Summary
Ce protocole décrit des cultures organotypiques à long terme du cortex humain adulte combinées à la transplantation intracorticale ex vivo de progéniteurs corticaux induits dérivés de cellules souches pluripotentes, qui présentent une nouvelle méthodologie pour tester davantage les thérapies à base de cellules souches pour les troubles neurodégénératifs humains.
Abstract
Les troubles neurodégénératifs sont courants et hétérogènes en termes de symptômes et d’affectation cellulaire, ce qui rend leur étude compliquée en raison du manque de modèles animaux appropriés qui imitent pleinement les maladies humaines et de la faible disponibilité du tissu cérébral humain post-mortem. La culture de tissus nerveux humains adultes offre la possibilité d’étudier différents aspects des troubles neurologiques. Les mécanismes moléculaires, cellulaires et biochimiques pourraient être facilement abordés dans ce système, ainsi que tester et valider des médicaments ou différents traitements, tels que les thérapies cellulaires. Cette méthode combine des cultures organotypiques à long terme du cortex humain adulte, obtenues à partir de patients épileptiques subissant une chirurgie résécante, et la transplantation intracorticale ex vivo de progéniteurs corticaux induits dérivés de cellules souches pluripotentes. Cette méthode permettra d’étudier la survie cellulaire, la différenciation neuronale, la formation d’entrées et de sorties synaptiques et les propriétés électrophysiologiques de cellules d’origine humaine après transplantation dans un tissu cortical humain adulte intact. Cette approche est une étape importante avant le développement d’une plateforme 3D de modélisation des maladies humaines qui rapprochera la recherche fondamentale de la traduction clinique des thérapies à base de cellules souches pour les patients atteints de différents troubles neurologiques et permettra le développement de nouveaux outils pour reconstruire les circuits neuronaux endommagés.
Introduction
Les troubles neurodégénératifs, tels que la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer ou l’accident vasculaire cérébral ischémique, sont un groupe de maladies qui partagent la caractéristique commune d’un dysfonctionnement neuronal ou de la mort. Ils sont hétérogènes en termes de zone cérébrale et de population neuronale affectée. Malheureusement, les traitements pour ces maladies sont rares ou d’une efficacité limitée en raison du manque de modèles animaux qui imitent ce qui se passe dans le cerveau humain 1,2. La thérapie par cellules souches est l’une des stratégies les plus prometteuses pour la régénération du cerveau3. La génération de progéniteurs neuronaux à partir de cellules souches provenant de différentes sources a été grandement développée ces dernières années 4,5. Des publications récentes ont montré que les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPS) à long terme auto-renouvelées neuroépithéliales (lt-NES), suivant un protocole de différenciation corticale et après transplantation intracorticale dans un modèle de rat avec accident vasculaire cérébral ischémique affectant le cortex somatosensoriel, génèrent des neurones corticaux matures. De plus, les neurones issus de greffes ont reçu des connexions synaptiques afférentes et efférentes des neurones hôtes, montrant leur intégration dans le réseau neuronal du rat 6,7. Les axones dérivés de la greffe ont été myélinisés et trouvés dans différentes zones du cerveau du rat, y compris la zone péri-infarctus, le corps calleux et le cortex somatosensoriel controlatéral. Plus important encore, la transplantation dérivée de cellules iPS a inversé les déficits moteurs chez les animaux victimes d’un AVC7.
Même si les modèles animaux permettent d’étudier la survie à la transplantation, l’intégration neuronale et l’effet des cellules greffées sur les fonctions motrices et cognitives, les informations sur l’interaction entre cellules humaines (greffon-hôte) font défaut dansce système8,9. Pour cette raison, une méthode combinée de culture organotypique du cerveau humain à long terme avec la transplantation ex vivo de progéniteurs neuronaux humains dérivés de cellules iPS est décrite ici. Les cultures organotypiques du cerveau humain obtenues à partir de résections neurochirurgicales sont des modèles 3D physiologiquement pertinents du cerveau qui permettent aux chercheurs d’améliorer leur compréhension des circuits du système nerveux central humain et de la façon la plus précise de tester les traitements pour les troubles cérébraux humains. Cependant, pas assez de recherches ont été faites dans ce contexte, et dans la plupart des cas, les cultures organotypiques du cerveau de l’hippocampe humain ont été utilisées10,11. Le cortex cérébral est affecté par plusieurs troubles neurodégénératifs, tels que l’AVC ischémique12 ou la maladie d’Alzheimer13, il est donc important d’avoir un système 3D cortical humain qui nous permet d’élargir nos connaissances et de tester et valider différentes stratégies thérapeutiques. Au cours des dernières années, plusieurs études ont utilisé des cultures de tissus corticaux humains adultes (hACtx) pour modéliser les maladies du cerveau humain 14,15,16,17,18,19; Cependant, les informations disponibles dans le contexte de la thérapie par cellules souches sont limitées. Deux études ont déjà démontré la faisabilité du système décrit ici. En 2018, il a été démontré que des cellules souches embryonnaires humaines programmées avec différents facteurs de transcription et transplantées dans du tissu hACtx donnaient naissance à des neurones corticaux matures capables de s’intégrer dans les réseaux corticaux humains adultes20. En 2020, la transplantation de cellules lt-NES dans le système organotypique humain a révélé leur capacité à se différencier en neurones corticaux matures et spécifiques à une couche présentant les propriétés électrophysiologiques des neurones fonctionnels. Les neurones greffés ont établi des contacts synaptiques afférents et efférents avec les neurones corticaux humains dans les tranches de cerveau adultes, comme corroboré par le traçage monosynaptique rétrograde du virus de la rage, les enregistrements de patch-clamp à cellules entières et la microscopie immunoélectronique21.
