Summary
Este protocolo describe cultivos organotípicos a largo plazo de la corteza humana adulta combinados con trasplante intracortical ex vivo de progenitores corticales derivados de células madre pluripotentes inducidas, que presentan una metodología novedosa para probar aún más las terapias basadas en células madre para trastornos neurodegenerativos humanos.
Abstract
Los trastornos neurodegenerativos son comunes y heterogéneos en cuanto a sus síntomas y afectación celular, lo que complica su estudio debido a la falta de modelos animales adecuados que imiten completamente las enfermedades humanas y la escasa disponibilidad de tejido cerebral humano post-mortem. El cultivo de tejido nervioso humano adulto ofrece la posibilidad de estudiar diferentes aspectos de los trastornos neurológicos. Los mecanismos moleculares, celulares y bioquímicos podrían abordarse fácilmente en este sistema, así como probar y validar medicamentos o diferentes tratamientos, como las terapias basadas en células. Este método combina cultivos organotípicos a largo plazo de la corteza humana adulta, obtenidos de pacientes epilépticos sometidos a cirugía resectiva, y trasplante intracortical ex vivo de progenitores corticales derivados de células madre pluripotentes inducidos. Este método permitirá el estudio de la supervivencia celular, la diferenciación neuronal, la formación de entradas y salidas sinápticas y las propiedades electrofisiológicas de las células derivadas del ser humano después del trasplante en tejido cortical humano adulto intacto. Este enfoque es un paso importante previo al desarrollo de una plataforma de modelado de enfermedades humanas en 3D que acercará la investigación básica a la traducción clínica de terapias basadas en células madre para pacientes con diferentes trastornos neurológicos y permitirá el desarrollo de nuevas herramientas para reconstruir circuitos neuronales dañados.
Introduction
Los trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer o el accidente cerebrovascular isquémico, son un grupo de enfermedades que comparten la característica común del mal funcionamiento neuronal o la muerte. Son heterogéneos en cuanto al área cerebral y población neuronal afectada. Desafortunadamente, los tratamientos para estas enfermedades son escasos o de eficacia limitada debido a la falta de modelos animales que imiten lo que ocurre en el cerebro humano 1,2. La terapia con células madre es una de las estrategias más prometedoras para la regeneración cerebral3. La generación de progenitores neuronales a partir de células madre de diferentes fuentes se ha desarrollado mucho en los últimos años 4,5. Publicaciones recientes han demostrado que las células madre neuroepiteliales autorenovadoras a largo plazo (lt-NES) derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPS), siguiendo un protocolo de diferenciación cortical y después del trasplante intracortical en un modelo de rata con accidente cerebrovascular isquémico que afecta a la corteza somatosensorial, generan neuronas corticales maduras. Además, las neuronas derivadas del injerto recibieron conexiones sinápticas aferentes y eferentes de las neuronas huésped, mostrando su integración en la red neuronal de ratas 6,7. Los axones derivados del injerto se mielinizaron y se encontraron en diferentes áreas del cerebro de la rata, incluida el área periinfarto, el cuerpo calloso y la corteza somatosensorial contralateral. Lo más importante es que el trasplante derivado de células iPS revirtió los déficits motores en animales con accidente cerebrovascular7.
Incluso si los modelos animales ayudan a estudiar la supervivencia del trasplante, la integración neuronal y el efecto de las células injertadas sobre las funciones motoras y cognitivas, la información sobre la interacción entre células humanas (injerto-huésped) falta en este sistema 8,9. Por esta razón, aquí se describe un método combinado de cultivo organotípico del cerebro humano a largo plazo con el trasplante ex vivo de progenitores neuronales derivados de células iPS humanas. Los cultivos organotípicos del cerebro humano obtenidos de resecciones neuroquirúrgicas son modelos 3D fisiológicamente relevantes del cerebro que permiten a los investigadores aumentar su comprensión de los circuitos del sistema nervioso central humano y la forma más precisa de probar tratamientos para trastornos cerebrales humanos. Sin embargo, no se ha realizado suficiente investigación en este contexto, y en la mayoría de los casos, se han utilizado cultivos organotípicos del cerebro del hipocampo humano10,11. La corteza cerebral se ve afectada por varios trastornos neurodegenerativos, como el ictus isquémico12 o la enfermedad de Alzheimer13, por lo que es importante contar con un sistema 3D cortical humano que nos permita ampliar nuestros conocimientos y probar y validar diferentes estrategias terapéuticas. Varios estudios realizados en los últimos años han utilizado cultivos de tejido cortical humano adulto (hACtx) para modelar enfermedades cerebrales humanas 14,15,16,17,18,19; sin embargo, hay información limitada disponible en el contexto de la terapia con células madre. Dos estudios ya han demostrado la viabilidad del sistema descrito aquí. En 2018, se demostró que las células madre embrionarias humanas programadas con diferentes factores de transcripción y trasplantadas en tejido hACtx dan lugar a neuronas corticales maduras que podrían integrarse en redes corticales humanas adultas20. En 2020, el trasplante de células lt-NES en el sistema organotípico humano reveló su capacidad para diferenciarse en neuronas corticales maduras y específicas de capa con las propiedades electrofisiológicas de las neuronas funcionales. Las neuronas injertadas establecieron contactos sinápticos aferentes y eferentes con las neuronas corticales humanas en los cortes cerebrales adultos, como lo corroboran el trazado monosináptico retrógrado del virus de la rabia, los registros de pinzas de parche de células enteras y la microscopía inmunoelectrónica21.
