Summary
Detta protokoll beskriver långsiktiga organotypiska kulturer av vuxna humana cortex i kombination med ex vivo intrakortikal transplantation av inducerade pluripotenta stamcellshärledda kortikala stamceller, som presenterar en ny metod för att ytterligare testa stamcellsbaserade terapier för mänskliga neurodegenerativa sjukdomar.
Abstract
Neurodegenerativa störningar är vanliga och heterogena när det gäller deras symtom och cellulära påverkan, vilket gör deras studie komplicerad på grund av bristen på lämpliga djurmodeller som helt efterliknar mänskliga sjukdomar och den dåliga tillgängligheten av mänsklig hjärnvävnad efter döden. Vuxen mänsklig nervvävnadsodling erbjuder möjligheten att studera olika aspekter av neurologiska störningar. Molekylära, cellulära och biokemiska mekanismer kan enkelt hanteras i detta system, liksom testning och validering av läkemedel eller olika behandlingar, såsom cellbaserade terapier. Denna metod kombinerar långsiktiga organotypiska kulturer av den vuxna humana cortexen, erhållna från epileptiska patienter som genomgår resektiv kirurgi, och ex vivo intrakortikal transplantation av inducerade pluripotenta stamcellshärledda kortikala stamceller. Denna metod kommer att möjliggöra studier av cellöverlevnad, neuronal differentiering, bildandet av synaptiska ingångar och utgångar och de elektrofysiologiska egenskaperna hos humana härledda celler efter transplantation i intakt vuxen human kortikal vävnad. Detta tillvägagångssätt är ett viktigt steg före utvecklingen av en 3D-modelleringsplattform för mänskliga sjukdomar som kommer att föra grundforskningen närmare den kliniska översättningen av stamcellsbaserade terapier för patienter med olika neurologiska störningar och möjliggöra utveckling av nya verktyg för att rekonstruera skadade neurala kretsar.
Introduction
Neurodegenerativa störningar, såsom Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom eller ischemisk stroke, är en grupp sjukdomar som delar det gemensamma inslaget i neuronal funktionsfel eller död. De är heterogena när det gäller hjärnområdet och neuronpopulationen som påverkas. Tyvärr är behandlingar för dessa sjukdomar knappa eller med begränsad effekt på grund av bristen på djurmodeller som efterliknar vad som händer i den mänskliga hjärnan 1,2. Stamcellsterapi är en av de mest lovande strategierna för hjärnregenerering3. Genereringen av neuronala progenitorer från stamceller från olika källor har utvecklats kraftigt de senaste åren 4,5. Nya publikationer har visat att humant inducerade pluripotenta stamceller (iPS) cellhärledda långsiktiga självförnyande neuroepitelliknande stamceller (lt-NES), efter ett kortikalt differentieringsprotokoll och efter intrakortikal transplantation i en råttmodell med ischemisk stroke som påverkar den somatosensoriska cortexen, genererar mogna kortikala neuroner. Dessutom mottog de transplantat-härledda neuronerna afferenta och efferenta synaptiska anslutningar från värdneuronerna, vilket visar deras integration i råttneuronnätverket 6,7. De transplantathärledda axonerna myeliniserades och hittades i olika delar av råtthjärnan, inklusive peri-infarktområdet, corpus callosum och kontralateral somatosensorisk cortex. Viktigast av allt, iPS-cell-härledd transplantation reverserade motoriska underskott hos strokedjur7.
Även om djurmodeller hjälper till att studera transplantationsöverlevnad, neuronal integration och effekten av de ympade cellerna på motoriska och kognitiva funktioner, saknas information om interaktion mellan mänskliga celler (transplantatvärd) i detta system 8,9. Av denna anledning beskrivs här en kombinerad metod för långsiktig organotypisk kultur i hjärnan hos hjärnan med ex vivo-transplantation av humana iPS-cellhärledda neuronala progenitorer. Mänskliga hjärnans organotypiska kulturer erhållna från neurokirurgiska resektioner är fysiologiskt relevanta 3D-modeller av hjärnan som gör det möjligt för forskare att öka sin förståelse för det mänskliga centrala nervsystemet kretsar och det mest exakta sättet att testa behandlingar för mänskliga hjärnsjukdomar. Emellertid, inte tillräckligt forskning har gjorts i detta sammanhang, och i de flesta fall, mänskliga hippocampus hjärnan organotypiska kulturer har använts10,11. Hjärnbarken påverkas av flera neurodegenerativa störningar, såsom ischemisk stroke12 eller Alzheimers sjukdom13, så det är viktigt att ha ett mänskligt kortikalt 3D-system som gör att vi kan utöka vår kunskap och testa och validera olika terapeutiska strategier. Flera studier under de senaste åren har använt kulturer från vuxen human kortikal (hACtx) vävnad för att modellera mänskliga hjärnsjukdomar 14,15,16,17,18,19; Det finns dock begränsad information om stamcellsterapi. Två studier har redan visat genomförbarheten av det system som beskrivs här. År 2018 visade sig mänskliga embryonala stamceller programmerade med olika transkriptionsfaktorer och transplanterade i hACtx-vävnad ge upphov till mogna kortikala neuroner som kunde integreras i vuxna humana kortikala nätverk20. År 2020 avslöjade transplantationen av lt-NES-celler i det mänskliga organotypiska systemet deras förmåga att differentiera till mogna, lagerspecifika kortikala neuroner med de elektrofysiologiska egenskaperna hos funktionella neuroner. De ympade neuronerna etablerade både afferenta och efferenta synaptiska kontakter med de mänskliga kortikala neuronerna i de vuxna hjärnskivorna, vilket bekräftas av rabiesvirus retrograd monosynaptisk spårning, helcellspatch-clampinspelningar och immunelektronmikroskopi21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer de riktlinjer som godkänts av den regionala etikprövningsnämnden, Lund (etiskt tillståndsnummer 2021-07006-01). Frisk neokortikal vävnad erhölls från patienter som genomgick elektiv kirurgi för temporallobsepilepsi. Informerat samtycke erhölls från alla patienter.
