Summary
Dit protocol beschrijft organotypische culturen op lange termijn van de volwassen menselijke cortex in combinatie met ex vivo intracorticale transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide corticale voorlopers, die een nieuwe methodologie presenteren om op stamcellen gebaseerde therapieën voor menselijke neurodegeneratieve aandoeningen verder te testen.
Abstract
Neurodegeneratieve aandoeningen komen vaak voor en zijn heterogeen in termen van hun symptomen en cellulaire affectatie, waardoor hun studie gecompliceerd is vanwege het ontbreken van goede diermodellen die menselijke ziekten volledig nabootsen en de slechte beschikbaarheid van post-mortem menselijk hersenweefsel. Volwassen menselijke zenuwweefselkweek biedt de mogelijkheid om verschillende aspecten van neurologische aandoeningen te bestuderen. Moleculaire, cellulaire en biochemische mechanismen kunnen gemakkelijk worden aangepakt in dit systeem, evenals het testen en valideren van geneesmiddelen of verschillende behandelingen, zoals celgebaseerde therapieën. Deze methode combineert langdurige organotypische culturen van de volwassen menselijke cortex, verkregen van epileptische patiënten die resectieve chirurgie ondergaan, en ex vivo intracorticale transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide corticale voorlopercellen. Deze methode zal de studie van celoverleving, neuronale differentiatie, de vorming van synaptische inputs en outputs en de elektrofysiologische eigenschappen van van de mens afgeleide cellen na transplantatie in intact volwassen menselijk corticale weefsel mogelijk maken. Deze aanpak is een belangrijke stap voorafgaand aan de ontwikkeling van een 3D-platform voor het modelleren van menselijke ziekten dat fundamenteel onderzoek dichter bij de klinische vertaling van op stamcellen gebaseerde therapieën voor patiënten met verschillende neurologische aandoeningen zal brengen en de ontwikkeling van nieuwe hulpmiddelen voor het reconstrueren van beschadigde neurale circuits mogelijk zal maken.
Introduction
Neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer of ischemische beroerte, zijn een groep ziekten die het gemeenschappelijke kenmerk van neuronale storing of dood delen. Ze zijn heterogeen in termen van het hersengebied en de neuronale populatie die wordt beïnvloed. Helaas zijn behandelingen voor deze ziekten schaars of van beperkte werkzaamheid vanwege het ontbreken van diermodellen die nabootsen wat er in het menselijk brein gebeurt 1,2. Stamceltherapie is een van de meest veelbelovende strategieën voor hersenregeneratie3. De generatie van neuronale voorlopers uit stamcellen uit verschillende bronnen is de afgelopen jaren sterk ontwikkeld 4,5. Recente publicaties hebben aangetoond dat door de mens geïnduceerde pluripotente stam (iPS) cel-afgeleide lange termijn zelfvernieuwende neuro-epitheliale-achtige stam (lt-NES) cellen, volgens een corticale differentiatieprotocol en na intracorticale transplantatie in een ratmodel met ischemische beroerte die de somatosensorische cortex beïnvloedt, volwassen corticale neuronen genereren. Bovendien ontvingen de van graft afgeleide neuronen afferente en efferente synaptische verbindingen van de gastheerneuronen, wat hun integratie in het neuronale netwerk van de rataantoont 6,7. De van het transplantaat afgeleide axonen werden gemyeliniseerd en gevonden in verschillende gebieden van het rattenbrein, waaronder het peri-infarctgebied, corpus callosum en contralaterale somatosensorische cortex. Het belangrijkste is dat iPS-celtransplantatie motorische tekorten bij beroertedieren omkeerde7.
Zelfs als diermodellen helpen bij het bestuderen van transplantatieoverleving, neuronale integratie en het effect van de getransplanteerde cellen op motorische en cognitieve functies, ontbreekt informatie over interactie tussen menselijke cellen (graft-host) in dit systeem 8,9. Om deze reden wordt hier een gecombineerde methode van langdurige organotypische cultuur van de menselijke hersenen met de ex vivo transplantatie van van menselijke iPS-cellen afgeleide neuronale voorlopers beschreven. Organotypische culturen van het menselijk brein verkregen uit neurochirurgische resecties zijn fysiologisch relevante 3D-modellen van de hersenen waarmee onderzoekers hun begrip van de menselijke circuits van het centrale zenuwstelsel en de meest nauwkeurige manier om behandelingen voor menselijke hersenaandoeningen te testen, kunnen vergroten. Er is echter niet genoeg onderzoek gedaan in deze context en in de meeste gevallen zijn menselijke hippocampale hersenorganotypische culturen gebruikt10,11. De hersenschors wordt beïnvloed door verschillende neurodegeneratieve aandoeningen, zoals ischemische beroerte12 of de ziekte van Alzheimer13, dus het is belangrijk om een menselijk corticale 3D-systeem te hebben waarmee we onze kennis kunnen uitbreiden en verschillende therapeutische strategieën kunnen testen en valideren. Verschillende studies in de afgelopen jaren hebben culturen van volwassen humaan corticale (hACtx) weefsel gebruikt om menselijke hersenziekten te modelleren 14,15,16,17,18,19; Er is echter beperkte informatie beschikbaar in het kader van stamceltherapie. Twee studies hebben de haalbaarheid van het hier beschreven systeem al aangetoond. In 2018 werd aangetoond dat menselijke embryonale stamcellen geprogrammeerd met verschillende transcriptiefactoren en getransplanteerd in hACtx-weefsel aanleiding gaven tot volwassen corticale neuronen die konden integreren in volwassen menselijke corticale netwerken20. In 2020 onthulde de transplantatie van lt-NES-cellen in het menselijke organotypische systeem hun vermogen om te differentiëren in volwassen, laagspecifieke corticale neuronen met de elektrofysiologische eigenschappen van functionele neuronen. De geënte neuronen legden zowel afferente als efferente synaptische contacten met de menselijke corticale neuronen in de volwassen hersenplakken, zoals bevestigd door retrograde monosynaptische tracering van het rabiësvirus, patchklemregistraties van hele cellen en immuno-elektronenmicroscopie21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de richtlijnen die zijn goedgekeurd door de regionale ethische commissie, Lund, Zweden (ethisch vergunningsnummer 2021-07006-01). Gezond neocorticale weefsel werd verkregen van patiënten die electieve chirurgie ondergingen voor temporale kwab epilepsie. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten.