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Protocol
Ce protocole suit les lignes directrices approuvées par le Comité régional d’éthique de Lund, Suède (numéro de permis éthique 2021-07006-01). Le tissu néocortical sain a été obtenu chez des patients subissant une chirurgie élective pour l’épilepsie du lobe temporal. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients.
NOTE: Tous les tissus obtenus ont été traités quelle que soit leur taille. Cependant, les tissus d’une taille inférieure à 1-1,5 mm3 seront techniquement difficiles à manipuler et à sectionner avec un vibratome.
1. Collecte, entretien, coupe et placage de tissus
- Préparations la veille du tranchage des tissus
- Préparer 2 L de solution de coupe (tableau 1) dans une fiole jaugée. Dissoudre tous les ingrédients sauf MgCl 2 et CaCl2 dans ~1 800 mL d’eau désionisée et faire des bulles avec du gaz carbogen pendant 15 min. Ajouter ensuite les quantités appropriées de solutions de 1 M MgCl 2 et CaCl2 et continuer à bouillonner pendant encore 15 minutes. Enfin, remplir la fiole jusqu’au repère de 2 L; vérifier le pH et l’osmolarité et ajuster si nécessaire. Congeler 2 x 350 mL de la solution préparée et conserver le reste à 4 °C.
REMARQUE: Le pH et l’osmolarité sont généralement de 7,3-7,4 et 295-300 mOsm, respectivement. - Préparer 100 mL de solution de rinçage (tableau 2). Dissoudre 476 mg de HEPES et 200,6 mg de glucose dans 100 mL de HBSS complété par 5 mL de pénicilline / streptomycine. Celui-ci peut être conservé à 4 °C jusqu’à 10 jours.
- Préparer le milieu de culture corticale chez l’adulte humain (hACtx) (milieu hACtx) (tableau 3) et le filtrer dans le laboratoire de culture cellulaire sous une hotte ventilée. Le milieu comprend un milieu neuronal sans rouge de phénol (voir le tableau des matériaux), un supplément de vitamine B27, de la L-glutamine (voir le tableau des matériaux) et de la gentamicine. Conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- Préparer 2 L de solution de coupe (tableau 1) dans une fiole jaugée. Dissoudre tous les ingrédients sauf MgCl 2 et CaCl2 dans ~1 800 mL d’eau désionisée et faire des bulles avec du gaz carbogen pendant 15 min. Ajouter ensuite les quantités appropriées de solutions de 1 M MgCl 2 et CaCl2 et continuer à bouillonner pendant encore 15 minutes. Enfin, remplir la fiole jusqu’au repère de 2 L; vérifier le pH et l’osmolarité et ajuster si nécessaire. Congeler 2 x 350 mL de la solution préparée et conserver le reste à 4 °C.
- Préparations le jour de l’opération avant l’arrivée des échantillons de tissus
- Vérifiez la disponibilité de l’équipement et de l’espace de laboratoire nécessaires, et nettoyez soigneusement tous les outils chirurgicaux et le vibratome (voir le tableau des matériaux), ainsi que l’espace de paillasse, avec de l’eau distillée (sans détergent), suivie d’éthanol à 70%. Laissez sécher l’éthanol pendant au moins 30 minutes avant d’utiliser les outils et l’équipement.
- Écraser la solution de coupe congelée et faire bouillonner la « soupe » de glace et de liquide avec du gaz carbogen pendant 30 min. Ensuite, fermez hermétiquement l’un des contenants avec la solution broyée ''soupe'' et placez-le dans la glacière. Cela sera utilisé pour prélever les tissus de la salle d’opération.
- Calibrez le vibratome et réglez les paramètres de coupe : vitesse de 0,05 mm/s et vibration de 1,7 mm. Placez la chambre de coupe sur un étage de vibratome et démarrez le refroidisseur qui y est connecté de manière à ce que la chambre soit à une température constante de −3 °C.
- Préparez la chambre de collecte des tranches avec des inserts pour placer les tranches de tissu et la solution de coupe, en la faisant bouillonner constamment avec du gaz carbogen à température ambiante (RT).
- Dans le laboratoire de culture cellulaire et sous une hotte ventilée, placez les inserts de culture dans une plaque à 6 puits à l’aide d’une pince. Ajouter 5 mL de milieu hACtx au bas de l’insert jusqu’à ce qu’il entre en contact avec la membrane, en évitant la formation de bulles, et ajouter 2 mL sur le dessus de l’insert. Équilibrer dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO 2 pendant au moins2 h avant de transférer les tranches de tissu dans les inserts.
- Procédures de collecte et de tranchage des tissus
- Immédiatement après la résection, prélever le tissu du patient dans la salle d’opération, si possible, directement dans un récipient avec une solution de coupe congelée, bouillonnée et écrasée. Transférez immédiatement le contenant fermé sur de la glace dans la zone de coupe du laboratoire.
- Inspectez le tissu et localisez la meilleure surface pour le coller (voir étape 1.3.3) jusqu’au stade de coupe du vibratome, en tenant compte de l’orientation des couches corticales. Si nécessaire, coupez la surface inégale avec un scalpel afin qu’il soit facile de placer le tissu sur la scène pour une orientation optimale de la tranche.