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Protocol
Este protocolo sigue las directrices aprobadas por el Comité Regional de Ética, Lund, Suecia (número de permiso ético 2021-07006-01). Se obtuvo tejido neocortical sano de pacientes sometidos a cirugía electiva para la epilepsia del lóbulo temporal. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes.
NOTA: Todos los tejidos obtenidos fueron procesados independientemente de su tamaño. Sin embargo, los tejidos de menos de 1-1.5 mm3 de tamaño serán técnicamente difíciles de manejar y seccionar con un vibratomo.
1. Recolección de tejidos, mantenimiento, corte y recubrimiento
- Preparaciones el día antes del corte de tejido
- Preparar 2 L de solución de corte (tabla 1) en un matraz aforado. Disuelva todos los ingredientes excepto MgCl 2 y CaCl2 en ~ 1,800 ml de agua desionizada y burbujee con gas carbógeno durante 15 min. Luego agregue cantidades apropiadas de soluciones de 1 M de MgCl 2 y CaCl2 y continúe burbujeando durante otros 15 minutos. Por último, llenar el matraz hasta la marca de 2 L; compruebe el pH y la osmolaridad y ajuste si es necesario. Congelar 2 x 350 ml de la solución preparada y almacenar el resto a 4 °C.
NOTA: El pH y la osmolaridad son típicamente 7.3-7.4 y 295-300 mOsm, respectivamente. - Preparar 100 ml de solución de enjuague (Tabla 2). Disuelva 476 mg de HEPES y 200,6 mg de glucosa en 100 ml de HBSS suplementado con 5 ml de penicilina/estreptomicina. Esto se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 10 días.
- Preparar el medio de cultivo cortical adulto humano (medio hACtx) (medio hACtx) (Tabla 3) y filtrarlo en el laboratorio de cultivo celular bajo una campana ventilada. El medio comprende medio neuronal sin rojo fenol (ver la Tabla de Materiales), suplemento B27, L-glutamina (ver la Tabla de Materiales) y gentamicina. Conservar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
- Preparar 2 L de solución de corte (tabla 1) en un matraz aforado. Disuelva todos los ingredientes excepto MgCl 2 y CaCl2 en ~ 1,800 ml de agua desionizada y burbujee con gas carbógeno durante 15 min. Luego agregue cantidades apropiadas de soluciones de 1 M de MgCl 2 y CaCl2 y continúe burbujeando durante otros 15 minutos. Por último, llenar el matraz hasta la marca de 2 L; compruebe el pH y la osmolaridad y ajuste si es necesario. Congelar 2 x 350 ml de la solución preparada y almacenar el resto a 4 °C.
- Preparativos el día de la operación antes de la llegada de las muestras de tejido
- Verifique la disponibilidad del equipo necesario y el espacio de laboratorio, y limpie a fondo todas las herramientas quirúrgicas y el vibratomo (consulte la Tabla de materiales), así como el espacio de sobremesa, con agua destilada (sin detergente), seguido de etanol al 70%. Deje que el etanol se seque durante al menos 30 minutos antes de usar las herramientas y el equipo.
- Triture la solución de corte congelada y burbujee la "sopa" de hielo y líquido con gas carbógeno durante 30 minutos. Luego, cierre herméticamente uno de los recipientes con la solución triturada "sopa" y colóquelo en la nevera. Esto se usará para recolectar el tejido de la sala de operaciones.
- Calibre el vibratomo y ajuste los parámetros de corte: velocidad de 0,05 mm/s y vibración de 1,7 mm. Coloque la cámara de corte en una etapa de vibratomo y encienda el enfriador conectado a ella para que la cámara esté a una temperatura constante de -3 ° C.
- Prepare la cámara de recolección de rodajas con insertos para colocar las rodajas de tejido y la solución de corte, burbujeándola constantemente con gas carbógeno a temperatura ambiente (RT).
- En el laboratorio de cultivo celular y bajo una campana ventilada, coloque los insertos de cultivo en una placa de 6 pocillos usando fórceps. Añadir 5 mL de medio hACtx en la parte inferior del inserto hasta que entre en contacto con la membrana, evitando la formación de burbujas, y añadir 2 mL en la parte superior del inserto. Equilibrar en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2 durante al menos 2 h antes de transferir las rodajas de tejido a los insertos.
- Procedimientos de recolección y corte de tejidos
- Inmediatamente después de la resección, recoja el tejido del paciente en la sala de operaciones, si es posible, directamente en un recipiente con solución de corte congelada, burbujeada y triturada. Transfiera el recipiente cerrado en hielo inmediatamente al área de corte del laboratorio.
- Inspeccionar el tejido y localizar la mejor superficie para pegarlo (ver paso 1.3.3) a la etapa de corte del vibratomo, teniendo en cuenta la orientación de las capas corticales. Si es necesario, corte la superficie irregular con un bisturí para que sea fácil colocar el tejido en el escenario para una orientación óptima del corte.