OPMERKING: Alle verkregen weefsels werden verwerkt, ongeacht hun grootte. Weefsels kleiner dan 1-1,5 mm3 groot zullen echter technisch uitdagend zijn om te hanteren en te snijden met een vibratoom.
1. Weefselverzameling, onderhoud, snijden en plating
- Preparaten op de dag voor het snijden van weefsel
- Bereid 2 l snijoplossing (tabel 1) in een maatkolf. Los alle ingrediënten behalve MgCl 2 en CaCl2 op in ~ 1.800 ml gedeïoniseerd water en bel gedurende 15 minuten met carbogengas. Voeg vervolgens de juiste hoeveelheden van 1 M MgCl 2- en CaCl2-oplossingen toe en blijf nog 15 minuten borrelen. Vul ten slotte de kolf tot de 2 L-markering; controleer de pH en osmolariteit en pas deze indien nodig aan. Vries 2 x 350 ml van de bereide oplossing in en bewaar de rest bij 4 °C.
OPMERKING: De pH en osmolariteit zijn meestal respectievelijk 7,3-7,4 en 295-300 mOsm. - Bereid 100 ml spoeloplossing (tabel 2). Los 476 mg HEPES en 200,6 mg glucose op in 100 ml HBSS aangevuld met 5 ml penicilline/streptomycine. Dit kan tot 10 dagen bewaard worden bij 4 °C.
- Bereid humaan volwassen corticale (hACtx) kweekmedium (hACtx-medium) (tabel 3) en filtreer het in het celkweeklaboratorium onder een geventileerde kap. Het medium bestaat uit neuronaal medium zonder fenolrood (zie de materiaaltabel), B27-supplement, L-glutamine (zie de materiaaltabel) en gentamicine. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.
- Bereid 2 l snijoplossing (tabel 1) in een maatkolf. Los alle ingrediënten behalve MgCl 2 en CaCl2 op in ~ 1.800 ml gedeïoniseerd water en bel gedurende 15 minuten met carbogengas. Voeg vervolgens de juiste hoeveelheden van 1 M MgCl 2- en CaCl2-oplossingen toe en blijf nog 15 minuten borrelen. Vul ten slotte de kolf tot de 2 L-markering; controleer de pH en osmolariteit en pas deze indien nodig aan. Vries 2 x 350 ml van de bereide oplossing in en bewaar de rest bij 4 °C.
- Preparaten op de dag van de operatie vóór de aankomst van de weefselmonsters
- Controleer de beschikbaarheid van de benodigde apparatuur en laboratoriumruimte en reinig alle chirurgische hulpmiddelen en het vibratoom grondig (zie de tabel met materialen), evenals de tafelruimte, met gedestilleerd water (zonder reinigingsmiddel), gevolgd door 70% ethanol. Laat de ethanol minstens 30 minuten drogen voordat u de gereedschappen en apparatuur gebruikt.
- Plet de bevroren snijoplossing en bubbel de "soep" van ijs en vloeistof met carbogengas gedurende 30 minuten. Sluit vervolgens een van de containers met de gemalen oplossing ''soep'' goed af en plaats deze in de ijskast. Dit zal worden gebruikt om het weefsel uit de operatiekamer te verzamelen.
- Kalibreer het vibratoom en stel de snijparameters in: 0,05 mm/s snelheid en 1,7 mm trilling. Plaats de snijkamer op een vibratomentrap en start de koeler die erop is aangesloten, zodat de kamer een constante temperatuur van −3 °C heeft.
- Bereid de plakverzamelkamer voor met inzetstukken om de weefselplakken en de snijoplossing te plaatsen en laat het constant borrelen met carbogengas bij kamertemperatuur (RT).
- Plaats in het celkweeklab en onder een geventileerde kap de kweekinzetstukken in een 6-putplaat met behulp van een tang. Voeg 5 ml hACtx-medium toe aan de onderkant van het inzetstuk totdat het in contact komt met het membraan, waardoor de vorming van bellen wordt vermeden, en voeg 2 ml toe aan de bovenkant van het inzetstuk. Evenwicht in de couveuse bij 37 °C en 5% CO 2 gedurende ten minste2 uur voordat de weefselplakken in de inserts worden overgebracht.
- Procedures voor het verzamelen en snijden van weefsels
- Verzamel onmiddellijk na resectie het weefsel van de patiënt in de operatiekamer, indien mogelijk, rechtstreeks in een container met bevroren, bubbelende en gemalen snij-oplossing. Breng de gesloten container op ijs onmiddellijk over naar het snijgebied van het laboratorium.
- Inspecteer het weefsel en zoek het beste oppervlak om te lijmen (zie stap 1.3.3) naar het snijstadium van het vibratoom, rekening houdend met de oriëntatie van de corticale lagen. Snijd indien nodig het ongelijke oppervlak met een scalpel, zodat het gemakkelijk is om het weefsel op het podium te plaatsen voor een optimale snijoriëntatie.
- Lijm het weefsel op het podium met weefsellijm (zie de tabel met materialen), plaats het in de snijkamer en vul de kamer onmiddellijk met koud gebubbelde snijoplossing. Ga door met het borrelen tijdens het hele snijproces.