- Collez le tissu à la scène avec de l’adhésif pour tissu (voir le tableau des matériaux), placez-le dans la chambre de tranchage et remplissez immédiatement la chambre avec une solution de coupe à bulles. Continuez le barbotage pendant toute la procédure de coupe.
- Couper les tranches coronales ou sagittales, selon l’orientation tissu-lame, à une épaisseur de 300 μm pour contenir toutes les couches corticales et, si possible, la substance blanche. Placez les tranches dans la chambre de collecte avec une solution de coupe bouillonnante à TA.
REMARQUE: Couper du côté de la substance blanche vers la surface du cortex. Ne retirez pas les méninges, car cela pourrait endommager les tissus. La lame de coupe les tranche généralement facilement. - Une fois que tout le tissu a été coupé, transférer les tranches dans une boîte de Petri stérile avec une solution de rinçage à TA et les transporter au laboratoire de culture cellulaire. Cette étape est nécessaire pour éliminer l’excès de saccharose des tranches avant de les transférer sur la plaque de culture.
REMARQUE: Pour transférer les tranches (dans cette étape et les suivantes), utilisez une pipette en verre inversé, cassez la partie la plus mince et placez une tétine en caoutchouc pour l’aspiration.
- Culture et entretien de tranches de tissu hACtx
- Placez individuellement les tranches de tissu sur les inserts déjà humides et immergés. Après 24 heures, changer le milieu pour éliminer davantage le saccharose ou d’autres substances résiduelles des procédures de coupe.
- Remplacer le milieu de culture par un milieu frais tous les 7 jours. Après 2 semaines, utilisez le milieu hACtx sans gentamicine. La culture peut être maintenue jusqu’à 2 mois.
NOTE: Équilibrer le milieu hACtx dans l’incubateur à 37 °C et 5% CO 2 pendant au moins2 h avant le changement de milieu. Le milieu frais doit être préparé toutes les 2 semaines. Vérifiez les tranches tous les 2-3 jours et, si une partie du milieu s’est évaporée, ajoutez-en plus dans le haut de l’insert.
| Solution de coupe | Concentration des stocks | Concentration finale [mM] | Pour 1 L |
| Saccharose | Poudre | 200 | 68,46 g |
| NaHCO3 | Poudre | 21 | 1,76 g |
| Kcl | Poudre | 3 | 0,22 g |
| NaH2PO4 | Poudre | 1.25 | 0,17 g |
| Glucose | Poudre | 10 | 1,80 g |
| MgSO4 | 1 M | 2 | 2 mL |
| CaCl2 | 1 M | 1.6 | 1,6 mL |
| MgCl2 | 2 M | 2 | 1 mL |
Tableau 1 : Composition de la solution de coupe. MgCl 2 et CaCl2 sont utilisés comme solutions 1 M prépréparées dans l’eau désionisée.
| Solution de rinçage | Concentration des stocks | Concentration finale | Par 100 mL |
| HBSS | 1x | 95 mL | |
| PenStrep | 10 000 U/ml | 500 U/ml | 5 mL |
| HEPES | Poudre | 4,76 g/L | 476 mg |
| Glucose | Poudre | 2 g/L | 200,6 mg |
Tableau 2: Composition de la solution de rinçage.
| hACtx moyen | Concentration des stocks | Concentration finale | Par 100 mL | |
| Milieu neuronal sans rouge de phénol | 97,4 mL | voir le tableau des matières | ||
| B27 | 50x | 1:50 | 2 mL | |
| L-Glutamine | 100x | 1:200 | 500 μL | voir le tableau des matières |
| Gentamicine | 50 mg/mL | 1:1000 | 100 μL |
Tableau 3 : Composition du milieu hACtx.
2. Prolifération et différenciation des cellules lt-NES
NOTE: Les cellules Lt-NES sont générées comme décrit précédemment21,22 et transduites avec un vecteur lentiviral portant la protéine fluorescente verte (GFP) sous un promoteur constitutif (cellules GFP-lt-NES). Les flacons contenant 3 x 106 cellules sont conservés à −150 °C jusqu’à utilisation.
- Préparation des solutions de stock et des supports
- Diluer 100 μg de facteur de croissance des fibroblastes basiques (FGFb) dans 10 mL de PBS-0,1% BSA pour obtenir une concentration mère de 10 μg/mL. Préparer des aliquotes de 100 μL.
- Diluer 100 μg de facteur de croissance épidermique (EGF) dans 10 mL de PBS-0,1% BSA pour obtenir une concentration mère de 10 μg/mL. Préparer des aliquotes de 100 μL.
- Aliquote 50x B27 supplément dans un volume de 100 μL par aliquote.
- Diluer 10 mg de poly-L-ornithine dans 100 mL d’eau désionisée pour obtenir une concentration stock-mère de 100 μg/mL. Faire 1 mL d’aliquotes.
- Préparer 30 μL d’aliquotes de 1,20 mg/mL de laminine de souris.
- Diluer 10 mL de trypsine-EDTA (0,25 %) dans 90 mL de PBS jusqu’à une concentration mère de 0,025 %. Préparer 1 mL d’aliquotes.
- Diluer 0,025 g d’inhibiteur de la trypsine dans 50 mL de PBS à une concentration mère de 0,5 mg/mL. Préparer 1 mL d’aliquotes.
