01) द्वारा अनुमोदित दिशानिर्देशों का पालन करता है। टेम्पोरल लोब मिर्गी के लिए वैकल्पिक सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों से स्वस्थ नियोकॉर्टिकल ऊतक प्राप्त किया गया था। सभी रोगियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

नोट: प्राप्त सभी ऊतकों को उनके आकार की परवाह किए बिना संसाधित किया गया था। हालांकि, आकार में 1-1.5 मिमी3 से छोटे ऊतक तकनीकी रूप से एक वाइब्रेटोम के साथ संभालने और खंड करने के लिए चुनौतीपूर्ण होंगे।

1. ऊतक संग्रह, रखरखाव, काटने और चढ़ाना

  1. ऊतक के टुकड़े से पहले दिन तैयारी
    1. एक वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में 2 एल काटने का समाधान (तालिका 1) तैयार करें। एमजीसीएल 2 और सीएसीएल2 को छोड़कर सभी अवयवों को ~ 1,800 एमएल विआयनीकृतपानी में घोलें और 15 मिनट के लिए कार्बोजेन गैस के साथ बुलबुला करें। फिर 1 M MgCl 2 और CaCl2 समाधानों की उचित मात्रा जोड़ें और एक और 15 मिनट के लिए बुदबुदाते रहें। अंत में, फ्लास्क को 2 एल निशान तक भरें; पीएच और ऑस्मोलरिटी की जांच करें और यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें। तैयार घोल के 2 x 350 एमएल को फ्रीज करें और बाकी को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: पीएच और ऑस्मोलरिटी आमतौर पर क्रमशः 7.3-7.4 और 295-300 एमओएसएम हैं।
    2. 100 एमएल कुल्ला समाधान तैयार करें (तालिका 2)। 100 एमएल एचबीएसएस में 476 मिलीग्राम एचईपीईएस और 200.6 मिलीग्राम ग्लूकोज घोलें, जो 5 एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है। इसे 10 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. मानव वयस्क कॉर्टिकल (एचएसीटीएक्स) कल्चर माध्यम (एचएसीटीएक्स माध्यम) (तालिका 3) तैयार करें और इसे हवादार हुड के तहत सेल कल्चर लैब में फ़िल्टर करें। माध्यम में फिनोल लाल के बिना न्यूरोनल माध्यम शामिल है ( सामग्री की तालिका देखें), बी 27 पूरक, एल-ग्लूटामाइन ( सामग्री की तालिका देखें), और जेंटामाइसिन। 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. ऊतक के नमूनों के आगमन से पहले ऑपरेशन के दिन तैयारी
    1. आवश्यक उपकरण और प्रयोगशाला स्थान की उपलब्धता की जांच करें, और सभी सर्जिकल उपकरणों और विब्राटोम ( सामग्री की तालिका देखें), साथ ही बेंचटॉप स्पेस को आसुत पानी (डिटर्जेंट के बिना) के साथ अच्छी तरह से साफ करें, इसके बाद 70% इथेनॉल। उपकरणों और उपकरणों का उपयोग करने से पहले इथेनॉल को कम से कम 30 मिनट तक सूखने दें।
    2. जमे हुए काटने के घोल को कुचल दें और 30 मिनट के लिए कार्बोजेन गैस के साथ बर्फ और तरल के "सूप" को बुलबुला करें। फिर, कुचल समाधान 'सूप' के साथ कंटेनरों में से एक को कसकर बंद करें और इसे आइसबॉक्स में रखें। इसका उपयोग ऑपरेशन कक्ष से ऊतक एकत्र करने के लिए किया जाएगा।
    3. वाइब्रेटोम को कैलिब्रेट करें और काटने के मापदंडों को सेट करें: 0.05 मिमी / कटिंग चैंबर को वाइब्रेटोम स्टेज पर रखें और इससे जुड़े कूलर को शुरू करें ताकि कक्ष -3 डिग्री सेल्सियस के निरंतर तापमान पर हो।
    4. ऊतक स्लाइस और काटने के समाधान को रखने के लिए सम्मिलित के साथ स्लाइस संग्रह कक्ष तैयार करें, इसे कमरे के तापमान (आरटी) पर कार्बोजेन गैस के साथ लगातार बुदबुदाएं।
    5. सेल कल्चर लैब में और हवादार हुड के नीचे, कल्चर इंसर्ट को फोर्सप्स का उपयोग करके 6-वेल प्लेट में डालें। इंसर्ट के निचले भाग पर 5 एमएल एचएसीटीएक्स माध्यम जोड़ें जब तक कि यह झिल्ली से संपर्क न करे, बुलबुले के गठन से बच जाए, और इंसर्ट के शीर्ष पर 2 एमएल जोड़ें। ऊतक स्लाइस को इंसर्ट में स्थानांतरित करने से पहले कम से कम 2 घंटे के लिएइनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर संतुलन बनाएं।
  3. ऊतक संग्रह और टुकड़े करने की प्रक्रिया
    1. शोधन के तुरंत बाद, ऑपरेशन कक्ष में रोगी से ऊतक एकत्र करें, यदि संभव हो, तो सीधे जमे हुए, बुलबुले और कुचल काटने के समाधान के साथ एक कंटेनर में। बर्फ पर बंद कंटेनर को तुरंत प्रयोगशाला के काटने वाले क्षेत्र में स्थानांतरित करें।
    2. ऊतक का निरीक्षण करें और कॉर्टिकल परतों के अभिविन्यास पर विचार करते हुए, गोंद के लिए सबसे अच्छी सतह का पता लगाएं (चरण 1.3.3 देखें)। यदि आवश्यक हो, तो असमान सतह को स्केलपेल से काटें ताकि इष्टतम स्लाइस अभिविन्यास के लिए ऊतक को मंच पर रखना आसान हो।
    3. ऊतक चिपकने वाले के साथ ऊतक को मंच पर गोंद करें ( सामग्री की तालिका देखें), इसे स्लाइसिंग कक्ष में रखें, और तुरंत ठंडे बुलबुले वाले काटने के घोल के साथ कक्ष भरें। पूरी काटने की प्रक्रिया के दौरान बुदबुदाहट जारी रखें।
    4. ऊतक-से-ब्लेड अभिविन्यास के आधार पर कोरोनल या स्लाइस काटें, सभी कॉर्टिकल परतों और यदि संभव हो तो, सफेद पदार्थ को शामिल करने के लिए 300 μm की मोटाई पर। स्लाइस को संग्रह कक्ष में आरटी पर बुदबुदाहट काटने के घोल के साथ रखें।
      नोट: कॉर्टेक्स की सतह की ओर सफेद पदार्थ की तरफ से काटें। मेनिंगेस को न हटाएं, क्योंकि इससे ऊतक को नुकसान हो सकता है। काटने वाला ब्लेड आमतौर पर उनके माध्यम से आसानी से स्लाइस करता है।
    5. एक बार जब सभी ऊतक काट दिए जाते हैं, तो स्लाइस को आरटी में कुल्ला समाधान के साथ एक बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और उन्हें सेल कल्चर लैब में ले जाएं। संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित करने से पहले स्लाइस से अतिरिक्त सुक्रोज को हटाने के लिए यह कदम आवश्यक है।
      नोट: स्लाइस को स्थानांतरित करने के लिए (इस और निम्नलिखित चरणों में), एक उल्टे ग्लास पिपेट का उपयोग करें, पतले हिस्से को तोड़ दें, और चूषण के लिए एक रबर टेट रखें।
  4. HACX ऊतक स्लाइस की संस्कृति और रखरखाव
    1. व्यक्तिगत रूप से ऊतक स्लाइस को पहले से ही गीले और जलमग्न इंसर्ट के शीर्ष पर रखें। 24 घंटे के बाद, काटने की प्रक्रियाओं से किसी भी शेष सुक्रोज या अन्य अवशिष्ट पदार्थों को हटाने के लिए माध्यम बदलें।
    2. संस्कृति माध्यम को हर 7 दिनों में ताजा माध्यम से बदलें। 2 सप्ताह के बाद, जेंटामाइसिन के बिना एचएसीटीएक्स माध्यम का उपयोग करें। संस्कृति को 2 महीने तक बनाए रखा जा सकता है।
      नोट: मध्यम परिवर्तन से पहले कम से कम2 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में एचएसीटीएक्स माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर बराबर करें। ताजा माध्यम हर 2 सप्ताह में तैयार किया जाना चाहिए। हर 2-3 दिनों में स्लाइस की जांच करें और, यदि कुछ माध्यम वाष्पित हो गए हैं, तो सम्मिलित करने के शीर्ष पर अधिक जोड़ें।
काटने का समाधान स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता [mM] प्रति 1 L
शर्करा चूर्ण 200 68.46 ग्राम
NaHCO3 चूर्ण 21 1.76 ग्राम
KCl चूर्ण 3 0.22 ग्राम
NaH2PO4 चूर्ण 1.25 0.17 ग्राम
ग्लूकोज़ चूर्ण 10 1.80 ग्राम
MgSO4 1 M 2 2 mL
CaCl2 1 M 1.6 1.6 mL
MgCl2 2 M 2 1 mL

