Summary
Bu protokol, yetişkin insan korteksinin uzun süreli organotipik kültürlerini, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kortikal progenitörlerin ex vivo intrakortikal transplantasyonu ile birlikte tanımlamakta ve insan nörodejeneratif bozuklukları için kök hücre bazlı tedavileri daha fazla test etmek için yeni bir metodoloji sunmaktadır.
Abstract
Nörodejeneratif bozukluklar, semptomları ve hücresel etkileri açısından yaygın ve heterojendir, bu da insan hastalıklarını tamamen taklit eden uygun hayvan modellerinin bulunmaması ve ölüm sonrası insan beyin dokusunun zayıf mevcudiyeti nedeniyle çalışmalarını karmaşık hale getirmektedir. Yetişkin insan sinir dokusu kültürü, nörolojik bozuklukların farklı yönlerini inceleme imkanı sunar. Moleküler, hücresel ve biyokimyasal mekanizmalar bu sistemde kolayca ele alınabilir, ayrıca ilaçları veya hücre bazlı tedaviler gibi farklı tedavileri test edebilir ve doğrulayabilir. Bu yöntem, rezeksiyonel cerrahi geçiren epileptik hastalardan elde edilen yetişkin insan korteksinin uzun süreli organotipik kültürlerini ve indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kortikal progenitörlerin ex vivo intrakortikal transplantasyonunu birleştirir. Bu yöntem, hücre sağkalımı, nöronal farklılaşma, sinaptik girdi ve çıkışların oluşumu ve bozulmamış yetişkin insan kortikal dokusuna transplantasyondan sonra insan kaynaklı hücrelerin elektrofizyolojik özelliklerinin incelenmesine izin verecektir. Bu yaklaşım, temel araştırmayı farklı nörolojik bozuklukları olan hastalar için kök hücre tabanlı tedavilerin klinik çevirisine yaklaştıracak ve hasarlı sinir devrelerini yeniden yapılandırmak için yeni araçların geliştirilmesine izin verecek bir 3D insan hastalığı modelleme platformunun geliştirilmesinden önce önemli bir adımdır.
Introduction
Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı veya iskemik inme gibi nörodejeneratif bozukluklar, nöronal fonksiyon bozukluğu veya ölümün ortak özelliğini paylaşan bir grup hastalıktır. Etkilenen beyin bölgesi ve nöronal popülasyon açısından heterojendirler. Ne yazık ki, bu hastalıkların tedavileri, insan beyninde meydana gelenleri taklit eden hayvan modellerinin eksikliği nedeniyle kıttır veya sınırlı etkinliğe sahiptir 1,2. Kök hücre tedavisi, beyin yenilenmesi için en umut verici stratejilerden biridir3. Farklı kaynaklardan gelen kök hücrelerden nöronal progenitörlerin üretimi son yıllarda büyük ölçüde gelişmiştir 4,5. Son yayınlar, insan kaynaklı pluripotent kök (iPS) hücre kaynaklı uzun süreli kendini yenileyen nöroepitel benzeri kök (lt-NES) hücrelerinin, kortikal bir farklılaşma protokolünü takiben ve somatosensoriyel korteksi etkileyen iskemik inme ile bir sıçan modelinde intrakortikal transplantasyondan sonra, olgun kortikal nöronlar ürettiğini göstermiştir. Ek olarak, greft kaynaklı nöronlar, konakçı nöronlardan afferent ve efferent sinaptik bağlantılar aldı ve sıçan nöronal ağına entegrasyonlarını gösterdi 6,7. Greft kaynaklı aksonlar miyelinize edildi ve peri-enfarkt alanı, korpus kallozum ve kontralateral somatosensoriyel korteks dahil olmak üzere sıçan beyninin farklı bölgelerinde bulundu. En önemlisi, iPS hücre kaynaklı transplantasyon, inme hayvanlarında motor açıklarını tersine çevirdi7.
Hayvan modelleri, nakil sağkalımını, nöronal entegrasyonu ve aşılanmış hücrelerin motor ve bilişsel işlevler üzerindeki etkisini incelemeye yardımcı olsa bile, insan hücreleri (greft-konakçı) arasındaki etkileşim hakkında bilgi bu sistemde eksiktir 8,9. Bu nedenle, uzun süreli insan beyni organotipik kültürünün, insan iPS hücresi kaynaklı nöronal progenitörlerin ex vivo transplantasyonu ile kombine bir yöntemi burada tanımlanmıştır. Nöroşirürji rezeksiyonlarından elde edilen insan beyni organotipik kültürleri, araştırmacıların insan merkezi sinir sistemi devresi ve insan beyin bozuklukları için tedavileri test etmenin en doğru yolu hakkındaki anlayışlarını arttırmalarını sağlayan fizyolojik olarak ilgili 3D beyin modelleridir. Bununla birlikte, bu bağlamda yeterli araştırma yapılmamıştır ve çoğu durumda, insan hipokampal beyin organotipik kültürleri kullanılmıştır10,11. Serebral korteks, iskemik inme12 veya Alzheimer hastalığı13 gibi çeşitli nörodejeneratif bozukluklardan etkilenir, bu nedenle bilgimizi genişletmemize ve farklı terapötik stratejileri test etmemize ve doğrulamamıza izin veren bir insan kortikal 3D sistemine sahip olmak önemlidir. Son birkaç yılda yapılan birçok çalışma, insan beyin hastalıklarını modellemek için yetişkin insan kortikal (hACtx) dokusundan kültürleri kullanmıştır 14,15,16,17,18,19; ancak kök hücre tedavisi bağlamında sınırlı bilgi mevcuttur. İki çalışma, burada açıklanan sistemin fizibilitesini zaten göstermiştir. 2018 yılında, farklı transkripsiyon faktörleriyle programlanan ve hACtx dokusuna nakledilen insan embriyonik kök hücrelerinin, yetişkin insan kortikal ağlarına entegre olabilen olgun kortikal nöronlara yol açtığı gösterilmiştir20. 2020 yılında, lt-NES hücrelerinin insan organotipik sistemine transplantasyonu, fonksiyonel nöronların elektrofizyolojik özellikleri ile olgun, tabakaya özgü kortikal nöronlara farklılaşma kapasitelerini ortaya koydu. Aşılanmış nöronlar, kuduz virüsü retrograd monosinaptik izleme, tüm hücre yama-kelepçe kayıtları ve immüno-elektron mikroskobu21 ile doğrulandığı gibi, yetişkin beyin dilimlerindeki insan kortikal nöronları ile hem afferent hem de efferent sinaptik temaslar kurdu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Lund, İsveç Bölgesel Etik Komitesi tarafından onaylanan yönergeleri izler (etik izin numarası 2021-07006-01). Temporal lob epilepsisi nedeniyle elektif cerrahi uygulanan hastalardan sağlıklı neokortikal doku elde edildi. Tüm hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı.