OBS: Alla erhållna vävnader bearbetades oavsett storlek. Vävnader mindre än 1-1,5 mm3 i storlek kommer dock att vara tekniskt utmanande att hantera och sektionera med en vibratome.
1. Vävnadsinsamling, underhåll, skärning och plätering
- Förberedelser dagen före vävnadsskivning
- Bered 2 liter skärlösning (tabell 1) i en mätkolv. Lös upp alla ingredienser utom MgCl2 ochCaCl2 i ~1 800 ml avjoniserat vatten och bubbla med karbogengas i 15 minuter. Tillsätt sedan lämpliga mängder 1 M MgCl 2 och CaCl2 lösningar och fortsätt bubbla i ytterligare 15 minuter. Fyll slutligen kolven till 2 L-märket; kontrollera pH och osmolaritet och justera vid behov. Frys 2 x 350 ml av den beredda lösningen och förvara resten vid 4 °C.
OBS: pH och osmolaritet är typiskt 7,3-7,4 respektive 295-300 mOsm. - Bered 100 ml sköljlösning (tabell 2). Lös 476 mg HEPES och 200,6 mg glukos i 100 ml HBSS kompletterat med 5 ml penicillin/streptomycin. Detta kan förvaras vid 4 °C i upp till 10 dagar.
- Bered humant vuxenkortikalt (hACtx) odlingsmedium (hACtx-medium) (tabell 3) och filtrera det i cellodlingslaboratoriet under en ventilerad huva. Mediet består av neuronalt medium utan fenolrött (se materialförteckningen), B27-tillskott, L-glutamin (se materialtabellen) och gentamicin. Förvaras vid 4 °C i upp till 2 veckor.
- Bered 2 liter skärlösning (tabell 1) i en mätkolv. Lös upp alla ingredienser utom MgCl2 ochCaCl2 i ~1 800 ml avjoniserat vatten och bubbla med karbogengas i 15 minuter. Tillsätt sedan lämpliga mängder 1 M MgCl 2 och CaCl2 lösningar och fortsätt bubbla i ytterligare 15 minuter. Fyll slutligen kolven till 2 L-märket; kontrollera pH och osmolaritet och justera vid behov. Frys 2 x 350 ml av den beredda lösningen och förvara resten vid 4 °C.
- Förberedelser på operationsdagen före vävnadsprovernas ankomst
- Kontrollera tillgängligheten av nödvändig utrustning och labbutrymme och rengör noggrant alla kirurgiska verktyg och vibratomen (se materialtabellen) samt bänkutrymmet med destillerat vatten (utan tvättmedel), följt av 70% etanol. Låt etanolen torka i minst 30 minuter innan du använder verktygen och utrustningen.
- Krossa den frysta skärlösningen och bubbla "soppan" av is och vätska med karbogengas i 30 minuter. Stäng sedan en av behållarna ordentligt med den krossade lösningen '' soppa '' och placera den i isboxen. Detta kommer att användas för att samla vävnaden från operationssalen.
- Kalibrera vibratomen och ställ in skärparametrarna: 0,05 mm/s hastighet och 1,7 mm vibration. Placera skärkammaren på ett vibratomsteg och starta kylaren som är ansluten till den så att kammaren har en konstant temperatur på −3 °C.
- Förbered skivuppsamlingskammaren med insatser för att placera vävnadsskivorna och skärlösningen, bubbla den ständigt med karbogengas vid rumstemperatur (RT).
- I cellodlingslaboratoriet och under en ventilerad huva, placera odlingsinsatserna i en 6-brunnsplatta med pincett. Tillsätt 5 ml hACtx-medium på skärets undersida tills det kommer i kontakt med membranet, undvik att bubblor bildas och tillsätt 2 ml på skärets ovansida. Balansera i inkubatorn vid 37 °C och 5 %CO2 i minst 2 timmar innan vävnadsskivorna överförs till insatserna.
- Metoder för insamling och skivning av vävnader
- Omedelbart efter resektion, samla vävnaden från patienten i operationssalen, om möjligt, direkt i en behållare med fryst, bubblad och krossad skärlösning. Överför den slutna behållaren på is omedelbart till laboratoriets skärområde.
- Inspektera vävnaden och lokalisera den bästa ytan för att limma (se steg 1.3.3) den till vibratomets skärsteg, med tanke på orienteringen av de kortikala skikten. Om det behövs, skär den ojämna ytan med en skalpell så att det är lätt att placera vävnaden på scenen för optimal skivorientering.
- Limma vävnaden på scenen med vävnadslim (se materialtabellen), placera den i skivkammaren och fyll omedelbart kammaren med kall bubblad skärlösning. Fortsätt bubblingen under hela skärproceduren.