- Diluer 10 μg de Wnt3a (membre 3A du site d’intégration MMTV de type sans ailes) dans 1 mL de PBS-0,1 % de BSA pour obtenir une concentration stock-mère de 10 μg/mL. Préparer BMP4 (bone morphogenetic protein 4) de la même manière. Aliquote dans un volume de 100 μL.
- Diluer 1 mg de cyclopamine dans 2,5 mL de DMSO jusqu’à une concentration finale de 400 μg/mL et obtenir 100 μL d’aliquotes.
- Préparer le milieu basique (tableau 4) et le milieu défini par la différenciation (DDM, tableau 5) et conserver à 4 °C pendant 2 semaines au maximum.
- Enrobage de plats de culture
- Pour pré-enduire les plats de culture des cellules GFP-It-NES pendant la prolifération ou la différenciation, diluer la poly-L-ornithine 1:100 dans de l’eau désionisée et ajouter 5 mL de la solution dans une fiole T25. Incuber pendant la nuit chez RT.
- Laver les plaques revêtues de poly-L-ornithine 1x avec de l’eau désionisée et 1x avec du PBS.
- Pour les cellules GFP-It-NES en prolifération, diluer la laminine de souris à 1:500 dans du PBS et incuber pendant au moins 2 h à 37 °C. Pour les cellules GFP-It-NES en différenciation, diluer la laminine de souris à 1:100 dans du PBS et incuber pendant au moins 2 h à 37 °C.
- Prolifération des cellules GFP-lt-NES
- Réchauffer 5 mL (pour le lavage) et 5 mL (pour l’ensemencement) de milieu basique dans deux tubes différents de 15 mL.
- Décongeler rapidement un flacon de cellules GFP-lt-NES à 37 °C, les transférer dans le tube de lavage et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
- Aspirer le milieu avec précaution sans toucher la pastille et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu basique préchauffé. Transférer la suspension cellulaire dans le tube d’ensemencement contenant le milieu basique complété par des facteurs de prolifération : EGF (10 ng/mL), FGFb (10 ng/mL) et B27 (10 ng/mL). Ensemencer les cellules dans une fiole T25 enrobée de poly-L-ornithine/laminine.
- Nourrissez les cellules avec des facteurs de prolifération tous les jours. Remplacez le milieu s’il devient jaune. Passez les cellules tous les trois ou quatre jours (1 jour après qu’elles atteignent 100% de confluence).
- Fractionnement des cellules GFP-lt-NES pour la prolifération et la différenciation
- Préchauffer 5 mL de milieu basique par fiole (pour recueillir les cellules), plus le volume total nécessaire pour les réensemencer.
NOTE: Le passage est effectué à une dilution de 1:3 pour maintenir les cellules en prolifération, nécessitant 15 mL de milieu basique, et une dilution de 1:6 pour commencer la différenciation, nécessitant 30 mL de milieu basique. - Retirer le milieu du ballon de culture cellulaire par aspiration et ajouter 500 μL de trypsine préchauffée à 0,025 %. Incuber pendant 5-10 min à TA. Le détachement des cellules peut être confirmé au microscope optique standard à un grossissement de 10x.
- Ajouter un volume égal d’inhibiteur de la trypsine (concentration finale de 0,5 mg/mL) suivi de 5 mL de milieu basique chaud. Détachez et recueillez les cellules en les pipetant doucement de haut en bas. Transférer les cellules dans un tube de 15 mL et centrifuger pendant 5 min à 300 x g.
- Pour maintenir les cellules en prolifération, replaquer à une dilution de 1:3 dans un milieu basique frais complété par des facteurs de prolifération, et répéter l’étape 2.3.4.
- Préchauffer 5 mL de milieu basique par fiole (pour recueillir les cellules), plus le volume total nécessaire pour les réensemencer.
- Différenciation corticale des cellules GFP-lt-NES
- Au jour 0, remettre les cellules en suspension (à utiliser pour la différenciation) dans 30 mL de milieu basique additionné de facteurs de prolifération, et les plaquer dans six flacons T25 enrobés de différenciation (fractionnés 1:6).
- Le jour 1, changer la moitié du milieu en DDM et ajouter des facteurs de prolifération à la moitié de leur concentration.
- Le jour 2, changer complètement le milieu en DDM complété par des facteurs de différenciation: BMP4 (10 ng / mL), Wnt3a (10 ng / mL) et cyclopamine (400 ng / mL).
- Le jour 4, ajoutez uniquement les facteurs de différenciation. Remplacez le milieu s’il devient jaune.
- Le jour 6, changez le milieu en DDM complété par BMP4 et Wnt3a. La cyclopamine est retirée à cette étape.
- Le jour 7, détachez les cellules comme indiqué aux étapes 2.4.2 et 2.4.3.
| Support de base | Concentration des stocks | Concentration finale | Par 100 mL |
| DMEM/F12 avec L-glutamine | 1x | 98,7 mL | |
| Supplément N-2 | 100x | 1:100 | 1 mL |
| Glucose | 45% | 3,5 mL/L | 350 μL |
Tableau 4 : Composition du milieu de prolifération des cellules lt-NES (milieu basique).
| Milieu DDM | Concentration des stocks | Concentration finale | Par 100 mL |
| DMEM/F12 avec L-glutamine | 96 mL | ||
| N2 | 100 x | 1:100 | 1 mL |
| L’AENA | 100 x | 1:100 | 1 mL |
| Sodium Pyruvate | 100 mM | 1:100 | 1 mL |
| BSA V Fraction | 7.5% | 6,6 mL/L | 660 μL |
| 2-mercaptoéthanol | 50 nM | 7 μL/L | 0,7 μL |
| Glucose | 45% | 3,2 mL/L | 320 μL |
Tableau 5 : Composition du milieu défini par différenciation (DDM) des cellules lt-NES.