NOT: Elde edilen tüm dokular boyutlarına bakılmaksızın işlenmiştir. Bununla birlikte, 1-1.5mm3'ten daha küçük dokuların bir vibratomla işlenmesi ve kesilmesi teknik olarak zor olacaktır.
1. Doku toplama, bakım, kesme ve kaplama
- Doku dilimlemeden önceki gün hazırlıklar
- Volumetrik bir şişede 2 L kesme çözeltisi (Tablo 1) hazırlayın. MgCl 2 ve CaCl2 dışındaki tüm bileşenleri ~ 1.800 mL deiyonize suda çözün ve 15 dakika boyunca karbojen gazı ile kabarcık haline getirin. Daha sonra uygun miktarlarda 1 M MgCl 2 ve CaCl2 çözeltileri ekleyin ve 15 dakika daha köpürmeye devam edin. Son olarak, şişeyi 2 L işaretine doldurun; pH ve ozmolariteyi kontrol edin ve gerekirse ayarlayın. Hazırlanan çözeltinin 2 x 350 mL'sini dondurun ve geri kalanını 4 ° C'de saklayın.
NOT: pH ve ozmolarite sırasıyla sırasıyla 7.3-7.4 ve 295-300 mOsm'dur. - 100 mL durulama çözeltisi hazırlayın (Tablo 2). 476 mg HEPES ve 200.6 mg glikozu, 5 mL penisilin / streptomisin ile desteklenmiş 100 mL HBSS'de çözün. Bu, 4 ° C'de 10 güne kadar saklanabilir.
- İnsan yetişkin kortikal (hACtx) kültür ortamını (hACtx ortamı) (Tablo 3) hazırlayın ve havalandırmalı bir başlık altında hücre kültürü laboratuvarında filtreleyin. Ortam, fenol kırmızısı içermeyen nöronal ortamdan (Malzeme Tablosuna bakınız), B27 takviyesi, L-glutamin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve gentamisin'den oluşur. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
- Volumetrik bir şişede 2 L kesme çözeltisi (Tablo 1) hazırlayın. MgCl 2 ve CaCl2 dışındaki tüm bileşenleri ~ 1.800 mL deiyonize suda çözün ve 15 dakika boyunca karbojen gazı ile kabarcık haline getirin. Daha sonra uygun miktarlarda 1 M MgCl 2 ve CaCl2 çözeltileri ekleyin ve 15 dakika daha köpürmeye devam edin. Son olarak, şişeyi 2 L işaretine doldurun; pH ve ozmolariteyi kontrol edin ve gerekirse ayarlayın. Hazırlanan çözeltinin 2 x 350 mL'sini dondurun ve geri kalanını 4 ° C'de saklayın.
- Doku örneklerinin gelmesinden önce operasyon günü hazırlıklar
- Gerekli ekipmanın ve laboratuar alanının kullanılabilirliğini kontrol edin ve tüm cerrahi aletleri ve vibratomu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve tezgah üstü alanı, damıtılmış suyla (deterjansız) ve ardından% 70 etanol ile iyice temizleyin. Alet ve ekipmanı kullanmadan önce etanolün en az 30 dakika kurumasını bekleyin.
- Dondurulmuş kesme çözeltisini ezin ve buz ve sıvı "çorbasını" 30 dakika boyunca karbojen gazı ile kabartın. Ardından, kaplardan birini ezilmiş çözelti "çorba" ile sıkıca kapatın ve buz kutusuna yerleştirin. Bu, dokuyu ameliyathaneden toplamak için kullanılacaktır.
- Vibratomu kalibre edin ve kesme parametrelerini ayarlayın: 0,05 mm / s hız ve 1,7 mm titreşim. Kesme odasını bir vibratom aşamasına yerleştirin ve ona bağlı soğutucuyu çalıştırın, böylece oda -3 ° C'lik sabit bir sıcaklıkta olur.
- Doku dilimlerini ve kesme solüsyonunu yerleştirmek için dilim toplama odasını kesici uçlarla hazırlayın, oda sıcaklığında (RT) karbojen gazı ile sürekli köpürtün.
- Hücre kültürü laboratuvarında ve havalandırmalı bir davlumbazın altında, kültür eklerini forseps kullanarak 6 delikli bir plakaya yerleştirin. Kesici ucun altına, membranla temas edene kadar 5 mL hACtx ortamı ekleyerek kabarcık oluşumunu önleyin ve kesici ucun üstüne 2 mL ekleyin. Doku dilimlerini eklere aktarmadan önce inkübatörde 37 °C ve %5 CO 2'de en az 2 saat dengeleyin.
- Doku toplama ve dilimleme işlemleri
- Rezeksiyondan hemen sonra, mümkünse hastadan dokuyu doğrudan dondurulmuş, kabarcıklı ve ezilmiş kesme çözeltisi içeren bir kaba toplayın. Kapalı kabı buz üzerinde hemen laboratuvarın kesme alanına aktarın.
- Dokuyu inceleyin ve kortikal tabakaların yönünü göz önünde bulundurarak vibratomun kesme aşamasına yapıştırmak için en iyi yüzeyi bulun (bkz. adım 1.3.3). Gerekirse, düz olmayan yüzeyi bir neşterle kesin, böylece en uygun dilim oryantasyonu için dokuyu sahneye yerleştirmek kolaydır.
