Summary
В этом протоколе описываются долгосрочные органотипические культуры коры головного мозга взрослого человека в сочетании с интракортикальной трансплантацией ex vivo индуцированных плюрипотентных предшественников коры, полученных из стволовых клеток, которые представляют собой новую методологию для дальнейшего тестирования терапии нейродегенеративных заболеваний человека на основе стволовых клеток.
Abstract
Нейродегенеративные расстройства распространены и неоднородны с точки зрения их симптомов и клеточного воздействия, что затрудняет их изучение из-за отсутствия надлежащих моделей животных, которые полностью имитируют заболевания человека, и плохой доступности посмертной ткани мозга человека. Культура нервной ткани взрослого человека дает возможность изучать различные аспекты неврологических расстройств. Молекулярные, клеточные и биохимические механизмы могут быть легко рассмотрены в этой системе, а также тестирование и проверка лекарств или различных методов лечения, таких как клеточная терапия. Этот метод сочетает в себе долгосрочные органотипические культуры коры головного мозга взрослого человека, полученные от пациентов с эпилепсией, перенесших резективную операцию, и интракортикальную трансплантацию ex vivo индуцированных плюрипотентных предшественников коры, полученных из стволовых клеток. Этот метод позволит изучать выживаемость клеток, дифференцировку нейронов, формирование синаптических входов и выходов, а также электрофизиологические свойства клеток человеческого происхождения после трансплантации в интактную корковую ткань взрослого человека. Этот подход является важным шагом перед разработкой 3D-платформы моделирования заболеваний человека, которая приблизит фундаментальные исследования к клиническому переводу терапии на основе стволовых клеток для пациентов с различными неврологическими расстройствами и позволит разработать новые инструменты для реконструкции поврежденных нейронных цепей.
Introduction
Нейродегенеративные расстройства, такие как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера или ишемический инсульт, представляют собой группу заболеваний, которые имеют общую черту нарушения работы нейронов или смерти. Они неоднородны с точки зрения пораженной области мозга и популяции нейронов. К сожалению, методы лечения этих заболеваний скудны или имеют ограниченную эффективность из-за отсутствия животных моделей, имитирующих то, что происходит в человеческом мозге 1,2. Терапия стволовыми клетками является одной из наиболее перспективных стратегий регенерации мозга3. Генерация нейронных предшественников из стволовых клеток из разных источников получила значительное развитие в последние годы 4,5. Недавние публикации показали, что индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки человека, полученные из долгосрочных самообновляющихся нейроэпителиоподобных стволовых клеток (lt-NES), следуя протоколу корковой дифференцировки и после внутрикортикальной трансплантации в модели крысы с ишемическим инсультом, поражающим соматосенсорную кору, генерируют зрелые корковые нейроны. Кроме того, нейроны, полученные из трансплантата, получили афферентные и эфферентные синаптические связи от нейронов-хозяев, демонстрируя их интеграцию в нейронную сеть крысы 6,7. Аксоны, полученные из трансплантата, были миелинизированы и обнаружены в различных областях мозга крысы, включая периинфарктную область, мозолистое тело и контралатеральную соматосенсорную кору. Самое главное, что трансплантация iPS-клеток обратила вспять двигательный дефицит у животных, перенесших инсульт7.
Даже если животные модели помогают изучать выживаемость трансплантата, интеграцию нейронов и влияние трансплантированных клеток на двигательные и когнитивные функции, информация о взаимодействии между клетками человека (трансплантат-хозяин) в этой системе отсутствует 8,9. По этой причине здесь описан комбинированный метод длительного органотипического культивирования мозга человека с трансплантацией ex vivo нейронных предшественников, полученных из iPS-клеток человека. Органотипические культуры человеческого мозга, полученные в результате нейрохирургических резекций, являются физиологически значимыми 3D-моделями мозга, которые позволяют исследователям улучшить свое понимание схем центральной нервной системы человека и наиболее точного способа тестирования лечения заболеваний головного мозга человека. Однако в этом контексте было проведено недостаточно исследований, и в большинстве случаев использовались органотипические культуры мозга гиппокампа человека10,11. Кора головного мозга поражена несколькими нейродегенеративными расстройствами, такими как ишемический инсульт12 или болезнь Альцгеймера13, поэтому важно иметь 3D-систему коры головного мозга человека, которая позволяет нам расширять наши знания, а также тестировать и проверять различные терапевтические стратегии. В нескольких исследованиях, проведенных за последние несколько лет, использовались культуры из корковой ткани взрослого человека (hACtx) для моделирования заболеваний головного мозга человека 14,15,16,17,18,19; Тем не менее, ограниченная информация доступна в контексте терапии стволовыми клетками. Два исследования уже продемонстрировали осуществимость описанной здесь системы. В 2018 году было показано, что эмбриональные стволовые клетки человека, запрограммированные различными факторами транскрипции и трансплантированные в ткань hACtx, дают начало зрелым корковым нейронам, которые могут интегрироваться в корковые сети взрослого человека20. В 2020 году трансплантация клеток lt-NES в органотипическую систему человека выявила их способность дифференцироваться в зрелые слоеспецифические корковые нейроны с электрофизиологическими свойствами функциональных нейронов. Привитые нейроны установили как афферентные, так и эфферентные синаптические контакты с корковыми нейронами человека в срезах мозга взрослого человека, что подтверждается ретроградным моносинаптическим отслеживанием вируса бешенства, записями заклепов целых клеток и иммуноэлектронной микроскопией21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол соответствует руководящим принципам, утвержденным Региональным этическим комитетом, Лунд, Швеция (номер этического разрешения 2021-07006-01). Здоровая ткань неокортекса была получена от пациентов, перенесших плановую операцию по поводу височной эпилепсии. Информированное согласие было получено от всех пациентов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все полученные ткани были обработаны независимо от их размера. Тем не менее, ткани размером менее 1-1,5 мм3 будут технически сложными для обработки и разрезания с помощью вибратомы.