- Snijd coronale of sagittale plakjes, afhankelijk van de oriëntatie van weefsel tot mes, op een dikte van 300 μm om alle corticale lagen en, indien mogelijk, de witte stof te bevatten. Leg de plakjes in de opvangkamer met borrelende snijoplossing bij RT.
OPMERKING: Snijd van de witte stofzijde naar het oppervlak van de cortex. Verwijder de hersenvliezen niet, omdat dit het weefsel kan beschadigen. Het snijmes snijdt er meestal gemakkelijk doorheen. - Zodra al het weefsel is gesneden, breng je de plakjes over in een steriele petrischaal met spoeloplossing bij RT en transporteer je ze naar het celkweeklaboratorium. Deze stap is nodig om overtollige sucrose uit de plakjes te verwijderen voordat ze op de kweekplaat worden overgebracht.
OPMERKING: Om de plakjes over te brengen (in deze en de volgende stappen), gebruikt u een omgekeerde glazen pipet, breekt u het dunnere deel af en plaatst u een rubberen speen om te zuigen.
- Kweek en onderhoud van hACtx weefselplakjes
- Plaats de plakjes weefsel afzonderlijk op de reeds natte en ondergedompelde inserts. Vervang na 24 uur het medium om eventuele resterende sacharose of andere reststoffen uit de snijprocedures verder te verwijderen.
- Vervang het kweekmedium om de 7 dagen door vers medium. Gebruik na 2 weken hACtx-medium zonder gentamicine. De cultuur kan maximaal 2 maanden worden gehandhaafd.
OPMERKING: Balanceer het hACtx-medium in de incubator bij 37 °C en 5% CO 2 gedurende ten minste2 uur vóór de mediumwissel. Vers medium moet om de 2 weken worden bereid. Controleer de plakjes om de 2-3 dagen en voeg, als een deel van het medium is verdampt, meer toe aan de bovenkant van de insert.
| Snij-oplossing | Voorraadconcentratie | Eindconcentratie [mM] | Per 1 L |
| Sacharose | Poeder | 200 | 68.46 gr |
| NaHCO3 | Poeder | 21 | 1,76 gr |
| Kcl | Poeder | 3 | 0,22 g |
| NaH2PO4 | Poeder | 1.25 | 0,17 g |
| Glucose | Poeder | 10 | 1,80 gr |
| MgSO4 | 1 m | 2 | 2 ml |
| CaCl2 | 1 m | 1.6 | 1,6 ml |
| MgCl2 | 2 m | 2 | 1 ml |
Tabel 1: Samenstelling van de snijoplossing. MgCl 2 en CaCl2 worden gebruikt als vooraf bereide 1 M-oplossingen in gedeïoniseerd water.
| Spoeloplossing | Voorraadconcentratie | Eindconcentratie | Per 100 ml |
| HBSS | 1x | 95 ml | |
| Penstreptokokken | 10.000 U/ml | 500 U/ml | 5 ml |
| HEPES | Poeder | 4,76 g/l | 476 mg |
| Glucose | Poeder | 2 g/l | 200,6 mg |
Tabel 2: Samenstelling van de spoeloplossing.
| hACtx medium | Voorraadconcentratie | Eindconcentratie | Per 100 ml | |
| Neuronaal medium zonder fenolrood | 97,4 ml | zie materiaaltabel | ||
| B27 | 50x | 1:50 | 2 ml | |
| L-Glutamine | 100x | 1:200 | 500 μL | zie materiaaltabel |
| Gentamicine | 50 mg/ml | 1:1000 | 100 μL |
Tabel 3: Samenstelling van hACtx-medium.
2. Proliferatie en differentiatie van lt-NES-cellen
OPMERKING: Lt-NES-cellen worden gegenereerd zoals eerder beschreven21,22 en getransduceerd met een lentivirale vector die groen fluorescerend eiwit (GFP) draagt onder een constitutieve promotor (GFP-lt-NES-cellen). Injectieflacons met 3 x 106 cellen worden bewaard bij −150 °C tot gebruik.
- Bereiding van de voorraadoplossingen en media
- Verdun 100 μg basische fibroblastgroeifactor (bFGF) in 10 ml PBS-0,1% BSA tot een voorraadconcentratie van 10 μg/ml. Bereid 100 μL aliquots.
- Verdun 100 μg epidermale groeifactor (EGF) in 10 ml PBS-0,1% BSA tot een stamconcentratie van 10 μg/ml. Bereid 100 μL aliquots.
- Aliquot 50x B27 supplement in een volume van 100 μL per aliquot.
- Verdun 10 mg poly-L-ornithine in 100 ml gedeïoniseerd water tot een stamconcentratie van 100 μg/ml. Maak 1 ml aliquots.
- Bereid 30 μL aliquots van 1,20 mg/ml muislaminine.
- Verdun 10 ml trypsine-EDTA (0,25%) in 90 ml PBS tot een voorraadconcentratie van 0,025%. Bereid 1 ml aliquots.
- Verdun 0,025 g trypsineremmer in 50 ml PBS tot een stamconcentratie van 0,5 mg/ml. Bereid 1 ml aliquots.
- Verdun 10 μg Wnt3a (Wingless-type MMTV-integratieplaatsfamilielid 3A) in 1 ml PBS-0,1% BSA tot een voorraadconcentratie van 10 μg/ml. Bereid BMP4 (botmorfogenetisch eiwit 4) op dezelfde manier voor. Aliquot in een volume van 100 μL.
- Verdun 1 mg cyclopamine in 2,5 ml DMSO tot een eindconcentratie van 400 μg/ml en maak 100 μl aliquots.
- Bereid basismedium (tabel 4) en differentiatiegedefinieerd medium (DDM, tabel 5) en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.