- Pegue el tejido a la plataforma con adhesivo tisular (consulte la Tabla de materiales), colóquelo en la cámara de corte e inmediatamente llene la cámara con una solución de corte con burbujas frías. Continúe el burbujeo durante todo el procedimiento de corte.
- Corte cortes coronales o sagitales, dependiendo de la orientación del tejido a la cuchilla, a un espesor de 300 μm para contener todas las capas corticales y, si es posible, la sustancia blanca. Coloque las rodajas en la cámara de recolección con solución de corte burbujeante en RT.
NOTA: Corte desde el lado de la sustancia blanca hacia la superficie de la corteza. No retire las meninges, ya que esto puede dañar el tejido. La cuchilla de corte generalmente los corta fácilmente. - Una vez que se haya cortado todo el tejido, transfiera las rodajas a una placa de Petri estéril con solución de enjuague en RT y transpórtelas al laboratorio de cultivo celular. Este paso es necesario para eliminar el exceso de sacarosa de las rodajas antes de transferirlas a la placa de cultivo.
NOTA: Para transferir las rodajas (en este y los siguientes pasos), use una pipeta de vidrio invertido, rompa la parte más delgada y coloque una tetina de goma para succionar.
- Cultivo y mantenimiento de cortes de tejido hACtx
- Coloque individualmente las rodajas de tejido sobre los insertos ya húmedos y sumergidos. Después de 24 h, cambie el medio para eliminar aún más cualquier resto de sacarosa u otras sustancias residuales de los procedimientos de corte.
- Reemplace el medio de cultivo con medio fresco cada 7 días. Después de 2 semanas, use hACtx medium sin gentamicina. El cultivo se puede mantener hasta por 2 meses.
NOTA: Equilibrar el medio hACtx en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2 durante al menos 2 h antes de que el medio cambie. El medio fresco debe prepararse cada 2 semanas. Revise las rodajas cada 2-3 días y, si parte del medio se ha evaporado, agregue más a la parte superior del inserto.
| Solución de corte | Concentración de existencias | Concentración final [mM] | Por 1 L |
| Sacarosa | Polvo | 200 | 68,46 g |
| NaHCO3 | Polvo | 21 | 1,76 g |
| Kcl | Polvo | 3 | 0,22 g |
| NaH2PO4 | Polvo | 1.25 | 0,17 g |
| Glucosa | Polvo | 10 | 1,80 g |
| MgSO4 | 1 M | 2 | 2 ml |
| CaCl2 | 1 M | 1.6 | 1,6 ml |
| MgCl2 | 2 M | 2 | 1 ml |
Tabla 1: Composición de la solución de corte. MgCl 2 y CaCl2 se utilizan como soluciones prepreparadas de 1 M en agua desionizada.
| Solución de enjuague | Concentración de existencias | Concentración final | Por 100 ml |
| HBSS | 1x | 95 ml | |
| PenStrep | 10.000 U/ml | 500 U/ml | 5 ml |
| HEPES | Polvo | 4,76 g/L | 476 mg |
| Glucosa | Polvo | 2 g/L | 200.6 mg |
Tabla 2: Composición de la solución de aclarado.
| Medio hACtx | Concentración de existencias | Concentración final | Por 100 ml | |
| Medio neuronal sin rojo fenol | 97.4 ml | ver Tabla de Materiales | ||
| B27 | 50x | 1:50 | 2 ml | |
| L-Glutamina | 100x | 1:200 | 500 μL | ver Tabla de Materiales |
| Gentamicina | 50 mg/ml | 1:1000 | 100 μL |
Tabla 3: Composición del medio hACtx.
2. Proliferación y diferenciación de células lt-NES
NOTA: Las células Lt-NES se generan como se describió anteriormente21,22 y se transducen con un vector lentiviral que transporta proteína fluorescente verde (GFP) bajo un promotor constitutivo (células GFP-lt-NES). Los viales que contienen 3 x 106 células se almacenan a -150 °C hasta su uso.
- Preparación de las soluciones y medios de stock
- Diluir 100 μg de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en 10 ml de PBS-0,1% de BSA para tener una concentración madre de 10 μg/ml. Preparar alícuotas de 100 μL.
- Diluir 100 μg de factor de crecimiento epidérmico (EGF) en 10 ml de PBS-0,1% de BSA para tener una concentración madre de 10 μg/ml. Preparar alícuotas de 100 μL.
- Suplemento alícuota 50x B27 en un volumen de 100 μL por alícuota.
- Diluir 10 mg de poli-L-ornitina en 100 ml de agua desionizada para tener una concentración madre de 100 μg/ml. Hacer 1 ml de alícuotas.
- Preparar 30 μL de alícuotas de laminina de ratón de 1,20 mg/ml.
- Diluir 10 ml de tripsina-EDTA (0,25%) en 90 ml de PBS hasta una concentración madre de 0,025%. Preparar 1 ml de alícuotas.
- Diluir 0,025 g de inhibidor de tripsina en 50 ml de PBS hasta una concentración madre de 0,5 mg/ml. Preparar 1 ml de alícuotas.
- Diluir 10 μg de Wnt3a (miembro de la familia 3A del sitio de integración MMTV tipo sin alas) en 1 ml de PBS-0.1% BSA para tener una concentración de stock de 10 μg / ml. Prepare BMP4 (proteína morfogenética ósea 4) de la misma manera. Alícuota en un volumen de 100 μL.