- Dokuyu doku yapıştırıcısı ile sahneye yapıştırın ( Malzeme Tablosuna bakınız), dilimleme odasına yerleştirin ve odayı hemen soğuk kabarcıklı kesme çözeltisi ile doldurun. Tüm kesme prosedürü boyunca köpürmeye devam edin.
- Koronal veya sagital dilimleri, dokudan bıçağa yönelime bağlı olarak, tüm kortikal tabakaları ve mümkünse beyaz maddeyi içerecek şekilde 300 μm kalınlığında kesin. Dilimleri RT'de köpüren kesme çözeltisi ile toplama odasına yerleştirin.
NOT: Beyaz madde tarafından korteksin yüzeyine doğru kesin. Meninksleri çıkarmayın, çünkü bu dokuya zarar verebilir. Kesme bıçağı genellikle kolayca dilimler. - Tüm doku kesildikten sonra, dilimleri RT'de durulama çözeltisi ile steril bir Petri kabına aktarın ve hücre kültürü laboratuvarına taşıyın. Bu adım, fazla sakarozu kültür plakasına aktarmadan önce dilimlerden çıkarmak için gereklidir.
NOT: Dilimleri aktarmak için (bu ve sonraki adımlarda), ters çevrilmiş bir cam pipet kullanın, daha ince kısmı kesin ve emme için kauçuk bir meme ucu yerleştirin.
- hACtx doku dilimlerinin kültürü ve bakımı
- Doku dilimlerini ayrı ayrı ıslak ve batık eklerin üzerine yerleştirin. 24 saat sonra, kalan sakkaroz veya diğer artık maddeleri kesme prosedürlerinden daha fazla çıkarmak için ortamı değiştirin.
- Kültür ortamını her 7 günde bir taze ortamla değiştirin. 2 hafta sonra, gentamisinsiz hACtx ortamı kullanın. Kültür 2 aya kadar korunabilir.
NOT: İnkübatördeki hACtx ortamını 37 °C'de ve %5 CO 2'de ortam değişiminden önce en az2 saat dengeleyin. Her 2 haftada bir taze ortam hazırlanmalıdır. Dilimleri her 2-3 günde bir kontrol edin ve ortamın bir kısmı buharlaşmışsa, kesici ucun üstüne daha fazlasını ekleyin.
| Kesme çözümü | Stok konsantrasyonu | Son konsantrasyon [mM] | 1 L başına |
| Sakaroz | Toz | 200 | 68.46 gr |
| NaHCO3 | Toz | 21 | 1.76 gr |
| Kartal | Toz | 3 | 0.22 gr |
| NaH2PO4 | Toz | 1.25 | 0.17 gr |
| Glikoz | Toz | 10 | 1.80 gr |
| MgSO4 | 1 milyon | 2 | 2 mL |
| CaCl2 | 1 milyon | 1.6 | 1,6 mL |
| MgCl2 | 2 milyon | 2 | 1 mL |
Tablo 1: Kesme çözeltisinin bileşimi. MgCl 2 ve CaCl2, deiyonize suda önceden hazırlanmış 1 M çözeltileri olarak kullanılır.
| Durulama çözeltisi | Stok konsantrasyonu | Son konsantrasyon | 100 mL başına |
| HBSS | 1 adet | 95 mL | |
| PenStrep | 10.000 U/mL | 500 U/mL | 5 mL |
| HEPES | Toz | 4,76 gr/l | 476 mg |
| Glikoz | Toz | 2 g/L | 200,6 mg |
Tablo 2: Durulama çözeltisinin bileşimi.
| hACtx ortam | Stok konsantrasyonu | Son konsantrasyon | 100 mL başına | |
| Fenol kırmızısı olmayan nöronal ortam | 97,4 mL | Bkz. Malzeme Tablosu | ||
| B27 Serisi | 50x | 1:50 | 2 mL | |
| L-Glutamin | 100x | 1:200 | 500 μL | Bkz. Malzeme Tablosu |
| Gentamisin | 50 mg/mL | 1:1000 | 100 μL |
Tablo 3: hACtx ortamının bileşimi.
2. lt-NES hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması
NOT: Lt-NES hücreleri daha önce tarif edildiği gibi21,22 üretilir ve kurucu bir promotör (GFP-lt-NES hücreleri) altında yeşil floresan protein (GFP) taşıyan bir lentiviral vektör ile dönüştürülür. 3 x 106 hücre içeren şişeler kullanıma kadar -150 ° C'de saklanır.
- Stok çözeltilerinin ve ortamın hazırlanması
- 10 mL PBS-%0.1 BSA'da 100 μg bazik fibroblast büyüme faktörünü (bFGF) 10 μg/mL stok konsantrasyonuna sahip olacak şekilde seyreltin. 100 μL aliquots hazırlayın.
- 10 μg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna sahip olmak için 10 mL PBS-0.1% BSA'da 100 μg epidermal büyüme faktörünü (EGF) seyreltin. 100 μL aliquots hazırlayın.
- Aliquot başına 100 μL hacimde Aliquot 50x B27 takviyesi.
- 100 μg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna sahip olmak için 100 mL deiyonize suda 10 mg poli-L-ornitin seyreltin. 1 mL aliquots yapın.
- 1.20 mg/mL fare laminininden 30 μL alikot hazırlayın.
- 90 mL PBS'de 10 mL tripsin-EDTA (%0,25) %0,025'lik bir stok konsantrasyonuna seyreltin. 1 mL aliquots hazırlayın.
- 0.025 g tripsin inhibitörünü 50 mL PBS'de 0.5 mg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna seyreltin. 1 mL aliquots hazırlayın.
- 10 μg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna sahip olmak için 1 mL PBS-0.1% BSA'da 10 μg Wnt3a (Kanatsız tip MMTV entegrasyon sitesi aile üyesi 3A) seyreltin. BMP4'ü (kemik morfogenetik protein 4) aynı şekilde hazırlayın. 100 μL'lik bir hacimde Aliquot.
- 2.5 mL DMSO'da 1 mg siklopamini 400 μg / mL'lik son konsantrasyona kadar seyreltin ve 100 μL alikotlar yapın.