- Skär koronala eller sagittala skivor, beroende på vävnad-till-bladorientering, i en tjocklek av 300 μm för att innehålla alla kortikala skikt och, om möjligt, den vita substansen. Placera skivorna i uppsamlingskammaren med bubblande skärlösning vid RT.
OBS: Skär från den vita substanssidan mot cortexens yta. Ta inte bort hjärnhinnorna, eftersom det kan skada vävnaden. Skärbladet skär vanligtvis lätt igenom dem. - När all vävnad har skurits, överför skivorna till en steril petriskål med sköljlösning vid RT och transportera dem till cellodlingslaboratoriet. Detta steg är nödvändigt för att avlägsna överskott av sackaros från skivorna innan de överförs till odlingsplattan.
OBS: För att överföra skivorna (i detta och följande steg), använd en inverterad glaspipett, bryt av den tunnare delen och placera en gummispene för sugning.
- Odling och underhåll av hACtx-vävnadsskivor
- Placera vävnadsskivorna individuellt ovanpå de redan våta och nedsänkta insatserna. Byt medium efter 24 timmar för att ytterligare avlägsna kvarvarande sackaros eller andra restämnen från styckningsmetoderna.
- Byt ut odlingsmediet med färskt medium var 7: e dag. Efter 2 veckor, använd hACtx medium utan gentamicin. Kulturen kan bibehållas i upp till 2 månader.
OBS: Balansera hACtx-mediet i inkubatorn vid 37 °C och 5 %CO2 i minst 2 timmar före mediebytet. Färskt medium bör beredas var 2: e vecka. Kontrollera skivorna var 2-3: e dag och, om något av mediet har avdunstat, lägg till mer på toppen av insatsen.
| Skärande lösning | Beståndets koncentration | Slutlig koncentration [mM] | Per 1 L |
| Sackaros | Pulver | 200 | 68.46 gr |
| NaHCO3 | Pulver | 21 | 1.76 gr |
| KCl | Pulver | 3 | 0.22 gr |
| NaH2PO4 | Pulver | 1.25 | 0.17 gr |
| Glukos | Pulver | 10 | 1.80 gr |
| MgSO4 | 1 meter | 2 | 2 ml |
| CaCl2 | 1 meter | 1.6 | 1,6 ml |
| MgCl2 | 2 meter | 2 | 1 ml |
Tabell 1: Skärlösningens sammansättning. MgCl2 ochCaCl2 används som förberedda 1 M-lösningar i avjoniserat vatten.
| Sköljlösning | Beståndets koncentration | Slutlig koncentration | Per 100 ml |
| HBSS | 1x | 95 ml | |
| PenStrep | 10 000 E/ml | 500 E/ml | 5 ml |
| HEPES | Pulver | 4,76 g/l | 476 mg |
| Glukos | Pulver | 2 g/L | 200,6 mg |
Tabell 2: Sköljlösningens sammansättning.
| hACtx medium | Beståndets koncentration | Slutlig koncentration | Per 100 ml | |
| Neuronalt medium utan fenolrött | 97,4 ml | se Materialförteckning | ||
| B27 | 50x | 1:50 | 2 ml | |
| L-glutamin | 100x | 1:200 | 500 μL | se Materialförteckning |
| Gentamicin | 50 mg/ml | 1:1000 | 100 μL |
Tabell 3: Sammansättning av hACtx-medium.
2. Spridning och differentiering av lt-NES-celler
OBS: Lt-NES-celler genereras som tidigare beskrivits21,22 och transduceras med en lentiviral vektor som bär grönt fluorescerande protein (GFP) under en konstitutiv promotor (GFP-lt-NES-celler). Injektionsflaskor innehållande 3 x 106 celler förvaras vid −150 °C fram till användning.
- Beredning av stamlösningar och media
- Späd 100 μg basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) i 10 ml PBS-0,1 % BSA så att den får en lagerkoncentration på 10 μg/ml. Bered alikvoter på 100 μl.
- Späd 100 μg epidermal tillväxtfaktor (EGF) i 10 ml PBS-0,1 % BSA så att den får en lagerkoncentration på 10 μg/ml. Bered alikvoter på 100 μl.
- Alikvot 50x B27-tillskott i en volym av 100 μl per alikvot.
- Späd 10 mg poly-L-ornitin i 100 ml avjoniserat vatten så att lagret kan börja användas med en lagerkoncentration på 100 μg/ml. Gör 1 ml alikvoter.
- Bered 30 μl alikvoter av 1,20 mg/ml muslaminin.
- Späd 10 ml trypsin-EDTA (0,25%) i 90 ml PBS till en lagerkoncentration på 0,025%. Förbered 1 ml alikvoter.
- Späd 0,025 g trypsinhämmare i 50 ml PBS till en lagerkoncentration på 0,5 mg/ml. Förbered 1 ml alikvoter.
- Späd 10 μg Wnt3a (Wingless-type MMTV integration site family member 3A) i 1 ml PBS-0,1% BSA för att få en lagerkoncentration på 10 μg/ml. Förbered BMP4 (benmorfogenetiskt protein 4) på samma sätt. Alikvot i en volym av 100 μl.
- Späd 1 mg cyklopamin i 2,5 ml DMSO till en slutlig koncentration på 400 μg/ml och gör 100 μl alikvoter.
- Bered basmedium (tabell 4) och differentieringsdefinierat medium (DDM, tabell 5) och förvara vid 4 °C i upp till 2 veckor.
