Summary
该协议描述了成人皮层的长期器官型培养与诱导多能干细胞衍生皮质祖细胞的 离体 皮质内移植相结合,这提供了一种新方法来进一步测试基于干细胞的治疗人类神经退行性疾病。
Abstract
神经退行性疾病在症状和细胞影响方面是常见且异质的,由于缺乏完全模仿人类疾病的适当动物模型以及死后人类脑组织的可用性差,他们的研究变得复杂。成人神经组织培养为研究神经系统疾病的不同方面提供了可能性。分子,细胞和生化机制可以很容易地在这个系统中解决,以及测试和验证药物或不同的治疗方法,如基于细胞的疗法。该方法结合了从接受切除手术的癫痫患者获得的成人皮层的长期器官型培养物,以及诱导多能干细胞来源的皮质祖细胞的 体外 皮质移植。该方法将允许研究细胞存活,神经元分化,突触输入和输出的形成以及移植到完整的成人皮质组织后人类来源细胞的电生理特性。这种方法是开发3D人类疾病建模平台之前的重要一步,该平台将使基础研究更接近基于干细胞的治疗的临床转化,用于患有不同神经系统疾病的患者,并允许开发用于重建受损神经回路的新工具。
Introduction
神经退行性疾病,如帕金森病、阿尔茨海默病或缺血性中风,是一组具有神经元功能障碍或死亡共同特征的疾病。它们在受影响的大脑区域和神经元群体方面是异质的。不幸的是,由于缺乏模仿人脑中发生的事情的动物模型,这些疾病的治疗方法很少或疗效有限1,2。干细胞疗法是大脑再生最有前途的策略之一3。近年来,从不同来源的干细胞中产生神经元祖细胞已经有了很大的发展4,5。最近的出版物表明,人类诱导多能干(iPS)细胞衍生的长期自我更新神经上皮样干(lt-NES)细胞,遵循皮质分化方案,并在缺血性中风影响躯体感觉皮层的大鼠模型中进行皮质内移植后,产生成熟的皮质神经元。此外,移植物衍生的神经元接收来自宿主神经元的传入和传出突触连接,显示它们整合到大鼠神经元网络中6,7。移植物来源的轴突被髓鞘化,发现在大鼠大脑的不同区域,包括梗死周围区域、胼胝体和对侧躯体感觉皮层。最重要的是,iPS细胞衍生的移植逆转了中风动物的运动缺陷7。
即使动物模型有助于研究移植存活,神经元整合以及移植细胞对运动和认知功能的影响,该系统中也缺少有关人类细胞(移植物 - 宿主)之间相互作用的信息8,9。出于这个原因,这里描述了一种长期人脑器官型培养与人iPS细胞来源神经元祖细胞离体移植的组合方法。从神经外科切除中获得的人脑器官型培养物是与大脑的生理相关的3D模型,使研究人员能够增加对人类中枢神经系统回路的理解以及测试人类脑部疾病治疗的最准确方法。然而,在这种情况下还没有进行足够的研究,在大多数情况下,已经使用了人类海马脑器官型培养物10,11。大脑皮层受到几种神经退行性疾病的影响,例如缺血性中风12 或阿尔茨海默病13,因此拥有一个人类皮质 3D 系统非常重要,该系统使我们能够扩展我们的知识并测试和验证不同的治疗策略。过去几年的几项研究使用成人皮质(hACtx)组织的培养物来模拟人类脑部疾病14,15,16,17,18,19;然而,在干细胞治疗方面可获得的信息有限。两项研究已经证明了此处描述的系统的可行性。2018年,用不同转录因子编程并移植到hACtx组织中的人类胚胎干细胞被证明会产生成熟的皮质神经元,这些神经元可以整合到成人皮质网络中20。2020 年,将 lt-NES 细胞移植到人类器官型系统中揭示了它们分化成具有功能神经元电生理特性的成熟、层特异性皮质神经元的能力。移植神经元与成人脑切片中的人类皮质神经元建立了传入和传出突触接触,狂犬病病毒逆行单突触追踪、全细胞膜片钳记录和免疫电子显微镜证实了这一点21。
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Protocol
该协议遵循瑞典隆德区域伦理委员会批准的指南(道德许可证号 2021-07006-01)。从接受颞叶癫痫择期手术的患者获得健康的新皮质组织。获得所有患者的知情同意。
注意:无论其大小如何,所有获得的组织都经过处理。然而,小于 1-1.5 mm3 的组织在技术上具有挑战性,难以处理和用振动切片机切片。
1. 组织收集、维护、切割和电镀
- 组织切片前一天的准备工作
