Summary
פרוטוקול זה מתאר תרביות אורגנוטיפיות ארוכות טווח של קליפת המוח האנושית הבוגרת בשילוב עם השתלה תוך-קורטיקלית ex vivo של אבות קורטיקליים פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בתאי גזע, אשר מציגים מתודולוגיה חדשנית לבדיקה נוספת של טיפולים מבוססי תאי גזע להפרעות נוירודגנרטיביות אנושיות.
Abstract
הפרעות נוירודגנרטיביות נפוצות והטרוגניות מבחינת הסימפטומים שלהן וההשפעה התאית, מה שהופך את המחקר שלהם למסובך בשל היעדר מודלים נכונים של בעלי חיים המחקים באופן מלא מחלות אנושיות והזמינות הירודה של רקמת המוח האנושית לאחר המוות. תרבית רקמת העצבים האנושית למבוגרים מציעה את האפשרות לחקור היבטים שונים של הפרעות נוירולוגיות. מנגנונים מולקולריים, תאיים וביוכימיים יכולים להיות מטופלים בקלות במערכת זו, כמו גם בדיקה ותיקוף של תרופות או טיפולים שונים, כגון טיפולים מבוססי תאים. שיטה זו משלבת תרביות אורגנוטיפיות ארוכות טווח של קליפת המוח האנושית הבוגרת, המתקבלות מחולי אפילפסיה שעברו ניתוח כריתה, והשתלה תוך-קורטיקלית ex vivo של אבות קליפת המוח המושרים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע. שיטה זו תאפשר לחקור את הישרדות התא, התמיינות עצבית, היווצרות קלטים ויציאות סינפטיים, ואת התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תאים שמקורם בבני אדם לאחר השתלה ברקמת קליפת המוח האנושית הבוגרת השלמה. גישה זו היא צעד חשוב לפני פיתוח פלטפורמה תלת-ממדית למידול מחלות אנושיות שתקרב את המחקר הבסיסי לתרגום קליני של טיפולים מבוססי תאי גזע לחולים עם הפרעות נוירולוגיות שונות ותאפשר פיתוח כלים חדשים לשחזור מעגלים עצביים פגועים.
Introduction
הפרעות נוירודגנרטיביות, כגון מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר או שבץ איסכמי, הן קבוצה של מחלות החולקות את התכונה המשותפת של תפקוד עצבי או מוות. הם הטרוגניים במונחים של אזור המוח והאוכלוסייה העצבית מושפעת. למרבה הצער, טיפולים למחלות אלה הם נדירים או בעלי יעילות מוגבלת בשל היעדר מודלים של בעלי חיים המחקים את מה שקורה במוח האנושי 1,2. טיפול בתאי גזע הוא אחת האסטרטגיות המבטיחות ביותר להתחדשות המוח3. הדור של אבות עצביים מתאי גזע ממקורות שונים התפתח מאוד בשנים האחרונות 4,5. פרסומים אחרונים הראו כי תאי גזע דמויי נוירואפיתל (lt-NES) המושרים על ידי תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע ארוכי טווח המתחדשים מעצמם, בעקבות פרוטוקול התמיינות קליפת המוח ולאחר השתלה תוך-קורטיקלית במודל חולדה עם שבץ איסכמי המשפיע על קליפת המוח הסומטוסנסורית, מייצרים נוירונים בוגרים בקליפת המוח. בנוסף, תאי העצב שמקורם בשתלים קיבלו קשרים סינפטיים afferent ו-efferent מהנוירונים המארחים, והראו את השתלבותם ברשת העצבית של החולדה 6,7. האקסונים שמקורם בשתלים עברו מיאלינציה ונמצאו באזורים שונים במוח החולדה, כולל אזור הפרי-אוטם, כפיס המוח וקליפת המוח הסומטוסנסורית. והכי חשוב, השתלת תאי iPS הפכה ליקויים מוטוריים בחיות שבץ7.
גם אם מודלים של בעלי חיים עוזרים לחקור הישרדות השתלות, אינטגרציה עצבית והשפעת התאים המושתלים על תפקודים מוטוריים וקוגניטיביים, מידע על אינטראקציה בין תאים אנושיים (שתל-מארח) חסר במערכת זו 8,9. מסיבה זו, מתוארת כאן שיטה משולבת של תרבית אורגנוטיפית ארוכת טווח במוח האנושי עם השתלת ex vivo של אבות עצביים אנושיים שמקורם בתאי iPS. תרביות אורגנוטיפיות של המוח האנושי המתקבלות מכריתות נוירוכירורגיות הן מודלים תלת-ממדיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית של המוח, המאפשרים לחוקרים להגביר את הבנתם את המעגלים החשמליים של מערכת העצבים המרכזית האנושית ואת הדרך המדויקת ביותר לבחון טיפולים להפרעות במוח האנושי. עם זאת, לא נעשה מספיק מחקר בהקשר זה, וברוב המקרים, תרביות אורגנוטיפיות של מוח ההיפוקמפוס האנושי שימשו10,11. קליפת המוח מושפעת ממספר הפרעות נוירודגנרטיביות, כגון שבץ איסכמי12 או מחלת אלצהיימר13, ולכן חשוב שתהיה לנו מערכת תלת ממדית קליפת המוח האנושית המאפשרת לנו להרחיב את הידע שלנו ולבדוק ולאמת אסטרטגיות טיפוליות שונות. מספר מחקרים בשנים האחרונות השתמשו בתרביות מרקמת קליפת המוח האנושית הבוגרת (hACtx) כדי למדל מחלות מוח אנושיות 14,15,16,17,18,19; עם זאת, מידע מוגבל זמין בהקשר של טיפול בתאי גזע. שני מחקרים כבר הוכיחו את היתכנות המערכת המתוארת כאן. בשנת 2018, תאי גזע עובריים אנושיים שתוכנתו עם גורמי שעתוק שונים והושתלו ברקמת hACtx הוכחו כמולידים נוירונים קליפתיים בוגרים שיכולים להשתלב ברשתות קליפת המוח האנושיות הבוגרות20. בשנת 2020, השתלת תאי LT-NES במערכת האורגנוטיפית האנושית חשפה את יכולתם להתמיין לנוירונים קליפתיים בוגרים וספציפיים לשכבה עם התכונות האלקטרופיזיולוגיות של נוירונים פונקציונליים. תאי העצב המושתלים יצרו מגעים סינפטיים משפיעים ותוססים עם תאי העצב בקליפת המוח האנושית בפרוסות המוח הבוגרות, כפי שאומתו על ידי מעקב מונוסינפטי מדרדר של נגיף הכלבת, רישומי טלאי של תאים שלמים ומיקרוסקופ אלקטרונים חיסוני21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות שאושרו על ידי הוועדה האתית המחוזית, לונד, שבדיה (היתר אתי מספר 2021-07006-01). רקמה ניאוקורטיקלית בריאה התקבלה מחולים שעברו ניתוח אלקטיבי לאפילפסיה של האונה הרקתית. הסכמה מדעת התקבלה מכל החולים.