- Beläggning av kulturrätter
- För att förbelägga diskarna för att odla GFP-It-NES-cellerna under proliferation eller differentiering, späd poly-L-ornitin 1:100 i avjoniserat vatten och tillsätt 5 ml av lösningen till en T25-kolv. Inkubera över natten vid RT.
- Tvätta de poly-L-ornitinbelagda plattorna 1x med avjoniserat vatten och 1x med PBS.
- För GFP-It-NES-celler i proliferation, späd muslaminin vid 1:500 i PBS och inkubera i minst 2 timmar vid 37 °C. För GFP-It-NES-celler i differentiering, späd muslaminin vid 1:100 i PBS och inkubera i minst 2 timmar vid 37 °C.
- Spridning av GFP-lt-NES-cellerna
- Värm 5 ml (för tvätt) och 5 ml (för sådd) basmedium i två olika 15 ml rör.
- Tina snabbt en injektionsflaska med GFP-lt-NES-celler vid 37 °C, överför dem till tvättröret och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter.
- Aspirera mediet försiktigt utan att vidröra pelleten och suspendera cellerna i 1 ml förvärmt basmedium. Överför cellsuspensionen till såddröret som innehåller basmedium kompletterat med proliferationsfaktorer: EGF (10 ng/ml), bFGF (10 ng/ml) och B27 (10 ng/ml). Frö cellerna på en poly-L-ornitin/lamininbelagd T25-kolv.
- Mata cellerna med spridningsfaktorer varje dag. Byt ut mediet om det blir gult. Passera cellerna var tredje eller fjärde dag (1 dag efter att de når 100% sammanflöde).
- Dela GFP-lt-NES-cellerna för spridning och differentiering
- Förvärm 5 ml basmedium per kolv (för att samla upp cellerna), plus den totala volym som behövs för att sätta tillbaka dem.
OBS: Passagen görs vid en 1: 3 utspädning för att hålla cellerna i spridning, vilket kräver 15 ml basmedium och en 1: 6 utspädning för att starta differentiering, vilket kräver 30 ml basmedium. - Avlägsna mediet från cellodlingskolven genom aspiration och tillsätt 500 μL förvärmt 0,025% trypsin. Inkubera i 5-10 min vid rumstemperatur. Avlägsnandet av cellerna kan bekräftas under ett standardljusmikroskop vid 10x förstoring.
- Tillsätt en lika stor volym trypsinhämmare (0,5 mg/ml slutlig koncentration) följt av 5 ml varmt basmedium. Lossa och samla cellerna genom att försiktigt pipettera upp och ner. Överför cellerna till ett 15 ml rör och centrifugera i 5 minuter vid 300 x g.
- För att cellerna skall fortsätta att föröka sig, platta om med spädningen 1:3 i färskt basmedium kompletterat med proliferationsfaktorer och upprepa steg 2.3.4.
- Förvärm 5 ml basmedium per kolv (för att samla upp cellerna), plus den totala volym som behövs för att sätta tillbaka dem.
- Kortikal differentiering av GFP-lt-NES-cellerna
- På dag 0 suspenderas cellerna (avsedda att användas för differentiering) i 30 ml basmedium kompletterat med proliferationsfaktorer och plattas upp i sex differentieringsbelagda T25-kolvar (delad 1:6).
- På dag 1, byt hälften av mediet till DDM och lägg till spridningsfaktorer vid hälften av deras koncentration.
- På dag 2, byt mediet helt till DDM kompletterat med differentieringsfaktorer: BMP4 (10 ng / ml), Wnt3a (10 ng / ml) och cyklopamin (400 ng / ml).
- På dag 4, lägg till differentieringsfaktorerna ensam. Byt ut mediet om det blir gult.
- På dag 6, byt medium till DDM kompletterat med BMP4 och Wnt3a. Cyklopaminen avlägsnas vid detta steg.
- På dag 7 lossnar cellerna enligt anvisningarna i steg 2.4.2 och steg 2.4.3.
| Grundläggande medium | Beståndets koncentration | Slutlig koncentration | Per 100 ml |
| DMEM/F12 med L-glutamin | 1x | 98,7 ml | |
| N-2 tillägg | 100x | 1:100 | 1 ml |
| Glukos | 45% | 3,5 ml/L | 350 μL |
Tabell 4: Sammansättning av proliferationsmedium för lt-NES-celler (basmedium).
| DDM-medium | Beståndets koncentration | Slutlig koncentration | Per 100 ml |
| DMEM/F12 med L-glutamin | 96 ml | ||
| N2 | 100 x | 1:100 | 1 ml |
| NEAA | 100 x | 1:100 | 1 ml |
| Natriumpyruvat | 100 mM | 1:100 | 1 ml |
| BSA V-fraktion | 7.5% | 6,6 ml/l | 660 μL |
| 2-merkaptoetanol | 50 nM | 7 μl/l | 0,7 μL |
| Glukos | 45% | 3,2 ml/l | 320 μL |
Tabell 5: Sammansättning av differentieringsdefinierat medium (DDM) för lt-NES-celler.
3. Transplantation av GFP-lt-NES-cellerna till organotypiska hACtx-skivor
OBS: hACtx-vävnaden ska odlas i 1 vecka före celltransplantation. För att underlätta transplantationsproceduren är det nödvändigt att ta bort 2 ml av hACtx-mediet från toppen av insatsen för att förhindra att vävnaden flyter.