- 在容量瓶中制备2L切割溶液(表1)。将除 MgCl 2 和 CaCl2 以外的所有成分溶解在 ~1,800 mL 去离子水中,并用碳原气体搅拌 15 分钟。然后加入适量的 1 M MgCl 2 和 CaCl2 溶液,并继续冒泡 15 分钟。最后,将烧瓶填充至2L标记;检查pH值和渗透压,并根据需要进行调整。冷冻2 x 350mL制备的溶液,并将其余的储存在4°C。
注意:pH和渗透压通常分别为7.3-7.4和295-300 mOsm。 - 准备100 mL冲洗溶液(表2)。将 476 毫克 HEPES 和 200.6 毫克葡萄糖溶解在补充有 5 毫升青霉素/链霉素的 100 毫升 HBSS 中。这可以储存在4°C长达10天。
- 制备人成人皮质(hACtx)培养基(hACtx培养基)(表3),并在细胞培养实验室的通风罩下过滤。培养基包括不含酚红的神经元培养基(见材料表)、B27补充剂、L-谷氨酰胺(见材料表)和庆大霉素。在4°C下储存长达2周。
- 在容量瓶中制备2L切割溶液(表1)。将除 MgCl 2 和 CaCl2 以外的所有成分溶解在 ~1,800 mL 去离子水中,并用碳原气体搅拌 15 分钟。然后加入适量的 1 M MgCl 2 和 CaCl2 溶液,并继续冒泡 15 分钟。最后,将烧瓶填充至2L标记;检查pH值和渗透压,并根据需要进行调整。冷冻2 x 350mL制备的溶液,并将其余的储存在4°C。
- 组织样本到达前手术当天的准备工作
- 检查所需设备和实验室空间的可用性,并用蒸馏水(不含清洁剂)彻底清洁所有手术工具和振动切片机(见 材料表)以及台式空间,然后用70%乙醇。在使用工具和设备之前,让乙醇干燥至少30分钟。
- 压碎冷冻切割溶液,用碳原气体将冰和液体的“汤”泡30分钟。然后,用压碎的溶液“汤”紧紧关闭其中一个容器,并将其放入冰箱中。这将用于从手术室收集组织。
- 校准振动切开机并设置切割参数:0.05 mm/s 速度和 1.7 mm 振动。将切割室放在振动切开器载物台上并启动与其连接的冷却器,使切割室处于-3°C的恒定温度。
- 用插入物准备切片收集室以放置组织切片和切割溶液,在室温(RT)下用碳原气体不断鼓泡。
- 在细胞培养实验室和通风罩下,使用镊子将培养插入物放入 6 孔板中。在插入物底部加入 5 mL hACtx 培养基,直到其接触膜,避免形成气泡,并在插入物顶部添加 2 mL。在将组织切片转移到插入物之前,在培养箱中在37°C和5%CO 2下平衡至少2 小时。
- 组织采集和切片程序
- 切除后,如果可能的话,立即在手术室中将患者的组织收集到装有冷冻,气泡和粉碎切割溶液的容器中。立即将冰上的封闭容器转移到实验室的切割区域。
- 检查组织并找到将其粘合(见步骤1.3.3)到振动切片机切割阶段的最佳表面,考虑皮质层的方向。如果需要,用手术刀切割不平坦的表面,以便将组织轻松放置在载物台上以获得最佳切片方向。
- 用纸巾粘合剂将纸巾粘在载物台上(见 材料表),将其放入切片室中,并立即用冷气泡切割溶液填充腔室。在整个切割过程中继续冒泡。
- 根据组织到叶片的方向,以300μm的厚度切割冠状或矢状切片,以包含所有皮质层,如果可能的话,还包括白质。将切片放入带有室温鼓泡切割溶液的收集室中。
注意:从白质侧切向皮质表面。不要去除脑膜,因为这可能会损坏组织。切割刀片通常很容易切开它们。 - 切割完所有组织后,将切片转移到带有室温冲洗溶液的无菌培养皿中,并将其运送到细胞培养实验室。此步骤对于在将切片转移到培养板之前从切片中去除多余的蔗糖是必要的。
注意:要转移切片(在此步骤和后续步骤中),请使用倒置玻璃移液管,折断较薄的部分,然后放置橡胶奶嘴进行抽吸。
- hACtx组织切片的培养和维护
- 单独将组织切片放在已经湿润和浸没的插入物的顶部。24小时后,更换培养基以进一步去除切割过程中残留的任何蔗糖或其他残留物质。
- 每7天用新鲜培养基更换培养基。2周后,使用不含庆大霉素的hACtx培养基。培养物可维持长达 2 个月。
注意:在更换培养基之前,在培养箱中以37°C和5%CO 2平衡hACtx培养基至少2 小时。新鲜培养基应每 2 周准备一次。每 2-3 天检查一次切片,如果一些培养基蒸发,请在插入物顶部添加更多。