3. Transplantation des cellules GFP-lt-NES en tranches organotypiques hACtx
REMARQUE: Le tissu hACtx doit être cultivé pendant 1 semaine avant la greffe de cellule. Pour faciliter la procédure de transplantation, il est nécessaire de retirer 2 mL du milieu hACtx du haut de l’insert pour empêcher le tissu de flotter.
- Resuspendre les cellules GFP-lt-NES amorcées corticalement (à partir de l’étape 2.5.6) dans une matrice membranaire basale pure et froide (voir le tableau des matériaux) à une concentration de 1 x 105 cellules/μL et transférer la solution dans un tube stérile plus petit.
REMARQUE: Pendant la procédure de transplantation, tous les matériaux (embouts de pipettes, tubes, capillaires, etc.) doivent être pré-refroidis pour éviter la solidification du gel. Décongeler le gel de matrice membranaire basale sur de la glace pendant 30 minutes avant son utilisation. - Recueillir la suspension cellulaire dans un capillaire en verre froid relié à une tétine en caoutchouc pour l’aspiration. Injectez la suspension cellulaire sous forme de petites gouttes (environ 1 μL chacune) en poignardant la tranche de tissu semi-sèche à différents endroits.
- Incuber à 37 °C pendant 30 min pour que le gel se solidifie. Transférez la plaque de l’incubateur à la hotte et ajoutez soigneusement 2 ml de milieu hACtx sur le dessus de l’insert pour immerger complètement le tissu.
- Remplacer le milieu de culture par un milieu hACtx frais une fois par semaine.
4. Validation
- Coloration des tranches hACtx
- Au moment souhaité, sortez les tranches du laboratoire de culture cellulaire et retirez-les de l’insert en l’immergeant dans une boîte de Petri avec du PBS. Ensuite, transférer les tranches dans des flacons de coloration à l’aide d’une pipette en verre inversé (voir le NOTA à l’étape 1.3.5) et les fixer avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant une nuit à 4 °C.
- Rincer 3x avec KPBS pendant 15 min à chaque fois, et incuber toute la nuit à 4 °C avec une solution de perméabilisation (0,02% BSA et 1% Triton X-100 dans KPBS).
- Le lendemain, ajouter une solution de blocage (KPBS avec 0,2% de Triton X-100, 1% de BSA, azoture de sodium [1:10 000] et 10% de sérum d’âne normal) et incuber toute la nuit à 4 °C.
- Après blocage, ajouter les anticorps primaires (voir tableau 6 pour les dilutions) dilués dans la solution de blocage et incuber pendant 48 h à 4 °C.
- Laver 3x avec une solution bloquante sans ajouter de sérum pendant 15 min chacun. Ajouter les anticorps secondaires dilués dans une solution de blocage (voir tableau 6 pour les dilutions) et incuber pendant 48 h à 4 °C.
- Laver 3x avec une solution bloquante sans sérum, et incuber pendant 2 h à TA dans une coloration Hoechst diluée dans une solution de perméabilisation (1:1 000).
- Lavez 3x avec KPBS, montez les tranches sur des lames de verre à l’aide d’un pinceau et laissez-les sécher. Enfin, rincez les lames avec de l’eau désionisée, enlevez l’excès d’eau, ajoutez le support de montage et recouvrez avec un couvercle en verre. Conserver les lames pendant au moins 24 h à TA et les conserver à 4 °C jusqu’à l’imagerie.
NOTE: Pour les anticorps marquant les épitopes nucléaires, effectuer le prélèvement d’antigène avant la perméabilisation (étape 4.1.2) avec du citrate de sodium (10 mM, pH 6,0) pendant 2 h à 65 °C.
- Pince patch-clamp à cellules entières
- Le jour de l’enregistrement, préparer 1 L de liquide céphalorachidien artificiel humain (haCSF), modifié pour mieux correspondre à l’environnement cérébral humain (tableau 7). Comme pour la solution de coupe, faire environ 900 mL de la solution avec tous les ingrédients sauf CaCl 2 dissous dans de l’eau désionisée, et faire des bulles avec du carbogène pendant 15 minutes avant d’ajouter le volume approprié de solution de CaCl2 1 M. Remplir la fiole jaugée jusqu’à la marque 1 L et continuer à bouillonner à TA pendant 15 minutes supplémentaires avant de commencer l’enregistrement et tout au long de l’expérience.
- Transférer les tranches de tissu de la plaque de culture à la chambre d’enregistrement sur la scène d’un microscope droit qui est constamment perfusé avec du haCSF à bulles à un taux de perfusion de 2 mL/min et chauffé à 34 °C à l’aide d’un régulateur de température de bain.
- Tirer les capillaires en verre avec un extracteur de pipette à une résistance moyenne de 3-5 MΩ, et remplir les capillaires avec une solution interne à base de K-gluconate (tableau 8) avec un 2-4 mg de biocytine fraîchement ajouté pour l’identification post-hoc des cellules enregistrées. Le pH et l’osmolarité de cette solution interne sont respectivement de 7,2-7,3 et 285-295 mOsm.