तालिका 1: काटने के समाधान की संरचना। एमजीसीएल2 और सीएसीएल2 का उपयोग विआयनीकृत पानी में पूर्व-तैयार 1 एम समाधान के रूप में किया जाता है।

कुल्ला समाधान स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता प्रति 100 mL
HBSS 1x 95 mL
PenStrep 10,000 U / 500 U/ 5 mL
HEPES चूर्ण 4.76 g/L 476 मिलीग्राम
ग्लूकोज़ चूर्ण 2 g/L 200.6 मिलीग्राम

तालिका 2: कुल्ला समाधान की संरचना।

hACtx मध्यम स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता प्रति 100 mL
फिनोल लाल के बिना न्यूरोनल माध्यम 97.4 एमएल सामग्री की तालिका देखें
B27 50x 1:50 2 mL
एल-ग्लूटामाइन 100x 1:200 500 μL सामग्री की तालिका देखें
Gentamicin 50 मिलीग्राम / 1:1000 100 μL

तालिका 3: एचएसीटीएक्स माध्यम की संरचना।

2. एलटी-एनईएस कोशिकाओं का प्रसार और भेदभाव

नोट: एलटी-एनईएस कोशिकाएं पहले वर्णित21,22 के रूप में उत्पन्न होती हैं और एक संवैधानिक प्रमोटर (जीएफपी-एलटी-एनईएस कोशिकाओं) के तहत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को ले जाने वाले लेंटिवायरल वेक्टर के साथ ट्रांसड्यूस होती हैं। 3 x 106 कोशिकाओं वाली शीशियों को उपयोग तक -150 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।