切割解决方案 | 库存集中度 | 最终浓度 [mM] | 每 1 升 |
蔗糖 | 粉 | 200 | 68.46 克 |
氢氧化钠3 | 粉 | 21 | 1.76 克 |
氯化钾 | 粉 | 3 | 0.22 克 |
二氧化钠2聚四 | 粉 | 1.25 | 0.15 % |
葡萄糖 | 粉 | 10 | 1.80 克 |
氧化镁4 | 2 . | 2 | 2毫升 |
氯化钙2 | 2 . | 1.6 | 1.6毫升 |
氯化镁2 | 1 . | 2 | 1毫升 |
表1:切割液的组成。 MgCl 2和CaCl2用作去离子水中预先制备的1 M溶液。
冲洗液 | 库存集中度 | 最终浓度 | 每 100 毫升 |
哈佛商学院 | 1 倍 | 95毫升 | |
彭斯特雷普 | 10,000 U/毫升 | 500 U/毫升 | 5毫升 |
赫佩斯 | 粉 | 4.76 克/升 | 476毫克 |
葡萄糖 | 粉 | 2 克/升 | 200.6毫克 |
表2:冲洗液的组成。
hACtx 培养基 | 库存集中度 | 最终浓度 | 每 100 毫升 | |
不含酚红的神经元培养基 | 97.4毫升 | 见材料表 | ||
B27 | 50 倍 | 1:50 | 2毫升 | |
L-谷氨酰胺 | 100 倍 | 1:200 | 500 微升 | 见材料表 |
庆大霉素 | 50毫克/毫升 | 1:1000 | 100 微升 |
表3:hACtx培养基的组成。
2. lt-NES细胞的增殖和分化
注意:Lt-NES细胞如前所述21,22产生,并在组成型启动子(GFP-lt-NES细胞)下用携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体转导。含有3 x 106细胞的小瓶储存在-150°C直至使用。
- 制备储备溶液和培养基
- 在 10 mL PBS-0.1% BSA 中稀释 100 μg 碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF),使其储备浓度为 10 μg/mL。准备 100 μL 等分试样。
- 在 10 mL PBS-0.1% BSA 中稀释 100 μg 表皮生长因子 (EGF),使原液浓度为 10 μg/mL。准备 100 μL 等分试样。
- 等分试样 50x B27 补充剂,体积为每等分试样 100 μL。
- 在 100 mL 去离子水中稀释 10 mg 聚 L-鸟氨酸,使其储备浓度为 100 μg/mL。制作 1 mL 等分试样。
- 制备 30 μL 等分试样的 1.20 mg/mL 小鼠层粘连蛋白。
- 将 10 mL 胰蛋白酶-EDTA (0.25%) 在 90 mL PBS 中稀释至原液浓度为 0.025%。准备 1 mL 等分试样。
- 在 50 mL PBS 中稀释 0.025 g 胰蛋白酶抑制剂至储备浓度为 0.5 mg/mL。准备 1 mL 等分试样。
- 在 1 mL PBS-0.1% BSA 中稀释 10 μgWnt3a(无翼型 MMTV 集成位点家族成员 3A),使原液浓度为 10 μg/mL。以相同的方式制备BMP4(骨形态发生蛋白4)。等分在 100 μL 的体积中。
- 将 1 mg 环巴胺稀释在 2.5 mL DMSO 中至终浓度为 400 μg/mL,并制成 100 μL 等分试样。
- 制备碱性培养基(表4)和分化定义的培养基(DDM, 表5),并在4°C下储存长达2周。
- 培养皿的涂层
- 为了在增殖或分化过程中预包被培养皿以培养GFP-It-NES细胞,在去离子水中以1:100稀释聚-L-鸟氨酸,并将5mL溶液加入T25烧瓶中。在室温下孵育过夜。
- 用去离子水清洗聚-L-鸟氨酸涂层板1x,用PBS洗涤1x。
- 对于增殖中的GFP-It-NES细胞,在PBS中以1:500稀释小鼠层粘连蛋白,并在37°C下孵育至少2小时。 对于分化的GFP-It-NES细胞,在PBS中以1:100稀释小鼠层粘连蛋白,并在37°C下孵育至少2小时。