1. Сбор, уход, резка и покрытие тканей
- Препараты за день до среза тканей
- Приготовьте 2 л режущего раствора (табл. 1) в мерной колбе. Растворите все ингредиенты, кроме MgCl 2 и CaCl2, в ~ 1,800 мл деионизированной воды и пузыритесь с газообразным карбогеном в течение 15 минут. Затем добавьте соответствующее количество 1 М растворов MgCl2 иCaCl2 и продолжайте барботировать еще 15 минут. Наконец, наполните колбу до отметки 2 л; проверьте рН и осмолярность и при необходимости отрегулируйте. Заморозьте 2 x 350 мл приготовленного раствора, а остальное храните при температуре 4 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ: pH и осмолярность обычно составляют 7,3-7,4 и 295-300 мОсм соответственно. - Приготовьте 100 мл ополаскивающего раствора (табл. 2). Растворите 476 мг HEPES и 200,6 мг глюкозы в 100 мл HBSS с добавлением 5 мл пенициллина/стрептомицина. Его можно хранить при температуре 4 °C до 10 дней.
- Подготовьте питательную среду для взрослого человека (hACtx) (среда hACtx) (таблица 3) и отфильтруйте ее в лаборатории клеточных культур под вентилируемым колпаком. Среда содержит нейронную среду без фенольного красного (см. Таблицу материалов), добавку B27, L-глютамин (см. Таблицу материалов) и гентамицин. Хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
- Приготовьте 2 л режущего раствора (табл. 1) в мерной колбе. Растворите все ингредиенты, кроме MgCl 2 и CaCl2, в ~ 1,800 мл деионизированной воды и пузыритесь с газообразным карбогеном в течение 15 минут. Затем добавьте соответствующее количество 1 М растворов MgCl2 иCaCl2 и продолжайте барботировать еще 15 минут. Наконец, наполните колбу до отметки 2 л; проверьте рН и осмолярность и при необходимости отрегулируйте. Заморозьте 2 x 350 мл приготовленного раствора, а остальное храните при температуре 4 ° C.
- Подготовка в день операции до прибытия образцов тканей
- Проверьте наличие необходимого оборудования и лабораторных помещений и тщательно очистите все хирургические инструменты и вибратом (см. Таблицу материалов), а также рабочее пространство дистиллированной водой (без моющего средства), а затем 70% этанолом. Дайте этанолу высохнуть не менее 30 минут перед использованием инструментов и оборудования.
- Измельчите замороженный режущий раствор и взбейте «суп» изо льда и жидкости с газообразным карбогеном в течение 30 минут. Затем плотно закройте одну из емкостей с измельченным раствором «супа» и поместите ее в холодильник. Это будет использоваться для сбора ткани из операционной.
- Откалибруйте вибратому и установите параметры резки: скорость 0,05 мм/с и вибрацию 1,7 мм. Поместите режущую камеру на вибратомный столик и запустите подключенный к ней охладитель так, чтобы камера находилась при постоянной температуре −3 °C.
- Подготовьте камеру для сбора срезов со вставками для размещения срезов ткани и режущим раствором, постоянно пузыря его газообразным карбогеном при комнатной температуре (RT).
- В лаборатории клеточных культур и под вентилируемым колпаком поместите вкладыши для культивирования в 6-луночную пластину с помощью щипцов. Добавьте 5 мл среды hACtx в нижнюю часть вкладыша до тех пор, пока он не соприкоснется с мембраной, избегая образования пузырьков, и добавьте 2 мл в верхнюю часть вкладыша. Уравновесить в инкубаторе при 37 °C и 5%CO2 в течение не менее 2 ч перед переносом срезов ткани во вкладыши.
- Процедуры по сбору и нарезке тканей
- Сразу после резекции соберите ткань у пациента в операционной, по возможности, непосредственно в емкость с замороженным, пузырящимся и измельченным режущим раствором. Немедленно перенесите закрытый контейнер на льду в зону резки лаборатории.
- Осмотрите ткань и найдите наилучшую поверхность для приклеивания (см. шаг 1.3.3) к стадии разрезания вибратомы, учитывая ориентацию кортикальных слоев. При необходимости разрежьте неровную поверхность скальпелем так, чтобы ткань можно было легко разместить на сцене для оптимальной ориентации среза.
- Приклейте ткань к сцене тканевым клеем (см. Таблицу материалов), поместите ее в камеру нарезки и сразу же заполните камеру холодным пузырчатым раствором для резки. Продолжайте барботирование в течение всей процедуры резки.