- Diluir 1 mg de ciclopamina en 2,5 ml de DMSO hasta una concentración final de 400 μg/ml, y hacer 100 μL de alícuotas.
- Preparar el medio básico (Tabla 4) y el medio definido por diferenciación (DDM, Tabla 5), y almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
- Recubrimiento de platos de cultivo
- Para pre-cubrir los platos para cultivar las células GFP-It-NES durante la proliferación o diferenciación, diluir poli-L-ornitina 1:100 en agua desionizada y añadir 5 ml de la solución a un matraz T25. Incubar durante la noche en RT.
- Lave las placas recubiertas de poli-L-ornitina 1x con agua desionizada y 1x con PBS.
- Para las células GFP-It-NES en proliferación, diluir la laminina de ratón a 1:500 en PBS e incubar durante al menos 2 h a 37 °C. Para las células GFP-It-NES en diferenciación, diluir la laminina de ratón a 1:100 en PBS e incubar durante al menos 2 h a 37 °C.
- Proliferación de las células GFP-lt-NES
- Calentar 5 ml (para lavar) y 5 ml (para sembrar) de medio básico en dos tubos diferentes de 15 ml.
- Descongelar rápidamente un vial de células GFP-lt-NES a 37 °C, transferirlas al tubo de lavado y centrifugar a 300 x g durante 5 min.
- Aspirar el medio con cuidado sin tocar el pellet, y resuspender las células en 1 mL de medio básico precalentado. Transfiera la suspensión celular al tubo de siembra que contiene medio básico suplementado con factores de proliferación: EGF (10 ng/mL), bFGF (10 ng/mL) y B27 (10 ng/mL). Sembrar las células en un matraz T25 recubierto de poli-L-ornitina/laminina.
- Alimente las células con factores de proliferación todos los días. Reemplace el medio si se vuelve amarillo. Paso de las células cada tercer o cuarto día (1 día después de que alcancen el 100% de confluencia).
- División de las células GFP-lt-NES para su proliferación y diferenciación
- Precaliente 5 ml de medio básico por matraz (para recoger las células), más el volumen total necesario para volver a sembrarlas.
NOTA: El paso se realiza en una dilución 1:3 para mantener las células en proliferación, requiriendo 15 mL de medio básico, y una dilución 1:6 para iniciar la diferenciación, requiriendo 30 mL de medio básico. - Retirar el medio del matraz de cultivo celular por aspiración y añadir 500 μL de tripsina al 0,025% precalentada. Incubar durante 5-10 min en RT. El desprendimiento de las células se puede confirmar bajo un microscopio óptico estándar con un aumento de 10x.
- Añadir un volumen igual de inhibidor de tripsina (0,5 mg/ml de concentración final) seguido de 5 ml de medio básico caliente. Separa y recoge las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Transfiera las células a un tubo de 15 ml y centrifugar durante 5 minutos a 300 x g.
- Para mantener las células en proliferación, repúltelas a una dilución 1:3 en medio básico fresco complementado con factores de proliferación, y repite el paso 2.3.4.
- Precaliente 5 ml de medio básico por matraz (para recoger las células), más el volumen total necesario para volver a sembrarlas.
- Diferenciación cortical de las células GFP-lt-NES
- El día 0, resuspender las células (que se utilizarán para la diferenciación) en 30 ml de medio básico suplementado con factores de proliferación, y colocarlas en seis matraces T25 recubiertos de diferenciación (divididos 1:6).
- El día 1, cambie la mitad del medio a DDM y agregue factores de proliferación a la mitad de su concentración.
- En el día 2, cambie completamente el medio a DDM suplementado con factores de diferenciación: BMP4 (10 ng / ml), Wnt3a (10 ng / ml) y ciclopamina (400 ng / ml).
- En el día 4, agregue solo los factores de diferenciación. Reemplace el medio si se vuelve amarillo.
- El día 6, cambie el medio a DDM suplementado con BMP4 y Wnt3a. La ciclopamina se elimina en este paso.
- El día 7, separe las celdas como se indica en los pasos 2.4.2 y 2.4.3.
| Medio Básico | Concentración de existencias | Concentración final | Por 100 ml |
| DMEM/F12 con L-Glutamina | 1x | 98.7 mL | |
| Suplemento N-2 | 100x | 1:100 | 1 ml |
| Glucosa | 45% | 3.5 mL/L | 350 μL |
Tabla 4: Composición del medio de proliferación de células lt-NES (medio básico).
| Medio DDM | Concentración de existencias | Concentración final | Por 100 ml |
| DMEM/F12 con L-Glutamina | 96 ml | ||
| N2 | 100 x | 1:100 | 1 ml |
| NEAA | 100 x | 1:100 | 1 ml |
| Piruvato de sodio | 100 mM | 1:100 | 1 ml |
| BSA V Fracción | 7.5% | 6,6 ml/l | 660 μL |
| 2-mercaptoetanol | 50 nM | 7 μL/L | 0,7 μL |
| Glucosa | 45% | 3.2 mL/L | 320 μL |
Tabla 5: Composición del medio definido por diferenciación (DDM) de las células lt-NES.