- GFP-lt-NES细胞的增殖
- 在两个不同的 15 mL 管中加热 5 mL(用于洗涤)和 5 mL(用于接种)碱性培养基。
- 在37°C下快速解冻一瓶GFP-lt-NES细胞,将它们转移到洗涤管中,并以300× g 离心5分钟。
- 小心吸出培养基,不要接触沉淀,并将细胞重悬于1 mL预热的碱性培养基中。将细胞悬液转移到含有补充有增殖因子的基本培养基的接种管中:EGF (10 ng/mL)、bFGF (10 ng/mL) 和 B27 (10 ng/mL)。将细胞接种在聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的T25烧瓶上。
- 每天用增殖因子喂养细胞。如果介质变黄,请更换介质。每三天或第四天(达到100%汇合后1天)传代一次细胞。
- 分裂GFP-lt-NES细胞以进行增殖和分化
- 每个烧瓶预热 5 mL 碱性培养基(以收集细胞),加上重新接种所需的总体积。
注意:传代以 1:3 稀释度进行以保持细胞增殖,需要 15 mL 碱性培养基,1:6 稀释度开始分化,需要 30 mL 碱性培养基。 - 抽吸从细胞培养瓶中取出培养基,并加入 500 μL 预热的 0.025% 胰蛋白酶。在室温下孵育5-10分钟。细胞的分离可以在10倍放大镜的标准光学显微镜下确认。
- 加入等体积的胰蛋白酶抑制剂(0.5 mg/mL 终浓度),然后加入 5 mL 温热碱性培养基。通过轻轻上下移液分离和收集细胞。将细胞转移到 15 mL 管中,并以 300 x g 离心 5 分钟 。
- 为了保持细胞增殖,在补充有增殖因子的新鲜碱性培养基中以1:3稀释度重新铺板,然后重复步骤2.3.4。
- 每个烧瓶预热 5 mL 碱性培养基(以收集细胞),加上重新接种所需的总体积。
- GFP-lt-NES细胞的皮质分化
- 在第 0 天,将细胞(用于分化)重悬于 30 mL 补充有增殖因子的碱性培养基中,并将它们接种在六个分化包被的 T25 烧瓶中(以 1:6 的比例分裂)。
- 在第1天,将一半的培养基改为DDM,并在其浓度的一半时添加增殖因子。
- 在第 2 天,将培养基完全更换为补充有分化因子的 DDM:BMP4 (10 ng/mL)、Wnt3a (10 ng/mL) 和环巴胺 (400 ng/mL)。
- 在第 4 天,单独添加分化因子。如果介质变黄,请更换介质。
- 在第6天,将培养基更换为补充有BMP4和Wnt3a的DDM。在此步骤中除去环巴胺。
- 在第7天,按照步骤2.4.2和步骤2.4.3中所述分离细胞。
基本介质 | 库存集中度 | 最终浓度 | 每 100 毫升 |
DMEM/F12 含 L-谷氨酰胺 | 1 倍 | 98.7毫升 | |
N-2 补充剂 | 100 倍 | 1:100 | 1毫升 |
葡萄糖 | 45% | 3.5毫升/升 | 350 微升 |
表4:lt-NES细胞增殖培养基(碱性培养基)的组成。
DDM 介质 | 库存集中度 | 最终浓度 | 每 100 毫升 |
DMEM/F12 含 L-谷氨酰胺 | 96毫升 | ||
N2 | 100 x | 1:100 | 1毫升 |
国家能源局 | 100 x | 1:100 | 1毫升 |
丙酮酸钠 | 100 毫米 | 1:100 | 1毫升 |
BSA V 分数 | 7.5% | 6.6毫升/升 | 660 微升 |
2-巯基乙醇 | 50 纳米 | 7 微升/升 | 0.7 微升 |
葡萄糖 | 45% | 3.2毫升/升 | 320 微升 |
表5:lt-NES细胞分化定义培养基(DDM)的组成。
3. 将GFP-lt-NES细胞移植到器官型hACtx切片中
注意:hACtx组织应在细胞移植前培养1周。为了便于移植过程,有必要从插入物顶部去除2 mL的hACtx培养基以防止组织漂浮。
- 将皮质引发的GFP-lt-NES细胞(来自步骤2.5.6)重悬于冷纯基底膜基质(参见 材料表)中,浓度为1 x 105 个细胞/ μL,并将溶液转移到较小的无菌管中。
