Mezzo condizionato all'organo: mezzo generatore da cellule d'organo raccolte per studi sul cancro metastatico

Alcuni organi producono fattori solubili e diventano siti preferenziali per la metastasi del cancro al seno. Un mezzo condizionato preparato da queste cellule di organi raccolti può aiutare a identificare e studiare tali fattori.

Inizia posizionando un organo raccolto come un fegato in un tubo contenente PBS freddo e capovolgendo il tubo su e giù per rimuovere il sangue residuo dell'organo. Mettere l'organo in una piastra di Petri. E usando un bisturi, tagliare a dadini l'organo in piccoli pezzi.

Risospendi questi pezzi in un tubo contenente un mezzo basale integrato con un antibiotico per sostenere la crescita cellulare e prevenire la contaminazione. Ora, versare la sospensione cellulare in una piastra di coltura e incubare a 37 gradi Celsius con un apporto continuo di anidride carbonica per la durata richiesta.

Durante l'incubazione, queste cellule rilasciano metaboliti, fattori di crescita, proteine della matrice extracellulare nel mezzo. Quindi, trasferire la sospensione cellulare su un tubo di centrifuga e aggiungere un mezzo fresco per diluirlo. Centrifugare il tubo e filtrare il supernatante, che è il mezzo condizionato, in un tubo fresco.

Nel seguente protocollo, prepareremo i media condizionati dai polmoni del topo e dal cervello per studiare il comportamento metastatico delle cellule tumorali del seno.

Per generare il mezzo condizionato al polmone, invertire tre volte i tubi del tessuto polmonare per rimuovere il sangue residuo dagli organi. Quindi sostituire il lavaggio con PBS freddo fresco e ripetere fino a quando la soluzione salina non è priva di sangue.

Successivamente, trasferire i polmoni in una piastra di Petri di vetro di 60 millimetri quadrati per topo e utilizzare due lame di bisturi sterili per tritare i tessuti con ripetute affezioni avanti e indietro.

Quando i frammenti di tessuto hanno una dimensione di circa 1 millimetro a cubetti, rimescolare i pezzi nel volume appropriato del mezzo DMEM/F-12 integrato con antibiotici e incubare i tessuti in un pozzo di una piastra da 6 pozzetti per topo a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

Dopo 24 ore, trasferire l'intero contenuto di ciascun pozzo in singoli tubi conici da 50 millilitri e diluire il supporto condizionato con tre volumi equivalenti di mezzo DMEM/F-12 fresco per tubo.

Centrifugare i tubi per rimuovere eventuali grandi pezzi di detriti tissutali. Quindi mettere in comune il supporto condizionato attraverso un colino per siringhe da 0,22 micron in un singolo tubo conico da 50 millilitri.