- Temel ortamı (Tablo 4) ve farklılaşma tanımlı ortamı (DDM, Tablo 5) hazırlayın ve 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
- Kültür tabaklarının kaplanması
- Proliferasyon veya farklılaşma sırasında GFP-It-NES hücrelerini kültürlemek için bulaşıkları önceden kaplamak için, poli-L-ornitin 1:100'ü deiyonize suda seyreltin ve bir T25 şişesine 5 mL çözelti ekleyin. RT'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
- Poli-L-ornitin kaplı plakaları 1x deiyonize su ile ve 1x PBS ile yıkayın.
- Proliferasyondaki GFP-It-NES hücreleri için, fare lamininini PBS'de 1:500'de seyreltin ve 37 ° C'de en az 2 saat inkübe edin. Farklılaşmadaki GFP-It-NES hücreleri için, fare lamininini PBS'de 1:100'de seyreltin ve 37 ° C'de en az 2 saat inkübe edin.
- GFP-lt-NES hücrelerinin çoğalması
- İki farklı 15 mL tüpte 5 mL (yıkama için) ve 5 mL (tohumlama için) temel ortamın sıcak olması.
- Bir şişe GFP-lt-NES hücresini 37 ° C'de hızla çözün, yıkama tüpüne aktarın ve 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
- Pelet dokunmadan ortamı dikkatlice aspire edin ve hücreleri önceden ısıtılmış bazik ortamın 1 mL'sinde yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu, proliferasyon faktörleri ile desteklenmiş temel ortamı içeren tohumlama tüpüne aktarın: EGF (10 ng / mL), bFGF (10 ng / mL) ve B27 (10 ng / mL). Hücreleri poli-L-ornitin / laminin kaplı T25 şişe üzerine tohumlayın.
- Hücreleri her gün proliferasyon faktörleri ile besleyin. Sararırsa ortamı değiştirin. Hücreleri her üç veya dördüncü günde bir geçirin (% 100 akıcılığa ulaştıktan 1 gün sonra).
- GFP-lt-NES hücrelerinin proliferasyon ve farklılaşma için bölünmesi
- Şişe başına 5 mL temel ortamın önceden ısıtılması (hücreleri toplamak için), artı onları yeniden tohumlamak için gereken toplam hacim.
NOT: Geçiş, hücreleri proliferasyonda tutmak için 15 mL bazik ortam gerektiren 1: 3 seyreltmede ve farklılaşmayı başlatmak için 30 mL bazik ortam gerektiren 1: 6 seyreltmede yapılır. - Ortamı hücre kültürü şişesinden aspirasyonla çıkarın ve 500 μL önceden ısıtılmış% 0.025 tripsin ekleyin. RT'de 5-10 dakika kuluçkaya yatırın. Hücrelerin ayrılması, 10x büyütmede standart bir ışık mikroskobu altında doğrulanabilir.
- Eşit miktarda tripsin inhibitörü (0.5 mg / mL nihai konsantrasyon) ve ardından 5 mL ılık bazik ortam ekleyin. Hücreleri yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek ayırın ve toplayın. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Hücreleri proliferasyonda tutmak için, proliferasyon faktörleri ile desteklenmiş taze bazik ortamda 1: 3 seyreltmede yeniden plakalayın ve adım 2.3.4'ü tekrarlayın.
- Şişe başına 5 mL temel ortamın önceden ısıtılması (hücreleri toplamak için), artı onları yeniden tohumlamak için gereken toplam hacim.
- GFP-lt-NES hücrelerinin kortikal farklılaşması
- 0. günde, hücreleri (farklılaşma için kullanılmak üzere) proliferasyon faktörleri ile desteklenmiş 30 mL temel ortamda yeniden askıya alın ve altı farklılaşma kaplı T25 şişesinde (bölünmüş 1: 6) plakalayın.
- 1. günde, ortamın yarısını DDM'ye değiştirin ve konsantrasyonlarının yarısına proliferasyon faktörleri ekleyin.
- 2. günde, ortamı tamamen farklılaşma faktörleriyle desteklenen DDM'ye değiştirin: BMP4 (10 ng / mL), Wnt3a (10 ng / mL) ve siklopamin (400 ng / mL).
- 4. günde, yalnızca farklılaşma faktörlerini ekleyin. Sararırsa ortamı değiştirin.
- 6. günde, ortamı BMP4 ve Wnt3a ile desteklenmiş DDM olarak değiştirin. Ansiklopamin bu adımda kaldırılır.
- 7. günde, hücreleri adım 2.4.2 ve adım 2.4.3'te belirtildiği gibi ayırın.
| Temel Orta | Stok konsantrasyonu | Son konsantrasyon | 100 mL başına |
| DMEM/F12 L-Glutamin ile | 1 adet | 98,7 milyon L | |
| N-2 takviyesi | 100x | 1:100 | 1 mL |
| Glikoz | 45% | 3,5 mL/B | 350 μL |
Tablo 4: lt-NES hücrelerinin proliferasyon ortamının bileşimi (bazik ortam).
| DDM ortamı | Stok konsantrasyonu | Son konsantrasyon | 100 mL başına |
| DMEM/F12 L-Glutamin ile | 96 mL | ||
| N2 | 100 x | 1:100 | 1 mL |
| cesaret | 100 x | 1:100 | 1 mL |
| Sodyum Piruvat | 100 mM | 1:100 | 1 mL |
| BSA V Fraksiyonu | 7.5% | 6,6 mL/B | 660 μL |
| 2-merkaptoetanol | 50 nM | 7 μL/L | 0,7 μL |
| Glikoz | 45% | 3,2 mL/B | 320 μL |
Tablo 5: lt-NES hücrelerinin farklılaşma tanımlı ortamının (DDM) bileşimi.
3. GFP-lt-NES hücrelerinin organotipik hACtx dilimlerine nakli
NOT: hACtx dokusu, hücre naklinden 1 hafta önce kültüre alınmalıdır. Transplantasyon prosedürünü kolaylaştırmak için, dokunun kaymasını önlemek için hACtx ortamının 2 mL'sini kesici ucun üstünden çıkarmak gerekir.