הערה: כל הרקמות שהתקבלו עובדו ללא קשר לגודלן. עם זאת, רקמות קטנות מ 1-1.5 מ"מ3 בגודל יהיה מאתגר מבחינה טכנית לטפל לחתוך עם ויברטום.
1. איסוף, תחזוקה, חיתוך וציפוי רקמות
- הכנות ביום שלפני חיתוך רקמות
- מכינים 2 ליטר של תמיסת חיתוך (טבלה 1) בצלוחית נפחית. יש להמיס את כל המרכיבים למעט MgCl 2 ו-CaCl2 ב~1,800 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה ולבעבע בגז קרבוגן למשך 15 דקות. לאחר מכן הוסיפו כמויות מתאימות של 1 M MgCl 2 ו-CaCl2 והמשיכו לבעבע במשך 15 דקות נוספות. לבסוף, למלא את הבקבוק עד סימן 2 L; בדוק את ה- pH והאוסמולריות והתאם במידת הצורך. להקפיא 2 x 350 מ"ל של פתרון מוכן ולאחסן את השאר ב 4 °C.
הערה: ה- pH והאוסמולריות הם בדרך כלל 7.3-7.4 ו- 295-300 mOsm, בהתאמה. - הכינו 100 מ"ל של תמיסת שטיפה (טבלה 2). להמיס 476 מ"ג HEPES ו-200.6 מ"ג גלוקוז ב-100 מ"ל HBSS בתוספת 5 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין. זה יכול להיות מאוחסן ב 4 °C עד 10 ימים.
- הכינו מדיום תרבית קליפת המוח האנושית הבוגרת (hACtx) (מדיום hACtx) (טבלה 3) וסננו אותו במעבדה לתרביות תאים מתחת למכסה מנוע מאוורר. התווך מורכב מתווך עצבי ללא אדום פנול (ראה טבלת חומרים), תוסף B27, L-גלוטמין (ראה טבלת חומרים) וגנטמיצין. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
- מכינים 2 ליטר של תמיסת חיתוך (טבלה 1) בצלוחית נפחית. יש להמיס את כל המרכיבים למעט MgCl 2 ו-CaCl2 ב~1,800 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה ולבעבע בגז קרבוגן למשך 15 דקות. לאחר מכן הוסיפו כמויות מתאימות של 1 M MgCl 2 ו-CaCl2 והמשיכו לבעבע במשך 15 דקות נוספות. לבסוף, למלא את הבקבוק עד סימן 2 L; בדוק את ה- pH והאוסמולריות והתאם במידת הצורך. להקפיא 2 x 350 מ"ל של פתרון מוכן ולאחסן את השאר ב 4 °C.
- הכנות ביום הניתוח לפני הגעת דגימות הרקמה
- בדקו את זמינות הציוד הדרוש וחלל המעבדה, ונקו היטב את כל כלי הניתוח ואת הוויברטומה (ראו טבלת חומרים), כמו גם את חלל הספסל, במים מזוקקים (ללא חומר ניקוי), ולאחר מכן 70% אתנול. תן אתנול להתייבש לפחות 30 דקות לפני השימוש בכלים ובציוד.
- מרסקים את תמיסת החיתוך הקפואה ומבעבעים את "מרק" הקרח והנוזל בגז קרבוגן למשך 30 דקות. לאחר מכן, סגור היטב את אחד המיכלים עם תמיסה כתוש "מרק" ומניחים אותו בתיבת הקרח. זה ישמש לאיסוף הרקמה מחדר הניתוח.
- כיילו את הוויברטום וקבעו את פרמטרי החיתוך: מהירות 0.05 מ"מ לשנייה ורטט 1.7 מ"מ. מניחים את תא החיתוך על במת ויברטומה ומתחילים את הצידנית המחוברת אליה כך שהתא יהיה בטמפרטורה קבועה של -3 מעלות צלזיוס.
- הכינו את תא איסוף הפרוסות עם תוספות כדי להניח את פרוסות הרקמה ותמיסת החיתוך, מבעבעים אותה כל הזמן עם גז קרבוגן בטמפרטורת החדר (RT).
- במעבדה לתרביות תאים ומתחת למכסה מנוע מאוורר, מניחים את תוספות התרבית בצלחת בעלת 6 בארות באמצעות מלקחיים. הוסף 5 מ"ל של מדיום hACtx בתחתית העלון עד שהוא בא במגע עם הממברנה, תוך הימנעות מהיווצרות בועות, והוסף 2 מ"ל בחלק העליון של העלון. יש לאזן באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 למשך שעתיים לפחות לפני העברת פרוסות הרקמה לתוספות.
- הליכי איסוף וחיתוך רקמות
- מיד לאחר הכריתה, יש לאסוף את הרקמה מהמטופל בחדר הניתוח, במידת האפשר, ישירות לתוך מיכל עם תמיסת חיתוך קפואה, מבעבעת ומרוסקת. מעבירים מיד את המיכל הסגור על קרח לאזור החיתוך של המעבדה.
- בדוק את הרקמה ואתר את המשטח הטוב ביותר להדבקה (ראה שלב 1.3.3) אותה לשלב החיתוך של הוויברטום, בהתחשב בכיוון של שכבות קליפת המוח. במידת הצורך, חותכים את המשטח הלא אחיד עם אזמל כך שיהיה קל להניח את הרקמה על הבמה לכיוון פרוסה אופטימלי.
- מדביקים את הרקמה לשלב בדבק רקמות (ראו טבלת חומרים), מניחים אותה בתא החיתוך וממלאים מיד את החדר בתמיסת חיתוך בועות קרות. המשיכו את המבעבעים במהלך כל הליך החיתוך.