3. Trasplante de las células GFP-lt-NES en rodajas organotípicas de hACtx
NOTA: El tejido hACtx debe cultivarse durante 1 semana antes del trasplante de células. Para facilitar el procedimiento de trasplante, es necesario extraer 2 ml del medio hACtx de la parte superior del inserto para evitar que el tejido flote.
- Resuspender las células GFP-lt-NES preparadas corticalmente (a partir del paso 2.5.6) en una matriz de membrana basal pura fría (ver la Tabla de materiales) a una concentración de 1 x 105 células/μL y transferir la solución a un tubo estéril más pequeño.
NOTA: Durante el procedimiento de trasplante, todos los materiales (puntas de pipeta, tubos, capilar, etc.) deben enfriarse previamente para evitar la solidificación del gel. Descongele el gel de la matriz de membrana basal en hielo durante 30 minutos antes de su uso. - Recoja la suspensión celular en un capilar de vidrio frío conectado a una tetina de goma para succionar. Inyecte la suspensión celular como pequeñas gotas (aprox. 1 μL cada una) apuñalando el corte de tejido semiseco en varios sitios.
- Incubar a 37 °C durante 30 minutos para que el gel se solidifique. Transfiera la placa de la incubadora a la campana y agregue cuidadosamente 2 ml de medio hACtx a la parte superior del inserto para sumergir completamente el tejido.
- Reemplace el medio de cultivo con medio hACtx fresco una vez por semana.
4. Validación
- Tinción de las rodajas hACtx
- En el momento deseado, saque las rodajas del laboratorio de cultivo celular y retírelas del inserto sumergiéndolas en una placa de Petri con PBS. A continuación, transfiera las rodajas a los viales de tinción utilizando una pipeta de vidrio invertido (véase la NOTA en el paso 1.3.5) y fíjelas con paraformaldehído al 4% (PFA) durante la noche a 4 °C.
- Enjuagar 3 veces con KPBS durante 15 min cada vez e incubar durante la noche a 4 °C con solución de permeabilización (0,02% BSA y 1% Triton X-100 en KPBS).
- Al día siguiente, añadir solución de bloqueo (KPBS con Triton X-100 al 0,2%, BSA al 1%, azida sódica [1:10.000] y suero de burro normal al 10%), e incubar durante la noche a 4 °C.
- Después del bloqueo, añadir los anticuerpos primarios (ver Tabla 6 para las diluciones) diluidos en la solución de bloqueo, e incubar durante 48 h a 4 °C.
- Lave 3 veces con solución bloqueante sin agregar suero durante 15 minutos cada una. Añadir los anticuerpos secundarios diluidos en solución bloqueante (ver Tabla 6 para las diluciones) e incubar durante 48 h a 4 °C.
- Lavar 3 veces con solución bloqueante sin suero, e incubar durante 2 h en RT en tinción Hoechst diluida en solución de permeabilización (1:1.000).
- Lave 3x con KPBS, monte las rodajas en portaobjetos de vidrio con un pincel y déjelas secar. Finalmente, enjuague los portaobjetos con agua desionizada, elimine el exceso de agua, agregue el medio de montaje y cubra con un cubreobjetos de vidrio. Conservar los portaobjetos durante al menos 24 h a RT y conservarlos a 4 °C hasta obtener imágenes.
NOTA: Para el marcado de anticuerpos con epítopos nucleares, realizar la recuperación de antígenos antes de la permeabilización (paso 4.1.2) con citrato de sodio (10 mM, pH 6,0) durante 2 h a 65 °C.
- Placa-pinza de célula entera
- El día de la grabación, prepare 1 L de líquido cefalorraquídeo artificial humano (haCSF), modificado para que coincida mejor con el entorno del cerebro humano (Tabla 7). Similar a la solución de corte, hacer aproximadamente 900 ml de la solución con todos los ingredientes excepto CaCl 2 disuelto en agua desionizada, y burbujear con carbogen durante 15 minutos antes de agregar el volumen apropiado de solución de CaCl2 1 M. Llene el matraz volumétrico hasta la marca de 1 L y continúe burbujeando en RT durante 15 minutos adicionales antes de comenzar la grabación y durante todo el experimento.
- Transfiera los cortes de tejido de la placa de cultivo a la cámara de registro en la etapa de un microscopio vertical que se perfunde constantemente con haCSF burbujeante a una velocidad de perfusión de 2 ml / min y se calienta a 34 ° C utilizando un controlador de temperatura de baño.
- Tire de los capilares de vidrio con un extractor de pipeta a una resistencia promedio de 3-5 MΩ, y rellene los capilares con una solución interna a base de K-gluconato (Tabla 8) con 2-4 mg de biocitina recién agregados para la identificación post-hoc de las células registradas. El pH y la osmolaridad de esta solución interna son 7.2-7.3 y 285-295 mOsm, respectivamente.
- En el caso de la grabación de la célula huésped, obtenga una visión general aproximada de la rebanada con un objetivo 4x y encuentre una celda de aspecto saludable para parchear con un objetivo 40x. Luego, proceda con la abrazadera de parche estándar de celda completa.