  1. स्टॉक समाधान और मीडिया की तैयारी
    1. पीबीएस-0.1% बीएसए के 10 एमएल में 100 μg बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (bFGF) को पतला करें ताकि 10 μg / mL की स्टॉक एकाग्रता हो। 100 μL एलिकोट तैयार करें।
    2. पीबीएस-0.1% बीएसए के 10 एमएल में एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) के 100 μg को पतला करें ताकि 10 μg / mL की स्टॉक एकाग्रता हो। 100 μL एलिकोट तैयार करें।
    3. एलिकोट 50x B27 प्रति एलिकोट 100 μL की मात्रा में पूरक है।
    4. 100 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में 10 मिलीग्राम पॉली-एल-ऑर्निथिन को पतला करें ताकि 100 μg / mL की स्टॉक एकाग्रता हो। 1 एमएल एलिकोट बनाएं।
    5. 1.20 मिलीग्राम / एमएल माउस लैमिनिन के 30 μL एलिकोट तैयार करें।
    6. पीबीएस के 90 एमएल में ट्रिप्सिन-ईडीटीए (0.25%) के 10 एमएल को 0.025% की स्टॉक एकाग्रता तक पतला करें। 1 एमएल एलिकोट तैयार करें।
    7. पीबीएस के 50 एमएल में 0.025 ग्राम ट्रिप्सिन अवरोधक को 0.5 मिलीग्राम / एमएल की स्टॉक एकाग्रता में पतला करें। 1 एमएल एलिकोट तैयार करें।
    8. पीबीएस-0.1% बीएसए के 1 एमएल में डब्ल्यूएनटी 3 ए (विंगलेस-टाइप एमएमटीवी एकीकरण साइट परिवार के सदस्य 3 ए) के 10 μg को पतला करें ताकि 10 μg / mL की स्टॉक एकाग्रता हो। बीएमपी 4 (हड्डी मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन 4) को उसी तरह तैयार करें। 100 μL की मात्रा में Aliquot.
    9. डीएमएसओ के 2.5 एमएल में 1 मिलीग्राम साइक्लोपामाइन को 400 μg / mL की अंतिम सांद्रता में पतला करें, और 100 μL एलिकोट बनाएं।
    10. मूल माध्यम (तालिका 4) और विभेदन-परिभाषित माध्यम (डीडीएम, तालिका 5) तैयार करें, और 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. संस्कृति व्यंजनों की कोटिंग
    1. प्रसार या विभेदन के दौरान जीएफपी-आईटी-एनईएस कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए व्यंजनों को पूर्व-कोट करने के लिए, विआयनीकृत पानी में पॉली-एल-ऑर्निथिन 1: 100 को पतला करें और टी 25 फ्लास्क में 5 एमएल घोल जोड़ें। आरटी पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    2. पॉली-एल-ऑर्निथिन लेपित प्लेटों को 1x को विआयनीकृत पानी से और 1x को पीबीएस के साथ धोएं।
    3. प्रसार में जीएफपी-आईटी-एनईएस कोशिकाओं के लिए, पीबीएस में 1:500 पर माउस लेमिनिन को पतला करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। विभेदन में जीएफपी-आईटी-एनईएस कोशिकाओं के लिए, पीबीएस में 1: 100 पर माउस लेमिनिन को पतला करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. GFP-lt-NES कोशिकाओं का प्रसार
    1. दो अलग-अलग 15 एमएल ट्यूबों में मूल माध्यम के 5 एमएल (धोने के लिए) और 5 एमएल (सीडिंग के लिए) गर्म करें।
    2. तेजी से 37 डिग्री सेल्सियस पर जीएफपी-एलटी-एनईएस कोशिकाओं की एक शीशी को पिघलाएं, उन्हें वॉशिंग ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. गोली को स्पर्श किए बिना माध्यम को सावधानी से एस्पिरेट करें, और कोशिकाओं को 1 एमएल पूर्व-गर्म मूल माध्यम में पुन: निलंबित करें। सेल निलंबन को प्रसार कारकों के साथ पूरक बुनियादी माध्यम युक्त सीडिंग ट्यूब में स्थानांतरित करें: ईजीएफ (10 एनजी / एमएल), बीएफजीएफ (10 एनजी / एमएल), और बी 27 (10 एनजी / एमएल)। कोशिकाओं को पॉली-एल-ऑर्निथिन/लैमिनिन-लेपित टी 25 फ्लास्क पर बीज दें।
    4. कोशिकाओं को हर दिन प्रसार कारकों के साथ खिलाएं। यदि माध्यम पीला हो जाता है तो इसे बदलें। कोशिकाओं को हर तीसरे या चौथे दिन पारित करें (100% सामंजस्य तक पहुंचने के 1 दिन बाद)।
  4. प्रसार और विभेदन के लिए GFP-lt-NES कोशिकाओं को विभाजित करना
    1. प्रति फ्लास्क (कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए) मूल माध्यम के पूर्व-गर्म 5 एमएल, साथ ही उन्हें फिर से सीज करने के लिए आवश्यक कुल मात्रा।
      नोट: कोशिकाओं को प्रसार में रखने के लिए मार्ग 1: 3 कमजोर पड़ने पर किया जाता है, जिसमें 15 एमएल बुनियादी माध्यम की आवश्यकता होती है, और भेदभाव शुरू करने के लिए 1: 6 कमजोर पड़ने की आवश्यकता होती है, जिसमें 30 एमएल बुनियादी माध्यम की आवश्यकता होती है।
    2. कोशिका संस्कृति फ्लास्क से माध्यम को आकांक्षा द्वारा हटा दें, और 500 μL पूर्व-गर्म 0.025% ट्रिप्सिन जोड़ें। आरटी पर 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं की टुकड़ी की पुष्टि 10x आवर्धन पर एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत की जा सकती है।
    3. ट्रिप्सिन अवरोधक (0.5 मिलीग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) की एक समान मात्रा जोड़ें, इसके बाद 5 एमएल गर्म बुनियादी माध्यम। कोशिकाओं को अलग करें और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके इकट्ठा करें। कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 300 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. कोशिकाओं को प्रसार में रखने के लिए, प्रसार कारकों के साथ पूरक ताजा बुनियादी माध्यम में 1: 3 कमजोर पड़ने पर पुनरावृत्ति करें, और चरण 2.3.4 को दोहराएं।
  5. जीएफपी-एलटी-एनईएस कोशिकाओं का कॉर्टिकल भेदभाव
    1. दिन 0 पर, प्रसार कारकों के साथ पूरक बुनियादी माध्यम के 30 एमएल में कोशिकाओं (भेदभाव के लिए उपयोग किए जाने वाले) को फिर से निलंबित करें, और उन्हें छह विभेदन-लेपित टी 25 फ्लास्क (विभाजित 1: 6) में प्लेट करें।
    2. दिन 1 पर, माध्यम के आधे हिस्से को डीडीएम में बदलें, और उनकी एकाग्रता के आधे हिस्से पर प्रसार कारक जोड़ें।
    3. दिन 2 पर, माध्यम को पूरी तरह से डीडीएम में बदलें जो भेदभाव कारकों के साथ पूरक है: बीएमपी 4 (10 एनजी / एमएल), डब्ल्यूएनटी 3 ए (10 एनजी / एमएल), और साइक्लोपामाइन (400 एनजी / एमएल)।
    4. दिन 4 पर, अकेले भेदभाव कारक जोड़ें। यदि माध्यम पीला हो जाता है तो इसे बदलें।
    5. दिन 6 पर, बीएमपी 4 और डब्ल्यूएनटी 3 ए के साथ पूरक डीडीएम में माध्यम बदलें। इस चरण में साइक्लोपामाइन को हटा दिया जाता है।
    6. दिन 7 पर, चरण 2.4.2 और चरण 2.4.3 में बताए गए अनुसार कोशिकाओं को अलग करें।
मूल माध्यम स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता प्रति 100 mL
एल-ग्लूटामाइन के साथ डीएमईएम / एफ 12 1x 98.7 एमएल
एन -2 पूरक 100x 1:100 1 mL
ग्लूकोज़ 45% 3.5 mL/ 350 μL

तालिका 4: एलटी-एनईएस कोशिकाओं (मूल माध्यम) के प्रसार माध्यम की संरचना।

DDM माध्यम स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता प्रति 100 mL
एल-ग्लूटामाइन के साथ डीएमईएम / एफ 12 96 mL
N2 100 x 1:100 1 mL
एनईएए 100 x 1:100 1 mL
सोडियम पाइरूवेट 100 mM 1:100 1 mL
बीएसए वी अंश 7.5% 6.6 mL/ 660 μL
2-मर्काप्टोएथेनॉल 50 nM 7 μL/L 0.7 μL
ग्लूकोज़ 45% 3.2 mL/ 320 μL

तालिका 5: एलटी-एनईएस कोशिकाओं के विभेदन-परिभाषित माध्यम (डीडीएम) की संरचना।

3. जीएफपी-एलटी-एनईएस कोशिकाओं का ऑर्गेनोटाइपिक एचएसीटीएक्स स्लाइस में प्रत्यारोपण

नोट: सेल प्रत्यारोपण से पहले 1 सप्ताह के लिए एचएसीटीएक्स ऊतक को सुसंस्कृत किया जाना चाहिए। प्रत्यारोपण प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए, ऊतक को तैरने से रोकने के लिए सम्मिलित के शीर्ष से 2 एमएल एचएसीटीएक्स माध्यम को हटाना आवश्यक है।