- Dans le cas de l’enregistrement de la cellule hôte, obtenez une vue d’ensemble approximative de la tranche avec un objectif 4x et trouvez une cellule d’apparence saine à patcher avec un objectif 40x. Ensuite, procédez avec la pince patch à cellules entières standard.
- Dans le cas de l’enregistrement des cellules greffées, identifier la zone tissulaire avec les cellules greffées à l’aide d’un objectif 4x et d’un filtre d’épifluorescence dans la gamme bleue (460 nm) par expression de rapporteur GFP dans la greffe. Ensuite, zoomez sur la zone située avec un objectif 40x et trouvez une cellule greffée exprimant la GFP pour une pince patch standard à cellules entières.
- Vérifiez le potentiel de membrane au repos (RMP) immédiatement après avoir pénétré dans la cellule et assurez-vous que la qualité de l’enregistrement est bonne. Enregistrer tous les paramètres d’intérêt (p. ex., résistance de la membrane [Ri], paramètres AP, courants de sodium et de potassium et activité synaptique) dans la configuration tension ou pince de courant de la cellule entière.
- Après avoir recueilli toutes les données nécessaires, rétractez soigneusement la pipette d’enregistrement sans endommager davantage la cellule afin qu’elle puisse être identifiée par immunomarquage post-hoc.
- Transférer la tranche dans la solution de PFA à 4 % pour une fixation et une coloration ultérieures, comme décrit à l’étape 4.1. La streptavidine est utilisée pour immunomarquer les cellules remplies de biocytine pendant les enregistrements.
| ANTICORPS | Dilution | Notes |
| Primaire | ||
| Poulet anti-GFP | 1:1000 | |
| Poulet anti-MAP2 | 1:1000 | |
| Chèvre anti-AiF1 | 1:100 | |
| Souris anti-MBP | 1:1000 | Récupération d’antigène nécessaire |
| Souris anti-SC123 | 1:2000 | |
| Lapin anti-NeuN | 1:1000 | |
| Lapin anti-Olig2 | 1:500 | |
| Lapin anti-Tmem119 | 1:200 | |
| Secondaire | ||
| 488-conjugué AffinityPure Donkey anti-souris IgG | 1:500 | |
| 488-conjugué AffinityPure Donkey anti-lapin IgG | 1:500 | |
| AffinityPure Donkey 488-conjugué IgG anti-poulet | 1:500 | |
| Affinité conjuguée Cy3Pure Donkey Anti-poulet IgG | 1:500 | |
| Cy3-conjugué AffinityPure Donkey anti-chèvre IgG | 1:500 | |
| Cy3-conjugué AffinityPure Donkey anti-souris IgG | 1:500 | |
| Alexa fluor 647-conjugué streptavidine | 1:500 |
Tableau 6 : Liste des anticorps primaires et secondaires pour l’immunohistochimie.
| haCSF | Concentration des stocks | Concentration finale [mM] | Pour 1 L |
| NaCl | Poudre | 129 | 7,54 g |
| NaHCO3 | Poudre | 21 | 1,76 g |
| Glucose | Poudre | 10 | 1,80 g |
| Kcl | Poudre | 3 | 0,22 g |
| NaH2PO4 | Poudre | 1.25 | 0,17 g |
| MgSO4 | 1 M | 2 | 2 mL |
| CaCl2 | 1 M | 1.6 | 1,6 mL |
Tableau 7 : Composition du liquide céphalorachidien artificiel (haCSF).
| Solution interne de K-gluconate | Concentration des stocks | Concentration finale [mM] | Par 100 mL |
| K-gluconate | Poudre | 122.5 | 2,87 g |
| Kcl | Poudre | 12.5 | 93,18 mg |
| NaCl | Poudre | 8 | 46,76 mg |
| HEPES | Poudre | 10 | 238,32 mg |
| MgATP | Poudre | 2 | 101,4 mg |
| Na3GTP | Poudre | 0.3 | 17,0 mg |
| Note: Ajustez le pH avec KOH/HCl | |||
Tableau 8 : Composition de la solution interne à base de K-gluconate.
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Representative Results
Conformément au protocole décrit, le tissu hACtx d’un patient atteint d’épilepsie du lobe temporal a été prélevé et traité, comme expliqué ci-dessus. Quelques tranches ont été fixées après 24 h en culture pour étudier le point de départ du tissu hôte. L’analyse de différentes populations de cellules neurales telles que les neurones (exprimant NeuN et Map2, Figure 1A), les oligodendrocytes (Olig2 et MBP, Figure 1B) et les astrocytes (GFAP spécifique à l’homme, également appelé STEM123, Figure 1C) a montré une préservation optimale du tissu.
L’étape suivante consistait à étudier comment les conditions de culture affectent la viabilité neuronale dans les tissus humains. À cette fin, la coloration de NeuN et Map2 a été réalisée après 2 semaines de culture. Au moment étudié, l’expression de ces deux marqueurs neuronaux était encore présente dans le tissu (Figure 2A). De plus, des enregistrements électrophysiologiques ont été effectués pour évaluer la fonctionnalité. Les enregistrements utilisant une pince patch à cellules entières ont montré que les neurones avaient maintenu une RMP (-70 mV en moyenne) et une résistance à l’entrée membranaire (Ri) (300 MΩ en moyenne), comparables aux neurones des préparations aiguës21,23. Dans l’ensemble, les cellules étaient légèrement moins actives que dans les tissus frais, bien que la majorité des cellules étaient encore capables de tirer au moins un (Figure 2B-E), sinon plusieurs, potentiels d’action (AP, Figure 2F-I), et des courants rapides de sodium vers l’intérieur et de potassium vers l’extérieur étaient présents lors des injections de courant de pas en mode tension-clampage (Figure 2C-E, G-I). Pris ensemble, ces enregistrements ont indiqué que les neurones dans les cultures organotypiques étaient relativement sains et présentaient des propriétés intrinsèques neurophysiologiques typiques.