- Coating van cultuurgerechten
- Om de gerechten voor te coaten om de GFP-It-NES-cellen tijdens proliferatie of differentiatie te kweken, verdunt u poly-L-ornithine 1:100 in gedeïoniseerd water en voegt u 5 ml van de oplossing toe aan een T25-kolf. Incubeer 's nachts bij RT.
- Was de poly-L-ornithine gecoate platen 1x met gedeïoniseerd water en 1x met PBS.
- Voor GFP-It-NES-cellen in proliferatie, verdun muislaminine bij 1:500 in PBS en incubeer gedurende ten minste 2 uur bij 37 °C. Voor GFP-It-NES-cellen in differentiatie, verdun muislaminine bij 1:100 in PBS en incubeer gedurende ten minste 2 uur bij 37 °C.
- Proliferatie van de GFP-lt-NES-cellen
- Verwarm 5 ml (voor wassen) en 5 ml (voor zaaien) basismedium in twee verschillende buisjes van 15 ml.
- Ontdooi snel een injectieflacon met GFP-lt-NES-cellen bij 37 °C, breng ze over in de wasbuis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g .
- Zuig het medium voorzichtig aan zonder de pellet aan te raken en resuspensie van de cellen in 1 ml voorverwarmd basisch medium. Breng de celsuspensie over naar de zaaibuis met basisch medium aangevuld met proliferatiefactoren: EGF (10 ng / ml), bFGF (10 ng / ml) en B27 (10 ng / ml). Zaai de cellen uit op een poly-L-ornithine/met laminine beklede T25-kolf.
- Voed de cellen elke dag met proliferatiefactoren. Vervang het medium als het geel wordt. Passeer de cellen om de derde of vierde dag (1 dag nadat ze 100% confluency hebben bereikt).
- Splitsen van de GFP-lt-NES cellen voor proliferatie en differentiatie
- Verwarm 5 ml basisch medium per kolf voor (om de cellen te verzamelen), plus het totale volume dat nodig is om ze opnieuw in te zaaien.
OPMERKING: De passage wordt gedaan bij een verdunning van 1:3 om de cellen in proliferatie te houden, waarbij 15 ml basisch medium nodig is, en een verdunning van 1:6 om differentiatie te starten, waarvoor 30 ml basisch medium nodig is. - Verwijder het medium uit de celkweekkolf door aspiratie en voeg 500 μL voorverwarmd 0,025% trypsine toe. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij RT. Het loslaten van de cellen kan worden bevestigd onder een standaard lichtmicroscoop bij 10x vergroting.
- Voeg een gelijk volume trypsineremmer (0,5 mg/ml eindconcentratie) toe, gevolgd door 5 ml warm basisch medium. Maak de cellen los en verzamel ze door zachtjes op en neer te pipetteren. Breng de cellen over in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g.
- Om de cellen in proliferatie te houden, herplaat met een verdunning van 1:3 in vers basismedium aangevuld met proliferatiefactoren en herhaal stap 2.3.4.
- Verwarm 5 ml basisch medium per kolf voor (om de cellen te verzamelen), plus het totale volume dat nodig is om ze opnieuw in te zaaien.
- Corticale differentiatie van de GFP-lt-NES cellen
- Op dag 0 resuspensieer je de cellen (te gebruiken voor differentiatie) in 30 ml basismedium aangevuld met proliferatiefactoren en plaats je ze in zes met differentiatie gecoate T25-kolven (gesplitst 1:6).
- Verander op dag 1 de helft van het medium in DDM en voeg proliferatiefactoren toe aan de helft van hun concentratie.
- Verander op dag 2 het medium volledig in DDM aangevuld met differentiatiefactoren: BMP4 (10 ng / ml), Wnt3a (10 ng / ml) en cyclopamine (400 ng / ml).
- Tel op dag 4 alleen de differentiatiefactoren bij elkaar op. Vervang het medium als het geel wordt.
- Verander op dag 6 het medium in DDM aangevuld met BMP4 en Wnt3a. De cyclopamine wordt bij deze stap verwijderd.
- Maak op dag 7 de cellen los zoals vermeld in stap 2.4.2 en stap 2.4.3.
| Basis Medium | Voorraadconcentratie | Eindconcentratie | Per 100 ml |
| DMEM/F12 met L-Glutamine | 1x | 98,7 ml | |
| N-2 supplement | 100x | 1:100 | 1 ml |
| Glucose | 45% | 3,5 ml/l | 350 μL |
Tabel 4: Samenstelling van het proliferatiemedium van lt-NES-cellen (basisch medium).
| DDM-medium | Voorraadconcentratie | Eindconcentratie | Per 100 ml |
| DMEM/F12 met L-Glutamine | 96 ml | ||
| N2 | 100 x | 1:100 | 1 ml |
| Neaa | 100 x | 1:100 | 1 ml |
| Natriumpyruvaat | 100 mM | 1:100 | 1 ml |
| BSA V Fractie | 7.5% | 6,6 ml/l | 660 μL |
| 2-mercaptoethanol | 50 nM | 7 μL/L | 0,7 μL |
| Glucose | 45% | 3,2 ml/l | 320 μL |
Tabel 5: Samenstelling van differentiatiegedefinieerd medium (DDM) van lt-NES-cellen.
3. Transplantatie van de GFP-lt-NES-cellen in organotypische hACtx-plakjes
OPMERKING: Het hACtx-weefsel moet gedurende 1 week voorafgaand aan de celtransplantatie worden gekweekt. Om de transplantatieprocedure te vergemakkelijken, is het noodzakelijk om 2 ml van het hACtx-medium van de bovenkant van de insert te verwijderen om te voorkomen dat het weefsel zweeft.
- Resuspendeer de corticale geprimeerde GFP-lt-NES-cellen (vanaf stap 2.5.6) in koude zuivere keldermembraanmatrix (zie de materiaaltabel) in een concentratie van 1 x 105 cellen/μL en breng de oplossing over naar een kleinere steriele buis.