  1. 1 x 10 5 कोशिकाओं /μL की सांद्रता पर ठंडे शुद्ध तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स ( सामग्री की तालिका देखें) में कॉर्टिकल रूप से प्राइमेड जीएफपी-एलटी-एनईएस कोशिकाओं (चरण2.5.6 से) को फिर से निलंबित करें और घोल को एक छोटे बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: प्रत्यारोपण प्रक्रिया के दौरान, जेल जमने से बचने के लिए सभी सामग्रियों (पिपेट टिप्स, ट्यूब, केशिका, आदि) को पूर्व-ठंडा किया जाना चाहिए। इसके उपयोग से पहले 30 मिनट के लिए बर्फ पर बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स जेल को पिघलाएं।
  2. सेल निलंबन को सक्शन के लिए रबर टेट से जुड़े ठंडे ग्लास केशिका में इकट्ठा करें। विभिन्न स्थानों पर अर्ध-शुष्क ऊतक स्लाइस को छुरा घोंपकर सेल निलंबन को छोटी बूंदों (लगभग 1 μL प्रत्येक) के रूप में इंजेक्ट करें।
  3. जेल को जमने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। प्लेट को इनक्यूबेटर से वापस हुड में स्थानांतरित करें, और ऊतक को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए इंसर्ट के शीर्ष पर 2 एमएल एचएसीटीएक्स माध्यम को सावधानीपूर्वक जोड़ें।
  4. प्रति सप्ताह एक बार ताजा एचएसीटीएक्स माध्यम के साथ संस्कृति माध्यम को बदलें।

4. सत्यापन

  1. HACtx स्लाइस का धुंधला होना
    1. वांछित समय बिंदु पर, सेल कल्चर लैब से स्लाइस निकालें, और उन्हें पीबीएस के साथ पेट्री डिश में डुबोकर डालने से हटा दें। फिर, स्लाइस को उल्टे ग्लास पिपेट का उपयोग करके धुंधला शीशियों में स्थानांतरित करें (चरण 1.3.5 में नोट देखें), और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ ठीक करें।
    2. हर बार 15 मिनट के लिए KPBS के साथ 3x को धोएं, और परमेबिलाइजेशन समाधान (0.02% बीएसए और KPBS में 1% ट्राइटन X-100) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    3. अगले दिन, ब्लॉकिंग समाधान जोड़ें (0.2% ट्राइटन एक्स -100, 1% बीएसए, सोडियम एज़ाइड [1: 10,000], और 10% सामान्य गधे सीरम के साथ केपीबीएस), और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    4. ब्लॉक करने के बाद, ब्लॉकिंग समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें (कमजोर पड़ने के लिए तालिका 6 देखें), और 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. प्रत्येक 15 मिनट के लिए सीरम जोड़े बिना ब्लॉकिंग समाधान के साथ 3x धो लें। ब्लॉकिंग समाधान में पतला द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें (कमजोर पड़ने के लिए तालिका 6 देखें), और 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. सीरम के बिना ब्लॉकिंग समाधान के साथ 3x को धोएं, और 2 घंटे के लिए RT में होचस्ट स्टेन में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. केपीबीएस के साथ 3x धोएं, पेंटब्रश का उपयोग करके ग्लास स्लाइड पर स्लाइस माउंट करें, और उन्हें सूखने दें। अंत में, स्लाइड्स को विआयनीकृत पानी से धोएं, अतिरिक्त पानी निकालें, माउंटिंग माध्यम जोड़ें, और ग्लास कवरस्लिप के साथ कवर करें। आरटी पर कम से कम 24 घंटे के लिए स्लाइड रखें, और इमेजिंग तक उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: परमाणु एपिटोप्स लेबलिंग करने वाले एंटीबॉडी के लिए, 65 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सोडियम साइट्रेट (10 एमएम, पीएच 6.0) के साथ परमेबिलाइजेशन (चरण 4.1.2) से पहले एंटीजन पुनर्प्राप्ति करें।
  2. पूरे सेल पैच-क्लैंप
    1. रिकॉर्डिंग के दिन, मानव कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एचसीएसएफ) का 1 एल तैयार करें, जिसे मानव मस्तिष्क के वातावरण से बेहतर मिलान करने के लिए संशोधित किया गया है (तालिका 7)। काटने के समाधान के समान, विआयनीकृत पानी में घुले CaCl2 को छोड़कर सभी अवयवों के साथ लगभग 900 मिलीलीटर घोल बनाएं, और 1 M CaCl2 समाधान की उचित मात्रा जोड़ने से पहले इसे 15 मिनट के लिए कार्बोजेन के साथ बुलबुला करें। वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क को 1 एल मार्क तक भरें, और रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले और प्रयोग के दौरान अतिरिक्त 15 मिनट के लिए आरटी पर बुदबुदाना जारी रखें।
    2. एक सीधे माइक्रोस्कोप के चरण पर कल्चर प्लेट से रिकॉर्डिंग कक्ष में ऊतक स्लाइस स्थानांतरित करें जो लगातार 2 एमएल / मिनट की छिड़काव दर पर बुलबुले वाले एचसीएसएफ के साथ जुड़ा हुआ है और स्नान तापमान नियंत्रक का उपयोग करके 34 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है।
    3. पिपेट पुलर के साथ ग्लास केशिकाओं को 3-5 एम के औसत प्रतिरोध तक खींचें, और रिकॉर्ड की गई कोशिकाओं की पोस्ट-हॉक पहचान के लिए ताजा जोड़े गए 2-4 मिलीग्राम बायोसाइटिन के साथ के-ग्लूकोनेट-आधारित आंतरिक समाधान (तालिका 8) के साथ केशिकाओं को वापस भरें। इस आंतरिक समाधान का पीएच और परासरणक्रमशः 7.2-7.3 और 285-295 एमओएसएम है।
    4. मेजबान सेल रिकॉर्डिंग के मामले में, 4x उद्देश्य के साथ स्लाइस का एक मोटा अवलोकन प्राप्त करें, और 40x उद्देश्य के साथ पैच करने के लिए एक स्वस्थ दिखने वाला सेल ढूंढें। फिर, मानक पूरे सेल पैच क्लैंप के साथ आगे बढ़ें।
    5. ग्राफ्टेड सेल रिकॉर्डिंग के मामले में, ग्राफ्ट में जीएफपी रिपोर्टर अभिव्यक्ति द्वारा ब्लू रेंज (460 एनएम) में 4x उद्देश्य और एक एपिफ्लोरेसेंस फिल्टर का उपयोग करके ग्राफ्टेड कोशिकाओं के साथ ऊतक क्षेत्र की पहचान करें। फिर, 40x उद्देश्य के साथ स्थित क्षेत्र में ज़ूम इन करें, और एक मानक पूरे सेल पैच क्लैंप के लिए जीएफपी व्यक्त करने वाला एक ग्राफ्टेड सेल ढूंढें।
    6. सेल में टूटने के तुरंत बाद आराम झिल्ली क्षमता (आरएमपी) की जांच करें, और सुनिश्चित करें कि रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता अच्छी है। पूरे सेल वोल्टेज या वर्तमान-क्लैंप कॉन्फ़िगरेशन में रुचि के सभी मापदंडों (जैसे, झिल्ली प्रतिरोध [आरआई], एपी पैरामीटर, सोडियम और पोटेशियम धाराओं और सिनैप्टिक गतिविधि) को रिकॉर्ड करें।
    7. सभी आवश्यक डेटा एकत्र करने के बाद, सेल को और नुकसान पहुंचाए बिना रिकॉर्डिंग पिपेट को सावधानीपूर्वक वापस ले लें ताकि इसे पोस्ट-हॉक इम्यूनोस्टेनिंग के साथ पहचाना जा सके।
    8. चरण 4.1 में वर्णित के रूप में, स्लाइस को आगे के निर्धारण और धुंधला करने के लिए 4% पीएफए समाधान में स्थानांतरित करें। स्ट्रेप्टाविडिन का उपयोग रिकॉर्डिंग के दौरान बायोसाइटिन से भरी कोशिकाओं को इम्यूनोलेबल करने के लिए किया जाता है।
एंटीबॉडी तनूकरण नोट्स 
प्राथमिक
चिकन एंटी-जीएफपी 1:1000
चिकन एंटी-एमएपी 2 1:1000
बकरी विरोधी AIF1 1:100
माउस एंटी-MBP 1:1000 एंटीजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता
माउस एंटी-SC123 1:2000
खरगोश विरोधी NeuN 1:1000
खरगोश विरोधी Olig2 1:500
खरगोश विरोधी Tmem119 1:200
माध्यमिक
488-संयुग्मित एफिनिटीप्योर गधे एंटी-माउस आईजीजी 1:500
488-संयुग्मित एफिनिटीप्योर गधा विरोधी खरगोश आईजीजी 1:500
488-संयुग्मित एफिनिटीप्योर गधा एंटी-चिकन आईजीजी 1:500
Cy3-संयुग्मित एफिनिटीप्योर गधा एंटी-चिकन आईजीजी 1:500
Cy3-संयुग्मित एफिनिटीप्योर गधा विरोधी बकरी आईजीजी 1:500
Cy3-संयुग्मित एफिनिटीप्योर गधा एंटी-माउस IgG 1:500
एलेक्सा फ्लोर 647-संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन 1:500