- Нарежьте корональные или сагиттальные срезы, в зависимости от ориентации ткани к лезвию, толщиной 300 мкм, чтобы они содержали все корковые слои и, если возможно, белое вещество. Поместите срезы в камеру сбора с барботажным режущим раствором при RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрежьте со стороны белого вещества по направлению к поверхности коры. Не удаляйте мозговые оболочки, так как это может повредить ткани. Режущее лезвие обычно легко разрезает их. - После того, как вся ткань будет разрезана, перенесите срезы в стерильную чашку Петри с промывающим раствором при ЛТ и транспортируйте их в лабораторию клеточных культур. Этот шаг необходим для удаления излишков сахарозы со срезов перед переносом их на культуральную тарелку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы перенести ломтики (на этом и следующих шагах), используйте перевернутую стеклянную пипетку, отломите более тонкую часть и поместите резиновую соску для всасывания.
- Культивирование и уход за срезами тканей hACtx
- По отдельности положите кусочки ткани поверх уже влажных и погруженных в воду вставок. Через 24 часа смените среду, чтобы дополнительно удалить оставшуюся сахарозу или другие остаточные вещества из процедур резки.
- Заменяйте питательную среду свежей средой каждые 7 дней. Через 2 недели используйте среднюю hACtx без гентамицина. Культуру можно выдерживать до 2 месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уравновесьте среду hACtx в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO 2 в течение не менее2 ч до смены среды. Свежую среду следует готовить каждые 2 недели. Проверяйте ломтики каждые 2-3 дня и, если часть среды испарилась, добавьте еще в верхнюю часть вкладыша.
| Режущий раствор | Концентрация запасов | Конечная концентрация [мМ] | На 1 л |
| Сахароза | Порошок | 200 | 68.46 г |
| NaHCO3 | Порошок | 21 | 1.76 г |
| KCl | Порошок | 3 | 0,22 г |
| NaH2PO4 | Порошок | 1.25 | 0,17 г |
| Глюкоза | Порошок | 10 | 1.80 г |
| MgSO4 | 1 м | 2 | 2 мл |
| CaCl2 | 1 м | 1.6 | 1,6 мл |
| MgCl2 | 2 М | 2 | 1 мл |
Таблица 1: Состав режущего раствора. MgCl 2 и CaCl2 используются в качестве предварительно приготовленных 1 М растворов в деионизированной воде.
| Ополаскивающий раствор | Концентрация запасов | Конечная концентрация | На 100 мл |
| ГБСС | 1x | 95 мл | |
| ПенСтрептококк | 10 000 ЕД/мл | 500 ЕД/мл | 5 мл |
| ХЕПЕС | Порошок | 4,76 г/л | 476 мг |
| Глюкоза | Порошок | 2 г/л | 200,6 мг |
Таблица 2: Состав ополаскивающего раствора.
| hACtx средний | Концентрация запасов | Конечная концентрация | На 100 мл | |
| Нейронная среда без фенолового красного | 97,4 мл | см. Таблица материалов | ||
| В27 | В 50 раз | 1:50 | 2 мл | |
| L-глютамин | В 100 раз | 1:200 | 500 мкл | см. Таблица материалов |
| Гентамицин | 50 мг/мл | 1:1000 | 100 мкл |
Таблица 3: Состав среды hACtx.
2. Пролиферация и дифференцировка клеток lt-NES
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки Lt-NES генерируются, как описаноранее 21,22, и трансдуцируются лентивирусным вектором, несущим зеленый флуоресцентный белок (GFP), под конститутивным промотором (клетки GFP-lt-NES). Флаконы, содержащие 3 x 106 ячеек, хранят при температуре -150 °C до использования.
- Подготовка исходных растворов и сред
- Разбавьте 100 мкг основного фактора роста фибробластов (bFGF) в 10 мл PBS-0,1% BSA, чтобы получить исходную концентрацию 10 мкг / мл. Приготовьте 100 мкл аликвот.
- Разбавьте 100 мкг эпидермального фактора роста (EGF) в 10 мл PBS-0,1% BSA, чтобы получить исходную концентрацию 10 мкг / мл. Приготовьте 100 мкл аликвот.
- Добавка Aliquot 50x B27 в объеме 100 мкл на аликвоту.
- Разведите 10 мг поли-L-орнитина в 100 мл деионизированной воды, чтобы получить исходную концентрацию 100 мкг / мл. Сделайте аликвоты по 1 мл.
- Приготовьте 30 мкл аликвот 1,20 мг/мл мышиного ламинина.
- Разбавьте 10 мл трипсина-ЭДТА (0,25%) в 90 мл PBS до исходной концентрации 0,025%. Приготовьте 1 мл аликвот.
- Разбавьте 0,025 г ингибитора трипсина в 50 мл PBS до исходной концентрации 0,5 мг / мл. Приготовьте 1 мл аликвот.
- Разбавьте 10 мкг Wnt3a (член семейства сайтов интеграции MMTV бескрылого типа 3A) в 1 мл PBS-0,1% BSA, чтобы получить исходную концентрацию 10 мкг / мл. Таким же образом готовят BMP4 (костный морфогенетический белок 4). Аликвота в объеме 100 мкл.
- Разведите 1 мг циклопамина в 2,5 мл ДМСО до конечной концентрации 400 мкг / мл и сделайте 100 мкл аликвот.
- Подготовьте основную среду (таблица 4) и среду с дифференциацией (DDM, таблица 5) и храните при температуре 4 °C до 2 недель.