- Resuspendera de kortikalt grundade GFP-lt-NES-cellerna (från steg 2.5.6) i kall ren basalmembranmatris (se materialtabellen) i en koncentration av 1 x 105 celler/μl och överför lösningen till ett mindre sterilt rör.
OBS: Under transplantationsproceduren bör alla material (pipettspetsar, rör, kapillär, etc.) förkylas för att undvika gelstelning. Tina basalmembranmatrisgelen på is i 30 minuter före användning. - Samla cellsuspensionen i en kall glaskapillär ansluten till en gummispene för sugning. Injicera cellsuspensionen som små droppar (ca 1 μl vardera) genom att sticka den halvtorra vävnadsskivan på olika ställen.
- Inkubera vid 37 °C i 30 minuter så att gelen stelnar. Överför plattan från inkubatorn tillbaka till huven och tillsätt försiktigt 2 ml hACtx-medium till toppen av insatsen för att helt nedsänka vävnaden.
- Byt ut odlingsmediet mot färskt hACtx-medium en gång i veckan.
4. Validering
- Färgning av hACtx-skivorna
- Vid önskad tidpunkt, ta ut skivorna från cellodlingslaboratoriet och ta bort dem från insatsen genom att nedsänka den i en petriskål med PBS. Överför sedan skivorna till färgningsflaskor med en inverterad glaspipett (se anmärkningen i steg 1.3.5) och fixera dem med 4% paraformaldehyd (PFA) över natten vid 4 °C.
- Skölj 3 gånger med KPBS i 15 minuter varje gång och inkubera över natten vid 4 °C med permeabiliseringslösning (0,02 % BSA och 1 % Triton X-100 i KPBS).
- Nästa dag, tillsätt blockerande lösning (KPBS med 0,2% Triton X-100, 1% BSA, natriumazid [1:10,000] och 10% normalt åsneserum) och inkubera över natten vid 4 °C.
- Efter blockering tillsätts de primära antikropparna (se tabell 6 för spädningarna) utspädda i blockeringslösningen och inkubera i 48 timmar vid 4 °C.
- Tvätta 3x med blockerande lösning utan tillsats av serum i 15 minuter vardera. Tillsätt sekundära antikroppar utspädda i blockerande lösning (se tabell 6 för spädningarna) och inkubera i 48 timmar vid 4 °C.
- Tvätta 3x med blockerande lösning utan serum och inkubera i 2 timmar vid RT i Hoechst fläck utspädd i permeabiliseringslösning (1:1 000).
- Tvätta 3x med KPBS, montera skivorna på glasskivor med en pensel och låt dem torka. Skölj slutligen glasen med avjoniserat vatten, ta bort överflödigt vatten, tillsätt monteringsmediet och täck med ett glasskydd. Håll objektglasen i minst 24 timmar vid rumstemperatur och förvara dem vid 4 °C tills de avbildas.
OBS: För antikroppsmärkning av nukleära epitoper, utför antigenhämtning före permeabilisering (steg 4.1.2) med natriumcitrat (10 mM, pH 6,0) i 2 timmar vid 65 °C.
- Patch-klämma för hela celler
- På inspelningsdagen förbereds 1 liter human artificiell cerebrospinalvätska (haCSF), modifierad för att bättre matcha den mänskliga hjärnmiljön (tabell 7). I likhet med skärlösningen, gör cirka 900 ml av lösningen med alla ingredienser utomCaCl2 upplöst i avjoniserat vatten och bubbla den med karbogen i 15 minuter innan lämplig volym 1 M CaCl2-lösning tillsätts. Fyll upp mätkolven till markeringen 1 L och fortsätt bubbla vid rumstemperatur i ytterligare 15 minuter innan inspelningen påbörjas och under hela experimentet.
- Överför vävnadsskivorna från odlingsplattan till registreringskammaren på scenen i ett upprätt mikroskop som ständigt perfuseras med bubblad haCSF med en perfusionshastighet på 2 ml / min och värms till 34 ° C med hjälp av en badtemperaturregulator.
- Dra glaskapillärerna med pipettdragare till ett genomsnittligt motstånd på 3-5 MΩ och fyll kapillärerna med K-glukonatbaserad intern lösning (tabell 8) med en nyligen tillsatt 2-4 mg biocytin för post-hoc-identifiering av de registrerade cellerna. PH och osmolariteten hos denna interna lösning är 7,2-7,3 respektive 285-295 mOsm.
- När det gäller inspelning av värdceller får du en grov översikt över segmentet med ett 4x-mål och hittar en hälsosam cell att lappa med ett 40x-mål. Fortsätt sedan med den vanliga helcellsklämman.
- Vid ympad cellregistrering, identifiera vävnadsområdet med de ympade cellerna med hjälp av ett 4x objektiv och ett epifluorescensfilter i det blå området (460 nm) genom GFP-rapportöruttryck i transplantatet. Zooma sedan in på det lokaliserade området med ett 40x mål och hitta en ympad cell som uttrycker GFP för en standard helcellsklämma.
- Kontrollera vilomembranpotentialen (RMP) omedelbart efter att ha brutit in i cellen och se till att kvaliteten på inspelningen är bra. Registrera alla parametrar av intresse (t.ex. membranresistans [Ri], AP-parametrar, natrium- och kaliumströmmar och synaptisk aktivitet) i helcellsspänningen eller strömklämkonfigurationen.
- Efter att ha samlat in alla nödvändiga data, dra försiktigt tillbaka inspelningspipetten utan att skada cellen ytterligare så att den kan identifieras med post-hoc immunfärgning.