तालिका 6: इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी की सूची।

haCSF स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता [mM] प्रति 1 L
NaCl चूर्ण 129 7.54 ग्राम
NaHCO3 चूर्ण 21 1.76 ग्राम
ग्लूकोज़ चूर्ण 10 1.80 ग्राम
KCl चूर्ण 3 0.22 ग्राम
NaH2PO4 चूर्ण 1.25 0.17 ग्राम
MgSO4 1 M 2 2 mL
CaCl2 1 M 1.6 1.6 mL

तालिका 7: कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एचसीएसएफ) की संरचना।

के-ग्लूकोनेट आंतरिक समाधान स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता [mM] प्रति 100 mL
के-ग्लूकोनेट चूर्ण 122.5 2.87 ग्राम
KCl चूर्ण 12.5 93.18 मिलीग्राम
NaCl चूर्ण 8 46.76 मिलीग्राम
HEPES चूर्ण 10 238.32 मिलीग्राम
MgATP चूर्ण 2 101.4 मिलीग्राम
Na3GTP चूर्ण 0.3 17.0 मिलीग्राम
नोट: KAH/HCl के साथ pH समायोजित करें

तालिका 8: के-ग्लूकोनेट-आधारित आंतरिक समाधान की संरचना।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, टेम्पोरल लोब मिर्गी वाले रोगी से एचएसीटीएक्स ऊतक एकत्र और संसाधित किया गया था, जैसा कि ऊपर बताया गया है। मेजबान ऊतक के शुरुआती बिंदु का अध्ययन करने के लिए संस्कृति में 24 घंटे के बाद कुछ स्लाइस तय किए गए थे। विभिन्न तंत्रिका कोशिका आबादी जैसे न्यूरॉन्स (न्यूएन और मैप 2, चित्रा 1 ए को व्यक्त करते हुए), ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स (ओलिग 2 और एमबीपी, चित्रा 1 बी), और एस्ट्रोसाइट्स (मानव-विशिष्ट जीएफएपी, जिसे एसटीईएम 123, चित्रा 1 सी भी कहा जाता है) के विश्लेषण ने ऊतक का इष्टतम संरक्षण दिखाया।

अगला कदम यह अध्ययन करना था कि संस्कृति की स्थिति मानव ऊतक में न्यूरोनल व्यवहार्यता को कैसे प्रभावित करती है। इस उद्देश्य के लिए, 2 सप्ताह की संस्कृति के बाद NeuN और Map2 का धुंधलापन किया गया था। अध्ययन किए गए समय बिंदु पर, इन दोनों न्यूरोनल मार्करों की अभिव्यक्ति अभी भी ऊतक (चित्रा 2 ए) में मौजूद थी। इसके अतिरिक्त, कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग की गई थी। पूरे सेल पैच क्लैंप का उपयोग करके रिकॉर्डिंग से पता चला है कि न्यूरॉन्स ने आरएमपी (औसतन −70 एमवी) और झिल्ली इनपुट प्रतिरोध (आरआई) (औसतन 300 एम) को बनाए रखा था, जो तीव्र तैयारी21,23 से न्यूरॉन्स के बराबर था। कुल मिलाकर, कोशिकाएं ताजा ऊतक की तुलना में थोड़ी कम सक्रिय थीं, हालांकि अधिकांश कोशिकाएं अभी भी कम से कम एक (चित्रा 2 बी-ई) को फायर करने में सक्षम थीं, यदि एकाधिक नहीं, तो एक्शन पोटेंशिअल (एपी, चित्रा 2 एफ-आई), और वोल्टेज-क्लैंप मोड में चरण वर्तमान इंजेक्शन पर तेज आंतरिक सोडियम और धीमी बाहरी पोटेशियम धाराएं मौजूद थीं (चित्रा 2 सी-ई, चित्रा 2 सी-ई, जी-आई)। एक साथ लिया गया, इन रिकॉर्डिंग ने संकेत दिया कि ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों में न्यूरॉन्स अपेक्षाकृत स्वस्थ थे और विशिष्ट न्यूरोफिज़ियोलॉजिकल आंतरिक गुणों का प्रदर्शन करते थे।

इसके अलावा, माइक्रोग्लिया सक्रियण पर संस्कृति के प्रभाव का मूल्यांकन 24 घंटे (चित्रा 3 ए) और 2 सप्ताह सुसंस्कृत (चित्रा 3 बी) ऊतक में टीएमईएम 119 और आईबीए 1 धुंधला द्वारा किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, माइक्रोग्लियल उपस्थिति में कुछ बदलाव देखे गए थे। संस्कृति में 2 सप्ताह के बाद, वे कम रामित हो गए और तीव्र ऊतक की तुलना में अधिक सक्रिय आकृति विज्ञान प्राप्त किया।