- En el caso de la grabación de células injertadas, identifique el área de tejido con las células injertadas utilizando un objetivo 4x y un filtro de epifluorescencia en el rango azul (460 nm) mediante la expresión del reportero GFP en el injerto. Luego, acérquese al área ubicada con un objetivo de 40x y encuentre una célula injertada que exprese GFP para una pinza de parche de células enteras estándar.
- Verifique el potencial de membrana en reposo (RMP) inmediatamente después de entrar en la celda y asegúrese de que la calidad de la grabación sea buena. Registre todos los parámetros de interés (por ejemplo, resistencia de la membrana [Ri], parámetros AP, corrientes de sodio y potasio y actividad sináptica) en la configuración de voltaje de celda completa o pinza de corriente.
- Después de recopilar todos los datos necesarios, retraiga cuidadosamente la pipeta de registro sin dañar aún más la célula para que pueda identificarse con inmunotinción post-hoc.
- Transfiera la rebanada a la solución de PFA al 4% para su posterior fijación y tinción, como se describe en el paso 4.1. La estreptavidina se utiliza para inmunomarcar las células llenas de biocitina durante las grabaciones.
| ANTICUERPOS | Dilución | Notas |
| Primario | ||
| Pollo anti-GFP | 1:1000 | |
| Pollo anti-MAP2 | 1:1000 | |
| Cabra anti-AiF1 | 1:100 | |
| Ratón anti-MBP | 1:1000 | Se necesita recuperación de antígenos |
| Ratón anti-SC123 | 1:2000 | |
| Conejo anti-NeuN | 1:1000 | |
| Conejo anti-Olig2 | 1:500 | |
| Conejo anti-Tmem119 | 1:200 | |
| Secundario | ||
| AffinityPure Donkey anti-ratón IgG conjugado con 488 | 1:500 | |
| 488-conjugado AffinityPure Donkey anti-conejo IgG | 1:500 | |
| 488-conjugado AffinityPure Donkey anti-pollo IgG | 1:500 | |
| Cy3-conjugado AffinityPure Donkey anti-pollo IgG | 1:500 | |
| Cy3-conjugado AffinityPure Donkey anti-cabra IgG | 1:500 | |
| Cy3-conjugado AffinityPure Donkey anti-ratón IgG | 1:500 | |
| Estreptavidina conjugada con Alexa fluor 647 | 1:500 |
Tabla 6: Lista de anticuerpos primarios y secundarios para inmunohistoquímica.
| haCSF | Concentración de existencias | Concentración final [mM] | Por 1 L |
| NaCl | Polvo | 129 | 7,54 g |
| NaHCO3 | Polvo | 21 | 1,76 g |
| Glucosa | Polvo | 10 | 1,80 g |
| Kcl | Polvo | 3 | 0,22 g |
| NaH2PO4 | Polvo | 1.25 | 0,17 g |
| MgSO4 | 1 M | 2 | 2 ml |
| CaCl2 | 1 M | 1.6 | 1,6 ml |
Tabla 7: Composición del líquido cefalorraquídeo artificial (haCSF).
| Solución interna de K-gluconato | Concentración de existencias | Concentración final [mM] | Por 100 ml |
| K-gluconato | Polvo | 122.5 | 2,87 g |
| Kcl | Polvo | 12.5 | 93,18 mg |
| NaCl | Polvo | 8 | 46,76 mg |
| HEPES | Polvo | 10 | 238,32 mg |
| MgATP | Polvo | 2 | 101.4 mg |
| Na3GTP | Polvo | 0.3 | 17.0 mg |
| Nota: Ajuste el pH con KOH/HCl | |||
Tabla 8: Composición de la solución interna a base de K-gluconato.
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Representative Results
Siguiendo el protocolo descrito, se recolectó y procesó tejido hACtx de un paciente con epilepsia del lóbulo temporal, como se explicó anteriormente. Se fijaron unas rodajas después de 24 h en cultivo para estudiar el punto de partida del tejido huésped. El análisis de diferentes poblaciones de células neuronales como neuronas (que expresan NeuN y Map2, Figura 1A), oligodendrocitos (Olig2 y MBP, Figura 1B) y astrocitos (GFAP específico para humanos, también llamado STEM123, Figura 1C) mostró una preservación óptima del tejido.
El siguiente paso fue estudiar cómo las condiciones de cultivo afectan la viabilidad neuronal en el tejido humano. Para ello, la tinción de NeuN y Map2 se realizó después de 2 semanas de cultivo. En el punto de tiempo estudiado, la expresión de estos dos marcadores neuronales todavía estaba presente en el tejido (Figura 2A). Además, se realizaron registros electrofisiológicos para evaluar la funcionalidad. Los registros utilizando pinza de parche de células enteras mostraron que las neuronas habían sostenido RMP (-70 mV en promedio) y resistencia de entrada de membrana (Ri) (300 MΩ en promedio), comparable a las neuronas de preparaciones agudas21,23. En general, las células eran ligeramente menos activas que en el tejido fresco, aunque la mayoría de las células todavía eran capaces de disparar al menos uno (Figura 2B-E), si no múltiples, potenciales de acción (AP, Figura 2F-I), y las corrientes rápidas de sodio hacia adentro y las corrientes lentas de potasio hacia afuera estaban presentes en las inyecciones de corriente escalonada en modo de pinza de voltaje (Figura 2C-E, G-I). Tomados en conjunto, estas grabaciones indicaron que las neuronas en cultivos organotípicos eran relativamente sanas y exhibían propiedades intrínsecas neurofisiológicas típicas.