- חותכים פרוסות קורונליות או קשת, בהתאם לכיוון הרקמה ללהב, בעובי של 300 מיקרומטר כדי להכיל את כל שכבות קליפת המוח, ואם אפשר, את החומר הלבן. מניחים את הפרוסות בתא האיסוף עם תמיסת חיתוך מבעבעת ב- RT.
הערה: חתכו מצד החומר הלבן לכיוון פני השטח של קליפת המוח. אין להסיר את קרומי המוח, שכן הדבר עלול לפגוע ברקמה. להב החיתוך בדרך כלל פורס אותם בקלות. - לאחר שכל הרקמה נחתכה, העבירו את הפרוסות לצלחת פטרי סטרילית עם תמיסת שטיפה ב-RT והעבירו אותן למעבדה לתרביות תאים. שלב זה יש צורך להסיר עודפי סוכרוז מן הפרוסות לפני העברתם לצלחת התרבית.
הערה: כדי להעביר את הפרוסות (בשלב זה ובשלבים הבאים), השתמשו בפיפטת זכוכית הפוכה, שברו את החלק הדק יותר והניחו טיט גומי לשאיבה.
- תרבית ותחזוקה של פרוסות רקמת hACtx
- הניחו בנפרד את פרוסות הרקמה על גבי התוספות שכבר היו רטובות ושקועות. לאחר 24 שעות, שנה את המדיום כדי להסיר עוד יותר את שאריות הסוכרוז או חומרים שיוריים אחרים מהליכי החיתוך.
- החליפו את מדיום התרבית במדיום טרי כל 7 ימים. לאחר שבועיים, יש להשתמש במדיום hACtx ללא גנטמיצין. התרבות יכולה להישמר עד חודשיים.
הערה: יש לאזן את מדיום ה-hACtx באינקובטור ב-37°C וב-5%CO2 למשך שעתיים לפחות לפני השינוי הבינוני. מדיום טרי צריך להיות מוכן כל שבועיים. בדקו את הפרוסות כל 2-3 ימים, ואם חלק מהמדיום התאדה, הוסיפו עוד לחלק העליון של העלון.
| פתרון חיתוך | ריכוז מלאי | ריכוז סופי [mM] | לכל 1 ליטר |
| סוכרוז | אבקה | 200 | 68.46 גרם |
| NaHCO3 | אבקה | 21 | 1.76 גרם |
| KCl | אבקה | 3 | 0.22 גרם |
| NaH2PO4 | אבקה | 1.25 | 0.17 גרם |
| גלוקוז | אבקה | 10 | 1.80 גרם |
| MgSO4 | 1 מטר | 2 | 2 מ"ל |
| CaCl2 | 1 מטר | 1.6 | 1.6 מ"ל |
| MgCl2 | 2 מטר | 2 | 1 מ"ל |
טבלה 1: הרכב תמיסת החיתוך. MgCl 2 ו-CaCl2 משמשים כתמיסות מוכנות מראש של 1 M במים נטולי יונים.
| תמיסת שטיפה | ריכוז מלאי | ריכוז סופי | לכל 100 מ"ל |
| HBSS | 1x | 95 מ"ל | |
| PenStrep | 10,000 U/מ"ל | 500 U / מ"ל | 5 מ"ל |
| HEPES | אבקה | 4.76 גרם/ליטר | 476 מ"ג |
| גלוקוז | אבקה | 2 גרם/ליטר | 200.6 מ"ג |
טבלה 2: הרכב תמיסת שטיפה.
| hACtx בינוני | ריכוז מלאי | ריכוז סופי | לכל 100 מ"ל | |
| תווך עצבי ללא פנול אדום | 97.4 מ"ל | ראה טבלת חומרים | ||
| B27 | פי 50 | 1:50 | 2 מ"ל | |
| ל-גלוטמין | פי 100 | 1:200 | 500 μL | ראה טבלת חומרים |
| גנטמיצין | 50 מ"ג/מ"ל | 1:1000 | 100 מיקרוליטר |
טבלה 3: הרכב מדיום hACtx.
2. התרבות והתמיינות של תאי lt-NES
הערה: תאי Lt-NES נוצרים כפי שתואר קודם לכן21,22 ומומרים באמצעות וקטור לנטי-ויראלי הנושא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת מקדם מכונן (תאי GFP-lt-NES). בקבוקונים המכילים 3 x 106 תאים מאוחסנים ב -150 ° C עד לשימוש.
- הכנת פתרונות מלאי ומדיה
- לדלל 100 מיקרוגרם של גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF) ב 10 מ"ל של PBS-0.1% BSA כדי לקבל ריכוז מלאי של 10 מיקרוגרם / מ"ל. להכין 100 μL aliquots.
- לדלל 100 מיקרוגרם של גורם גדילה אפידרמיס (EGF) ב 10 מ"ל של PBS-0.1% BSA כדי לקבל ריכוז מלאי של 10 מיקרוגרם / מ"ל. להכין 100 μL aliquots.
- תוספת Aliquot 50x B27 בנפח של 100 μL לכל aliquot.
- לדלל 10 מ"ג של poly-L-ornithine ב 100 מ"ל של מים deionized יש ריכוז מלאי של 100 מיקרוגרם / מ"ל. הפוך 1 מ"ל aliquots.
- הכן 30 μL aliquots של 1.20 מ"ג / מ"ל למינין עכבר.
- לדלל 10 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.25%) ב 90 מ"ל של PBS לריכוז מלאי של 0.025%. הכן 1 מ"ל aliquots.
- לדלל 0.025 גרם של מעכב טריפסין ב 50 מ"ל של PBS לריכוז מלאי של 0.5 מ"ג / מ"ל. הכן 1 מ"ל aliquots.
- יש לדלל 10 מיקרוגרם של Wnt3a (Wingless-type MMTV integration site family member 3A) ב-1 מ"ל של PBS-0.1% BSA כדי לקבל ריכוז מלאי של 10 מיקרוגרם/מ"ל. הכינו BMP4 (חלבון מורפוגנטי עצם 4) באותו אופן. Aliquot בנפח של 100 μL.