मेजबान ऊतक को चिह्नित करने के बाद, एलटी-एनईएस सेल-व्युत्पन्न पूर्वजों का प्रत्यारोपण निम्नानुसार किया गया था। जीएफपी-एलटी-एनईएस कोशिकाओं को 7 दिनों के लिए विभेदित किया गया था और 1 सप्ताह के सुसंस्कृत एचएसीटीएक्स ऊतक (चित्रा 4 ए) में ग्राफ्ट किया गया था। जीएफपी (चित्रा 4 बी, सी) के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके प्रत्यारोपण का अवलोकन देखा गया था। परिणामों की तुलना ऊतक में पिछले प्रत्यारोपण के साथ की गई थी जो शोधन और चढ़ाना के बीच लंबे समय की खिड़की होने के कारण खराब रूप से संरक्षित थे। छवियों से पता चलता है कि, इष्टतम प्रणाली में, पूर्व विवो प्रत्यारोपण के 4 सप्ताह बाद, ग्राफ्टेड जीएफपी-एलटी-एनईएस कोशिकाओं ने पूरे ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृति (चित्रा 4 बी) में विस्तारित न्यूरॉइट्स और व्यापक और जटिल आर्बराइजेशन का प्रदर्शन किया। खराब मेजबान कनेक्टिविटी के कारण खराब संरक्षित ऊतक ने सफल प्रत्यारोपण की अनुमति नहीं दी। मुश्किल से कोई ग्राफ्टेड सेल बच गया; इसके अलावा, मृत कोशिकाओं पर एंटीबॉडी के मलबे और अस्पष्ट लेबलिंग को व्यापक रूप से पूरे मानव स्लाइस (चित्रा 4 सी) में देखा गया था।

ग्राफ्टेड कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों के बारे में, यह पाया गया कि, सफल प्रत्यारोपण के मामले में, कोशिकाएं न केवल रूपात्मक रूप से बल्कि कार्यात्मक रूप से सक्रिय परिपक्व न्यूरॉन्स बन गईं, जिनमें दोहराव और अक्सर सहज एपी, तेज आंतरिक सोडियम और धीमी बाहरी पोटेशियम धाराएं, और सिनैप्टिक गतिविधि का एक निश्चित स्तर था, जो ग्राफ्टिंग के 4 सप्ताह बाद मेजबान ऊतक के साथ ग्राफ्ट के कार्यात्मक एकीकरण का संकेत देता है (चित्रा 4 डी-एच)।

Figure 1
चित्रा 1: संस्कृति में 24 घंटे के बाद एचएसीटीएक्स ऊतक में विभिन्न सेल आबादी का लक्षण वर्णन। (ए) न्यूरॉन्स (न्यूएन और मैप 2 को व्यक्त करते हुए), (बी) ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स (ओलिग 2 और एमबीपी), और (सी) एस्ट्रोसाइट्स (मानव-विशिष्ट जीएफएपी [एसटीईएम 123] की उपस्थिति दिखाते हुए एचएसीटीएक्स ऊतक की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां। परमाणु धुंधलापन (हो: होचस्ट, नीला) व्यक्तिगत और विलय पैनलों में शामिल है। स्केल बार = 20 μm। सफेद तीर कोलोकलाइजेशन का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृति में 2 सप्ताह के बाद एचएसीटीएक्स न्यूरॉन्स के लक्षण वर्णन और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुण। (B-I) 2 सप्ताह के एचएसीटीएक्स ऊतक में दर्ज कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के उदाहरण। (बी, एफ) रिकॉर्ड किए गए न्यूरॉन (लाल) की बायोसाइटिन लेबलिंग, परमाणु धुंधलापन (हो: होचस्ट, नीला) के साथ, एक विलय पैनल में शामिल है। स्केल सलाखों = 20 μm. पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग निशान (सी-ई) एकल, या (जी-आई) कई एपी वाले सेल के उदाहरण दिखाते हैं। एपी को या तो (सी, जी) 250 पीए चरण, या (डी, एच) आरएमपी में 0 से 300 पीए बढ़े हुए करंट इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया गया था। इनसेट प्रत्येक मामले में एपी में से एक के आवर्धित दृश्य को इंगित करते हैं। (E, I) वोल्टेज-क्लैंप मोड में 10 एमवी वृद्धि में -70 एमवी से लागू वोल्टेज विध्रुवण चरणों में दोनों सेल उदाहरणों में आंतरिक सोडियम और बाहरी पोटेशियम धाराओं को देखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एचएसीटीएक्स ऊतक में माइक्रोग्लिया आबादी का लक्षण वर्णन। संस्कृति में (ए) 24 घंटे और (बी) 2 सप्ताह के बाद IBA1 और Tmem119 की अभिव्यक्ति दिखाने वाले HACX ऊतक की कॉन्फोकल छवियां। परमाणु धुंधलापन (हो: होचस्ट, नीला) व्यक्तिगत और विलय पैनलों में शामिल है। स्केल बार = 20 μm। सफेद तीर कोलोकलाइजेशन का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: जीएफपी-एलटी-एनईएस कोशिकाओं के पूर्व विवो प्रत्यारोपण के 4 सप्ताह बाद एलटी-एनईएस सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के अवलोकन और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुण। डिफ = भेदभाव। (बी, सी) (बी) अच्छी तरह से संरक्षित और (सी) खराब संरक्षित एचएसीटीएक्स ऊतक में ग्राफ्टेड जीएफपी-एलटी-एनईएस कोशिकाओं के प्रतिनिधि कॉन्फोकल चित्र। स्केल बार = 50 μm. (D) एक ग्राफ्ट-व्युत्पन्न न्यूरॉन का उदाहरण अनायास एपी फायर करता है। इनसेट एपी में से एक के आवर्धित दृश्य को इंगित करता है। दोहराए जाने वाले एपी को -70 एमवी की क्षमता से विध्रुवण धारा के एक (ई) चरण (50 पीए) या (एफ) बढ़े हुए (0 से 300 पीए) इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। (छ) आंतरिक सोडियम और बाहरी पोटेशियम धाराओं को -70 एमवी की होल्डिंग क्षमता से वोल्टेज-क्लैंप मोड में 10 एमवी विध्रुवण चरणों द्वारा प्रेरित किया गया था। (एच) वोल्टेज-क्लैंप मोड में, -70 एमवी की होल्डिंग क्षमता पर ग्राफ्ट-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में सहज पोस्टसिनेप्टिक धाराओं (एसपीएससी) को देखा जा सकता है। इनसेट कुछ एसपीएससी के आवर्धित दृश्य को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