- Överför skivan till 4 % PFA-lösningen för ytterligare fixering och färgning, enligt beskrivningen i steg 4.1. Streptavidin används för att immunmärka cellerna fyllda med biocytin under inspelningarna.
| ANTIKROPPAR | Utspädning | Anteckningar |
| Primär | ||
| Kyckling anti-GFP | 1:1000 | |
| Kyckling anti-MAP2 | 1:1000 | |
| Get anti-AiF1 | 1:100 | |
| Mus anti-MBP | 1:1000 | Antigenhämtning behövs |
| Mus anti-SC123 | 1:2000 | |
| Kanin anti-NeuN | 1:1000 | |
| Kanin anti-Olig2 | 1:500 | |
| Kanin anti-Tmem119 | 1:200 | |
| Sekundär | ||
| 488-konjugerad AffinityPure Donkey anti-mus IgG | 1:500 | |
| 488-konjugerad AffinityPure Donkey anti-kanin IgG | 1:500 | |
| 488-konjugerad AffinityPure Donkey anti-kyckling IgG | 1:500 | |
| Cy3-konjugerad AffinityPure Donkey anti-kyckling IgG | 1:500 | |
| Cy3-konjugerad affinitetRen åsna anti-get IgG | 1:500 | |
| Cy3-konjugerad AffinityPure Donkey anti-mus IgG | 1:500 | |
| Alexa fluor 647-konjugerad Streptavidin | 1:500 |
Tabell 6: Förteckning över primära och sekundära antikroppar för immunhistokemi.
| haCSF | Beståndets koncentration | Slutlig koncentration [mM] | Per 1 L |
| NaCl | Pulver | 129 | 7.54 gr |
| NaHCO3 | Pulver | 21 | 1.76 gr |
| Glukos | Pulver | 10 | 1.80 gr |
| KCl | Pulver | 3 | 0.22 gr |
| NaH2PO4 | Pulver | 1.25 | 0.17 gr |
| MgSO4 | 1 meter | 2 | 2 ml |
| CaCl2 | 1 meter | 1.6 | 1,6 ml |
Tabell 7: Sammansättning av artificiell cerebrospinalvätska (haCSF).
| K-glukonat intern lösning | Beståndets koncentration | Slutlig koncentration [mM] | Per 100 ml |
| K-glukonat | Pulver | 122.5 | 2.87 gr |
| KCl | Pulver | 12.5 | 93,18 mg |
| NaCl | Pulver | 8 | 46,76 mg |
| HEPES | Pulver | 10 | 238,32 mg |
| MgATP | Pulver | 2 | 101,4 mg |
| Na3GTP | Pulver | 0.3 | 17,0 mg |
| Not: Justera pH med KOH/HCl | |||
Tabell 8: Sammansättning av K-glukonatbaserad intern lösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter det beskrivna protokollet samlades hACtx-vävnad från en patient med temporallobsepilepsi in och bearbetades, såsom förklarats ovan. Några skivor fixerades efter 24 h i odling för att studera utgångspunkten för värdvävnaden. Analysen av olika neurala cellpopulationer såsom neuroner (uttrycker NeuN och Map2, figur 1A), oligodendrocyter (Olig2 och MBP, figur 1B) och astrocyter (humanspecifik GFAP, även kallad STEM123, figur 1C) visade optimal bevarande av vävnaden.
Nästa steg var att studera hur odlingsförhållandena påverkar den neuronala livskraften i mänsklig vävnad. För detta ändamål utfördes färgningen av NeuN och Map2 efter 2 veckors kultur. Vid den studerade tidpunkten var uttrycket av båda dessa neuronala markörer fortfarande närvarande i vävnaden (figur 2A). Dessutom utfördes elektrofysiologiska inspelningar för att bedöma funktionaliteten. Inspelningarna med helcellsplåsterklämma visade att nervcellerna hade upprätthållit RMP (−70 mV i genomsnitt) och membraningångsresistens (Ri) (300 MΩ i genomsnitt), jämförbara med nervceller från akuta preparat21,23. Sammantaget var cellerna något mindre aktiva än i färsk vävnad, även om majoriteten av cellerna fortfarande kunde avfyra minst en (figur 2B-E), om inte flera, åtgärdspotentialer (AP, figur 2F-I), och snabba inåtgående natrium- och långsamma utåtriktade kaliumströmmar var närvarande vid stegströminjektioner i spänningsklämläge (figur 2C-E, G-I). Sammantaget indikerade dessa registreringar att neuronerna i organotypiska kulturer var relativt friska och uppvisade typiska neurofysiologiska inneboende egenskaper.
Vidare utvärderades effekten av odling på mikrogliaaktivering genom färgning av Tmem119 och Iba1 i 24 timmar (figur 3A) och 2 veckors odlad (figur 3B) vävnad. Som förväntat observerades vissa förändringar i mikroglialt utseende. Efter 2 veckor i odling blev de mindre förgrenade och förvärvade en mer aktiverad morfologi jämfört med akut vävnad.