注意:在移植过程中,所有材料(移液器吸头、管、毛细管等)都应预冷,以避免凝胶凝固。使用前在冰上解冻基底膜基质凝胶30分钟。 - 将细胞悬液收集到连接到橡胶奶嘴的冷玻璃毛细管中进行抽吸。通过在各个部位刺伤半干组织切片,以小滴(每滴约 1 μL)形式注入细胞悬液。
- 在37°C孵育30分钟以使凝胶凝固。将板从培养箱转移回罩,并小心地将 2 mL hACtx 培养基添加到插入物顶部以完全浸没组织。
- 每周一次用新鲜的hACtx培养基替换培养基。
4. 验证
- hACtx切片的染色
- 在所需的时间点,从细胞培养实验室取出切片,并通过将其浸入带有PBS的培养皿中将其从插入物中取出。然后,使用倒置玻璃移液管将切片转移到染色小瓶中(参见步骤1.3.5中的注释),并在4°C下用4%多聚甲醛(PFA)固定过夜。
- 每次用KPBS冲洗3x15分钟,并在4°C下用透化溶液(KPBS中的0.02%BSA和1%Triton X-100)孵育过夜。
- 第二天,加入封闭溶液(KPBS与0.2%Triton X-100,1%BSA,叠氮化钠[1:10,000]和10%正常驴血清),并在4°C孵育过夜。
- 封闭后,加入稀释在封闭溶液中的一抗(稀释液参见 表6 ),并在4°C下孵育48小时。
- 用封闭溶液洗涤3次,每次不添加血清15分钟。加入在封闭溶液中稀释的二抗(稀释液参见 表6 ),并在4°C下孵育48小时。
- 用不含血清的封闭溶液洗涤3x,并在室温下在透化溶液稀释的Hoechst染色剂中孵育2小时(1:1,000)。
- 用KPBS清洗3次,用画笔将切片安装在载玻片上,然后晾干。最后,用去离子水冲洗载玻片,去除多余的水,加入安装剂,并用玻璃盖玻片盖住。将载玻片在室温下保持至少24小时,并将它们储存在4°C直至成像。
注意:对于标记核表位的抗体,在用柠檬酸钠(10mM,pH 6.0)在65°C下透化(步骤4.1.2)2小时之前进行抗原修复。
- 全细胞膜片钳
- 在记录当天,准备1L人人工脑脊液(haCSF),经过修改以更好地匹配人脑环境(表7)。与切割溶液类似,用除CaCl2 以外的所有成分溶解在去离子水中制备约900mL溶液,并用碳原搅拌15分钟,然后加入适当体积的1M CaCl2 溶液。将容量瓶填充至1L标记,并在开始记录之前和整个实验过程中继续在室温下冒泡15分钟。
- 将组织切片从培养板转移到正置显微镜载物台上的记录室,正置显微镜以2mL / min的灌注速率不断灌注气泡haCSF,并使用浴温控制器加热至34°C。
- 用移液器拉动玻璃毛细管至平均电阻为3-5MΩ,并用新加入的2-4mg生物细胞素回填基于K-葡萄糖酸盐的内部溶液(表8)填充毛细管,用于事后鉴定记录的细胞。该内溶液的pH和渗透压分别为7.2-7.3和285-295 mOsm。
- 在宿主细胞记录的情况下,使用4倍物镜粗略地了解切片,并找到一个看起来健康的细胞,用40倍物镜进行修补。然后,继续使用标准的全细胞膜片钳。
- 在移植细胞记录的情况下,使用4倍物镜和通过移植物中的GFP报告表达在蓝色范围(460nm)的落射荧光滤光片鉴定移植细胞的组织区域。然后,用40倍物镜放大到定位区域,找到表达GFP的移植细胞,用于标准的全细胞膜片钳。
- 进入细胞后立即检查静息膜电位(RMP),并确保记录质量良好。记录全电池电压或电流钳配置中的所有感兴趣参数(例如膜电阻 [Ri]、AP 参数、钠和钾电流以及突触活性)。
- 收集所有必要的数据后,小心地缩回记录移液器,不要进一步损坏细胞,以便可以通过事后免疫染色对其进行鉴定。
- 将切片转移到4%PFA溶液中以进行进一步固定和染色,如步骤4.1中所述。链霉亲和素用于在记录过程中免疫标记充满生物细胞素的细胞。
抗体 | 稀释 | 笔记 |
主要 | ||
鸡抗GFP | 1:1000 | |
鸡抗MAP2 | 1:1000 | |
山羊抗AiF1 | 1:100 | |
鼠标抗MBP | 1:1000 | 需要抗原修复 |
鼠标抗SC123 | 1:2000 | |
兔子反纽恩 | 1:1000 | |
兔子抗Olig2 | 1:500 | |