De plus, l’effet de la culture sur l’activation de la microglie a été évalué par coloration Tmem119 et Iba1 dans des tissus cultivés de 24 h (Figure 3A) et de 2 semaines (Figure 3B). Comme prévu, certains changements dans l’aspect microglial ont été observés. Après 2 semaines en culture, ils sont devenus moins ramifiés et ont acquis une morphologie plus activée par rapport aux tissus aigus.
Après avoir caractérisé le tissu hôte, la transplantation des progéniteurs dérivés des cellules lt-NES a été réalisée comme suit. Les cellules GFP-lt-NES ont été différenciées pendant 7 jours et greffées dans un tissu hACtx cultivé pendant 1 semaine (Figure 4A). Un aperçu de la transplantation a été observé en utilisant l’immunohistochimie avec GFP (Figure 4B,C). Les résultats ont été comparés à ceux de transplantations précédentes dans des tissus mal conservés en raison d’une fenêtre de temps plus longue entre la résection et le placage. Les images montrent que, dans le système optimal, 4 semaines après la transplantation ex vivo, les cellules GFP-lt-NES greffées présentaient des neurites étendus et des arborisations étendues et complexes dans toute la culture organotypique (Figure 4B). Le tissu mal conservé n’a pas permis une transplantation réussie en raison de la mauvaise connectivité de l’hôte. Presque aucune cellule greffée n’a survécu; de plus, des débris et un marquage non spécifique des anticorps sur les cellules mortes ont été largement observés dans toute la tranche humaine (Figure 4C).
En ce qui concerne les propriétés électrophysiologiques des cellules greffées, il a été constaté que, dans le cas d’une transplantation réussie, les cellules devenaient non seulement morphologiquement mais aussi fonctionnellement actives avec des PA répétitifs et souvent spontanés, des courants rapides de sodium vers l’intérieur et de potassium vers l’extérieur lents, et un certain niveau d’activité synaptique, indiquant une intégration fonctionnelle du greffon avec le tissu hôte 4 semaines après la greffe (Figure 4D-H).
Figure 1 : Caractérisation des différentes populations cellulaires dans le tissu hACtx après 24 h en culture. Images confocales représentatives du tissu hACtx montrant la présence (A) de neurones (exprimant NeuN et Map2), (B) d’oligodendrocytes (Olig2 et MBP) et (C) d’astrocytes (GFAP spécifique à l’homme [STEM123]). La coloration nucléaire (Ho: Hoechst, bleu) est incluse dans les panneaux individuels et fusionnés. Barre d’échelle = 20 μm. Les flèches blanches indiquent la colocalisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Caractérisation et propriétés électrophysiologiques des neurones hACtx après 2 semaines en culture organotypique. (A) Images confocales représentatives du tissu hACtx montrant l’expression de NeuN et Map2. (B-I) Exemples de neurones corticaux enregistrés dans le tissu hACtx âgé de 2 semaines. (B,F) Marquage biocytine du neurone enregistré (rouge), ainsi que coloration nucléaire (Ho: Hoechst, bleu), inclus dans un panneau fusionné. Barres d’échelle = 20 μm. Patch-clamp à cellules entières enregistrant des traces montrant des exemples d’une cellule avec (C-E) unique, ou (G-I) plusieurs points d’accès. Les PA ont été induits soit par (C,G) une étape de 250 pA, soit par (D,H) une injection de courant rampé de 0 à 300 pA à RMP. Les encarts indiquent une vue agrandie de l’un des points d’accès dans chaque cas. (E, I) Des courants de sodium et de potassium vers l’intérieur ont été observés dans les deux exemples de cellules aux étapes de dépolarisation de tension appliquées à partir de −70 mV par incréments de 10 mV en mode tension-pince. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Caractérisation de la population microgliale dans le tissu hACtx. Images confocales du tissu hACtx montrant l’expression d’Iba1 et Tmem119 après (A) 24 h et (B) 2 semaines en culture. La coloration nucléaire (Ho: Hoechst, bleu) est incluse dans les panneaux individuels et fusionnés. Barre d’échelle = 20 μm. Les flèches blanches indiquent la colocalisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Vue d’ensemble et propriétés électrophysiologiques des neurones dérivés des cellules lt-NES 4 semaines après la transplantation ex vivo de cellules GFP-lt-NES. (A) Conception expérimentale. Diff = différenciation. (B,C) Images confocales représentatives de cellules GFP-lt-NES greffées dans (B) des tissus hACtx bien conservés et (C) mal conservés. Barres d’échelle = 50 μm. (D) Exemple de trace d’un neurone dérivé d’une greffe déclenchant spontanément des PA. L’encart indique une vue agrandie de l’un des points d’accès. Les PA répétitifs pourraient être induits par une injection de courant dépolarisant à pas (50 pA) ou (F) rampée (0 à 300 pA) à partir du potentiel de −70 mV. (G) Les courants de sodium et de potassium vers l’intérieur ont été induits par des pas de dépolarisation de 10 mV en mode de serrage de tension à partir d’un potentiel de maintien de -70 mV. (H) En mode tension-pince, des courants postsynaptiques spontanés (CSPs) ont pu être observés dans les neurones dérivés du greffon à un potentiel de rétention de −70 mV. Les encarts indiquent une vue agrandie de certains des CSP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’obtention de tranches hACtx de qualité suffisante est l’étape la plus critique de ce protocole. Le tissu cortical est obtenu à partir de patients épileptiques subissant une chirurgie résécante24. La qualité du tissu réséqué, ainsi que le temps d’exposition du tissu entre la résection et la culture, sont critiques; Plus vite le tissu est transféré de la salle d’opération au laboratoire et coupé, plus la culture organotypique sera optimale. Idéalement, le tissu devrait être coupé et transféré au laboratoire de culture cellulaire dans les premières heures suivant le prélèvement. L’oxygénation du tissu au cours de ce processus améliore également la qualité des tranches. À cet égard, plus l’échantillon de tissu est grand, plus la concentration d’oxygène atteignant le noyau est faible et, par conséquent, plus la viabilité est faible si le tissu n’est pas coupé à temps. Si la qualité du tissu hôte n’est pas optimale, la validation des thérapies à base de cellules souches ne sera pas possible.