Efter karakterisering av värdvävnaden utfördes transplantationen av lt-NES-cellhärledda förfäder enligt följande. GFP-lt-NES-cellerna differentierades i 7 dagar och ympades i 1 veckas odlad hACtx-vävnad (figur 4A). En översikt över transplantationen observerades med hjälp av immunhistokemi med GFP (figur 4B, C). Resultaten jämfördes med tidigare transplantationer i vävnad som var dåligt bevarad på grund av att det fanns ett längre tidsfönster mellan resektion och plätering. Bilderna visar att i det optimala systemet, 4 veckor efter ex vivo-transplantation , uppvisade de ympade GFP-lt-NES-cellerna förlängda neuriter och omfattande och komplexa arboriseringar genom hela den organotypiska kulturen (figur 4B). Den dåligt bevarade vävnaden möjliggjorde inte framgångsrik transplantation på grund av den dåliga värdanslutningen. Knappt någon ympad cell överlevde; Dessutom observerades skräp och ospecifik märkning av antikroppar på döda celler i stor utsträckning i hela den mänskliga skivan (figur 4C).
När det gäller de elektrofysiologiska egenskaperna hos de ympade cellerna fann man att cellerna vid framgångsrik transplantation inte bara blev morfologiskt utan också funktionellt aktiva mogna neuroner med repetitiva och ofta spontana AP, snabbt inåtriktat natrium och långsamma yttre kaliumströmmar och en viss nivå av synaptisk aktivitet, vilket indikerar funktionell integration av transplantatet med värdvävnaden 4 veckor efter ympning (figur 4D-H).
Figur 1: Karakterisering av de olika cellpopulationerna i hACtx-vävnaden efter 24 timmar i odling. Representativa konfokala bilder av hACtx-vävnad som visar närvaron av (A) neuroner (uttrycker NeuN och Map2), (B) oligodendrocyter (Olig2 och MBP) och (C) astrocyter (humanspecifik GFAP [STEM123]). Kärnfärgning (Ho: Hoechst, blå) ingår i de enskilda och sammanslagna panelerna. Skalstång = 20 μm. De vita pilarna indikerar samlokalisering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Karakterisering och elektrofysiologiska egenskaper hos hACtx-neuroner efter 2 veckor i organotypisk kultur. (A) Representativa konfokala bilder av hACtx-vävnad som visar NeuN- och Map2-uttryck. (B–I) Exempel på kortikala neuroner registrerade i 2 veckor gammal hACtx-vävnad. (B,F) Biocytinmärkning av den inspelade neuronen (röd), tillsammans med kärnfärgning (Ho: Hoechst, blå), inkluderad i en sammanslagen panel. Skalstänger = 20 μm. Patch-clamp-registreringsspår för helcellspatch som visar exempel på en cell med (C-E) singel eller (G-I) flera åtkomstpunkter. AP inducerades antingen av (C,G) ett steg på 250 pA, eller (D,H) en rampströminjektion på 0 till 300 pA vid RMP. Indragen anger en förstorad vy av en av åtkomstpunkterna i varje enskilt fall. (E,I) Inåtgående natrium- och utåtriktade kaliumströmmar observerades i båda cellexemplen vid spänningsdepolarisationsstegen applicerade från -70 mV i steg om 10 mV i spänningsklämläge. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Karakterisering av mikrogliapopulationen i hACtx-vävnaden. Konfokala bilder av hACtx-vävnaden som visar uttrycket av Iba1 och Tmem119 efter (A) 24 timmar och (B) 2 veckor i odling. Kärnfärgning (Ho: Hoechst, blå) ingår i de enskilda och sammanslagna panelerna. Skalstång = 20 μm. De vita pilarna indikerar samlokalisering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Översikt och elektrofysiologiska egenskaper hos lt-NES-cell-härledda neuroner 4 veckor efter ex vivo-transplantation av GFP-lt-NES-celler. (A) Experimentell design. Diff = differentiering. (B,C) Representativa konfokala bilder av ympade GFP-lt-NES-celler i (B) välbevarad och (C) dåligt bevarad hACtx-vävnad. Skalstreck = 50 μm. (D) Exempel på spår av en transplantathärledd neuron som spontant avfyrar AP. Indraget anger en förstorad vy av en av åtkomstpunkterna. Repetitiva AP kan induceras genom en (E) steg (50 pA) eller (F) rampad (0 till 300 pA) injektion av depolariserande ström från potentialen på −70 mV. (G) Inåtgående natrium- och utgående kaliumströmmar inducerades genom 10 mV depolariserande steg i spänningsklämläge från en hållpotential på -70 mV. (H) I spänningsklämläge kunde spontana postsynaptiska strömmar (sPSC) observeras i transplantat-härledda neuroner vid en hållpotential på −70 mV. Infällningarna indikerar en förstorad vy av några av de privata säkerhetsföretagen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att få hACtx-skivor av tillräckligt hög kvalitet är det mest kritiska steget i detta protokoll. Kortikal vävnad erhålls från epileptiska patienter som genomgår resektiv kirurgi24. Kvaliteten på den resekterade vävnaden, liksom exponeringstiden för vävnaden mellan resektion och kultur, är kritisk; Ju snabbare vävnaden överförs från operationsrummet till laboratoriet och skärs, desto mer optimal blir den organotypiska kulturen. Helst bör vävnaden skäras och överföras till cellodlingslaboratoriet inom de första timmarna efter insamling. Syresättningen av vävnaden under denna process förbättrar också skivornas kvalitet. I detta avseende, ju större vävnadsprovet, desto lägre koncentration av syre som når kärnan och därmed desto lägre livskraft om vävnaden inte skärs i tid. Om värdvävnadens kvalitet inte är optimal kommer validering av stamcellsterapier inte att vara möjlig.