- Kortikal olarak astarlanmış GFP-lt-NES hücrelerini (adım 2.5.6'dan itibaren) soğuk saf bazal membran matrisinde ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1 x 105 hücre / μL konsantrasyonunda yeniden askıya alın ve çözeltiyi daha küçük bir steril tüpe aktarın.
NOT: Transplantasyon prosedürü sırasında, jel katılaşmasını önlemek için tüm malzemeler (pipet uçları, tüpler, kılcal damarlar vb.) önceden soğutulmalıdır. Bodrum membran matris jelini kullanmadan önce 30 dakika boyunca buz üzerinde çözün. - Hücre süspansiyonunu, emme için kauçuk bir meme ucuna bağlı soğuk bir cam kılcal damara toplayın. Yarı kuru doku dilimini çeşitli bölgelerde bıçaklayarak hücre süspansiyonunu küçük damlalar halinde (her biri yaklaşık 1 μL) enjekte edin.
- Jelin katılaşması için 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Plakayı inkübatörden kaputa geri aktarın ve dokuyu tamamen suya batırmak için kesici ucun üstüne dikkatlice 2 mL hACtx ortamı ekleyin.
- Kültür ortamını haftada bir kez taze hACtx ortamıyla değiştirin.
4. Doğrulama
- hACtx dilimlerinin boyanması
- İstenilen zaman noktasında, dilimleri hücre kültürü laboratuvarından çıkarın ve PBS ile bir Petri kabına batırarak ekinden çıkarın. Ardından, ters çevrilmiş bir cam pipet kullanarak dilimleri boyama şişelerine aktarın (adım 1.3.5'teki Not'a bakın) ve bunları 4 ° C'de gece boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin.
- KPBS ile her seferinde 15 dakika boyunca 3 kat durulayın ve geçirgenleştirme çözeltisi (KPBS'de% 0.02 BSA ve% 1 Triton X-100) ile 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
- Ertesi gün, bloke edici çözelti (% 0.2 Triton X-100,% 1 BSA, sodyum azid [1: 10.000] ve% 10 normal eşek serumu içeren KPBS) ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Bloke ettikten sonra, blokaj çözeltisinde seyreltilmiş birincil antikorları (seyreltmeler için Tablo 6'ya bakınız) ekleyin ve 4 ° C'de 48 saat boyunca inkübe edin.
- Her biri 15 dakika boyunca serum eklemeden 3x'i bloke edici çözelti ile yıkayın. Bloke edici çözeltide seyreltilmiş ikincil antikorları ekleyin (seyreltmeler için Tablo 6'ya bakınız) ve 4 ° C'de 48 saat boyunca inkübe edin.
- Serumsuz bloke edici çözelti ile 3x yıkayın ve geçirgenlik çözeltisinde seyreltilmiş Hoechst lekesinde RT'de 2 saat inkübe edin (1:1.000).
- KPBS ile 3x yıkayın, dilimleri bir boya fırçası kullanarak cam slaytlara monte edin ve kurumaya bırakın. Son olarak, slaytları deiyonize suyla durulayın, fazla suyu çıkarın, montaj ortamını ekleyin ve bir cam kapak kayması ile örtün. Slaytları RT'de en az 24 saat saklayın ve görüntülemeye kadar 4 °C'de saklayın.
NOT: Nükleer epitopları etiketleyen antikorlar için, 65 °C'de 2 saat boyunca sodyum sitrat (10 mM, pH 6.0) ile geçirgenleşmeden önce (adım 4.1.2) antijen alımı gerçekleştirin.
- Tüm hücre yama kelepçesi
- Kayıt gününde, insan beyni ortamına daha iyi uyacak şekilde modifiye edilmiş 1 L insan yapay beyin omurilik sıvısı (haCSF) hazırlayın (Tablo 7). Kesme çözeltisine benzer şekilde, deiyonize suda çözünmüş CaCl 2 dışındaki tüm bileşenlerle yaklaşık 900 mL çözelti yapın ve uygun hacimde 1 M CaCl2 çözeltisi eklemeden önce 15 dakika boyunca karbojenle kabartın. Volumetrik şişeyi 1 L işaretine kadar doldurun ve kayda başlamadan önce ve deney boyunca RT'de 15 dakika daha köpürmeye devam edin.
- Doku dilimlerini kültür plakasından 2 mL/dak perfüzyon hızında kabarcıklı haCSF ile sürekli perfüze edilen ve bir banyo sıcaklığı kontrol cihazı kullanılarak 34 °C'ye ısıtılan dik bir mikroskop sahnesindeki kayıt odasına aktarın.
- Cam kılcal damarları pipet çektirme ile ortalama 3-5 MΩ dirence çekin ve kılcal damarları, kaydedilen hücrelerin post-hoc tanımlanması için yeni eklenmiş 2-4 mg biyositin ile K-glukonat bazlı iç çözelti (Tablo 8) ile doldurun. Bu iç çözeltinin pH ve ozmolaritesi sırasıyla 7.2-7.3 ve 285-295 mOsm'dur.
- Konakçı hücre kaydı durumunda, 4x hedefli dilime kabaca genel bir bakış elde edin ve 40x hedefiyle yama yapmak için sağlıklı görünümlü bir hücre bulun. Ardından, standart tüm hücre yama kelepçesi ile devam edin.
- Aşılanmış hücre kaydı durumunda, greftteki GFP muhabir ekspresyonu ile 4x objektif ve mavi aralıkta (460 nm) bir epifloresan filtre kullanarak aşılanmış hücrelerle doku alanını tanımlayın. Ardından, 40x hedefi ile bulunan alana yakınlaştırın ve standart bir tüm hücre yama kelepçesi için GFP'yi eksprese eden aşılanmış bir hücre bulun.
- Hücreye girdikten hemen sonra dinlenme membranı potansiyelini (RMP) kontrol edin ve kaydın kalitesinin iyi olduğundan emin olun. İlgilenilen tüm parametreleri (örneğin, membran direnci [Ri], AP parametreleri, sodyum ve potasyum akımları ve sinaptik aktivite) tüm hücre voltajına veya akım kelepçesi konfigürasyonuna kaydedin.