兔子抗TMEM119 | 1:200 | |
二 次 | ||
488偶联亲和纯驴抗小鼠IgG | 1:500 | |
488-偶联亲和纯驴抗兔IgG | 1:500 | |
488-共轭亲和纯驴抗鸡IgG | 1:500 | |
Cy3偶联亲和纯驴抗鸡IgG | 1:500 | |
Cy3偶联亲和纯驴抗山羊IgG | 1:500 | |
Cy3偶联亲和纯驴抗小鼠IgG | 1:500 | |
Alexa fluor 647-缀合链霉亲和素 | 1:500 |
表6:用于免疫组织化学的一抗和二抗列表。
哈脑脊液 | 库存集中度 | 最终浓度 [mM] | 每 1 升 |
氯化钠 | 粉 | 129 | 7.54 克 |
氢氧化钠3 | 粉 | 21 | 1.76 克 |
葡萄糖 | 粉 | 10 | 1.80 克 |
氯化钾 | 粉 | 3 | 0.22 克 |
二氧化钠2聚四 | 粉 | 1.25 | 0.17 克 |
氧化镁4 | 2 . | 2 | 2毫升 |
氯化钙2 | 2 . | 1.6 | 1.6毫升 |
表7:人工脑脊液(haCSF)的组成。
K-葡萄糖酸内溶液 | 库存集中度 | 最终浓度 [mM] | 每 100 毫升 |
K-葡萄糖酸酯 | 粉 | 122.5 | 2.87 克 |
氯化钾 | 粉 | 12.5 | 93.18毫克 |
氯化钠 | 粉 | 8 | 46.76毫克 |
赫佩斯 | 粉 | 10 | 238.32毫克 |
甲基黄胺 | 粉 | 2 | 101.4毫克 |
Na3GTP | 粉 | 0.3 | 17.0毫克 |
注意: 用 KOH/HCl 调节 pH 值 |
表8:基于K-葡萄糖酸的内部溶液的组成。
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Representative Results
按照所描述的方案,如上所述,收集和处理来自颞叶癫痫患者的hACtx组织。在培养24小时后固定几片以研究宿主组织的起点。对不同神经细胞群的分析,如神经元(表达NeuN和Map2,图1A),少突胶质细胞(Olig2和MBP,图1B)和星形胶质细胞(人类特异性GFAP,也称为STEM123,图1C)显示组织的最佳保存。
下一步是研究培养条件如何影响人体组织中的神经元活力。为此,在培养2周后对NeuN和Map2进行染色。在研究的时间点,这两种神经元标志物的表达仍然存在于组织中(图2A)。此外,还进行了电生理记录以评估功能。使用全细胞膜片钳的记录显示,神经元具有持续的RMP(平均-70mV)和膜输入电阻(Ri)(平均300MΩ),与急性制剂的神经元相当21,23。总体而言,细胞的活性略低于新鲜组织,尽管大多数细胞仍然能够发射至少一个(图2B-E),如果不是多个,动作电位(AP,图2F-I),并且在电压钳模式下阶跃电流注入时存在快速向内钠和缓慢向外钾电流(图2C-E,G-I)。综上所述,这些记录表明器官型培养物中的神经元相对健康,并表现出典型的神经生理内在特性。
此外,通过Tmem119和Iba1染色在24小时(图3A)和2周培养(图3B)组织中评估培养对小胶质细胞活化的影响。正如预期的那样,观察到小胶质细胞外观的一些变化。培养2周后,与急性组织相比,它们的分支减少,并获得更活化的形态。
在表征宿主组织后,按如下方式进行lt-NES细胞衍生祖细胞的移植。将GFP-lt-NES细胞分化7天并移植到培养的hACtx组织中1周(图4A)。使用GFP的免疫组织化学观察移植的概述(图4B,C)。将结果与先前移植的结果进行比较,由于切除和铺板之间的时间窗口较长,保存不良的组织。图像显示,在最佳系统中, 离体 移植后4周,移植的GFP-lt-NES细胞在整个器官型培养中表现出延长的神经突和广泛而复杂的树化(图4B)。由于宿主连接不良,保存不良的组织无法成功移植。几乎没有任何移植细胞存活下来;此外,在整个人体切片中广泛观察到死细胞上的碎片和抗体的非特异性标记(图4C)。
关于移植细胞的电生理特性,发现在成功移植的情况下,细胞不仅在形态上而且在功能上变得活跃,具有重复且经常自发的AP,快速向内钠和缓慢向外钾电流,以及一定水平的突触活性,表明移植物在移植后4周与宿主组织的功能整合(图4D-H)。