उच्च पर्याप्त गुणवत्ता के एचएसीटीएक्स स्लाइस प्राप्त करना इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम है। कॉर्टिकल ऊतक मिर्गी के रोगियों से प्राप्त किया जाता है जोउपचारात्मक सर्जरी से गुजर रहे हैं। निकाले गए ऊतक की गुणवत्ता, साथ ही साथ शोधन और संस्कृति के बीच ऊतक का जोखिम समय महत्वपूर्ण है; जितनी तेजी से ऊतक को सर्जरी कक्ष से प्रयोगशाला में स्थानांतरित किया जाता है और काटा जाता है, ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृति उतनी ही इष्टतम होगी। आदर्श रूप से, ऊतक को संग्रह के बाद पहले कुछ घंटों के भीतर सेल कल्चर लैब में काटा और स्थानांतरित किया जाना चाहिए। इस प्रक्रिया के दौरान ऊतक का ऑक्सीकरण भी स्लाइस की गुणवत्ता में सुधार करता है। इस संबंध में, ऊतक का नमूना जितना बड़ा होता है, कोर तक पहुंचने वाली ऑक्सीजन की सांद्रता उतनी ही कम होती है और इस प्रकार, यदि ऊतक को समय में नहीं काटा जाता है तो व्यवहार्यता उतनी ही कम होती है। यदि मेजबान ऊतक की गुणवत्ता इष्टतम नहीं है, तो स्टेम सेल उपचारों का सत्यापन संभव नहीं होगा।

जब कॉर्टिकल ऊतक को मानव मस्तिष्क से एक प्लेट में स्थानांतरित किया जाता है, तो कुछ सीमाओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए। काटने की प्रक्रिया के दौरान, बड़ी संख्या में अक्षतंतु विच्छेदित होते हैं, न्यूरोनल क्षति को प्रेरित करते हैं जो माइक्रोग्लिया सक्रियण25 जैसी भड़काऊ प्रक्रियाओं को जन्म देगा। इस कारण से, भले ही मानव मस्तिष्क में स्थित होने पर ऊतक को स्वस्थ माना जाता है, लेकिन ऑर्गेनोटाइपिक सेक्शन26,27 के शोधन और तैयारी के दौरान हुई आंशिक क्षति के कारण संस्कृति में कोशिका व्यवहार अलग हो सकता है। माइक्रोग्लिया आबादी में परिवर्तन की निगरानी विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके की जा सकती है, जिसमें जारी साइटोकिन स्तरों का माप या रूपात्मक परिवर्तनों का आकलनशामिल है। महत्वपूर्ण रूप से, हालांकि माइक्रोग्लिया सक्रियण को पूरे अंग से पूर्व विवो संस्कृति स्थितियों में पर्यावरण में परिवर्तन के परिणामस्वरूप संस्कृति में 2 सप्ताह में देखा गया था, न्यूरॉन्स अभी भी इस समय बिंदु पर व्यवहार्य थे, जैसा कि न्यूरोनल धुंधलापन और उनके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों के विश्लेषण द्वारा दिखाया गया है। मोटे ऊतक स्लाइस बेहतर संरक्षित होते हैं; हालांकि, स्लाइस के आंतरिक भाग में पोषक तत्वों का प्रवेश प्रभावित होता है, जिसके परिणामस्वरूप आंशिक ऊतक मृत्यु होती है। इस कारण से, ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृति के लिए 300 μm इष्टतम मोटाई है।

अन्य 3 डी संस्कृति विधियों जैसे ऑर्गेनोइड या स्फेरॉइड की तुलना में एचएसीटीएक्स ऊतक की ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों में स्पष्ट फायदे हैं। स्रोत एक पूरी तरह से विकसित मानव मस्तिष्क है, जिसका अर्थ है कि सेलुलर और मैट्रिक्स वातावरण, साथ ही साथ विभिन्न सेल आबादी की परिपक्वता की स्थिति, आम तौर पर वयस्क मानव मस्तिष्क 25,29,30 में पाए जाने वाले समान हैं। ऑर्गेनोइड भ्रूण के ऊतकों के समान हैं, जो कुछ शोध क्षेत्रों के लिए इष्टतम है जैसे कि विकास संबंधी विकारों के मॉडलिंग31 लेकिन नहीं, उदाहरण के लिए, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के अध्ययन के लिए, जो मुख्य रूप से वयस्क आबादी को प्रभावित करते हैं और देर से शुरुआतकरते हैं 32,33। सबसे महत्वपूर्ण बात, मानव ऊतक की ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृति, आज तक, एकमात्र मानव प्रणाली है जो सेल थेरेपी के सत्यापन की अनुमति देती है।

न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में न्यूरोनल प्रतिस्थापन के लिए स्टेम सेल प्रत्यारोपण के बारे में अधिकांश ज्ञान विवो पशु मॉडलिंग से प्राप्त होता है। भले ही ये प्रणालियां क्षतिग्रस्त मेजबान सर्किटरी में प्रत्यारोपित कोशिकाओं के मॉड्यूलेटरी प्रभाव का आकलन करने के लिए बेहद मूल्यवान हैं, दुर्भाग्य से, इस सेटअप में परीक्षण किए गए उपचार आम तौर पर विफल हो जाते हैं जब कृन्तकों और मनुष्यों के बीच स्पष्ट अंतर के कारण क्लिनिक में अनुवाद कियाजाता है। इस कारण से, एचएसीटीएक्स ऊतक की ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृति मानव न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के मॉडलिंग के लिए एक उत्कृष्ट रणनीति है जो मानव तंत्रिका आबादी और मानव मस्तिष्क संरचना के संरक्षण के बीच बातचीत का अध्ययन करने की संभावना के कारण कॉर्टेक्स को प्रभावित करतीहै।

सारांश में, वयस्क मानव कॉर्टेक्स की दीर्घकालिक ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कॉर्टिकल पूर्वजों के एक्स विवो इंट्राकॉर्टिकल प्रत्यारोपण की यह संयुक्त पद्धति स्टेम सेल-आधारित उपचारों के सत्यापन के लिए एक आशाजनक रणनीति है, जो क्षतिग्रस्त मस्तिष्क में कार्यात्मक वसूली को उत्तेजित करने के लिए न्यूरोनल प्रतिस्थापन रणनीतियों के नैदानिक अनुवाद की सुविधा प्रदान कर सकती है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