- Gerekli tüm verileri topladıktan sonra, kayıt pipetini hücreye daha fazla zarar vermeden dikkatlice geri çekin, böylece post-hoc immün boyama ile tanımlanabilir.
- Adım 4.1'de açıklandığı gibi daha fazla sabitleme ve boyama için dilimi% 4 PFA çözeltisine aktarın. Streptavidin, kayıtlar sırasında biyositin ile doldurulmuş hücreleri immünoetiketlemek için kullanılır.
| ANTİKOR | Seyreltme | Notlar |
| Birincil | ||
| Tavuk anti-GFP | 1:1000 | |
| Tavuk anti-MAP2 | 1:1000 | |
| Keçi anti-AiF1 | 1:100 | |
| Fare anti-MBP | 1:1000 | Antijen alımı gerekli |
| Fare anti-SC123 | 1:2000 | |
| Tavşan anti-NeuN | 1:1000 | |
| Tavşan anti-Olig2 | 1:500 | |
| Tavşan anti-Tmem119 | 1:200 | |
| İkincil | ||
| 488-konjuge AffinitySaf Eşek anti-fare IgG | 1:500 | |
| 488-konjuge AffinitySaf Eşek tavşan karşıtı IgG | 1:500 | |
| 488-konjuge AffinitySaf Eşek anti-tavuk IgG | 1:500 | |
| Cy3-konjuge AffinitySaf Eşek anti-tavuk IgG | 1:500 | |
| Cy3-konjuge AffinitySaf Eşek anti-keçi IgG | 1:500 | |
| Cy3-konjuge AffinitySaf Eşek anti-fare IgG | 1:500 | |
| Alexa flor 647-konjuge Streptavidin | 1:500 |
Tablo 6: İmmünohistokimya için primer ve sekonder antikorların listesi.
| haCSF | Stok konsantrasyonu | Son konsantrasyon [mM] | 1 L başına |
| Arjantin | Toz | 129 | 7.54 gr |
| NaHCO3 | Toz | 21 | 1.76 gr |
| Glikoz | Toz | 10 | 1.80 gr |
| Kartal | Toz | 3 | 0.22 gr |
| NaH2PO4 | Toz | 1.25 | 0.17 gr |
| MgSO4 | 1 milyon | 2 | 2 mL |
| CaCl2 | 1 milyon | 1.6 | 1,6 mL |
Tablo 7: Suni beyin omurilik sıvısının (haCSF) bileşimi.
| K-Glukonat iç çözeltisi | Stok konsantrasyonu | Son konsantrasyon [mM] | 100 mL başına |
| K-glukonat | Toz | 122.5 | 2.87 gr |
| Kartal | Toz | 12.5 | 93.18 mg |
| Arjantin | Toz | 8 | 46,76 mg |
| HEPES | Toz | 10 | 238,32 mg |
| MgATP | Toz | 2 | 101.4 mg |
| Na3GTP | Toz | 0.3 | 17,0 mg |
| Not: KOH/HCl ile pH'ı ayarlayın | |||
Tablo 8: K-glukonat bazlı iç çözeltinin bileşimi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tarif edilen protokolü takiben, temporal lob epilepsisi olan bir hastadan hACtx dokusu yukarıda açıklandığı gibi toplandı ve işlendi. Konakçı dokunun başlangıç noktasını incelemek için kültürde 24 saat sonra birkaç dilim sabitlendi. Nöronlar (NeuN ve Map2, Şekil 1A'yı ifade eden), oligodendrositler (Olig2 ve MBP, Şekil 1B) ve astrositler (insana özgü GFAP, ayrıca STEM123, Şekil 1C olarak da adlandırılır) gibi farklı sinir hücresi popülasyonlarının analizi, dokunun optimal korunmasını göstermiştir.
Bir sonraki adım, kültür koşullarının insan dokusundaki nöronal canlılığı nasıl etkilediğini incelemekti. Bu amaçla NeuN ve Map2'nin boyanması 2 haftalık kültürden sonra yapıldı. İncelenen zaman noktasında, bu her iki nöronal belirtecin ekspresyonu dokuda hala mevcuttu (Şekil 2A). Ek olarak, işlevselliği değerlendirmek için elektrofizyolojik kayıtlar yapıldı. Tüm hücre yama kelepçesini kullanan kayıtlar, nöronların RMP (ortalama olarak -70 mV) ve membran giriş direncini (Ri) (ortalama 300 MΩ) sürdürdüğünü, akut preparatlardan21,23'teki nöronlarla karşılaştırılabilir olduğunu gösterdi. Genel olarak, hücreler taze dokudan biraz daha az aktifti, ancak hücrelerin çoğunluğu hala en az bir tanesini ateşleyebiliyordu (Şekil 2B-E), çoklu olmasa da, aksiyon potansiyelleri (AP'ler, Şekil 2F-I) ve voltaj kelepçesi modunda adım akımı enjeksiyonlarında hızlı içe doğru sodyum ve yavaş dışa doğru potasyum akımları mevcuttu (Şekil 2C-E, G-I). Birlikte ele alındığında, bu kayıtlar organotipik kültürlerdeki nöronların nispeten sağlıklı olduğunu ve tipik nörofizyolojik içsel özellikler sergilediğini göstermiştir.
Ayrıca, kültürün mikroglia aktivasyonu üzerindeki etkisi, 24 saat (Şekil 3A) ve 2 haftalık kültürlenmiş (Şekil 3B) dokuda Tmem119 ve Iba1 boyama ile değerlendirildi. Beklendiği gibi, mikroglial görünümde bazı değişiklikler gözlendi. Kültürde 2 hafta sonra, akut dokuya kıyasla daha az ramifiye oldular ve daha aktif bir morfoloji kazandılar.