图1:培养24小时后hACtx组织中不同细胞群的表征。 hACtx组织的代表性共聚焦图像显示(A)神经元(表达NeuN和Map2),(B)少突胶质细胞(Olig2和MBP)和(C)星形胶质细胞(人类特异性GFAP [STEM123])的存在。核染色(Ho:Hoechst,蓝色)包含在单个和合并的面板中。比例尺 = 20 μm。白色箭头表示共定位。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:器官型培养 2 周后 hACtx 神经元的表征和电生理特性。 (A)显示NeuN和Map2表达的hACtx组织的代表性共聚焦图像。(B-I)在2周大的hACtx组织中记录的皮质神经元的例子。(乙、女)记录神经元的生物细胞素标记(红色)以及核染色(Ho:Hoechst,蓝色),包含在合并的面板中。比例尺 = 20 μm。全细胞膜片钳记录迹线,显示具有 (C-E) 单个或 (G-I) 多个 AP 的单元示例。AP通过(C,G)250 pA步进或(D,H)RMP处0至300 pA斜坡电流注入诱导。插图表示每种情况下其中一个 AP 的放大视图。(E,I)在两个电池示例中,在电压箝位模式下以10 mV增量从−70 mV施加电压去极化步骤时,观察到向内钠和向外钾电流。请点击此处查看此图的大图。
图 3:hACtx 组织中小胶质细胞群的表征。 hACtx组织的共聚焦图像显示(A)24小时和(B)培养2周后Iba1和Tmem119的表达。核染色(Ho:Hoechst,蓝色)包含在单个和合并的面板中。比例尺 = 20 μm。白色箭头表示共定位。 请点击此处查看此图的大图。
图4:GFP-lt-NES细胞离体移植4周后lt-NES细胞衍生神经元的概述和电生理特性。 (A)实验设计。差异 = 差异。(乙,丙)移植的GFP-lt-NES细胞在(B)保存完好和(C)保存不良的hACtx组织中的代表性共聚焦图像。比例尺 = 50 μm。 (D)移植物衍生神经元自发发射AP的示例迹线。插图表示其中一个 AP 的放大视图。重复AP可以通过从−70 mV电位注入(E)步进(50 pA)或(F)斜坡(0至300 pA)去极化电流来诱导。(G) 在电压钳位模式下,10 mV 去极化步骤从 -70 mV 的保持电位感应向内钠电流和向外钾电流。(H)在电压钳模式下,可以在接物衍生的神经元中观察到自发的突触后电流(sPSC),保持电位为-70mV。插图表示某些 sPSC 的放大视图。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
获得足够高质量的hACtx切片是该协议中最关键的一步。 皮质组织是从接受切除手术的癫痫患者获得的24。切除组织的质量以及切除和培养之间的组织暴露时间至关重要;组织从手术室转移到实验室并切割的速度越快,器官型培养就越理想。理想情况下,应在收集后的最初几个小时内切割组织并将其转移到细胞培养实验室。在此过程中组织的氧合也提高了切片的质量。在这方面,组织样本越大,到达核心的氧气浓度就越低,因此,如果不及时切割组织,活力就越低。如果宿主组织的质量不是最佳的,干细胞疗法的验证将无法进行。
当皮质组织从人脑转移到平板上时,必须考虑一些限制。在切割过程中,大量轴突被解剖,诱发神经元损伤,从而导致炎症过程,如小胶质细胞活化25。出于这个原因,即使组织在位于人脑中时被认为是健康的,由于在器官型切片26,27的切除和制备过程中遭受的部分损伤,培养中的细胞行为也可能有所不同。可以使用不同的技术监测小胶质细胞群体的变化,包括测量释放的细胞因子水平或评估形态变化28。重要的是,尽管由于环境从整个器官到离体培养条件的变化,在培养中观察到2周的小胶质细胞活化,但神经元在该时间点仍然存活,如神经元染色和其电生理特性分析所示。较厚的组织切片保存得更好;然而,营养物质对切片内部的渗透受到影响,导致部分组织死亡。因此,300 μm是器官型培养的最佳厚度。