- Покрытие культуральной посуды
- Чтобы предварительно покрыть посуду для культивирования клеток GFP-It-NES во время пролиферации или дифференцировки, разведите поли-L-орнитин 1:100 в деионизированной воде и добавьте 5 мл раствора в колбу T25. Инкубация в течение ночи при RT.
- Вымойте пластины с поли-L-орнитиновым покрытием 1 раз деионизированной водой и 1 раз PBS.
- Для клеток GFP-It-NES в пролиферации разведите мышиный ламинин в соотношении 1:500 в PBS и инкубируйте не менее 2 ч при 37 ° C. Для дифференцировочных клеток GFP-It-NES разведите мышиный ламинин в соотношении 1:100 в PBS и инкубируйте не менее 2 ч при 37 ° C.
- Пролиферация клеток GFP-lt-NES
- Нагрейте 5 мл (для стирки) и 5 мл (для посева) основной среды в двух разных пробирках по 15 мл.
- Быстро разморозьте один флакон с ячейками GFP-lt-NES при 37 °C, перенесите их в промывочную трубку и центрифугу при 300 x g в течение 5 мин.
- Осторожно аспирируйте среду, не касаясь гранул, и ресуспендируйте клетки в 1 мл предварительно подогретой основной среды. Клеточную суспензию переносят в посевную трубку, содержащую основную среду с добавлением факторов пролиферации: EGF (10 нг/мл), bFGF (10 нг/мл) и B27 (10 нг/мл). Засейте клетки в колбу T25, покрытую поли-L-орнитином/ламинином.
- Подпитывайте клетки факторами пролиферации каждый день. Замените носитель, если он пожелтеет. Проходите клетки каждые третьи-четвертые сутки (через 1 день после того, как они достигнут 100% слияния).
- Расщепление клеток GFP-lt-NES для пролиферации и дифференцировки
- Предварительно разогрейте 5 мл основной среды на колбу (для сбора клеток) плюс общий объем, необходимый для их повторного посева.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пассаж осуществляется в разведении 1:3 для поддержания пролиферации клеток, требующем 15 мл основной среды, и разведении 1:6 для начала дифференцировки, требующем 30 мл основной среды. - Удалите среду из колбы для клеточной культуры путем аспирации и добавьте 500 мкл предварительно подогретого 0,025% трипсина. Инкубировать 5-10 мин при РТ. Отрыв клеток может быть подтвержден под стандартным световым микроскопом при 10-кратном увеличении.
- Добавьте равный объем ингибитора трипсина (0,5 мг / мл конечной концентрации), а затем 5 мл теплой основной среды. Отделяйте и собирайте клетки, аккуратно пипетируя вверх и вниз. Переведите клетки в пробирку объемом 15 мл и центрифугу в течение 5 мин при дозе 300 г .
- Чтобы сохранить пролиферацию клеток, переложите в разведение 1:3 в свежую основную среду, дополненную факторами пролиферации, и повторите шаг 2.3.4.
- Предварительно разогрейте 5 мл основной среды на колбу (для сбора клеток) плюс общий объем, необходимый для их повторного посева.
- Корковая дифференцировка клеток GFP-lt-NES
- На 0-й день ресуспендируют клетки (для дифференцировки) в 30 мл основной среды, дополненной факторами пролиферации, и помещают их в шесть колб T25 с дифференцировочным покрытием (разделенные 1:6).
- На 1-й день замените половину среды на DDM и добавьте факторы пролиферации в половине их концентрации.
- На 2-й день полностью смените среду на DDM с добавлением факторов дифференцировки: BMP4 (10 нг/мл), Wnt3a (10 нг/мл) и циклопамина (400 нг/мл).
- На 4-й день добавьте только факторы дифференциации. Замените носитель, если он пожелтеет.
- На 6-й день смените среду на DDM с добавлением BMP4 и Wnt3a. Циклопамин удаляется на этом этапе.
- На 7-й день отсоедините клетки, как указано в шагах 2.4.2 и 2.4.3.
| Базовый средний | Концентрация запасов | Конечная концентрация | На 100 мл |
| DMEM/F12 с L-глютамином | 1x | 98,7 мл | |
| Доплата N-2 | В 100 раз | 1:100 | 1 мл |
| Глюкоза | 45% | 3,5 мл/л | 350 мкл |
Таблица 4: Состав пролиферативной среды клеток lt-NES (базовая среда).
| Среда DDM | Концентрация запасов | Конечная концентрация | На 100 мл |
| DMEM/F12 с L-глютамином | 96 мл | ||
| Н2 | 100 х | 1:100 | 1 мл |
| NEAA | 100 х | 1:100 | 1 мл |
| Пируват натрия | 100 мМ | 1:100 | 1 мл |
| Фракция BSA V | 7.5% | 6,6 мл/л | 660 мкл |
| 2-меркаптоэтанол | 50 нМ | 7 мкл/л | 0,7 мкл |
| Глюкоза | 45% | 3,2 мл/л | 320 мкл |
Таблица 5: Состав дифференцировочной среды (DDM) клеток lt-NES.
3. Трансплантация клеток GFP-lt-NES в органотипические срезы hACtx
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань hACtx следует культивировать в течение 1 недели до трансплантации клеток. Чтобы облегчить процедуру трансплантации, необходимо удалить 2 мл среды hACtx из верхней части вкладыша, чтобы предотвратить всплытие ткани.