OPMERKING: Tijdens de transplantatieprocedure moeten alle materialen (pipetpunten, buizen, capillair, enz.) worden voorgekoeld om stolling van de gel te voorkomen. Ontdooi de keldermembraanmatrixgel op ijs gedurende 30 minuten voor gebruik. - Verzamel de celsuspensie in een koud glazen capillair dat is verbonden met een rubberen speen voor afzuiging. Injecteer de celsuspensie als kleine druppels (elk ongeveer 1 μL) door de halfdroge weefselschijf op verschillende plaatsen te steken.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten zodat de gel stolt. Breng de plaat van de incubator terug naar de kap en voeg voorzichtig 2 ml hACtx-medium toe aan de bovenkant van het inzetstuk om het weefsel volledig onder te dompelen.
- Vervang het kweekmedium eenmaal per week door vers hACtx-medium.
4. Validatie
- Kleuring van de hACtx-plakjes
- Haal op het gewenste tijdstip de plakjes uit het celkweeklab en verwijder ze uit de insert door deze onder te dompelen in een petrischaaltje met PBS. Breng vervolgens de plakjes over naar kleuringsflacons met behulp van een omgekeerde glazen pipet (zie de OPMERKING in stap 1.3.5) en fixeer ze met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende een nacht bij 4 °C.
- Spoel 3x met KPBS gedurende 15 minuten elke keer en incubeer 's nachts bij 4 °C met permeabilisatieoplossing (0,02% BSA en 1% Triton X-100 in KPBS).
- Voeg de volgende dag een blokkeringsoplossing toe (KPBS met 0,2% Triton X-100, 1% BSA, natriumazide [1:10.000] en 10% normaal ezelsserum) en incubeer 's nachts bij 4 °C.
- Voeg na blokkering de primaire antilichamen (zie tabel 6 voor de verdunningen) verdund in de blokkeringsoplossing toe en incubeer gedurende 48 uur bij 4 °C.
- Was 3x met blokkeeroplossing zonder serum toe te voegen gedurende 15 min elk. Voeg de secundaire antilichamen verdund in een blokkerende oplossing toe (zie tabel 6 voor de verdunningen) en incubeer gedurende 48 uur bij 4 °C.
- Was 3x met een blokkeeroplossing zonder serum en incubeer gedurende 2 uur bij RT in Hoechst-kleuring verdund in permeabilisatieoplossing (1:1.000).
- Was 3x met KPBS, monteer de plakjes met een kwast op glasplaten en laat ze drogen. Spoel ten slotte de dia's af met gedeïoniseerd water, verwijder overtollig water, voeg het montagemedium toe en dek af met een glazen afdekplaat. Bewaar de dia's ten minste 24 uur bij RT en bewaar ze bij 4 °C tot het beeld.
OPMERKING: Voor antilichamen die nucleaire epitopen labelen, voert u antigeenopvraging uit voorafgaand aan permeabilisatie (stap 4.1.2) met natriumcitraat (10 mM, pH 6,0) gedurende 2 uur bij 65 °C.
- Patchklem met hele cel
- Bereid op de dag van registratie 1 l menselijke kunstmatige hersenvocht (haCSF) voor, aangepast om beter aan te sluiten bij de menselijke hersenomgeving (tabel 7). Maak net als bij de snijoplossing ongeveer 900 ml van de oplossing met alle ingrediënten behalve CaCl 2 opgelost in gedeïoniseerd water en bubbel het gedurende 15 minuten met carbogen voordat u het juiste volume van 1 M CaCl2-oplossing toevoegt. Vul de maatkolf tot de 1 L-markering en blijf nog eens 15 minuten borrelen bij RT voordat u de opname start en gedurende het hele experiment.
- Breng de weefselplakken van de kweekplaat over naar de opnamekamer op het podium van een rechtopstaande microscoop die voortdurend wordt doordrenkt met bubbels haCSF met een perfusiesnelheid van 2 ml / min en wordt opgewarmd tot 34 ° C met behulp van een badtemperatuurregelaar.
- Trek glazen haarvaten met een pipettrekker tot een gemiddelde weerstand van 3-5 MΩ en vul de haarvaten met op K-gluconaat gebaseerde interne oplossing (tabel 8) met een vers toegevoegde 2-4 mg biocytine voor de post-hoc identificatie van de geregistreerde cellen. De pH en osmolariteit van deze interne oplossing zijn respectievelijk 7,2-7,3 en 285-295 mOsm.
- In het geval van opname van gastheercellen, krijgt u een ruw overzicht van de slice met een 4x-doelstelling en vindt u een gezond uitziende cel om te patchen met een 40x-objectief. Ga vervolgens verder met de standaard pleisterklem voor de hele cel.
- In het geval van getransplanteerde celregistratie, identificeert u het weefselgebied met de getransplanteerde cellen met behulp van een 4x-objectief en een epifluorescentiefilter in het blauwe bereik (460 nm) door GFP-reporterexpressie in het transplantaat. Zoom vervolgens in op het gelegen gebied met een 40x-objectief en zoek een getransplanteerde cel die GFP uitdrukt voor een standaard pleisterklem voor de hele cel.
- Controleer de rustmembraanpotentiaal (RMP) onmiddellijk na het inbreken in de cel en zorg ervoor dat de kwaliteit van de opname goed is. Noteer alle relevante parameters (bijv. Membraanweerstand [Ri], AP-parameters, natrium- en kaliumstromen en synaptische activiteit) in de configuratie van de hele celspanning of stroomklem.
- Nadat u alle benodigde gegevens hebt verzameld, trekt u de opnamepipet voorzichtig in zonder de cel verder te beschadigen, zodat deze kan worden geïdentificeerd met post-hoc immunostaining.