- לדלל 1 מ"ג של ציקלופמין ב 2.5 מ"ל של DMSO לריכוז סופי של 400 מיקרוגרם / מ"ל, ולעשות 100 μL aliquots.
- הכינו מדיום בסיסי (טבלה 4) ומדיום מוגדר בידול (DDM, טבלה 5), ואחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
- ציפוי של כלי תרבות
- כדי לצפות מראש את הכלים לתרבית תאי GFP-It-NES במהלך התרבות או התמיינות, לדלל פולי-L-אורניתין 1:100 במים נטולי יונים, ולהוסיף 5 מ"ל של התמיסה לצלוחית T25. לדגור לילה ב-RT.
- שטפו את הצלחות מצופות הפולי-L-אורניתין 1x עם מים נטולי יונים, ו-1x עם PBS.
- עבור תאי GFP-It-NES בהתפשטות, יש לדלל את למינין העכבר בשעה 1:500 ב-PBS ולדגור במשך שעתיים לפחות ב-37°C. עבור תאי GFP-It-NES בהתמיינות, יש לדלל את למינין העכבר בשעה 1:100 ב-PBS ולדגור במשך שעתיים לפחות ב-37°C.
- התפשטות תאי GFP-lt-NES
- חם 5 מ"ל (לשטיפה) ו 5 מ"ל (לזריעה) של מדיום בסיסי בשני צינורות שונים 15 מ"ל.
- הפשירו במהירות בקבוקון אחד של תאי GFP-lt-NES בטמפרטורה של 37°C, העבירו אותם לצינור הכביסה ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 300 x גרם למשך 5 דקות.
- שאפו את המדיום בזהירות מבלי לגעת בכדור, והשעו מחדש את התאים ב -1 מ"ל של מדיום בסיסי שחומם מראש. העבירו את תרחיף התא לצינור הזריעה המכיל תווך בסיסי בתוספת גורמי התפשטות: EGF (10 ננוגרם/מ"ל), bFGF (10 ננוגרם/מ"ל) ו-B27 (10 ננוגרם/מ"ל). זרעו את התאים על בקבוק T25 מצופה פולי-L-אורניתין/למינין.
- להאכיל את התאים עם גורמי התרבות כל יום. החלף את המדיום אם הוא הופך לצהוב. מעבר התאים כל יום שלישי או רביעי (יום אחד לאחר שהם מגיעים 100% מפגש).
- פיצול תאי GFP-lt-NES לצורך התרבות והתמיינות
- חימום מראש של 5 מ"ל של מדיום בסיסי לכל בקבוק (כדי לאסוף את התאים), בתוספת הנפח הכולל הדרוש כדי לזרוע אותם מחדש.
הערה: המעבר נעשה בדילול של 1:3 כדי לשמור על התאים בהתפשטות, הדורש 15 מ"ל של תווך בסיסי, ודילול של 1:6 כדי להתחיל התמיינות, הדורש 30 מ"ל של תווך בסיסי. - הסר את המדיום מבקבוק תרבית התאים על ידי שאיפה, והוסף 500 μL של 0.025% טריפסין שחומם מראש. יש לדגור במשך 5-10 דקות ב-RT. ניתן לאשר את ניתוק התאים תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי בהגדלה של פי 10.
- הוסף נפח שווה של מעכב טריפסין (ריכוז סופי של 0.5 מ"ג / מ"ל) ואחריו 5 מ"ל של מדיום בסיסי חם. נתקו ואספו את התאים על ידי פיפטציה עדינה למעלה ולמטה. מעבירים את התאים לצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 x גרם.
- כדי לשמור על התאים בהתפשטות, יש לבצע דילול של 1:3 בתווך בסיסי טרי בתוספת גורמי התפשטות, ולחזור על שלב 2.3.4.
- חימום מראש של 5 מ"ל של מדיום בסיסי לכל בקבוק (כדי לאסוף את התאים), בתוספת הנפח הכולל הדרוש כדי לזרוע אותם מחדש.
- התמיינות קורטיקלית של תאי GFP-lt-NES
- ביום 0, יש להשהות מחדש את התאים (שישמשו להתמיינות) ב-30 מ"ל של תווך בסיסי בתוספת גורמי התפשטות, ולחלוף אותם בשש צלוחיות T25 מצופות התמיינות (פיצול 1:6).
- ביום הראשון, שנו מחצית מהתווך ל-DDM, והוסיפו גורמי התפשטות במחצית מהריכוז שלהם.
- ביום השני, שנה את המדיום לחלוטין ל- DDM בתוספת גורמי התמיינות : BMP4 (10 ננוגרם/מ"ל), Wnt3a (10 נ"ג/מ"ל) וציקלופמין (400 נ"ג/מ"ל).
- ביום הרביעי, הוסף את גורמי הבידול בלבד. החלף את המדיום אם הוא הופך לצהוב.
- ביום השישי, שנה את המדיום ל- DDM בתוספת BMP4 ו- Wnt3a. הציקלופמין מוסר בשלב זה.
- ביום השביעי, נתק את התאים כאמור בשלב 2.4.2 ובשלב 2.4.3.
| מדיום בסיסי | ריכוז מלאי | ריכוז סופי | לכל 100 מ"ל |
| DMEM/F12 עם L-גלוטמין | 1x | 98.7 מ"ל | |
| תוספת N-2 | פי 100 | 1:100 | 1 מ"ל |
| גלוקוז | 45% | 3.5 מ"ל/ליטר | 350 מיקרוליטר |
טבלה 4: הרכב מדיום ההתרבות של תאי lt-NES (תווך בסיסי).
| DDM בינוני | ריכוז מלאי | ריכוז סופי | לכל 100 מ"ל |
| DMEM/F12 עם L-גלוטמין | 96 מ"ל | ||
| N2 | פי 100 | 1:100 | 1 מ"ל |
| NEAA | פי 100 | 1:100 | 1 מ"ל |
| נתרן פירובט | 100 מ"מ | 1:100 | 1 מ"ל |
| שבר BSA V | 7.5% | 6.6 מ"ל/ליטר | 660 μL |
| 2-מרקפטואתנול | 50 נאנומטר | 7 מיקרוליטר/ליטר | 0.7 מיקרוליטר |
| גלוקוז | 45% | 3.2 מ"ל/ליטר | 320 μL |
טבלה 5: הרכב תווך מוגדר התמיינות (DDM) של תאי lt-NES.