- Ресуспендируют кортикально праймированные клетки GFP-lt-NES (с этапа 2.5.6) в матрице холодной чистой базальной мембраны (см. Таблицу материалов) в концентрации 1 x 10,5 клеток/мкл и переносят раствор в меньшую стерильную пробирку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процедуры трансплантации все материалы (наконечники пипеток, трубки, капилляры и т. д.) должны быть предварительно охлаждены, чтобы избежать затвердевания геля. Перед использованием разморозьте матричный гель базальной мембраны на льду в течение 30 минут. - Соберите клеточную суспензию в холодный стеклянный капилляр, соединенный с резиновой соской для всасывания. Вводите клеточную суспензию в виде небольших капель (около 1 мкл каждая), втыкая полусухой срез ткани в различные места.
- Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин, чтобы гель затвердел. Перенесите пластину из инкубатора обратно в капюшон и осторожно добавьте 2 мл среды hACtx в верхнюю часть вкладыша, чтобы полностью погрузить ткань.
- Заменяйте питательную среду свежей средой hACtx один раз в неделю.
4. Валидация
- Окрашивание срезов hACtx
- В нужный момент времени выньте срезы из лаборатории клеточных культур и извлеките их из вкладыша, погрузив его в чашку Петри с PBS. Затем переложите ломтики во флаконы для окрашивания с помощью пипетки из перевернутого стекла (см. ПРИМЕЧАНИЕ на шаге 1.3.5) и зафиксируйте их 4% параформальдегидом (PFA) на ночь при 4 ° C.
- Промыть 3 раза KPBS в течение 15 минут каждый раз и инкубировать в течение ночи при 4 ° C с пермеабилизирующим раствором (0,02% BSA и 1% Triton X-100 в KPBS).
- На следующий день добавьте блокирующий раствор (KPBS с 0,2% Triton X-100, 1% BSA, азидом натрия [1:10 000] и 10% нормальной ослиной сывороткой) и инкубируйте в течение ночи при 4 ° C.
- После блокировки добавляют первичные антитела (см. Таблицу 6 для разведений), разведенные в блокирующем растворе, и инкубируют в течение 48 ч при 4 ° C.
- Промыть 3 раза блокирующим раствором без добавления сыворотки в течение 15 минут каждый. Добавляют вторичные антитела, разведенные в блокирующем растворе (см. Таблицу 6 для разведений), и инкубируют в течение 48 ч при 4 ° C.
- Промыть 3 раза блокирующим раствором без сыворотки и инкубировать в течение 2 ч при РТ в пятине Хёхста, разбавленном раствором для пермеабилизации (1:1 000).
- Вымойте 3x с помощью KPBS, закрепите ломтики на предметных стеклах с помощью кисти и дайте им высохнуть. Наконец, промойте предметные стекла деионизированной водой, удалите излишки воды, добавьте монтажную среду и накройте стеклянным покровным стеклом. Храните предметные стекла не менее 24 ч при RT и храните их при температуре 4 °C до получения изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для антител, мечущих ядерные эпитопы, проводят извлечение антигена перед пермеабилизацией (этап 4.1.2) цитратом натрия (10 мМ, рН 6,0) в течение 2 ч при 65 ° C.
- Цельноклеточный пластырь-зажим
- В день регистрации приготовьте 1 л искусственной спинномозговой жидкости человека (haCSF), модифицированной для лучшего соответствия среде мозга человека (таблица 7). Подобно режущему раствору, сделайте приблизительно 900 мл раствора со всеми ингредиентами, кроме CaCl2, растворенного в деионизированной воде, и пузырите его карбогеном в течение 15 мин, прежде чем добавлять соответствующий объем 1М раствора CaCl2. Наполните мерную колбу до отметки 1 л и продолжайте барботировать при RT еще 15 минут перед началом записи и на протяжении всего эксперимента.
- Перенесите срезы ткани из культуральной пластины в регистрирующую камеру на столике вертикального микроскопа, который постоянно перфузируется пузырьковым галиквором со скоростью перфузии 2 мл / мин и нагревается до 34 ° C с помощью регулятора температуры в ванне.
- Вытяните стеклянные капилляры с помощью пипетки-съемника до среднего сопротивления 3-5 МОм и заполните капилляры внутренним раствором на основе K-глюконата (таблица 8) свежедобавленным 2-4 мг биоцитина для последующей идентификации зарегистрированных клеток. рН и осмолярность этого внутреннего раствора составляют 7,2-7,3 и 285-295 мОсм соответственно.
- В случае записи клетки-хозяина получите приблизительный обзор среза с 4-кратным объективом и найдите здоровую клетку для исправления с 40-кратным объективом. Затем приступайте к стандартному цельноклеточному пластырному зажиму.
- В случае записи трансплантированных клеток идентифицируйте область ткани с привитыми клетками, используя 4-кратный объектив и эпифлуоресцентный фильтр в синем диапазоне (460 нм) по экспрессии репортера GFP в трансплантате. Затем увеличьте масштаб до расположенной области с 40-кратным объективом и найдите привитую клетку, экспрессирующую GFP, для стандартного цельноклеточного пластыря.