- Breng de plak over in de 4% PFA-oplossing voor verdere fixatie en kleuring, zoals beschreven in stap 4.1. Streptavidin wordt gebruikt om de cellen gevuld met biocytine tijdens de opnames te immunolabelen.
| ANTILICHAMEN | Verdunning | Notities |
| Primair | ||
| Kip anti-GFP | 1:1000 | |
| Kip anti-MAP2 | 1:1000 | |
| Geit anti-AiF1 | 1:100 | |
| Muis anti-MBP | 1:1000 | Antigeen retrieval nodig |
| Muis anti-SC123 | 1:2000 | |
| Konijn anti-NeuN | 1:1000 | |
| Konijn anti-Olig2 | 1:500 | |
| Konijn anti-Tmem119 | 1:200 | |
| Secundair | ||
| 488-geconjugeerde AffinityPure Donkey anti-muis IgG | 1:500 | |
| 488-geconjugeerde AffiniteitPure Ezel anti-konijn IgG | 1:500 | |
| 488-geconjugeerde AffinityPure Donkey anti-kip IgG | 1:500 | |
| Cy3-geconjugeerde AffiniteitPure Ezel anti-kip IgG | 1:500 | |
| Cy3-geconjugeerde AffiniteitPure Ezel anti-geit IgG | 1:500 | |
| Cy3-geconjugeerde AffiniteitPure Donkey anti-muis IgG | 1:500 | |
| Alexa fluor 647-geconjugeerd Streptavidin | 1:500 |
Tabel 6: Lijst van primaire en secundaire antilichamen voor immunohistochemie.
| haCSF | Voorraadconcentratie | Eindconcentratie [mM] | Per 1 L |
| NaCl | Poeder | 129 | 7,54 gr |
| NaHCO3 | Poeder | 21 | 1,76 gr |
| Glucose | Poeder | 10 | 1,80 gr |
| Kcl | Poeder | 3 | 0,22 g |
| NaH2PO4 | Poeder | 1.25 | 0,17 g |
| MgSO4 | 1 m | 2 | 2 ml |
| CaCl2 | 1 m | 1.6 | 1,6 ml |
Tabel 7: Samenstelling van kunstmatige cerebrospinale vloeistof (haCSF).
| K-Gluconaat interne oplossing | Voorraadconcentratie | Eindconcentratie [mM] | Per 100 ml |
| K-gluconaat | Poeder | 122.5 | 2,87 gr |
| Kcl | Poeder | 12.5 | 93,18 mg |
| NaCl | Poeder | 8 | 46,76 mg |
| HEPES | Poeder | 10 | 238,32 mg |
| MgATP | Poeder | 2 | 101,4 mg |
| Na3GTP | Poeder | 0.3 | 17,0 mg |
| Notitie: Pas de pH aan met KOH/HCl | |||
Tabel 8: Samenstelling van de interne oplossing op basis van K-gluconaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het beschreven protocol werd hACtx-weefsel van een patiënt met temporale kwab epilepsie verzameld en verwerkt, zoals hierboven uitgelegd. Een paar plakjes werden na 24 uur in cultuur gefixeerd om het startpunt van het gastheerweefsel te bestuderen. De analyse van verschillende neurale celpopulaties zoals neuronen (die NeuN en Map2 tot expressie brengen, figuur 1A), oligodendrocyten (Olig2 en MBP, figuur 1B) en astrocyten (mensspecifiek GFAP, ook wel STEM123 genoemd, figuur 1C) toonde een optimale conservering van het weefsel.
De volgende stap was om te bestuderen hoe de kweekomstandigheden de neuronale levensvatbaarheid in menselijk weefsel beïnvloeden. Voor dit doel werd de kleuring van NeuN en Map2 uitgevoerd na 2 weken kweek. Op het bestudeerde tijdstip was de expressie van beide neuronale markers nog steeds aanwezig in het weefsel (figuur 2A). Daarnaast werden elektrofysiologische opnames uitgevoerd om de functionaliteit te beoordelen. De opnames met behulp van whole-cell patch clamp toonden aan dat de neuronen RMP (-70 mV gemiddeld) en membraaninputweerstand (Ri) (gemiddeld 300 MΩ) hadden behouden, vergelijkbaar met neuronen uit acute preparaten21,23. Over het algemeen waren de cellen iets minder actief dan in vers weefsel, hoewel de meerderheid van de cellen nog steeds in staat was om ten minste één (figuur 2B-E), zo niet meerdere, actiepotentialen (AP's, figuur 2F-I) af te vuren, en snelle naar binnen gerichte natrium- en langzame uitgaande kaliumstromen waren aanwezig bij stapstroominjecties in spanningsklemmodus (figuur 2C-E, G-I). Samen gaven deze opnames aan dat de neuronen in organotypische culturen relatief gezond waren en typische neurofysiologische intrinsieke eigenschappen vertoonden.
Bovendien werd het effect van kweek op microglia-activering beoordeeld door Tmem119- en Iba1-kleuring in 24 uur (figuur 3A) en 2 weken gekweekt (figuur 3B) weefsel. Zoals verwacht werden enkele veranderingen in het microgliale uiterlijk waargenomen. Na 2 weken in cultuur werden ze minder vertakt en kregen ze een meer geactiveerde morfologie in vergelijking met acuut weefsel.