Konakçı doku karakterize edildikten sonra, lt-NES hücre kaynaklı progenitörlerin transplantasyonu aşağıdaki gibi gerçekleştirildi. GFP-lt-NES hücreleri 7 gün boyunca farklılaştırıldı ve 1 haftalık kültürlü hACtx dokusuna aşılandı (Şekil 4A). GFP ile immünohistokimya kullanılarak transplantasyona genel bir bakış gözlendi (Şekil 4B,C). Sonuçlar, rezeksiyon ve kaplama arasında daha uzun bir zaman aralığı olması nedeniyle kötü korunmuş dokudaki önceki transplantasyonlarla karşılaştırıldı. Görüntüler, optimal sistemde, ex vivo transplantasyondan 4 hafta sonra, aşılanmış GFP-lt-NES hücrelerinin tüm organotipik kültür boyunca genişletilmiş nöritler ve geniş ve karmaşık arborizasyonlar sergilediğini göstermektedir (Şekil 4B). Kötü korunmuş doku, zayıf konakçı bağlantısı nedeniyle başarılı transplantasyona izin vermedi. Neredeyse hiç aşılanmış hücre hayatta kalmadı; Dahası, ölü hücreler üzerindeki antikorların enkaz ve spesifik olmayan etiketlemesi, insan dilimi boyunca geniş çapta gözlenmiştir (Şekil 4C).
Aşılanan hücrelerin elektrofizyolojik özellikleri ile ilgili olarak, başarılı transplantasyon durumunda, hücrelerin sadece morfolojik olarak değil, aynı zamanda tekrarlayan ve sıklıkla spontan AP'ler, hızlı içe doğru sodyum ve yavaş dışa doğru potasyum akımları ve greftten 4 hafta sonra greftin konakçı doku ile fonksiyonel entegrasyonunu gösteren belirli bir sinaptik aktivite seviyesine sahip fonksiyonel olarak aktif olgun nöronlar haline geldiği bulunmuştur (Şekil 4D-H).
Şekil 1: Kültürde 24 saat sonra hACtx dokusundaki farklı hücre popülasyonlarının karakterizasyonu. (A) nöronlarının (NeuN ve Map2'yi ifade eden), (B) oligodendrositlerin (Olig2 ve MBP) ve (C) astrositlerin (insana özgü GFAP [STEM123]) varlığını gösteren hACtx dokusunun temsili konfokal görüntüleri. Nükleer boyama (Ho: Hoechst, mavi) bireysel ve birleştirilmiş panellere dahil edilmiştir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Beyaz oklar kolokalizasyonu gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Organotipik kültürde 2 hafta sonra hACtx nöronlarının karakterizasyonu ve elektrofizyolojik özellikleri. (A) NeuN ve Map2 ekspresyonunu gösteren hACtx dokusunun temsili konfokal görüntüleri. (B-I) 2 haftalık hACtx dokusunda kaydedilen kortikal nöronların örnekleri. (B,F) Kaydedilen nöronun biyositin etiketlemesi (kırmızı), nükleer boyama (Ho: Hoechst, mavi) ile birlikte, birleştirilmiş bir panele dahil edilmiştir. Ölçek çubukları = 20 μm. (C-E) tek veya (G-I) çoklu AP'lere sahip bir hücrenin örneklerini gösteren tüm hücre yama kelepçeli kayıt izleri. AP'ler ya (C, G) 250 pA'lık bir adım ya da (D, H) RMP'de 0 ila 300 pA rampalı akım enjeksiyonu ile indüklendi. Girintiler, her durumda AP'lerden birinin büyütülmüş bir görünümünü gösterir. (E,I) Her iki hücre örneğinde de iç sodyum ve dışa doğru potasyum akımları, voltaj kelepçesi modunda 10 mV'luk artışlarla -70 mV'den uygulanan voltaj depolarizasyon adımlarında gözlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: hACtx dokusundaki mikroglia popülasyonunun karakterizasyonu. Kültürde (A) 24 saat ve (B) 2 hafta sonra Iba1 ve Tmem119 ekspresyonunu gösteren hACtx dokusunun konfokal görüntüleri. Nükleer boyama (Ho: Hoechst, mavi) bireysel ve birleştirilmiş panellere dahil edilmiştir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Beyaz oklar kolokalizasyonu gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: GFP-lt-NES hücrelerinin ex vivo transplantasyonundan 4 hafta sonra lt-NES hücre kaynaklı nöronların genel bakışı ve elektrofizyolojik özellikleri. (A) Deneysel tasarım. Diff = farklılaşma. (B,C) (B) iyi korunmuş ve (C) kötü korunmuş hACtx dokusundaki aşılanmış GFP-lt-NES hücrelerinin temsili konfokal resimleri. Ölçek çubukları = 50 μm. (D) Kendiliğinden ateşlenen greft kaynaklı bir nöronun örnek izi. İç kısım, AP'lerden birinin büyütülmüş bir görünümünü gösterir. Tekrarlayan AP'ler, -70 mV potansiyelinden depolarizan akımın (E) adımı (50 pA) veya (F) ramped (0 ila 300 pA) enjeksiyonu ile indüklenebilir. (G) İçe doğru sodyum ve dışa doğru potasyum akımları, -70 mV'luk bir tutma potansiyelinden voltaj-kelepçe modunda 10 mV depolarize edici adımlarla indüklendi. (H) Voltaj kelepçesi modunda, greft kaynaklı nöronlarda -70 mV'luk bir tutma potansiyelinde kendiliğinden postsinaptik akımlar (sPSC'ler) gözlenebilir. Girintiler, bazı sPSC'lerin büyütülmüş bir görünümünü gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yeterince yüksek kalitede hACtx dilimleri elde etmek, bu protokoldeki en kritik adımdır. Rezeksiyon cerrahisi uygulanan epileptik hastalardan kortikal doku elde edilir24. Rezeke edilen dokunun kalitesi ve rezeksiyon ile kültür arasındaki dokunun maruz kalma süresi kritiktir; doku ameliyathaneden laboratuvara ne kadar hızlı aktarılır ve kesilirse, organotipik kültür o kadar optimal olur. İdeal olarak, doku kesilmeli ve toplandıktan sonraki ilk birkaç saat içinde hücre kültürü laboratuvarına aktarılmalıdır. Bu işlem sırasında dokunun oksijenlenmesi de dilimlerin kalitesini arttırır. Bu bağlamda, doku örneği ne kadar büyük olursa, çekirdeğe ulaşan oksijen konsantrasyonu o kadar düşük olur ve bu nedenle, doku zamanında kesilmezse canlılık o kadar düşük olur. Konakçı dokunun kalitesi optimal değilse, kök hücre tedavilerinin validasyonu mümkün olmayacaktır.