3. השתלת תאי GFP-lt-NES בפרוסות hACtx אורגנוטיפיות
הערה: רקמת hACtx צריכה להיות בתרבית במשך שבוע לפני השתלת תאים. כדי להקל על הליך ההשתלה, יש צורך להסיר 2 מ"ל של מדיום hACtx מהחלק העליון של הכנס כדי למנוע את הרקמה לצוף.
- יש להשהות מחדש את תאי GFP-lt-NES (החל משלב 2.5.6) במטריצת קרום מרתף טהורה קרה (ראה טבלת חומרים) בריכוז של 1 x 105 תאים/μL ולהעביר את התמיסה לצינור סטרילי קטן יותר.
הערה: במהלך הליך ההשתלה, יש לקרר מראש את כל החומרים (קצוות פיפטה, צינורות, נימים וכו ') כדי למנוע התמצקות ג'ל. הפשירו את ג'ל מטריצת קרום המרתף על קרח למשך 30 דקות לפני השימוש בו. - אספו את מתלה התא לתוך נימי זכוכית קרים המחוברים לטיט גומי לשאיבה. הזריקו את תרחיף התאים כטיפות קטנות (כ-1 מיקרוליטר כל אחת) על ידי דקירה של פרוסת הרקמה החצי יבשה באתרים שונים.
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות כדי שהג'ל יתמצק. מעבירים את הצלחת מהאינקובטור בחזרה למכסה המנוע, ומוסיפים בזהירות 2 מ"ל של מדיום hACtx לחלק העליון של האינקובטור כדי לטבול לחלוטין את הרקמה.
- החליפו את מדיום התרבית במדיום hACtx טרי פעם בשבוע.
4. אימות
- צביעת פרוסות hACtx
- בנקודת הזמן הרצויה, הוציאו את הפרוסות מהמעבדה לתרביות תאים, והוציאו אותן מהחדרה על ידי טבילתה בצלחת פטרי עם PBS. לאחר מכן, העבירו את הפרוסות לבקבוקוני צביעה באמצעות פיפטת זכוכית הפוכה (ראו הערה בשלב 1.3.5), וקבעו אותן עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
- יש לשטוף 3 פעמים עם KPBS במשך 15 דקות בכל פעם, ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם תמיסת חדירה (0.02% BSA ו-1% Triton X-100 ב-KPBS).
- למחרת, הוסיפו תמיסת חסימה (KPBS עם 0.2% טריטון X-100, 1% BSA, נתרן אזיד [1:10,000], ו-10% סרום חמורים רגיל), ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
- לאחר החסימה, מוסיפים את הנוגדנים הראשוניים (ראה טבלה 6 לדילול) המדוללים בתמיסת החסימה, ודגרים במשך 48 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- יש לשטוף 3 פעמים בתמיסת חסימה מבלי להוסיף סרום למשך 15 דקות כל אחד. מוסיפים את הנוגדנים המשניים המדוללים בתמיסת חסימה (ראו טבלה 6 לדילול), ודגרים במשך 48 שעות ב-4°C.
- יש לשטוף 3x בתמיסת חסימה ללא סרום, ולדגור במשך שעתיים ב-RT בכתם Hoechst מדולל בתמיסת חדירה (1:1,000).
- שטפו 3x עם KPBS, הרכיבו את הפרוסות על שקופיות זכוכית באמצעות מברשת צבע, והניחו להן להתייבש. לבסוף, שטפו את המגלשות במים נטולי יונים, הסירו עודפי מים, הוסיפו את אמצעי ההרכבה וכסו בכיסוי זכוכית. שמור את השקופיות למשך 24 שעות לפחות ב- RT, ואחסן אותן ב- 4 ° C עד להדמיה.
הערה: עבור נוגדנים המסמנים אפיטופים גרעיניים, בצע שליפת אנטיגן לפני חדירה (שלב 4.1.2) עם נתרן ציטראט (10 mM, pH 6.0) במשך 2 שעות ב 65 ° C.
- מהדק טלאי של תא שלם
- ביום ההקלטה, הכינו ליטר אחד של נוזל מוחי מלאכותי אנושי (haCSF), שעבר שינוי כדי להתאים טוב יותר לסביבת המוח האנושי (טבלה 7). בדומה לתמיסת החיתוך, הכינו כ-900 מ"ל של התמיסה עם כל המרכיבים למעט CaCl 2 מומסים במים נטולי יונים, ובעבעו אותה עם קרבוגן למשך 15 דקות לפני הוספת הנפח המתאים של תמיסת CaCl2 1 M. ממלאים את הבקבוק הנפחי עד לסימן 1 ליטר, וממשיכים לבעבע ב-RT במשך 15 דקות נוספות לפני תחילת ההקלטה ולאורך כל הניסוי.
- מעבירים את פרוסות הרקמה מצלחת התרבית לתא ההקלטה על במת מיקרוסקופ זקוף המחורר כל הזמן עם haCSF מבעבע בקצב זילוח של 2 מ"ל/דקה ומחומם ל-34 מעלות צלזיוס באמצעות בקר טמפרטורת אמבטיה.
- משוך נימי זכוכית עם מושך פיפטה להתנגדות ממוצעת של 3-5 MΩ, ומלא את הנימים בתמיסה פנימית מבוססת K-gluconate (טבלה 8) בתוספת טרייה של 2-4 מ"ג ביוציטין לזיהוי פוסט-הוק של התאים המתועדים. ה- pH והאוסמולריות של פתרון פנימי זה הם 7.2-7.3 ו- 285-295 mOsm, בהתאמה.
- במקרה של הקלטת תא מארח, קבל סקירה גסה של הפרוסה עם מטרה 4x, ומצא תא בריא לתיקון עם מטרה 40x. לאחר מכן, המשך עם מהדק תיקון סטנדרטי של תא שלם.
- במקרה של רישום תאים מושתלים, זהה את אזור הרקמה עם התאים המושתלים באמצעות מטרה 4x ומסנן אפיפלואורסצנטי בטווח הכחול (460 ננומטר) על ידי ביטוי כתב GFP בשתל. לאחר מכן, התקרבו לאזור הממוקם עם מטרה של 40x, ומצאו תא מושתל המבטא GFP עבור מהדק תיקון סטנדרטי של תא שלם.