与其他3D培养方法(如类器官或球状体)相比,hACtx组织的器官型培养具有明显的优势。来源是完全发育的人脑,这意味着细胞和基质环境,以及不同细胞群的成熟状态,与成人大脑中常见的相同25,29,30。类器官更类似于胎儿组织,这对于某些研究领域(例如发育障碍的建模)是最佳的31,但对于神经退行性疾病的研究则不是,例如,神经退行性疾病的研究,这些疾病主要影响成年人群并且发病较晚32,33。最重要的是,人体组织的器官型培养是迄今为止唯一允许验证细胞疗法的人体系统。
关于干细胞移植用于神经退行性疾病神经元替代的大部分知识都来自 体内 动物建模。尽管这些系统对于评估受损宿主回路中移植细胞的调节作用非常有价值,但不幸的是,由于啮齿动物和人类之间的明显差异,在此设置中测试的疗法在转化为临床时通常会失败34。出于这个原因,hACtx组织的器官型培养是模拟影响皮层的人类神经退行性疾病的绝佳策略,因为可以研究人类神经群体之间的相互作用和人类大脑结构的保存25。
综上所述,这种成人皮层长期器官型培养和诱导多能干细胞来源皮质祖细胞离 体 皮质移植的组合方法对于基于干细胞的疗法的验证是一种有前途的策略,可以促进神经元替代策略的临床转化,以刺激受损大脑的功能恢复。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了瑞典研究委员会,瑞典脑基金会,瑞典中风基金会,斯科讷地区,Thorsten and Elsa Segerfalk基金会以及瑞典政府战略研究领域倡议(StemTherapy)的资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue Cutting and electrophysiology | |||
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
HEPES | AppliChem | A1069 | |
Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2x91 | |
Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
Plastic Petri dish | Any suitable | ||
Potassium chloride | Merck | 104936 | |
Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
Vibratome | Leica | VT1200 S | |
RINSING SOLUTION | |||
D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
HEPES | AppliChem | A1069 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
Forceps | Any suitable | ||
Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
GENERATION OF lt-NES cells | |||
2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
Paint brush | Any suitable | ||
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
Distilled water | |||
Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
Sodium citrate | |||
Distilled water | |||
Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
References
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