Na karakterisering van het gastheerweefsel werd de transplantatie van de lt-NES-cel-afgeleide voorlopers als volgt uitgevoerd. De GFP-lt-NES-cellen werden gedurende 7 dagen gedifferentieerd en geënt in 1 week gekweekt hACtx-weefsel (figuur 4A). Een overzicht van de transplantatie werd waargenomen met behulp van immunohistochemie met GFP (figuur 4B,C). De resultaten werden vergeleken met die van eerdere transplantaties in weefsel dat slecht geconserveerd was omdat er een langer tijdvenster was tussen resectie en plating. De beelden laten zien dat, in het optimale systeem, 4 weken na ex vivo transplantatie, de geënte GFP-lt-NES-cellen uitgebreide neurieten en uitgebreide en complexe arborisaties vertoonden gedurende de hele organotypische cultuur (figuur 4B). Het slecht geconserveerde weefsel maakte geen succesvolle transplantatie mogelijk vanwege de slechte gastheerconnectiviteit. Er overleefde nauwelijks een geënte cel; bovendien werden puin en niet-specifieke etikettering van antilichamen op dode cellen in grote lijnen waargenomen in het hele menselijke deel (figuur 4C).
Met betrekking tot de elektrofysiologische eigenschappen van de getransplanteerde cellen, bleek dat, in het geval van succesvolle transplantatie, de cellen niet alleen morfologisch maar ook functioneel actieve volwassen neuronen werden met repetitieve en vaak spontane AP's, snelle naar binnen gerichte natrium- en langzame naar buiten gerichte kaliumstromen, en een bepaald niveau van synaptische activiteit, wat wijst op functionele integratie van het transplantaat met het gastheerweefsel 4 weken na het enten (figuur 4D-H).
Figuur 1: Karakterisering van de verschillende celpopulaties in het hACtx-weefsel na 24 uur in kweek. Representatieve confocale beelden van hACtx-weefsel die de aanwezigheid aantonen van (A) neuronen (die NeuN en Map2 tot expressie brengen), (B) oligodendrocyten (Olig2 en MBP) en (C) astrocyten (mensspecifieke GFAP [STEM123]). Nucleaire kleuring (Ho: Hoechst, blauw) is opgenomen in de afzonderlijke en samengevoegde panelen. Schaalbalk = 20 μm. De witte pijlen geven colocalisatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Karakterisering en elektrofysiologische eigenschappen van hACtx-neuronen na 2 weken in organotypische cultuur. (A) Representatieve confocale beelden van hACtx-weefsel met NeuN- en Map2-expressie. (B-I) Voorbeelden van de corticale neuronen geregistreerd in 2 weken oud hACtx-weefsel. (B,F) Biocytine-etikettering van het opgenomen neuron (rood), samen met nucleaire kleuring (Ho: Hoechst, blauw), opgenomen in een samengevoegd paneel. Schaalstaven = 20 μm. Whole-cell patch-clamp opnamesporen met voorbeelden van een cel met (C-E) enkele, of (G-I) meerdere AP's. AP's werden geïnduceerd door (C,G) een stap van 250 pA, of (D,H) een 0 tot 300 pA opgevoerde stroominjectie bij RMP. De inzetstukken geven in elk geval een vergroot beeld van een van de AP's aan. (E,I) Inwaartse natrium- en uitwaartse kaliumstromen werden waargenomen in beide celvoorbeelden bij de spanningsdepolarisatiestappen toegepast van −70 mV in stappen van 10 mV in spanningsklemmodus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karakterisering van de microgliapopulatie in het hACtx-weefsel. Confocale beelden van het hACtx-weefsel die de expressie van Iba1 en Tmem119 tonen na (A) 24 h en (B) 2 weken in cultuur. Nucleaire kleuring (Ho: Hoechst, blauw) is opgenomen in de afzonderlijke en samengevoegde panelen. Schaalbalk = 20 μm. De witte pijlen geven colocalisatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Overzicht en elektrofysiologische eigenschappen van lt-NES cel-afgeleide neuronen 4 weken na de ex vivo transplantatie van GFP-lt-NES cellen. (A) Experimenteel ontwerp. Diff = differentiatie. (B,C) Representatieve confocale foto's van getransplanteerde GFP-lt-NES-cellen in (B) goed geconserveerd en (C) slecht geconserveerd hACtx-weefsel. Schaalbalken = 50 μm. (D) Voorbeeldspoor van een van graft afgeleid neuron dat spontaan AP's afvuurt. De inzet geeft een vergrote weergave van een van de AP's aan. Repetitieve AP's kunnen worden geïnduceerd door een (E) stap (50 pA) of (F) verhoogde (0 tot 300 pA) injectie van depolariserende stroom van de potentiaal van −70 mV. (G) Inwaartse natrium- en uitwendige kaliumstromen werden geïnduceerd door 10 mV depolarisatiestappen in spanningsklemmodus vanaf een houdpotentiaal van -70 mV. (H) In de spanningsklemmodus konden spontane postsynaptische stromen (sPSC's) worden waargenomen in de van graft afgeleide neuronen met een houdpotentiaal van −70 mV. De inzetstukken geven een vergroot beeld aan van sommige van de sPSC's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het verkrijgen van hACtx-plakjes van voldoende hoge kwaliteit is de meest kritieke stap in dit protocol. Corticaal weefsel wordt verkregen van epileptische patiënten die een resectieve operatie ondergaan24. De kwaliteit van het gereseceerde weefsel, evenals de blootstellingstijd van het weefsel tussen resectie en kweek, is van cruciaal belang; Hoe sneller het weefsel van de operatiekamer naar het laboratorium wordt overgebracht en gesneden, hoe optimaler de organotypische cultuur zal zijn. Idealiter moet het weefsel binnen de eerste paar uur na verzameling worden gesneden en overgebracht naar het celkweeklaboratorium. De oxygenatie van het weefsel tijdens dit proces verbetert ook de kwaliteit van de plakjes. In dit opzicht geldt dat hoe groter het weefselmonster, hoe lager de concentratie zuurstof die de kern bereikt en dus hoe lager de levensvatbaarheid als het weefsel niet op tijd wordt gesneden. Als de kwaliteit van het gastheerweefsel niet optimaal is, is de validatie van stamceltherapieën niet mogelijk.