- בדקו את פוטנציאל קרום המנוחה (RMP) מיד לאחר הפריצה לתא, וודאו שאיכות ההקלטה טובה. רשום את כל הפרמטרים המעניינים (לדוגמה, התנגדות הממברנה [Ri], פרמטרי AP, זרמי נתרן ואשלגן ופעילות סינפטית) בתצורת מתח התא כולו או מהדק הזרם.
- לאחר איסוף כל הנתונים הדרושים, בזהירות למשוך פיפטה ההקלטה מבלי לפגוע עוד יותר התא, כך שניתן לזהות עם immunostaining פוסט-הוק.
- העבירו את הפרוסה לתמיסת 4% PFA להמשך קיבוע וצביעה, כמתואר בשלב 4.1. סטרפטאבידין משמש לסימון חיסוני של התאים המלאים בביוציטין במהלך ההקלטות.
| נוגדנים | דילול | הערות |
| הראשי | ||
| עוף נגד GFP | 1:1000 | |
| עוף נגד MAP2 | 1:1000 | |
| עז נגד AiF1 | 1:100 | |
| עכבר נגד MBP | 1:1000 | יש צורך בשליפת אנטיגן |
| עכבר נגד SC123 | 1:2000 | |
| ארנב אנטי NeuN | 1:1000 | |
| ארנב אנטי-אוליג2 | 1:500 | |
| ארנב נגד Tmem119 | 1:200 | |
| משני | ||
| 488-זיקה מצומדתחמור טהור נגד עכבר IgG | 1:500 | |
| 488-זיקה מצומדתחמור טהור נגד ארנב IgG | 1:500 | |
| 488-זיקה מצומדתחמור טהור נגד עוף IgG | 1:500 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey נגד עוף IgG | 1:500 | |
| Cy3-conjugated Affinityחמור טהור נגד עז IgG | 1:500 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey נגד עכבר IgG | 1:500 | |
| אלקסה פלואור 647-מצומד סטרפטאבידין | 1:500 |
טבלה 6: רשימת נוגדנים ראשוניים ומשניים לאימונוהיסטוכימיה.
| haCSF | ריכוז מלאי | ריכוז סופי [mM] | לכל 1 ליטר |
| NaCl | אבקה | 129 | 7.54 גרם |
| NaHCO3 | אבקה | 21 | 1.76 גרם |
| גלוקוז | אבקה | 10 | 1.80 גרם |
| KCl | אבקה | 3 | 0.22 גרם |
| NaH2PO4 | אבקה | 1.25 | 0.17 גרם |
| MgSO4 | 1 מטר | 2 | 2 מ"ל |
| CaCl2 | 1 מטר | 1.6 | 1.6 מ"ל |
טבלה 7: הרכב נוזל מוחי מלאכותי (haCSF).
| פתרון פנימי K-Gluconate | ריכוז מלאי | ריכוז סופי [mM] | לכל 100 מ"ל |
| קיי-גלוקונאט | אבקה | 122.5 | 2.87 גרם |
| KCl | אבקה | 12.5 | 93.18 מ"ג |
| NaCl | אבקה | 8 | 46.76 מ"ג |
| HEPES | אבקה | 10 | 238.32 מ"ג |
| MgATP | אבקה | 2 | 101.4 מ"ג |
| Na3GTP | אבקה | 0.3 | 17.0 מ"ג |
| הערה: התאמת pH עם KOH/HCl | |||
טבלה 8: הרכב תמיסה פנימית מבוססת K-gluconate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות הפרוטוקול המתואר, רקמת hACtx מחולה עם אפילפסיה של האונה הרקתית נאספה ועובדה, כפי שהוסבר לעיל. כמה פרוסות נקבעו לאחר 24 שעות בתרבית כדי לחקור את נקודת ההתחלה של הרקמה המארחת. ניתוח של אוכלוסיות תאים עצביים שונות כמו תאי עצב (המבטאים NeuN ו-Map2, איור 1A), אוליגודנדרוציטים (Olig2 ו-MBP, איור 1B) ואסטרוציטים (GFAP ספציפי לאדם, שנקרא גם STEM123, איור 1C) הראה שימור אופטימלי של הרקמה.
השלב הבא היה לחקור כיצד תנאי התרבית משפיעים על הכדאיות העצבית ברקמה האנושית. לשם כך, הצביעה של NeuN ו- Map2 בוצעה לאחר שבועיים של תרבות. בנקודת הזמן שנחקרה, הביטוי של שני הסמנים העצביים האלה עדיין היה נוכח ברקמה (איור 2A). בנוסף, בוצעו רישומים אלקטרופיזיולוגיים כדי להעריך את הפונקציונליות. ההקלטות שהשתמשו במהדק טלאי של תאים שלמים הראו כי תאי העצב סבלו מ-RMP (-70 mV בממוצע) ומהתנגדות קלט ממברנה (Ri) (300 MΩ בממוצע), בדומה לנוירונים מתכשירים חריפים21,23. באופן כללי, התאים היו מעט פחות פעילים מאשר ברקמה טרייה, אף על פי שרוב התאים עדיין היו מסוגלים לירות לפחות אחד (איור 2B-E), אם לא מרובים, פוטנציאלי פעולה (APs, איור 2F-I), ונתרן מהיר פנימה וזרמי אשלגן איטיים כלפי חוץ היו נוכחים בהזרקות זרם צעד במצב מהדק מתח (איור 2C-E, ז-י). יחד, הקלטות אלה הצביעו על כך שהנוירונים בתרביות אורגנוטיפיות היו בריאים יחסית והפגינו תכונות נוירופיזיולוגיות פנימיות.
יתר על כן, השפעת התרבית על הפעלת תאי מיקרוגליה הוערכה על-ידי צביעת Tmem119 ו-Iba1 ברקמה של 24 שעות (איור 3A) ושבועיים בתרבית (איור 3B). כצפוי, נצפו כמה שינויים במראה המיקרוגליה. לאחר שבועיים בתרבית, הם הפכו פחות מסועפים ורכשו מורפולוגיה פעילה יותר בהשוואה לרקמה חריפה.