Kortikal doku insan beyninden bir plakaya aktarıldığında, bazı sınırlamalar dikkate alınmalıdır. Kesme işlemi sırasında, çok sayıda akson diseke edilir ve mikroglia aktivasyonu25 gibi enflamatuar süreçlere yol açacak nöronal hasara neden olur. Bu nedenle, doku insan beyninde bulunduğunda sağlıklı kabul edilse bile, rezeksiyon sırasında meydana gelen kısmi hasar ve organotipik bölümlerin hazırlanması nedeniyle kültürdeki hücre davranışı farklı olabilir26,27. Mikroglia popülasyonundaki değişiklikler, salınan sitokin seviyelerinin ölçülmesi veya morfolojik değişikliklerin değerlendirilmesi de dahil olmak üzere farklı teknikler kullanılarak izlenebilir28. Önemli olarak, mikroglia aktivasyonu, bütün bir organdan ex vivo kültür koşullarına ortamdaki değişimin bir sonucu olarak kültürde 2 haftada gözlenmesine rağmen, nöronal boyama ve elektrofizyolojik özelliklerinin analizi ile gösterildiği gibi, nöronlar bu zaman noktasında hala yaşayabilirdi. Daha kalın doku dilimleri daha iyi korunur; Bununla birlikte, besinlerin dilimin iç kısmına nüfuz etmesi etkilenir ve kısmi doku ölümüne neden olur. Bu nedenle, 300 μm organotipik kültür için en uygun kalınlıktır.
hACtx dokusunun organotipik kültürleri, organoidler veya sferoidler gibi diğer 3D kültür yöntemlerine kıyasla açık avantajlara sahiptir. Kaynak tamamen gelişmiş bir insan beynidir, yani hücresel ve matris ortamının yanı sıra farklı hücre popülasyonlarının olgunlaşma durumu, genellikle yetişkin insan beyninde bulunanlarla aynıdır25,29,30. Organoidler, gelişimsel bozuklukların modellenmesi gibi bazı araştırma alanları için en uygun olan fetal dokulara daha benzerdir31, ancak örneğin, esas olarak yetişkin popülasyonu etkileyen ve geç başlangıçlı nörodejeneratif hastalıkların incelenmesi için değildir32,33. En önemlisi, insan dokusunun organotipik kültürü, bugüne kadar, hücre tedavilerinin doğrulanmasına izin veren tek insan sistemidir.
Nörodejeneratif bozukluklarda nöronal replasman için kök hücre nakli hakkındaki bilgilerin çoğu in vivo hayvan modellemesinden kaynaklanmaktadır. Bu sistemler, hasarlı konakçı devresindeki nakledilen hücrelerin modülatör etkisini değerlendirmek için son derece değerli olsa da, ne yazık ki, bu kurulumda test edilen tedaviler, kemirgenler ve insanlar arasındaki açık farklılıklar nedeniyle kliniğe çevrildiğinde normalde başarısız olmaktadır34. Bu nedenle, hACtx dokusunun organotipik kültürü, insan sinir popülasyonları arasındaki etkileşimleri ve insan beyin yapısının korunmasını inceleme olasılığı nedeniyle korteksi etkileyen insan nörodejeneratif hastalıklarını modellemek için mükemmel bir stratejidir25.
Özetle, yetişkin insan korteksinin uzun süreli organotipik kültürlerinin bu kombine metodolojisi ve indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kortikal progenitörlerin ex vivo intrakortikal transplantasyonu, hasarlı beyinde fonksiyonel iyileşmeyi uyarmak için nöronal replasman stratejilerinin klinik çevirisini kolaylaştırabilecek kök hücre bazlı tedavilerin doğrulanması için umut verici bir stratejidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, İsveç Araştırma Konseyi, İsveç Beyin Vakfı, İsveç İnme Vakfı, Bölge Skåne, Thorsten ve Elsa Segerfalk Vakfı ve İsveç Hükümeti Stratejik Araştırma Alanları Girişimi (StemTherapy) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Cutting and electrophysiology | |||
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
| Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
| Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2x91 | |
| Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
| Plastic Petri dish | Any suitable | ||
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
| Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| RINSING SOLUTION | |||
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
| Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| Forceps | Any suitable | ||
| Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
| GENERATION OF lt-NES cells | |||
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
| Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
| Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
| Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
| Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
| Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
| Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
| T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
| Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
| Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
| Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
| Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
| Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
| Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
| Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
| Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
| Paint brush | Any suitable | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
| Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
| Distilled water | |||
| Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
| Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
| Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
| Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium citrate | |||
| Distilled water | |||
| Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
| Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
| Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
References
- Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).
- Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work. Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).
- Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).
- Tornero, D., et al. Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli. Brain. 140 (3), 692-706 (2017).
- Palma-Tortosa, S., et al. Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).
- Robinson, N. B., et al. The current state of animal models in research: A review. International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Delavaran, H., et al. Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke. European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).
- Sabuncu, M. R., et al. The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease. Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).
- Eugene, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
- Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
- Kalmbach, B. E., et al. Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons. Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).
- Barth, M., et al. Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54 (2021).
- Almeida, G. M., et al. Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response. Frontiers in Neuroscience. 15, 674576 (2021).
- Schwarz, N., et al. Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures. Scientific Reports. 7, 12249 (2017).
- Miskinyte, G., et al. Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 207 (2017).
- Gronning Hansen, M., et al. Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry. Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).
- Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS One. 7 (1), 29597 (2012).
- Avaliani, N., et al. Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors. Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).
- Engel, J., et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).
- Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).
- Verwer, R. W., et al. Injury response of resected human brain tissue in vitro. Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).
- Verwer, R. W., et al. Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue. Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).
- Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Schwarz, N., et al. Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease. Elife. 8, 48417 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Wang, Z., et al. Organoid technology for brain and therapeutics research. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).
- Wang, H. Modeling neurological diseases with human brain organoids. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).
- Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).