- Проверьте мембранный потенциал покоя (RMP) сразу после взлома ячейки и убедитесь, что качество записи хорошее. Запишите все интересующие параметры (например, сопротивление мембраны [Ri], параметры AP, токи натрия и калия и синаптическую активность) в конфигурации напряжения целой ячейки или ток-зажима.
- После сбора всех необходимых данных осторожно втяните записывающую пипетку, не повреждая в дальнейшем клетку, чтобы ее можно было идентифицировать с помощью последующего иммуноокрашивания.
- Перенесите срез в 4% раствор PFA для дальнейшей фиксации и окрашивания, как описано на шаге 4.1. Стрептавидин используется для иммуномаркировки клеток, заполненных биоцитином во время записи.
| АНТИТЕЛА | Разбавление | Примечания |
| Первичный | ||
| Курица анти-GFP | 1:1000 | |
| Курица анти-MAP2 | 1:1000 | |
| Козел анти-АиФ1 | 1:100 | |
| Мышь с защитой от MBP | 1:1000 | Необходим поиск антигена |
| Мышь анти-SC123 | 1:2000 | |
| Кролик анти-NeuN | 1:1000 | |
| Кролик анти-Olig2 | 1:500 | |
| Кролик анти-Tmem119 | 1:200 | |
| Вторичный | ||
| 488-конъюгированный антимышиный IgG AffinityPure Donkey | 1:500 | |
| 488-конъюгированный AffinityPure Donkey против кроликов IgG | 1:500 | |
| 488-конъюгированный AffinityPure Donkey против куриного IgG | 1:500 | |
| Cy3-конъюгированный AffinityPure Donkey против куриного IgG | 1:500 | |
| Cy3-конъюгированный AffinityPure Donkey против козьего IgG | 1:500 | |
| Cy3-конъюгированный антимышиный IgG AffinityPure Donkey | 1:500 | |
| Alexa флуор 647-конъюгированный стрептавидин | 1:500 |
Таблица 6: Список первичных и вторичных антител для иммуногистохимии.
| haCSF | Концентрация запасов | Конечная концентрация [мМ] | На 1 л |
| NaCl | Порошок | 129 | 7.54 г |
| NaHCO3 | Порошок | 21 | 1.76 г |
| Глюкоза | Порошок | 10 | 1.80 г |
| KCl | Порошок | 3 | 0,22 г |
| NaH2PO4 | Порошок | 1.25 | 0,17 г |
| MgSO4 | 1 м | 2 | 2 мл |
| CaCl2 | 1 м | 1.6 | 1,6 мл |
Таблица 7: Состав искусственной спинномозговой жидкости (haCSF).
| Внутренний раствор K-глюконата | Концентрация запасов | Конечная концентрация [мМ] | На 100 мл |
| К-глюконат | Порошок | 122.5 | 2.87 г |
| KCl | Порошок | 12.5 | 93.18 мг |
| NaCl | Порошок | 8 | 46,76 мг |
| ХЕПЕС | Порошок | 10 | 238,32 мг |
| МгАТФ | Порошок | 2 | 101,4 мг |
| Na3GTP | Порошок | 0.3 | 17,0 мг |
| Заметка: Отрегулируйте pH с помощью KOH/HCl | |||
Таблица 8: Состав внутреннего раствора на основе К-глюконата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В соответствии с описанным протоколом ткань hACtx у пациента с височной эпилепсией была собрана и обработана, как описано выше. Несколько срезов фиксировали через 24 ч в культуре для изучения начальной точки ткани хозяина. Анализ различных популяций нервных клеток, таких как нейроны (экспрессирующие NeuN и Map2, рис. 1A), олигодендроциты (Olig2 и MBP, рис. 1B) и астроциты (специфический для человека GFAP, также называемый STEM123, рис. 1C), показал оптимальную сохранность ткани.
Следующим шагом было изучение того, как условия культивирования влияют на жизнеспособность нейронов в тканях человека. С этой целью окрашивание NeuN и Map2 проводили через 2 недели культивирования. В исследуемый момент времени экспрессия обоих этих нейрональных маркеров все еще присутствовала в ткани (рис. 2А). Кроме того, были проведены электрофизиологические записи для оценки функциональности. Записи с использованием цельноклеточного пластыря показали, что нейроны имели устойчивый RMP (в среднем -70 мВ) и сопротивление мембранного входа (Ri) (в среднем 300 МОм), сравнимые с нейронами от острых препаратов21,23. В целом, клетки были немного менее активны, чем в свежей ткани, хотя большинство клеток все еще были способны запускать по крайней мере один (рис. 2B-E), если не несколько, потенциалов действия (AP, рис. 2F-I), а быстрые входящие внутрь токи натрия и медленные выходные токи калия присутствовали при ступенчатых инжекциях тока в режиме зажима напряжения (рис. 2C-E, Г-И). Взятые вместе, эти записи показали, что нейроны в органотипических культурах были относительно здоровыми и проявляли типичные нейрофизиологические внутренние свойства.
Кроме того, влияние культуры на активацию микроглии оценивали путем окрашивания Tmem119 и Iba1 в 24-часовой (рис. 3A) и 2-недельной культивируемой (рис. 3B) ткани. Как и ожидалось, наблюдались некоторые изменения во внешнем виде микроглии. После 2 недель в культуре они стали менее разветвленными и приобрели более активированную морфологию по сравнению с острой тканью.
