Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- ابدأ بالبيض الحبيبي الذي تم عزله عن طريق تبييض الديدان البالغة المرقة. تأكد من إجراء كل خطوة من هذا الإجراء بشكل معقم لتجنب تلوث الخلايا المستزرعة.
بعد فترة هضم مناسبة، طرد مركزي بلطف البيض واستبدال supernatant مع خلية ثقافة المتوسطة لوقف الهضم. ثم، تمرير الأجنة من خلال إبرة قياس 18 لفصل الخلايا الفردية ميكانيكيا.
في بروتوكول المثال، سنقوم بإعداد الخلايا الجنينية للتمايز والتحليل المورفولوجي في المختبر.
- أثناء العمل تحت غطاء تدفق صفح لتجنب إدخال التلوث البكتيري، resuspend البيض بيليه في ملليلتر واحد من اثنين ملليغرام لكل مليلتر chitinase ونقلها إلى أنبوب مخروطي الطازجة 15 ملليلتر. صخرة الأنبوب لمدة 10 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، اعتمادا على نضارة الانزيم.
بعد إزالة المتسخ بعناية، أضف ثلاثة ملليلترات من وسيط L15. نقل البيض إلى لوحة قطرها ستة سنتيمترات والبدء في التفكك اليدوي باستخدام حقنة معقمة 10 ملليلتر مع إبرة عيار 18. لمراقبة درجة الانفصال، ضع قطرة تعليق في طبق بيتري طازج وعرض تحت المجهر.
لإزالة كتل الخلية، البيض غير المهضوم، وفقست اليرقات، وتصفية بلطف تعليق من خلال مرشح خمسة ميكرون وتشغيل أربعة إلى خمسة ملليلتر إضافية من L15 المتوسطة من خلال مرشح لاستعادة الخلايا.