לאחר אפיון הרקמה המארחת, בוצעה השתלת אבות שמקורם בתאי lt-NES כדלקמן. תאי GFP-lt-NES התמינו במשך 7 ימים והושתלו ברקמת hACtx בתרבית של שבוע אחד (איור 4A). סקירה כללית של ההשתלה נצפתה באמצעות אימונוהיסטוכימיה עם GFP (איור 4B,C). התוצאות הושוו לאלו של השתלות קודמות ברקמה שהשתמרה בצורה גרועה בשל חלון זמן ארוך יותר בין כריתה לציפוי. התמונות מראות שבמערכת האופטימלית, 4 שבועות לאחר השתלת ex vivo, תאי GFP-lt-NES שהושתלו הציגו נוירוטים מורחבים וארבוריזציה נרחבת ומורכבת לאורך כל התרבית האורגנוטיפית (איור 4B). הרקמה שהשתמרה בצורה גרועה לא אפשרה השתלה מוצלחת בשל קישוריות המארח הלקויה. כמעט אף תא מושתל שרד; יתר על כן, פסולת ותיוג לא ספציפי של נוגדנים על תאים מתים נצפו באופן נרחב בכל הפרוסה האנושית (איור 4C).
באשר לתכונות האלקטרופיזיולוגיות של התאים המושתלים, נמצא כי במקרה של השתלה מוצלחת, התאים הפכו לא רק מבחינה מורפולוגית אלא גם לנוירונים בוגרים פעילים מבחינה תפקודית עם APs חוזרים ולעתים קרובות ספונטניים, נתרן מהיר פנימה וזרמי אשלגן איטיים כלפי חוץ, ורמה מסוימת של פעילות סינפטית, המעידה על אינטגרציה תפקודית של השתל עם הרקמה המארחת 4 שבועות לאחר ההשתלה (איור 4D-H).
איור 1: אפיון אוכלוסיות התאים השונות ברקמת hACtx לאחר 24 שעות בתרבית. תמונות קונפוקליות מייצגות של רקמת hACtx המראות נוכחות של (A) נוירונים (המבטאים NeuN ו-Map2), (B) אוליגודנדרוציטים (Olig2 ו-MBP), ו-(C) אסטרוציטים (GFAP ספציפי לאדם [STEM123]). צביעה גרעינית (Ho: Hoechst, כחול) כלולה בפאנלים הבודדים והממוזגים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. החיצים הלבנים מציינים קולוקליזציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אפיון ותכונות אלקטרופיזיולוגיות של תאי עצב hACtx לאחר שבועיים בתרבית אורגנוטיפית. (A) תמונות קונפוקליות מייצגות של רקמת hACtx המציגות ביטוי NeuN ו-Map2. (ב-ט) דוגמאות לנוירונים בקליפת המוח שנרשמו ברקמת hACtx בת שבועיים. (ב,ו) תיוג ביוציטין של תא העצב המוקלט (אדום), יחד עם צביעה גרעינית (Ho: Hoechst, כחול), כלול בלוח ממוזג. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. עקבות רישום מהדק טלאים של תא שלם המציגות דוגמאות לתא עם נקודות גישה בודדות (C-E) או (G-I) מרובות. נקודות גישה הושרו על ידי (C,G) צעד של 250 pA, או (D,H) הזרקת זרם מוגבר של 0 עד 300 pA ב-RMP. הכניסות מציינות תצוגה מוגדלת של אחת מנקודות הגישה בכל אחד מהמקרים. (ה,ט) זרמי נתרן פנימיים וזרמי אשלגן חיצוניים נצפו בשתי דוגמאות התאים בשלבי דפולריזציה של מתח שהופעלו מ -70 mV במרווחים של 10 mV במצב מהדק מתח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אפיון אוכלוסיית תאי המיקרוגליה ברקמת hACtx. תמונות קונפוקליות של רקמת hACtx המראות את הביטוי של Iba1 ו- Tmem119 לאחר (A) 24 שעות ו- (B) שבועיים בתרבית. צביעה גרעינית (Ho: Hoechst, כחול) כלולה בפאנלים הבודדים והממוזגים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. החיצים הלבנים מציינים קולוקליזציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סקירה כללית ותכונות אלקטרופיזיולוגיות של תאי עצב שמקורם בתאי LT-NES 4 שבועות לאחר השתלת תאי ה-ex vivo של תאי GFP-lt-NES. (A) תכנון ניסויי. Diff = בידול. (ב,ג) תמונות קונפוקליות מייצגות של תאי GFP-lt-NES מושתלים ב-(B) רקמת hACtx שהשתמרה היטב ו-(C) השתמרה בצורה גרועה. מוטות קנה מידה = 50 מיקרומטר. (D) עקבות לדוגמה של תא עצב שמקורו בשתל, היורה באופן ספונטני נקודות גישה. הכניסה מציינת תצוגה מוגדלת של אחת מנקודות הגישה (AP). נקודות גישה חוזרות יכולות להיגרם על ידי הזרקת צעד (E) (50 pA) או (F) רמפה (0 עד 300 pA) של זרם דה-פולריזציה מהפוטנציאל של -70 mV. (G) זרמי נתרן כלפי פנים וזרמי אשלגן כלפי חוץ הושרו על ידי צעדים דה-פולריזציה של 10 mV במצב מהדק מתח מפוטנציאל אחיזה של -70 mV. (H) במצב מהדק מתח, ניתן היה לצפות בזרמים פוסט-סינפטיים ספונטניים (sPSCs) בתאי עצב שמקורם בשתלים בפוטנציאל החזקה של -70 mV. הכניסות מציינות תצוגה מוגדלת של חלק מה-sPSC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השגת פרוסות hACtx באיכות גבוהה מספיק היא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה. רקמת קליפת המוח מתקבלת מחולים אפילפטיים שעברו ניתוח כריתה24. איכות הרקמה המנותחת, כמו גם זמן החשיפה של הרקמה בין כריתה לתרבית, היא קריטית; ככל שהרקמה מועברת מהר יותר מחדר הניתוח למעבדה ונחתכת, כך התרבות האורגנוטיפית תהיה אופטימלית יותר. באופן אידיאלי, יש לחתוך את הרקמה ולהעביר אותה למעבדה לתרבית תאים בשעות הראשונות לאחר האיסוף. חמצון הרקמה בתהליך זה משפר גם את איכות הפרוסות. בהקשר זה, ככל שדגימת הרקמה גדולה יותר, כך ריכוז החמצן המגיע לליבה נמוך יותר, ולכן, הכדאיות נמוכה יותר אם הרקמה לא נחתכת בזמן. אם איכות הרקמה המארחת אינה אופטימלית, תיקוף של טיפולים בתאי גזע לא יהיה אפשרי.
