Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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Bestimmte Organe produzieren lösliche Faktoren und werden zu bevorzugten Stellen für Brustkrebsmetastasen. Ein konditioniertes Medium, das aus diesen geernteten Organen hergestellt wird, kann helfen, solche Faktoren zu identifizieren und zu untersuchen.
Beginnen Sie, indem Sie ein geerntetes Organ wie eine Leber in eine Röhre mit kaltem PBS legen und die Röhre nach oben und unten kippen, um das Restblut des Organs zu entfernen. Legen Sie die Orgel in eine Petrischale. Und mit einem Skalpell, würfeln Sie das Organ in kleine Stücke.
Setzen Sie diese Stücke in eine Röhre mit einem Basalmedium, das mit einem Antibiotikum ergänzt wird, um das Zellwachstum zu unterstützen und eine Kontamination zu verhindern. Gießen Sie nun die Zellsuspension in eine Kulturplatte und brüten bei 37 Grad Celsius mit einer kontinuierlichen Kohlendioxidversorgung für die erforderliche Dauer.
Während der Inkubation setzen diese Zellen Metaboliten, Wachstumsfaktoren, extrazelluläre Matrixproteine in das Medium frei. Als nächstes übertragen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenrohr und fügen Sie frisches Medium hinzu, um es zu verdünnen. Zentrifugieren Sie das Rohr und filtern Sie den Überstand, das konditionierte Medium, in ein frisches Rohr.
Im folgenden Protokoll bereiten wir konditionierte Medien aus der Mauslunge und dem Gehirn vor, um das metastasierende Verhalten von Brustkrebszellen zu untersuchen.
Um das lungenkonditionierte Medium zu erzeugen, invertieren Sie die Röhren des Lungengewebes dreimal, um Restblut aus den Organen zu entfernen. Dann die Wäsche durch frisch kalte PBS ersetzen und wiederholen, bis die Herzlösung blutfrei ist.
Als nächstes übertragen Sie die Lunge in eine 60 Quadratmillimeter Glas Petrischale pro Maus und verwenden Sie zwei sterile Skalpellklingen, um das Gewebe mit wiederholtem Hin- und Herslicing zu zerkleinern.
Wenn die Gewebefragmente etwa 1 Millimeter groß sind, setzen Sie die Stücke im entsprechenden Volumen von DMEM/F-12-Medium, das mit Antibiotika ergänzt wird, wieder auf und brüten sie das Gewebe in einem Brunnen einer 6-Well-Platte pro Maus bei 37 Grad Celsius und 5% CO2.
Nach 24 Stunden den gesamten Inhalt jedes Brunnens in einzelne 50 Milliliter konische Röhren übertragen und das konditionierte Medium mit drei äquivalenten Volumina frischer DMEM/F-12-Medium pro Tube verdünnen.
Zentrifugieren Sie die Rohre, um große Teile von Gewebeablagerungen zu entfernen. Dann bündeln Sie das konditionierte Medium durch ein 0,22 Mikron Spritzensieb in einem einzigen 50 Milliliter konischen Rohr.