После характеристики ткани хозяина трансплантация прогенитаторов, полученных из клеток lt-NES, проводилась следующим образом. Клетки GFP-lt-NES дифференцировали в течение 7 дней и пересаживали в 1-недельную культивируемую ткань hACtx (рис. 4A). Обзор трансплантации наблюдался с использованием иммуногистохимии с GFP (рис. 4B, C). Результаты сравнивались с результатами предыдущих трансплантаций в ткани, которые плохо сохранились из-за более длительного временного окна между резекцией и покрытием. Изображения показывают, что в оптимальной системе через 4 недели после трансплантации ex vivo трансплантированные клетки GFP-lt-NES демонстрировали расширенные нейриты и обширные и сложные арборизации по всей органотипической культуре (рис. 4B). Плохо сохранившаяся ткань не позволяла провести успешную трансплантацию из-за плохой связности хозяина. Почти ни одна привитая клетка не сохранилась; кроме того, обломки и неспецифическая маркировка антител на мертвых клетках широко наблюдались по всему срезу человека (рис. 4C).
Что касается электрофизиологических свойств привитых клеток, было обнаружено, что в случае успешной трансплантации клетки становятся не только морфологически, но и функционально активными зрелыми нейронами с повторяющимися и часто спонтанными АП, быстрыми внутренними натриевыми и медленными наружними калиевыми токами, а также определенным уровнем синаптической активности, что указывает на функциональную интеграцию трансплантата с тканью хозяина через 4 недели после трансплантации (рис. 4D-H).
Рисунок 1: Характеристика различных клеточных популяций в ткани hACtx через 24 часа в культуре. Репрезентативные конфокальные изображения ткани hACtx, показывающие наличие (A) нейронов (экспрессирующих NeuN и Map2), (B) олигодендроцитов (Olig2 и MBP) и (C) астроцитов (человеческий GFAP [STEM123]). Ядерное окрашивание (Ho: Hoechst, синий) включено в отдельные и объединенные панели. Масштабная линейка = 20 мкм. Белые стрелки указывают на колокализацию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Характеристика и электрофизиологические свойства нейронов hACtx через 2 недели в органотипической культуре. (A) Репрезентативные конфокальные изображения ткани hACtx, показывающие экспрессию NeuN и Map2. (Б-И) Примеры корковых нейронов, зарегистрированных в 2-недельной ткани hACtx. (Б,Ж) Биоцитиновая маркировка зарегистрированного нейрона (красный) вместе с ядерным окрашиванием (Ho: Hoechst, синий), включенный в объединенную панель. Масштабные линейки = 20 мкм. Следы записи патч-зажима для всей ячейки, показывающие примеры ячеек с (C-E) одним или (G-I) несколькими точками доступа. AP индуцировались либо шагом (C, G) 250 пА, либо (D, H) инжекцией импульсного тока от 0 до 300 пА при RMP. Вставки указывают на увеличенный вид одной из точек доступа в каждом случае. (Е,И) Входящий натриевый и внешний токи калия наблюдались в обоих примерах ячеек на этапах деполяризации напряжения, применяемых от −70 мВ с шагом 10 мВ в режиме зажима напряжения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Характеристика популяции микроглии в ткани hACtx. Конфокальные изображения ткани hACtx, показывающие экспрессию Iba1 и Tmem119 через (A) 24 ч и (B) 2 недели в культуре. Ядерное окрашивание (Ho: Hoechst, синий) включено в отдельные и объединенные панели. Масштабная линейка = 20 мкм. Белые стрелки указывают на колокализацию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Обзор и электрофизиологические свойства нейронов, полученных из клеток lt-NES, через 4 недели после трансплантации клеток GFP-lt-NES ex vivo. (A) Экспериментальный дизайн. Diff = дифференциация. (В,В) Репрезентативные конфокальные снимки трансплантированных клеток GFP-lt-NES в (B) хорошо сохранившейся и (C) плохо сохранившейся ткани hACtx. Масштабные линейки = 50 мкм. (D) Пример следа нейрона, полученного из трансплантата, самопроизвольно запускающего AP. Врезка указывает на увеличенный вид одной из точек доступа. Повторяющиеся AP могут быть вызваны шагом (E) (50 пА) или (F) усилением (от 0 до 300 пА) деполяризующего тока с потенциалом -70 мВ. (G) Входящий натриевый и внешний токи калия индуцировались стадиями деполяризации 10 мВ в режиме зажима напряжения с удерживающим потенциалом -70 мВ. (H) В режиме зажима напряжения спонтанные постсинаптические токи (sPSCs) могут наблюдаться в нейронах, полученных из трансплантата, при потенциале удержания -70 мВ. Вставки указывают на увеличенный вид некоторых sPSC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Получение срезов hACtx достаточно высокого качества является наиболее важным шагом в этом протоколе. Кортикальная ткань получают у пациентов с эпилепсией, перенесших резекционную операцию24. Качество резецированной ткани, а также время экспозиции ткани между резекцией и культивированием имеют решающее значение; Чем быстрее ткань будет перенесена из операционной в лабораторию и разрезана, тем более оптимальной будет органотипическая культура. В идеале ткань должна быть разрезана и перенесена в лабораторию клеточных культур в течение первых нескольких часов после сбора. Насыщение ткани кислородом во время этого процесса также улучшает качество срезов. В связи с этим, чем больше образец ткани, тем ниже концентрация кислорода, достигающего ядра, и, таким образом, тем ниже жизнеспособность, если ткань вовремя не разрезать. Если качество ткани хозяина не является оптимальным, валидация терапии стволовыми клетками будет невозможна.