När den kortikala vävnaden överförs från den mänskliga hjärnan till en platta måste vissa begränsningar beaktas. Under skärprocessen dissekeras ett stort antal axoner, vilket inducerar neuronal skada som leder till inflammatoriska processer såsom mikrogliaaktivering25. Av denna anledning, även om vävnaden anses vara frisk när den ligger i den mänskliga hjärnan, kan cellbeteendet i odling vara annorlunda på grund av den partiella skada som lidits under resektion och beredning av de organotypiska sektionerna26,27. Förändringar i mikrogliapopulationen kan övervakas med hjälp av olika tekniker, inklusive mätning av de frisatta cytokinnivåerna eller bedömning av morfologiska förändringar28. Viktigt, även om mikrogliaaktivering observerades vid 2 veckor i odling som ett resultat av förändringen i miljön från ett helt organ till ex vivo-odlingsförhållanden, var neuronerna fortfarande livskraftiga vid denna tidpunkt, vilket framgår av neuronfärgningen och analysen av deras elektrofysiologiska egenskaper. Tjockare vävnadsskivor bevaras bättre; Penetrationen av näringsämnen till skivans inre del påverkas emellertid, vilket resulterar i partiell vävnadsdöd. Av denna anledning är 300 μm den optimala tjockleken för organotypisk kultur.
Organotypiska kulturer av hACtx-vävnad har tydliga fördelar jämfört med andra 3D-odlingsmetoder såsom organoider eller sfäroider. Källan är en fullt utvecklad mänsklig hjärna, vilket innebär att cell- och matrismiljön, liksom mognadsstatusen för de olika cellpopulationerna, är densamma som de som vanligtvis finns i den vuxna mänskliga hjärnan25,29,30. Organoider liknar mer fostervävnader, vilket är optimalt för vissa forskningsområden som modellering av utvecklingsstörningar31 men inte till exempel för studier av neurodegenerativa sjukdomar, som främst påverkar den vuxna befolkningen och har en sen debut32,33. Viktigast är att den organotypiska kulturen av mänsklig vävnad hittills är det enda mänskliga systemet som möjliggör validering av cellterapier.
Det mesta av kunskapen om stamcellstransplantation för neuronal ersättning vid neurodegenerativa sjukdomar härrör från in vivo djurmodellering . Även om dessa system är extremt värdefulla för att bedöma den modulerande effekten av transplanterade celler i de skadade värdkretsarna, misslyckas tyvärr terapier som testas i denna inställning normalt när de översätts till kliniken på grund av de tydliga skillnaderna mellan gnagare och människor34. Av denna anledning är den organotypiska kulturen av hACtx-vävnad en utmärkt strategi för modellering av mänskliga neurodegenerativa sjukdomar som påverkar cortex på grund av möjligheten att studera interaktionerna mellan mänskliga neurala populationer och bevarandet av den mänskliga hjärnstrukturen25.
Sammanfattningsvis är denna kombinerade metod för långsiktiga organotypiska kulturer av den vuxna humana cortexen och ex vivo intrakortikal transplantation av inducerade pluripotenta stamcellshärledda kortikala föregångare en lovande strategi för validering av stamcellsbaserade terapier, vilket kan underlätta den kliniska översättningen av neuronala ersättningsstrategier för att stimulera funktionell återhämtning i den skadade hjärnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Arbetet stöds av anslag från Vetenskapsrådet, Hjärnfonden, Strokestiftelsen, Region Skåne, Thorsten och Elsa Segerfalks stiftelse samt Regeringens initiativ för strategiska forskningsområden (StemTherapy).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Cutting and electrophysiology | |||
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
| Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
| Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2x91 | |
| Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
| Plastic Petri dish | Any suitable | ||
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
| Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| RINSING SOLUTION | |||
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
| Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| Forceps | Any suitable | ||
| Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
| GENERATION OF lt-NES cells | |||
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
| Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
| Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
| Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
| Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
| Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
| Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
| T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
| Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
| Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
| Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
| Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
| Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
| Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
| Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
| Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
| Paint brush | Any suitable | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
| Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
| Distilled water | |||
| Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
| Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
| Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
| Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium citrate | |||
| Distilled water | |||
| Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
| Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
| Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
References
- Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).
- Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work. Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).
- Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).
- Tornero, D., et al. Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli. Brain. 140 (3), 692-706 (2017).
- Palma-Tortosa, S., et al. Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).
- Robinson, N. B., et al. The current state of animal models in research: A review. International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Delavaran, H., et al. Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke. European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).
- Sabuncu, M. R., et al. The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease. Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).
- Eugene, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
- Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
- Kalmbach, B. E., et al. Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons. Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).
- Barth, M., et al. Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54 (2021).
- Almeida, G. M., et al. Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response. Frontiers in Neuroscience. 15, 674576 (2021).
- Schwarz, N., et al. Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures. Scientific Reports. 7, 12249 (2017).
- Miskinyte, G., et al. Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 207 (2017).
- Gronning Hansen, M., et al. Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry. Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).
- Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS One. 7 (1), 29597 (2012).
- Avaliani, N., et al. Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors. Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).
- Engel, J., et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).
- Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).
- Verwer, R. W., et al. Injury response of resected human brain tissue in vitro. Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).
- Verwer, R. W., et al. Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue. Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).
- Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Schwarz, N., et al. Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease. Elife. 8, 48417 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Wang, Z., et al. Organoid technology for brain and therapeutics research. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).
- Wang, H. Modeling neurological diseases with human brain organoids. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).
- Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).