כאשר רקמת קליפת המוח מועברת מהמוח האנושי לצלחת, יש לקחת בחשבון כמה מגבלות. במהלך תהליך החיתוך, מספר רב של אקסונים מנותחים, גרימת נזק עצבי שיוביל לתהליכים דלקתיים כגון הפעלת מיקרוגליה25. מסיבה זו, גם אם הרקמה נחשבת בריאה כאשר היא ממוקמת במוח האדם, התנהגות התא בתרבית יכולה להיות שונה בשל הנזק החלקי שנגרם במהלך הכריתה וההכנה של הסעיפים האורגנוטיפיים26,27. ניתן לעקוב אחר שינויים באוכלוסיית תאי המיקרוגליה באמצעות טכניקות שונות, כולל מדידת רמות הציטוקינים המשתחררים או הערכת שינויים מורפולוגיים28. חשוב לציין, למרות שהפעלת מיקרוגליה נצפתה לאחר שבועיים בתרבית כתוצאה מהשינוי בסביבה מאיבר שלם לתנאי תרבית אקס ויוו, הנוירונים עדיין היו בני קיימא בנקודת זמן זו, כפי שמוצג על ידי הצביעה העצבית וניתוח התכונות האלקטרופיזיולוגיות שלהם. פרוסות רקמה עבות יותר נשמרות טוב יותר; עם זאת, חדירת חומרים מזינים לחלק הפנימי של הפרוסה מושפעת, וכתוצאה מכך מוות חלקי של רקמות. מסיבה זו, 300 מיקרומטר הוא העובי האופטימלי עבור תרבות אורגנוטיפית.
לתרביות אורגנוטיפיות של רקמת hACtx יש יתרונות ברורים בהשוואה לשיטות תרבית תלת-ממדיות אחרות כגון אורגנואידים או ספרואידים. המקור הוא מוח אנושי מפותח, כלומר הסביבה התאית והמטריציונית, כמו גם מצב ההבשלה של אוכלוסיות התאים השונות, זהים לאלה הנמצאים בדרך כלל במוח האנושי הבוגר25,29,30. אורגנואידים דומים יותר לרקמות העובר, וזה אופטימלי עבור כמה תחומי מחקר כגון מודלים של הפרעות התפתחותיות31 אבל לא, למשל, לחקר מחלות נוירודגנרטיביות, אשר משפיעים בעיקר על האוכלוסייה הבוגרת יש התפרצות מאוחרת32,33. והכי חשוב, התרבית האורגנוטיפית של רקמה אנושית היא, נכון להיום, המערכת האנושית היחידה המאפשרת אימות של טיפולים תאיים.
רוב הידע על השתלת תאי גזע להחלפה עצבית בהפרעות נוירודגנרטיביות נגזר ממודלים של בעלי חיים in vivo . אף על פי שמערכות אלה הן בעלות ערך רב להערכת ההשפעה המודולרית של תאים מושתלים במעגלים המארח הפגועים, למרבה הצער, טיפולים שנבדקו במערך זה נכשלים בדרך כלל כאשר הם מתורגמים למרפאה בשל ההבדלים הברורים בין מכרסמים לבני אדם34. מסיבה זו, התרבות האורגנוטיפית של רקמת hACtx היא אסטרטגיה מצוינת למידול מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות המשפיעות על קליפת המוח בשל האפשרות ללמוד את האינטראקציות בין אוכלוסיות עצביות אנושיות ושימור מבנה המוח האנושי25.
לסיכום, מתודולוגיה משולבת זו של תרביות אורגנוטיפיות ארוכות טווח של קליפת המוח האנושית הבוגרת והשתלה תוך-קורטיקלית ex vivo של אבות קליפת המוח המושרים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע היא אסטרטגיה מבטיחה לאימות טיפולים מבוססי תאי גזע, אשר יכולים להקל על התרגום הקליני של אסטרטגיות החלפה עצבית לגירוי התאוששות תפקודית במוח הפגוע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים ממועצת המחקר השבדית, קרן המוח השבדית, הקרן השבדית לשבץ מוחי, אזור Skåne, קרן Thorsten and Elsa Segerfalk והיוזמה הממשלתית השבדית לתחומי מחקר אסטרטגיים (StemTherapy).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Cutting and electrophysiology | |||
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
| Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
| Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2x91 | |
| Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
| Plastic Petri dish | Any suitable | ||
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
| Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| RINSING SOLUTION | |||
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
| Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| Forceps | Any suitable | ||
| Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
| GENERATION OF lt-NES cells | |||
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
| Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
| Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
| Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
| Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
| Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
| Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
| T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
| Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
| Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
| Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
| Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
| Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
| Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
| Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
| Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
| Paint brush | Any suitable | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
| Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
| Distilled water | |||
| Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
| Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
| Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
| Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium citrate | |||
| Distilled water | |||
| Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
| Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
| Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
References
- Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).
- Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work. Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).
- Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).
- Tornero, D., et al. Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli. Brain. 140 (3), 692-706 (2017).
- Palma-Tortosa, S., et al. Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).
- Robinson, N. B., et al. The current state of animal models in research: A review. International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Delavaran, H., et al. Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke. European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).
- Sabuncu, M. R., et al. The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease. Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).
- Eugene, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
- Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
- Kalmbach, B. E., et al. Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons. Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).
- Barth, M., et al. Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54 (2021).
- Almeida, G. M., et al. Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response. Frontiers in Neuroscience. 15, 674576 (2021).
- Schwarz, N., et al. Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures. Scientific Reports. 7, 12249 (2017).
- Miskinyte, G., et al. Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 207 (2017).
- Gronning Hansen, M., et al. Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry. Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).
- Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS One. 7 (1), 29597 (2012).
- Avaliani, N., et al. Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors. Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).
- Engel, J., et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).
- Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).
- Verwer, R. W., et al. Injury response of resected human brain tissue in vitro. Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).
- Verwer, R. W., et al. Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue. Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).
- Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Schwarz, N., et al. Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease. Elife. 8, 48417 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Wang, Z., et al. Organoid technology for brain and therapeutics research. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).
- Wang, H. Modeling neurological diseases with human brain organoids. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).
- Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).