При переносе кортикальной ткани из головного мозга человека в пластину необходимо учитывать некоторые ограничения. В процессе разрезания рассекается большое количество аксонов, вызывая повреждение нейронов, что приводит к воспалительным процессам, таким как активация микроглии25. По этой причине, даже если ткань считается здоровой, когда она находится в головном мозге человека, поведение клеток в культуре может быть другим из-за частичного повреждения, полученного во время резекции и подготовки органотипических срезов26,27. Изменения в популяции микроглии можно было контролировать с использованием различных методов, включая измерение уровней высвобожденных цитокинов или оценку морфологических изменений28. Важно отметить, что, хотя активация микроглии наблюдалась через 2 недели в культуре в результате изменения среды от целого органа к условиям культуры ex vivo, нейроны все еще были жизнеспособными в этот момент времени, как показало окрашивание нейронов и анализ их электрофизиологических свойств. Более толстые срезы ткани лучше сохраняются; Однако нарушается проникновение питательных веществ во внутреннюю часть среза, что приводит к частичной гибели тканей. По этой причине 300 мкм является оптимальной толщиной для органотипической культуры.
Органотипические культуры тканей hACtx имеют явные преимущества по сравнению с другими методами 3D-культивирования, такими как органоиды или сфероиды. Источником является полностью развитый человеческий мозг, а это означает, что клеточная и матричная среда, а также статус созревания различных клеточных популяций такие же, как и в мозге взрослого человека25,29,30. Органоиды больше похожи на ткани плода, что оптимально для некоторых областей исследований, таких как моделирование нарушений развития31, но не, например, для изучения нейродегенеративных заболеваний, которые поражают в основном взрослое население и имеют позднее начало32,33. Самое главное, что органотипическая культура тканей человека на сегодняшний день является единственной человеческой системой, которая позволяет проводить валидацию клеточной терапии.
Большая часть знаний о трансплантации стволовых клеток для замены нейронов при нейродегенеративных расстройствах получена из моделирования in vivo на животных. Несмотря на то, что эти системы чрезвычайно ценны для оценки модулирующего эффекта трансплантированных клеток в поврежденной схеме хозяина, к сожалению, методы лечения, протестированные в этой установке, обычно терпят неудачу при переводе в клинику из-за явных различий между грызунами и людьми34. По этой причине органотипическая культура ткани hACtx является отличной стратегией для моделирования нейродегенеративных заболеваний человека, поражающих кору головного мозга, благодаря возможности изучения взаимодействий между нейронными популяциями человека и сохранения структуры мозгачеловека 25.
Таким образом, эта комбинированная методология долгосрочных органотипических культур коры головного мозга взрослого человека и интракортикальной трансплантации ex vivo индуцированных плюрипотентных предшественников коры, полученных из стволовых клеток, является многообещающей стратегией для валидации терапии на основе стволовых клеток, которая может облегчить клиническую трансляцию стратегий замены нейронов для стимуляции функционального восстановления в поврежденном мозге.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается грантами Шведского исследовательского совета, Шведского фонда мозга, Шведского фонда борьбы с инсультом, Региона Сконе, Фонда Торстена и Эльзы Сегерфальк и Инициативы правительства Швеции по стратегическим исследованиям (StemTherapy).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Cutting and electrophysiology | |||
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
| Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
| Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2x91 | |
| Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
| Plastic Petri dish | Any suitable | ||
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
| Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| RINSING SOLUTION | |||
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
| Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| Forceps | Any suitable | ||
| Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
| GENERATION OF lt-NES cells | |||
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
| Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
| Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
| Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
| Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
| Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
| Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
| T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
| Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
| Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
| Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
| Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
| Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
| Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
| Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
| Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
| Paint brush | Any suitable | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
| Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
| Distilled water | |||
| Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
| Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
| Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
| Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium citrate | |||
| Distilled water | |||
| Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
| Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
| Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
References
- Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).
- Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work. Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).
- Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).
- Tornero, D., et al. Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli. Brain. 140 (3), 692-706 (2017).
- Palma-Tortosa, S., et al. Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).
- Robinson, N. B., et al. The current state of animal models in research: A review. International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Delavaran, H., et al. Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke. European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).
- Sabuncu, M. R., et al. The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease. Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).
- Eugene, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
- Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
- Kalmbach, B. E., et al. Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons. Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).
- Barth, M., et al. Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54 (2021).
- Almeida, G. M., et al. Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response. Frontiers in Neuroscience. 15, 674576 (2021).
- Schwarz, N., et al. Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures. Scientific Reports. 7, 12249 (2017).
- Miskinyte, G., et al. Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 207 (2017).
- Gronning Hansen, M., et al. Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry. Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).
- Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS One. 7 (1), 29597 (2012).
- Avaliani, N., et al. Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors. Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).
- Engel, J., et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).
- Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).
- Verwer, R. W., et al. Injury response of resected human brain tissue in vitro. Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).
- Verwer, R. W., et al. Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue. Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).
- Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Schwarz, N., et al. Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease. Elife. 8, 48417 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Wang, Z., et al. Organoid technology for brain and therapeutics research. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).
- Wang, H. Modeling neurological diseases with human brain organoids. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).
- Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).