Además, el efecto del cultivo sobre la activación de la microglía se evaluó mediante tinción Tmem119 e Iba1 en tejido cultivado de 24 h (Figura 3A) y 2 semanas (Figura 3B). Como era de esperar, se observaron algunos cambios en la apariencia microglial. Después de 2 semanas en cultivo, se volvieron menos ramificados y adquirieron una morfología más activada en comparación con el tejido agudo.
Después de caracterizar el tejido huésped, el trasplante de los progenitores derivados de células lt-NES se realizó de la siguiente manera. Las células GFP-lt-NES se diferenciaron durante 7 días y se injertaron en tejido hACtx cultivado durante 1 semana (Figura 4A). Se observó una visión general del trasplante mediante inmunohistoquímica con GFP (Figura 4B, C). Los resultados se compararon con los de trasplantes previos en tejido que estaba mal conservado debido a que había una ventana de tiempo más larga entre la resección y el recubrimiento. Las imágenes muestran que, en el sistema óptimo, 4 semanas después del trasplante ex vivo , las células GFP-lt-NES injertadas exhibieron neuritas extendidas y arborizaciones extensas y complejas a lo largo de todo el cultivo organotípico (Figura 4B). El tejido mal conservado no permitió un trasplante exitoso debido a la mala conectividad del huésped. Apenas ninguna célula injertada sobrevivió; además, los desechos y el etiquetado inespecífico de anticuerpos en células muertas se observaron ampliamente en toda la rebanada humana (Figura 4C).
Con respecto a las propiedades electrofisiológicas de las células injertadas, se encontró que, en el caso de un trasplante exitoso, las células se convirtieron no solo morfológicamente sino también en neuronas maduras funcionalmente activas con AP repetitivos y a menudo espontáneos, sodio rápido hacia adentro y corrientes lentas hacia afuera de potasio, y un cierto nivel de actividad sináptica, lo que indica la integración funcional del injerto con el tejido huésped 4 semanas después del injerto (Figura 4D-H).
Figura 1: Caracterización de las diferentes poblaciones celulares en el tejido hACtx tras 24 h en cultivo. Imágenes confocales representativas de tejido hACtx que muestran la presencia de (A) neuronas (que expresan NeuN y Map2), (B) oligodendrocitos (Olig2 y MBP) y (C) astrocitos (GFAP específico para humanos [STEM123]). La tinción nuclear (Ho: Hoechst, azul) se incluye en los paneles individuales y combinados. Barra de escala = 20 μm. Las flechas blancas indican colocalización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Caracterización y propiedades electrofisiológicas de neuronas hACtx después de 2 semanas en cultivo organotípico. (A) Imágenes confocales representativas del tejido hACtx que muestran la expresión de NeuN y Map2. (B-I) Ejemplos de las neuronas corticales registradas en tejido hACtx de 2 semanas de edad. (B,F) Etiquetado de biocitina de la neurona registrada (rojo), junto con tinción nuclear (Ho: Hoechst, azul), incluida en un panel combinado. Barras de escala = 20 μm. Trazas de registro de pinza de parche de células completas que muestran ejemplos de una celda con (C-E) AP únicos o (G-I) múltiples. Los AP fueron inducidos por (C, G) un paso de 250 pA, o (D, H) una inyección de corriente en rampa de 0 a 300 pA en RMP. Los recuadros indican una vista ampliada de uno de los AP en cada caso. (E,I) Se observaron corrientes de sodio y potasio hacia afuera en ambos ejemplos de celdas en los pasos de despolarización de voltaje aplicados de -70 mV en incrementos de 10 mV en modo de abrazadera de voltaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Caracterización de la población de microglía en el tejido hACtx. Imágenes confocales del tejido hACtx que muestran la expresión de Iba1 y Tmem119 después de (A) 24 h y (B) 2 semanas en cultivo. La tinción nuclear (Ho: Hoechst, azul) se incluye en los paneles individuales y combinados. Barra de escala = 20 μm. Las flechas blancas indican colocalización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Visión general y propiedades electrofisiológicas de las neuronas derivadas de células lt-NES 4 semanas después del trasplante ex vivo de células GFP-lt-NES. (A) Diseño experimental. Diff = diferenciación. (B,C) Imágenes confocales representativas de células GFP-lt-NES injertadas en (B) tejido hACtx bien conservado y (C) mal conservado. Barras de escala = 50 μm. (D) Ejemplo de traza de una neurona derivada del injerto que dispara espontáneamente APs. El recuadro indica una vista ampliada de uno de los AP. Los AP repetitivos podrían ser inducidos por una inyección de corriente despolarizante de corriente despolarizante de -70 mV en un paso (50 pA) (E) o (F) en rampa (0 a 300 pA). (G) Las corrientes de sodio y potasio hacia adentro fueron inducidas por pasos de despolarización de 10 mV en modo de abrazadera de voltaje desde un potencial de retención de -70 mV. (H) En el modo de pinza de voltaje, se pudieron observar corrientes postsinápticas espontáneas (sPSC) en las neuronas derivadas del injerto a un potencial de retención de -70 mV. Los recuadros indican una vista ampliada de algunas de las sPSC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La obtención de cortes hACtx de calidad suficiente es el paso más crítico en este protocolo. El tejido cortical se obtiene de pacientes epilépticos sometidos a cirugía resectiva24. La calidad del tejido resecado, así como el tiempo de exposición del tejido entre la resección y el cultivo, es crítica; Cuanto más rápido se transfiera el tejido de la sala de cirugía al laboratorio y se corte, más óptimo será el cultivo organotípico. Idealmente, el tejido debe cortarse y transferirse al laboratorio de cultivo celular dentro de las primeras horas después de la recolección. La oxigenación del tejido durante este proceso también mejora la calidad de las rodajas. En este sentido, cuanto mayor sea la muestra de tejido, menor será la concentración de oxígeno que llega al núcleo y, por lo tanto, menor será la viabilidad si el tejido no se corta a tiempo. Si la calidad del tejido huésped no es óptima, la validación de las terapias con células madre no será posible.