Wanneer het corticale weefsel van het menselijk brein naar een plaat wordt overgebracht, moet rekening worden gehouden met enkele beperkingen. Tijdens het snijproces wordt een groot aantal axonen ontleed, waardoor neuronale schade wordt veroorzaakt die zal leiden tot ontstekingsprocessen zoals microglia-activering25. Om deze reden, zelfs als het weefsel als gezond wordt beschouwd wanneer het zich in het menselijk brein bevindt, kan het celgedrag in cultuur anders zijn vanwege de gedeeltelijke schade die is opgelopen tijdens de resectie en voorbereiding van de organotypische secties26,27. Veranderingen in de microgliapopulatie kunnen worden gevolgd met behulp van verschillende technieken, waaronder de meting van de vrijgegeven cytokineniveaus of de beoordeling van morfologische veranderingen28. Belangrijk is dat, hoewel microglia-activering werd waargenomen na 2 weken in cultuur als gevolg van de verandering in de omgeving van een heel orgaan naar ex vivo kweekomstandigheden, de neuronen op dit tijdstip nog steeds levensvatbaar waren, zoals blijkt uit de neuronale kleuring en de analyse van hun elektrofysiologische eigenschappen. Dikkere weefselplakken blijven beter bewaard; de penetratie van voedingsstoffen naar het binnenste deel van de plak wordt echter beïnvloed, wat resulteert in gedeeltelijke weefseldood. Om deze reden is 300 μm de optimale dikte voor organotypische cultuur.
Organotypische culturen van hACtx-weefsel hebben duidelijke voordelen in vergelijking met andere 3D-kweekmethoden zoals organoïden of sferoïden. De bron is een volledig ontwikkeld menselijk brein, wat betekent dat de cellulaire en matrixomgeving, evenals de rijpingsstatus van de verschillende celpopulaties, dezelfde zijn als die over het algemeen worden aangetroffen in het volwassen menselijke brein25,29,30. Organoïden lijken meer op foetale weefsels, wat optimaal is voor sommige onderzoeksgebieden zoals het modelleren van ontwikkelingsstoornissen31, maar bijvoorbeeld niet voor de studie van neurodegeneratieve ziekten, die voornamelijk de volwassen bevolking treffen en een late aanvang hebben32,33. Het belangrijkste is dat de organotypische cultuur van menselijk weefsel tot op heden het enige menselijke systeem is dat de validatie van celtherapieën mogelijk maakt.
De meeste kennis over stamceltransplantatie voor neuronale vervanging bij neurodegeneratieve aandoeningen is afgeleid van in vivo diermodellering. Hoewel deze systemen uiterst waardevol zijn voor het beoordelen van het modulerende effect van getransplanteerde cellen in het beschadigde gastheercircuit, falen therapieën die in deze opstelling worden getest normaal gesproken wanneer ze naar de kliniek worden vertaald vanwege de duidelijke verschillen tussen knaagdieren en mensen34. Om deze reden is de organotypische cultuur van hACtx-weefsel een uitstekende strategie voor het modelleren van menselijke neurodegeneratieve ziekten die de cortex beïnvloeden vanwege de mogelijkheid om de interacties tussen menselijke neurale populaties en het behoud van de menselijke hersenstructuurte bestuderen 25.
Samenvattend is deze gecombineerde methodologie van langdurige organotypische culturen van de volwassen menselijke cortex en ex vivo intracorticale transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide corticale voorlopercellen een veelbelovende strategie voor de validatie van op stamcellen gebaseerde therapieën, die de klinische vertaling van neuronale vervangingsstrategieën voor het stimuleren van functioneel herstel in de beschadigde hersenen kunnen vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Swedish Research Council, de Swedish Brain Foundation, de Swedish Stroke Foundation, Region Skåne, The Thorsten and Elsa Segerfalk Foundation en het Swedish Government Initiative for Strategic Research Areas (StemTherapy).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Cutting and electrophysiology | |||
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
| Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
| Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2x91 | |
| Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
| Plastic Petri dish | Any suitable | ||
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
| Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| RINSING SOLUTION | |||
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
| Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| Forceps | Any suitable | ||
| Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
| GENERATION OF lt-NES cells | |||
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
| Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
| Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
| Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
| Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
| Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
| Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
| T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
| Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
| Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
| Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
| Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
| Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
| Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
| Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
| Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
| Paint brush | Any suitable | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
| Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
| Distilled water | |||
| Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
| Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
| Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
| Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium citrate | |||
| Distilled water | |||
| Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
| Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
| Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
References
- Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).
- Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work. Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).
- Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).
- Tornero, D., et al. Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli. Brain. 140 (3), 692-706 (2017).
- Palma-Tortosa, S., et al. Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).
- Robinson, N. B., et al. The current state of animal models in research: A review. International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Delavaran, H., et al. Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke. European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).
- Sabuncu, M. R., et al. The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease. Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).
- Eugene, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
- Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
- Kalmbach, B. E., et al. Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons. Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).
- Barth, M., et al. Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54 (2021).
- Almeida, G. M., et al. Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response. Frontiers in Neuroscience. 15, 674576 (2021).
- Schwarz, N., et al. Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures. Scientific Reports. 7, 12249 (2017).
- Miskinyte, G., et al. Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 207 (2017).
- Gronning Hansen, M., et al. Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry. Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).
- Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS One. 7 (1), 29597 (2012).
- Avaliani, N., et al. Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors. Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).
- Engel, J., et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).
- Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).
- Verwer, R. W., et al. Injury response of resected human brain tissue in vitro. Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).
- Verwer, R. W., et al. Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue. Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).
- Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Schwarz, N., et al. Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease. Elife. 8, 48417 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Wang, Z., et al. Organoid technology for brain and therapeutics research. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).
- Wang, H. Modeling neurological diseases with human brain organoids. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).
- Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).