यह काम स्वीडिश रिसर्च काउंसिल, स्वीडिश ब्रेन फाउंडेशन, स्वीडिश स्ट्रोक फाउंडेशन, रीजन स्केन, द थोर्स्टन और एल्सा सेगरफेल्क फाउंडेशन और स्वीडिश गवर्नमेंट इनिशिएटिव फॉर स्ट्रैटेजिक रिसर्च एरियाज (स्टेमथेरेपी) से अनुदान द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Cutting and electrophysiology
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Bath temperature controller  Luigs & Neumann TC0511354
Calcium Chloride dihydrate Merck 102382
Carbogen gas Air Liquide NA
Cooler Julaba FL 300 9661012.03
D-(+)Glucose Sigma-Aldrich G7021
Double Patch-Clamp amplifier HEKA electronic EPC10
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt Millipore 371701
HEPES AppliChem A1069
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Magnesium Sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 230391
Patchmaster HEKA electronic Patchmaster 2x91
Pipette Puller Sutter P-2000
Plastic Petri dish Any suitable
Potassium chloride Merck 104936
Potassium D-gluconate ThermoFisher B25135
Rubber teat + glass pipette Any suitable
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 106346
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Tissue adhesive: Acryl super glue Loctite 2062278
Upright microscope Olympus BX51WI 
Vibratome  Leica VT1200 S
RINSING SOLUTION
D-(+)Glucose Sigma-Aldrich G7021
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) ThermoFisher Scientific 14175095
HEPES AppliChem A1069
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15-140-122
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE
6-well plate ThermoFisher Scientific 140675
Alvetex scaffold 6 well insert Reinnervate Ltd AVP004-96
B27 Supplement (50x) ThermoFisher Scientific 17504001
BrainPhys without Phenol Red StemCell technologies #05791 Referenced as neuronal medium in the text
Filter units 250 mL or 500 mL Corning Sigma CLS431096/97
Forceps Any suitable
Gentamicin (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 15750037
Glutamax Supplement (100x) ThermoFisher Scientific 35050061 Referenced as L-glutamine in the text
Rubber teat + Glass pipette Any suitable
GENERATION OF lt-NES cells
2-Mercaptoethanol 50 mM ThermoFisher Scientific 31350010
Animal Free Recombinant EGF Peprotech AF-100-15
B27 Suplemment (50x) Thermo Fisher Scientific 17504001
bFGF Peprotech AF-100-18B
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) ThermoFisher Scientific 15260037
Cyclopamine, V. calcifornicum Calbiochem # 239803
D (+) Glucose solution (45%) Sigma G8769
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2438-10mL
DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 11320074
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190-144 Without calcium and magnesium
Laminin Mouse Protein, Natural Thermo Fisher Scientific 23017015
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) ThermoFisher Scientific 11140050
N-2 Supplement (100 x) ThermoFisher Scientific 17502001
Poly-L-Ornithine Merk P3655
Recombinant Human BMP-4 Protein R&D Systems 314-BP-010
Recombinant Human Wnt-3a Protein R&D Systems 5036-WN
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360070
Soybean Trypsin Inhibitor, powder Thermo Fisher Scientific 17075029
Sterile deionized water MilliQ MilliQ filter system
Trypsin EDTA (0.25%) Sigma T4049-500ML
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE 
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL Eppendorf Various
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) Corning CLS354277-1EA
Centrifuge Hettich Centrifugen Rotina 420R 5% CO2, 37 °C
Incubator ThermoForma Steri-Cult CO2 HEPA Class100
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm Vitrolife 14601
Sterile tubes Sarstedt Various
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm VWR 612-1701
Sterile pipette tips 0.1-1000  µL Biotix VWR Various
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL Costar Various
T25 flasks Nunc ThermoFisher Scientific 156367
IMMUNOHISTOCHEMISTRY
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoReserach 715-545-151
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG Jackson ImmunoReserach 711-545-152
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG Jackson ImmunoReserach 703-545-155
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin Jackson ImmunoReserach 016-600-084
Bovine Serum Albumin Jackson ImmunoReserach 001-000-162
Chicken anti-GFP Merk Millipore AB16901
Chicken anti-MAP2  Abcam ab5392
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG Jackson ImmunoReserach 703-165-155
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG Jackson ImmunoReserach 705-165-147
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoReserach 715-165-151
Diazabicyclooctane (DABCO) Sigma Aldrich D27802 Mounting media
Goat anti-AIF1 (C-terminal)  Biorad AHP2024
Hoechst 33342 Molecular Probes Nuclear staining
Mouse anti-MBP  BioLegend 808402
Mouse anti-SC123  Stem Cells Inc AB-123-U-050
Normal Donkey Serum Merk Millipore S30-100
Paint brush Any suitable
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 150127
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)
     Distilled water
     Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) Merk Millipore 104873
     Potassium phospate dibasic (K2HPO4) Sigma Aldrich P3786
     Sodium chloride (NaCl) Sigma Aldrich S3014
Rabbit anti-NeuN  Abcam ab104225
Rabbit anti-Olig2  Abcam ab109186
Rabbit anti-TMEM119  Abcam ab185333
Sodium azide Sigma Aldrich S2002-5G
Sodium citrate
       Distilled water
       Tri-Sodium Citrate Sigma Aldrich S1804-500G
       Tween-20 Sigma Aldrich P1379
Triton X-100 ThermoFisher Scientific 327371000 
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY
Confocal microscope Zeiss LSM 780
Microscope Slides 76 mm x 26 mm VWR 630-1985
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm Marienfeld 107242
Microscope Software Zeiss ZEN Black edition
Rubber teat + Glass pipette Any suitable

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References

  1. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).
  2. Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).
  3. Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work. Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).
  4. Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).
  5. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).
  6. Tornero, D., et al. Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli. Brain. 140 (3), 692-706 (2017).
  7. Palma-Tortosa, S., et al. Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).
  8. Robinson, N. B., et al. The current state of animal models in research: A review. International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).
  9. Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
  10. Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
  11. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  12. Delavaran, H., et al. Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke. European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).
  13. Sabuncu, M. R., et al. The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease. Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).
  14. Eugene, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
  15. Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
  16. Kalmbach, B. E., et al. Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons. Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).
  17. Barth, M., et al. Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54 (2021).
  18. Almeida, G. M., et al. Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response. Frontiers in Neuroscience. 15, 674576 (2021).
  19. Schwarz, N., et al. Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures. Scientific Reports. 7, 12249 (2017).
  20. Miskinyte, G., et al. Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 207 (2017).
  21. Gronning Hansen, M., et al. Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry. Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).
  22. Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS One. 7 (1), 29597 (2012).
  23. Avaliani, N., et al. Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors. Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).
  24. Engel, J., et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).
  25. Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).
  26. Verwer, R. W., et al. Injury response of resected human brain tissue in vitro. Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).
  27. Verwer, R. W., et al. Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue. Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).
  28. Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).
  29. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  30. Schwarz, N., et al. Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease. Elife. 8, 48417 (2019).
  31. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  32. Wang, Z., et al. Organoid technology for brain and therapeutics research. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).
  33. Wang, H. Modeling neurological diseases with human brain organoids. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).
  34. Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 190
मानव स्टेम सेल प्रत्यारोपण और सत्यापन के लिए एक <em>पूर्व विवो</em> मॉडल के रूप में वयस्क मानव कॉर्टेक्स की ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियां
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