Cuando el tejido cortical se transfiere del cerebro humano a una placa, se deben tener en cuenta algunas limitaciones. Durante el proceso de corte, un gran número de axones son disecados, induciendo daño neuronal que conducirá a procesos inflamatorios como la activación de la microglía25. Por esta razón, incluso si el tejido se considera sano cuando se localiza en el cerebro humano, el comportamiento celular en cultivo podría ser diferente debido al daño parcial sufrido durante la resección y preparación de las secciones organotípicas26,27. Los cambios en la población de microglia podrían ser monitoreados utilizando diferentes técnicas, incluyendo la medición de los niveles de citoquinas liberadas o la evaluación de cambios morfológicos28. Es importante destacar que, aunque la activación de la microglía se observó a las 2 semanas en cultivo como resultado del cambio en el entorno de un órgano completo a condiciones de cultivo ex vivo, las neuronas aún eran viables en este punto de tiempo, como lo demuestra la tinción neuronal y el análisis de sus propiedades electrofisiológicas. Las rodajas de tejido más gruesas se conservan mejor; Sin embargo, la penetración de nutrientes a la parte interna de la rebanada se ve afectada, lo que resulta en la muerte parcial del tejido. Por esta razón, 300 μm es el espesor óptimo para el cultivo organotípico.
Los cultivos organotípicos de tejido hACtx tienen claras ventajas en comparación con otros métodos de cultivo 3D como organoides o esferoides. La fuente es un cerebro humano completamente desarrollado, lo que significa que el entorno celular y de la matriz, así como el estado de maduración de las diferentes poblaciones celulares, son los mismos que los que generalmente se encuentran en el cerebro humano adulto25,29,30. Los organoides son más similares a los tejidos fetales, lo cual es óptimo para algunos campos de investigación como el modelado de trastornos del desarrollo31 pero no, por ejemplo, para el estudio de enfermedades neurodegenerativas, que afectan principalmente a la población adulta y tienen un inicio tardío32,33. Lo más importante es que el cultivo organotípico de tejido humano es, hasta la fecha, el único sistema humano que permite la validación de terapias celulares.
La mayor parte del conocimiento sobre el trasplante de células madre para el reemplazo neuronal en trastornos neurodegenerativos se deriva del modelado animal in vivo . A pesar de que estos sistemas son extremadamente valiosos para evaluar el efecto modulador de las células trasplantadas en el circuito del huésped dañado, desafortunadamente, las terapias probadas en esta configuración normalmente fallan cuando se traducen a la clínica debido a las claras diferencias entre roedores y humanos34. Por esta razón, el cultivo organotípico de tejido hACtx es una excelente estrategia para modelar enfermedades neurodegenerativas humanas que afectan la corteza debido a la posibilidad de estudiar las interacciones entre poblaciones neuronales humanas y la preservación de la estructura cerebral humana25.
En resumen, esta metodología combinada de cultivos organotípicos a largo plazo de la corteza humana adulta y trasplante intracortical ex vivo de progenitores corticales derivados de células madre pluripotentes inducidas es una estrategia prometedora para la validación de terapias basadas en células madre, que pueden facilitar la traducción clínica de estrategias de reemplazo neuronal para estimular la recuperación funcional en el cerebro dañado.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones del Consejo Sueco de Investigación, la Fundación Sueca del Cerebro, la Fundación Sueca del Accidente Cerebrovascular, la Región de Skåne, la Fundación Thorsten y Elsa Segerfalk y la Iniciativa del Gobierno Sueco para Áreas de Investigación Estratégicas (StemTherapy).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Cutting and electrophysiology | |||
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
| Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
| Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2x91 | |
| Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
| Plastic Petri dish | Any suitable | ||
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
| Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| RINSING SOLUTION | |||
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
| Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| Forceps | Any suitable | ||
| Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
| GENERATION OF lt-NES cells | |||
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
| Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
| Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
| Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
| Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
| Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
| Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
| T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
| Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
| Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
| Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
| Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
| Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
| Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
| Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
| Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
| Paint brush | Any suitable | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
| Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
| Distilled water | |||
| Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
| Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
| Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
| Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium citrate | |||
| Distilled water | |||
| Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
| Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
| Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
References
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