Lorsque le tissu cortical est transféré du cerveau humain à une plaque, certaines limitations doivent être prises en compte. Au cours du processus de coupe, un grand nombre d’axones sont disséqués, induisant des lésions neuronales qui conduiront à des processus inflammatoires tels que l’activation de la microglie25. Pour cette raison, même si le tissu est considéré comme sain lorsqu’il est situé dans le cerveau humain, le comportement cellulaire en culture pourrait être différent en raison des dommages partiels subis lors de la résection et de la préparation des sections organotypiques26,27. Les changements dans la population microgliale pourraient être surveillés à l’aide de différentes techniques, y compris la mesure des niveaux de cytokines libérées ou l’évaluation des changements morphologiques28. Il est important de noter que, bien que l’activation de la microglie ait été observée à 2 semaines en culture à la suite du changement d’environnement d’un organe entier à des conditions de culture ex vivo, les neurones étaient encore viables à ce moment-là, comme le montrent la coloration neuronale et l’analyse de leurs propriétés électrophysiologiques. Les tranches de tissu plus épaisses sont mieux conservées; Cependant, la pénétration des nutriments dans la partie interne de la tranche est affectée, entraînant une mort partielle des tissus. Pour cette raison, 300 μm est l’épaisseur optimale pour la culture organotypique.
Les cultures organotypiques de tissu hACtx présentent des avantages évidents par rapport à d’autres méthodes de culture 3D telles que les organoïdes ou les sphéroïdes. La source est un cerveau humain pleinement développé, ce qui signifie que l’environnement cellulaire et matriciel, ainsi que l’état de maturation des différentes populations cellulaires, sont les mêmes que ceux généralement trouvés dans le cerveau humain adulte25,29,30. Les organoïdes sont plus proches des tissus fœtaux, ce qui est optimal pour certains domaines de recherche comme la modélisation des troubles du développement31 mais pas, par exemple, pour l’étude des maladies neurodégénératives, qui touchent principalement la population adulte et ont une apparition tardive32,33. Plus important encore, la culture organotypique de tissus humains est, à ce jour, le seul système humain qui permet la validation des thérapies cellulaires.
La plupart des connaissances sur la transplantation de cellules souches pour le remplacement neuronal dans les maladies neurodégénératives proviennent de la modélisation animale in vivo . Même si ces systèmes sont extrêmement précieux pour évaluer l’effet modulateur des cellules transplantées dans les circuits hôtes endommagés, malheureusement, les thérapies testées dans cette configuration échouent normalement lorsqu’elles sont traduites à la clinique en raison des différences claires entre les rongeurs et les humains34. Pour cette raison, la culture organotypique du tissu hACtx est une excellente stratégie pour modéliser les maladies neurodégénératives humaines qui affectent le cortex en raison de la possibilité d’étudier les interactions entre les populations neuronales humaines et la préservation de la structure cérébrale humaine25.
En résumé, cette méthodologie combinée de cultures organotypiques à long terme du cortex humain adulte et de transplantation intracorticale ex vivo de progéniteurs corticaux induits dérivés de cellules souches pluripotentes est une stratégie prometteuse pour la validation de thérapies à base de cellules souches, qui peut faciliter la traduction clinique de stratégies de remplacement neuronal pour stimuler la récupération fonctionnelle dans le cerveau endommagé.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par des subventions du Conseil suédois de la recherche, de la Swedish Brain Foundation, de la Swedish Stroke Foundation, de la région de Scanie, de la Fondation Thorsten et Elsa Segerfalk et de l’Initiative du gouvernement suédois pour les domaines de recherche stratégiques (StemTherapy).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Cutting and electrophysiology | |||
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
| Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
| Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2x91 | |
| Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
| Plastic Petri dish | Any suitable | ||
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
| Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| RINSING SOLUTION | |||
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
| Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| Forceps | Any suitable | ||
| Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
| GENERATION OF lt-NES cells | |||
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
| Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
| Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
| Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
| Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
| Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
| Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
| T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
| Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
| Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
| Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
| Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
| Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
| Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
| Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
| Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
| Paint brush | Any suitable | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
| Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
| Distilled water | |||
| Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
| Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
| Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
| Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium citrate | |||
| Distilled water | |||
| Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
| Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
| Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
References
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